CN113694071A - 清除和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物用于治疗精神障碍 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及清除和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物用于治疗精神障碍。本发明发现年老斑马鱼和小鼠以及PPP2R2Cm/m突变斑马鱼均存在一定程度的精神障碍，且都存在严重的DNA损伤和细胞衰老。敲除衰老相关基因p53或p21的PPP2R2Cm/m突变斑马鱼的精神障碍症状得到显著改善，给予PPP2R2Cm/m突变斑马鱼具有清除衰老细胞作用的ABT263后精神障碍症状也得到显著改善。以上结果充分说明清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老是治疗DNA损伤累积、神经细胞衰老增加介导的精神障碍的有效途径，清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物可用于制备防治精神障碍的药物。

Description

清除和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物用于治 疗精神障碍
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及清除和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物用于治疗精神障碍。
背景技术
精神障碍是以个体认知、情感或意志行为障碍为特征的一种综合征。根据有无器质性因素主要分为：器质性精神障碍和功能性精神障碍。器质性精神障碍是因中枢神经系统疾病、代谢障碍、酒精物质滥用、中毒、脑损伤、脑炎等因素导致的障碍，患者常表现为意识障碍、感知觉障碍、情绪障碍、记忆障碍、人格行为改变等症状，如谵忘、遗忘综合征和痴呆。功能性精神障碍是因生物学、心理和社会环境因素长期相互作用，导致的幻觉、妄想、情绪障碍等症状，如焦虑症和精神分裂症。
蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是一种丝/苏氨酸磷酸酶，底物广泛，大多涉及转录因子和蛋白激酶，参与了多项细胞生物学功能，可在能量代谢、DNA损伤与修复、蛋白质翻译、细胞周期调控和信号转导等方面发挥重要作用。以往研究表明，PP2A具有肿瘤抑制效应；参与调控糖、脂代谢，PP2A功能异常会导致肿瘤发生、糖尿病、肥胖等的发生，同时冠状动脉粥样硬化也与PP2A的异常变异有关；参与了视网膜病变及心肌病等继发性病理过程。
p53和p21均为细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子，在细胞衰老的启动和维持中起着重要作用。ABT263是一种已知的具有清除衰老细胞的化合物。
目前未见使用清除和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物，通过清除和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的途径治疗DNA损伤累积、神经细胞衰老增加介导的精神障碍的研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物在防治精神障碍中的用途。
第一方面，本发明提供了清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物在制备防治精神障碍的药物中的应用。
作为一个优选例，所述精神障碍是由DNA损伤累积和/或衰老神经细胞增加而导致的精神障碍。
更优选地，所述DNA损伤累积和/或神经细胞衰老增加是由正常年龄增长导致的，或由PP2A活性和/或表达降低导致的。
作为另一优选例，所述精神障碍选自认知障碍、情感障碍和/或行为障碍。
更优选地，所述精神障碍其表型为对外界反应能力变弱、对新事物探索能力变弱、易激惹、焦虑、抑郁、社交能力下降、认知功能减退、学习能力下降或记忆能力下降。
作为另一优选例，所述清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物为小分子化合物或生物大分子。
作为另一优选例，所述清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物选自ABT263，引起PP2A活性和/或表达下降的化合物，引起p53活性和/或表达下降的化合物，以及引起p21活性和/或表达下降的化合物。
第二方面，本发明提供了一种防治有需要的受试者的精神障碍的方法，包括向所述受试者施用清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物的步骤。
作为一个优选例，所述精神障碍是DNA损伤累积和/或神经细胞衰老增加介导的精神障碍。
更优选地，所述DNA损伤累积和/或神经细胞衰老增加是由正常年龄增长导致的，或由PP2A活性和/或表达降低导致的。
作为另一优选例，所述精神障碍选自认知障碍、情感障碍和/或行为障碍。
更优选地，所述精神障碍其表型为对外界反应能力变弱、对新事物探索能力变弱、易激惹、焦虑、抑郁、社交能力下降、认知功能减退、学习能力下降或记忆能力下降。
作为另一优选例，所述清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物为小分子化合物或生物大分子。
作为另一优选例，所述清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物选自ABT263，引起PP2A活性和/或表达下降的化合物，引起p53活性和/或表达下降的化合物，以及引起p21活性和/或表达下降的化合物。
本文中，所述“精神障碍”是认知、情感、行为和意志等精神活动不同程度障碍的总称。本领域知晓，所述“认知”包括三个过程：感觉和知觉、记忆和注意、思维过程。所述“感觉和知觉”指利用眼、耳、鼻、舌及皮肤来了解周围事物以认识世界，这一过程是大脑对外界客观事物存在的感知，也就是把外界的事物反映到大脑的结果。所述“记忆和注意”中的“记忆”，指将既往感知过的事物在脑子里保留下来，“注意”指人的精神活动对一定事物的指向。所述“思维过程”指大脑通过运用过去的经验对感觉反映到大脑的信息进行分析、综合、判断从而得出结论的过程。所述“情感”是指人们对待任何一种事物的态度和外部表情。所述“行为和意志”，指的是人们为了达到一定目的而采取行动的心理过程。正常情况下，精神活动的三个方面“认知”、“情感”、“行为和意志”是相互协调而又步调统一的，并且与外界环境是相符合的。而当存在精神障碍的情况下，则表现出“认知”、“情感”和“行为和意志”三者的不协调，或者是“认知”、“情感”或“行为和意志”方面与外界环境的不符。
本文中，关于所述的“由正常年龄增长导致的DNA损伤累积和/或神经细胞衰老增加所导致的精神障碍”指影响健康衰老的精神症状，WHO认为，衰老在生物学层面上是各种分子和细胞损伤的逐渐累积导致生理储备的逐渐减少，各种能力普遍下降，导致许多疾病的风险增加。但这些变化既不是线性的，也不是在人群中一成不变的，它们是与年龄有着散在的相互关联。例如，尽管一些70岁以上的老人可能拥有健康的身体、良好的精神状态而享受生活，但绝大多数人是逐渐虚弱，需要各种辅助支持以满足他们的基本需要。WHO提出精神状态变化(或障碍)包括：应对能力变化；行为改变；记忆丧失；攻击性；抑郁、焦虑和冷漠；睡眠困难；错觉和幻觉；重复行为；行走和迷路；判断的变化。在老年人群中，上述一种或多种症状的出现提示老年人的精神或心理状况的下降。但这种精神状态变化(或障碍)有别于β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积和tau缠结造成的阿尔茨海默病(AD)。
本文中，所述“PP2A激动剂”指直接或间接作用于PP2A并使之激活，产生生理反应的化合物。
本文中，MPH英文全称为Methlphenidate，又名哌醋甲酯。DT-061是一种已知的PP2A激动剂，又简写为SMAP。FTY720是一种已知的PP2A激动剂，即芬戈莫德。
本发明优点在于：
本发明发现年老斑马鱼和小鼠以及PPP2R2Cm/m突变斑马鱼均存在一定程度的精神障碍，且都存在严重的DNA损伤和细胞衰老。使用MPH或其他PP2A激动剂可以逆转年老斑马鱼和小鼠以及PPP2R2Cm/m突变斑马鱼的精神障碍症状，且消除其DNA损伤和衰老的神经细胞。进一步，在敲除了衰老相关基因p53的PPP2R2Cm/m突变斑马鱼和敲除了衰老相关基因p21的PPP2R2Cm/m突变斑马鱼中观察到突变斑马鱼的精神障碍症状得到显著改善，且给予PPP2R2Cm/m突变斑马鱼具有清除衰老细胞作用的ABT263后精神障碍症状也得到显著改善。以上结果充分说明清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老是治疗精神障碍的有效途径，清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物可用于制备防治精神障碍的药物。
附图说明
图1：使用CRISPR-Cas9系统显示斑马鱼ppp2r2c基因突变的示意图。黄色和红色框分别显示目标外显子和结构域。红色虚线显示ppp2r2c中的4-核苷酸缺失。黑色三角形显示了用于扩增ppp2r2c mRNA的PCR引物的位置。
图2：对ppp2r2c基因不同位置处的引物ppp2r2c-p1，ppp2r2c-p2和ppp2r2c-p3(包括(图1)中所示的ppp2r2c突变区域之前和之后)进行RT-qPCR分析，PP2A的其他调节亚基基因(ppp2r2a，ppp2r2b，ppp2r2d)进行RT-qPCR分析和成年野生型和纯合型ppp2r2c突变体鱼脑中的ppp2r5c进行RT-qPCR分析，表明该模型ppp2r2c的mRNA表达水平特异性下降，模型构建成功(n＝3个独立的生物样本；非配对双侧t检验)。
图3：实验设计。对WT和ppp2r2cm/m(6月龄)鱼行为测试，使用或不使用MPH治疗3天。
图4：光刺激试验的实验方案与光刺激试验中记录和分析参数。a为光刺激试验的实验方案；b为30秒光照期间成鱼运动活动的代表图；c为在30秒光照期间突发状态持续时间的量化(每组n＝9)。
图5：a为在5分钟试验期间，有或没有MPH治疗3天的WT和ppp2r2cm/m(6月龄)镜检试验中的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜子攻击次数的量化(WT-vehicle、WT-MPH和ppp2r2cm/m-vehicle，n＝9；ppp2r2cm/m-MPH，n＝8)。
图6：a为在旷场试验的30分钟试验期间，使用或不使用MPH治疗3天，WT和ppp2r2cm /m(6月龄)的代表性运动轨迹(灰线)，其中正方形表示中心区域。b为成鱼在中心区停留的累积时间(ppp2r2cm/m-vehicle，n＝7；WT-vehicle和WT-MPH，n＝8；ppp2r2cm/m-MPH，n＝9)。数据为平均值±SEM，*P<0.05，**P<0.01，n.s.，不显著；双向方差分析。
图7：使用不同精神治疗药物进行的光刺激、镜像攻击和旷场试验。
图8：对成年ppp2r2cm/m斑马鱼脑进行为期3天的PP2A磷酸酶测定(n＝3个独立的生物样品，每个样品包含两个脑)。
图9：a为有无DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理的WT和ppp2r2cm/m(6月龄)在30秒光照期间的运动活性代表图。b为30秒照明期间突发状态持续时间的量化(WT，n＝9；WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝6，WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝10；WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝11)。
图10：a为在5分钟试验期间，有或没有DT-061、FTY720和MPH+DT-061治疗3天的情况下，对WT和ppp2r2cm/m(6月龄)进行镜像攻击试验的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜子攻击次数的量化(WT-vehicle，n＝9；WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm /m-DT-061，n＝6，WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝10；ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝11；WT-MPH+DT-061，n＝12)。
图11：a为旷场试验30分钟试验期间，在有或没有DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理3天的情况下，WT和ppp2r2cm/m(6月龄)的代表性运动轨迹(灰线)。方框显示中心区域。b为成鱼在中心区域内停留的累积时间(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。c为成鱼平均速度(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。d为成鱼的总游泳距离(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。
图12：免疫荧光法检测经或不经DT-061、FTY720和MPH+DT-061治疗3天的WT和ppp2r2cm/m(6月大)的OT中的NeuN(绿色)和γH2AX(红色)(比例尺，5μm)。量化神经元(NeuN+)和非神经元(NeuN)的γH2AX阳性百分比(阳性值表示细胞核中至少有5个γH2AX病灶的细胞核数量/细胞核总数量，n＝6/组；*表示NeuN+组的统计差异，#表示NeuN-组的统计差异)。
图13：经或不经DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理3天的WT和ppp2r2cm/m(6个月大)的OT中SA-β-gal与NeuN(绿色)免疫荧光共染色的代表性图像(比例尺，15μm)。箭头指向SA-β-gal+神经细胞。神经元SA-β-gal阳性神经元(NeuN+)和非神经元(NeuN)百分率的测定(n＝6/组；*表示NeuN+组的统计差异，#表示NeuN-组的统计差异)。数据为平均数±标准差，*P<0.05，**P<0.01，#P<0.05，##P<0.01，双因素方差分析。
图14：对6月(成鱼)和22月鱼(老年鱼)行为测试的实验设计，使用或不使用MPH或DT-061治疗3天。
图15：光刺激试验中记录和分析参数。a为30秒开灯期间的移动活动代表图。b为在30秒的灯光开启期间，对突发状态持续时间进行量化(6m，n＝8；22m，n＝15；22m MPH，n＝11；22m-DT-061，n＝9；单因素方差分析)。
图16：a为5分钟试验期间，成鱼镜像攻击试验中的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜像攻击次数的量化(6m，n＝14；22m，n＝15；22m-DT-061，n＝12；单因素方差分析)。
图17：a为在30分钟的旷场试验中的代表性的运动轨迹(灰线)。方框显示中心区域。b为成鱼在中心区域内的累计停留时间(3m，n＝18，22m，n＝11；22m MPH，n＝10；22m-DT-061，n＝9；单因素方差分析)。
图18：a为用或不用MPH或DT-061处理3天的22个月大的鱼的脑中Neun(绿色)和γH2AX(红色)共染色的代表性共焦图像(比例尺，5μm)。b为γH2AX阳性核的定量(正值表明至少有5个γH2AX病灶)(WT-vehicle，n＝4；WT-MPH，n＝7；WT-DT-061，n＝3；非配对双侧t检验)。
图19：a为用或不用MPH或DT-061处理3天的22个月龄WT鱼的SA-β-gal染色的代表性图像(比例尺，15μm)。b为SA-β-gal阳性细胞百分比的定量(WT-vehicle和WT-MPH，n＝6；WT-DT-061，n＝4；单因素方差分析)。
图20：用MPH或DT-061处理老年鱼后的PP2A磷酸酶测定(n＝3个独立的生物样品，每组含有两个大脑；单因素方差分析)。数据以平均数±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01。
图21：3月龄和14月龄小鼠经MPH治疗后的行为学实验设计。
图22：明暗转换试验中明室和暗室之间的转换次数(n＝5，3m；n＝8，14m；n＝8，14m-MPH；单因素方差分析)。
图23：Morris水迷宫实验的最长潜伏期。
图24：小鼠Morris水迷宫实验中跨越平台的频率。
图25：Morris水迷宫测试中正确象限的时间花费(3m，n＝4；14m，n＝4；14m-MPH，n＝5；单因素方差分析)。
图26：a为与3个月大的小鼠相比，14个月大的小鼠用MPH或vehicle治疗后，其大脑额叶和颞叶中Neun(绿色)和γH2AX(红色)共染色的代表性共焦图像(比例尺，25μm)。b为3m、14m和14m-MPH额叶或颞叶γH2AX阳性核的定量(3m，n＝6；14m，n＝3；14m-MPH，n＝3；非配对双侧t检验)。
图27：a为与3月龄小鼠相比，14月龄WT小鼠经MPH处理或不经MPH处理后大脑额叶和颞叶SA-β-gal染色的代表性图像(比例尺，25μm)。b为SA-β-gal染色阳性细胞百分比的定量(n＝3/组；非配对双侧t检验)。
图28：小鼠大脑额叶和颞叶的PP2A磷酸酶测定(3m，n＝5；14m，n＝8；14m-MPH，n＝8；非配对双侧t检验)。数据以平均数±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01。
图29：a为光刺激试验的30秒光照期间运动活动代表性结果。b为30秒的光照期间对突发运动状态进行量化(ppp2r2cm/mp53-/-，n＝11；WT、ppp2r2cm/m和ppp2r2cm/mp21-/-，n＝10；WT-ABT263，n＝9；ppp2r2cm/m-ABT263，n＝8；单因素方差分析)。
图30：a为在镜像攻击实验中WT和ppp2r2cm/m使用或不使用ABT263治疗3天，以及ppp2r2cm/mp53-/-和ppp2r2cm/mp21-/-的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜像攻击次数的量化(ppp2r2cm/mp53-/-，n＝11；WT、ppp2r2cm/m和ppp2r2cm/mp21-/-组，n＝10；WT-ABT263和ppp2r2cm/m-ABT263，n＝9；单因素方差分析)。
图31：a为在30分钟的旷场试验中WT和ppp2r2cm/m使用或不使用ABT263治疗3天，ppp2r2cm/mp53-/-以及ppp2r2cm/mp21-/-的代表性运动轨迹(灰线)。方框显示中心区域。b为在中心区域内停留的累积时间的量化(WT、ppp2r2cm/m和ppp2r2cm/mp21-/-组，n＝10；WT-ABT263、ppp2r2cm/m-ABT263和ppp2r2cm/mp53-/-，n＝9；单因素方差分析)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、实验方法
1、所有药物溶液均使用PBS(MPH 1.08mg/kg、丙戊酸钠300mg/kg、阿立哌唑0.6mg/kg、齐拉西酮1.6mg/kg、DT061和FTY720 5mg/kg)新鲜制备。给予斑马鱼在药物溶液中浸泡3天的食物，并在第4天进行行为分析。14和3月龄C57B6/J小鼠均在上海交通大学医学院瑞金医院动物设施中生产和饲养。该方案得到了动物实验伦理委员会的批准。14月龄和3月龄的C57B6/J小鼠均灌胃给予MPH(12.3mg/kg/d)共14天。
2、CRISPR-Cas9突变斑马鱼的产生。利用CRISPR-Cas9系统产生ppp2r2c突变斑马鱼，其中利用ZiFiT Targeter软件(http://zifit.partners.org/ZiFiT)设计了靶向ppp2r2c第9外显子(sgRNA：5′-GGGCAGAGATACC-3′(SEQ ID NO:1))和cdkn1a/p21第2外显子(sgRNA：5′-GGTAATGGGCCGACTAGG-3′(SEQ ID NO:2))的导向RNA。F0代培育至3个月大，与野生斑马鱼进行异交，以获得潜在的F1 indel突变。对从F1斑马鱼尾部分离的基因组DNA进行PCR扩增和测序，以鉴定ppp2r2c突变体(用于基因分型的引物：fwd5′-CaggcAgtgttGaagat-3′(SEQ ID NO:3)；rev 5′-GTGCTGAGAGGCCACTAA-3′(SEQ ID NO:4))和p21突变体(用于基因分型的引物：fwd 5′-TCTGTGATTGTGTG-3′(SEQ ID NO:5)；rev 5′-GAGTGCACATCGTTC-3′(SEQ ID NO:6))。
3、脑切片免疫荧光成像。斑马鱼组织在4℃分离并用4％PFA固定过夜，然后用30％蔗糖脱水过夜。将组织包埋在OCT中，并在5分钟时切片。冷冻切片和载玻片在4％PFA中固定30分钟，然后在室温下用0.5％Triton X-100、2％FBS在1×PBS中渗透和封闭1小时。在4℃下过夜进行与一级抗体的杂交，然后在PBS中用0.1％吐温-20洗涤三次。与相应二级抗体(Invitrogen)的杂交在37℃下进行至少2小时。最后，将切片与1×DAPI在室温下孵育5分钟。使用共焦激光扫描显微镜(SP8；莱卡)拍照。
4、PP2A磷酸酶测定。将从斑马鱼大脑、小鼠额叶和颞叶制备的匀浆置于20mM咪唑-HCl、2mM EDTA、2mM EGTA、pH 7.0和抑肽酶、亮肽和胃蛋白酶抑制剂各10μg/mL、1mM苯甲脒中，和1mM苯甲基磺酰氟，并通过添加1％NP-40进行溶解。然后根据制造商的说明，使用PP2A免疫沉淀磷酸酶分析试剂盒(微孔)进行分析。在微量滴定板读取器(BioTAK)中测量650nm(A650)波长处的吸光度。
5、斑马鱼行为分析。
将一条成年鱼放置在一个标准的交配池(21×10×7.5厘米)中，该交配池含有深度为6厘米的系统水，并让其适应15分钟，然后转移到一个自动观察和视频跟踪系统(ZebraLab；Viewpoint Life Sciences)。
光刺激试验：将一条成年鱼置于黑暗中，让其适应15分钟。然后打开灯30秒，并使用ZebraLab量化软件模块记录活动。量化测试的重点是斑马鱼的活动，它代表了斑马鱼在水箱中的全部移动量及其频率。该软件可以自动记录斑马鱼的位置，并将以前的位置与新位置进行比较。改变的像素被视为活动。我们使用野生型鱼类获得两个阈值(突发阈值为100，冻结值为20)。突发阈值指示95％移动的像素变化低于该值。冻结值表示当鱼停止移动时，像素变化低于该值。如果移动表面的值高于突发阈值，则活动将记录为突发活动，软件将自动记录活动的持续时间。
镜像攻击测试：将一面镜子放在水箱末端外，并使用ZebraLab跟踪软件模块连续5分钟监控鱼的攻击行为。
旷场试验：连续监测斑马鱼活动30分钟，使用视频跟踪软件(记录和分析在中心区域花费的时间(占总面积的30％)。
6、SA-β-gal染色。采用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Beyotime)进行。按照制造商的说明进行分析。图像是用蔡司A2显微镜拍摄的。
7、小鼠行为测定。
莫里斯水迷宫实验：莫里斯水迷宫实验在直径分别为120cm和10cm的蓝色圆形水池和平台上进行。圆形区域分为4个象限和一个平台区域。水池周围悬挂着4张不同形状的纸。实验总共花了6天。在最初的5天里，将平台固定在一个固定的位置，然后将老鼠放在水池中，让它们的头从每个象限朝向墙壁。通过上海鑫软信息技术有限公司的软件记录小鼠进入平台的潜伏期、距离，作为小鼠学习能力的判断。第6天，移除平台后重复该程序。记录小鼠穿过平台区域的频率、在正确象限的时间以及与平台位置的平均距离，作为对其记忆的判断。
光/暗转换实验：我们使用了一种仪器，该仪器由一个发光、顶部开放、不透明的有机玻璃盒(25×25×30厘米)和一个黑色、顶部封闭、不透明的有机玻璃盒(20×20×30厘米)连接而成。将动物放在照明箱中，通过一个连接门(12×5cm)自由地从灯光移动到暗室5分钟。灯箱由台灯照亮。如果四只爪子都在灯箱中，则认为老鼠在灯箱中。收集光室和暗室之间的转换次数。
二、实验结果
1、精神行为异常斑马鱼模型构建(图1、图2)。
图1：使用CRISPR-Cas9系统显示斑马鱼ppp2r2c基因突变的示意图。黄色和红色框分别显示目标外显子和结构域。红色虚线显示ppp2r2c中的4-核苷酸缺失。黑色三角形显示了用于扩增ppp2r2c mRNA的PCR引物的位置。
图2：对ppp2r2c基因不同位置处的引物ppp2r2c-p1，ppp2r2c-p2和ppp2r2c-p3(包括(图1)中所示的ppp2r2c突变区域之前和之后)进行RT-qPCR分析，PP2A的其他调节亚基基因(ppp2r2a，ppp2r2b，ppp2r2d)进行RT-qPCR分析和成年野生型和纯合型ppp2r2c突变体鱼脑中的ppp2r5c进行RT-qPCR分析，表明该模型ppp2r2c的mRNA表达水平特异性下降，模型构建成功(n＝3个独立的生物样本；非配对双侧t检验)。
2、MPH可以逆转ppp2r2cm/m模型表现出的异常精神行为(图3、图4、图5、图6、图7)。
图3：实验设计。对WT和ppp2r2cm/m(6月龄)鱼行为测试，使用或不使用MPH治疗3天。
图4：光刺激试验的实验方案与光刺激试验中记录和分析参数。a为光刺激试验的实验方案；b为30秒光照期间成鱼运动活动的代表图；c为在30秒光照期间突发状态持续时间的量化(每组n＝9)。
图5：a为在5分钟试验期间，有或没有MPH治疗3天的WT和ppp2r2cm/m(6月龄)镜检试验中的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜子攻击次数的量化(WT-vehicle、WT-MPH和ppp2r2cm/m-vehicle，n＝9；ppp2r2cm/m-MPH，n＝8)。
图6：a为在旷场试验的30分钟试验期间，使用或不使用MPH治疗3天，WT和ppp2r2cm /m(6月龄)的代表性运动轨迹(灰线)，其中正方形表示中心区域。b为成鱼在中心区停留的累积时间(ppp2r2cm/m-vehicle，n＝7；WT-vehicle和WT-MPH，n＝8；ppp2r2cm/m-MPH，n＝9)。数据为平均值±SEM，*P<0.05，**P<0.01，n.s.，不显著；双向方差分析。
图7：使用不同精神治疗药物进行的光刺激、镜像攻击和旷场试验。
3、PP2A激动剂改善ppp2r2cm/m行为障碍，恢复PP2A活性，消除DNA损伤(DDR)和衰老的神经细胞(图8、图9、图10、图11、图12、图13)。
图8：对成年ppp2r2cm/m斑马鱼脑进行为期3天的PP2A磷酸酶测定(n＝3个独立的生物样品，每个样品包含两个脑)。
图9：a为有无DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理的WT和ppp2r2cm/m(6月龄)在30秒光照期间的运动活性代表图。b为30秒照明期间突发状态持续时间的量化(WT，n＝9；WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝6；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝10；WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝11)。
图10：a为在5分钟试验期间，有或没有DT-061、FTY720和MPH+DT-061治疗3天的情况下，对WT和ppp2r2cm/m(6月龄)进行镜像攻击试验的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜子攻击次数的量化(WT-vehicle，n＝9；WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm /m-DT-061，n＝6；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝10；ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝11；WT-MPH+DT-061，n＝12)。
图11：a为旷场试验30分钟试验期间，在有或没有DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理3天的情况下，WT和ppp2r2cm/m(6月龄)的代表性运动轨迹(灰线)。方框显示中心区域。b为成鱼在中心区域内停留的累积时间(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。c为成鱼平均速度(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。d为成鱼的总游泳距离(WT-DT-061、ppp2r2cm/m-vehicle和ppp2r2cm/m-DT-061，n＝9；WT-vehicle，n＝10；WT-FTY-720和ppp2r2cm/m-FTY-720，n＝11，WT-MPH+DT-061和ppp2r2cm/m-MPH+DT-061，n＝6)。
图12：免疫荧光法检测经或不经DT-061、FTY720和MPH+DT-061治疗3天的WT和ppp2r2cm/m(6月大)的OT中的NeuN(绿色)和γH2AX(红色)(比例尺，5μm)。量化神经元(NeuN+)和非神经元(NeuN)的γH2AX阳性百分比(阳性值表示细胞核中至少有5个γH2AX病灶的细胞核数量/细胞核总数量，n＝6/组；*表示NeuN+组的统计差异，#表示NeuN-组的统计差异)。
图13：经或不经DT-061、FTY720和MPH+DT-061处理3天的WT和ppp2r2cm/m(6个月大)的OT中SA-β-gal与NeuN(绿色)免疫荧光共染色的代表性图像(比例尺，15μm)。箭头指向SA-β-gal+神经细胞。神经元SA-β-gal阳性神经元(NeuN+)和非神经元(NeuN)百分率的测定(n＝6/组；*表示NeuN+组的统计差异，#表示NeuN-组的统计差异)。数据为平均数±标准差，*P<0.05，**P<0.01，#P<0.05，##P<0.01，双因素方差分析。
4、MPH改善了年老鱼的行为障碍，恢复PP2A活性，消除DDR和衰老的神经细胞(图14、图15、图16、图17、图18、图19、图20)。
图14：对6月(成鱼)和22月鱼(老年鱼)行为测试的实验设计，使用或不使用MPH或DT-061治疗3天。
图15：光刺激试验中记录和分析参数。a为30秒开灯期间的移动活动代表图。b为在30秒的灯光开启期间，对突发状态持续时间进行量化(6m，n＝8；22m，n＝15；22m MPH，n＝11；22m-DT-061，n＝9；单因素方差分析)。
图16：a为5分钟试验期间，成鱼镜像攻击试验中的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜像攻击次数的量化(6m，n＝14；22m，n＝15；22m-DT-061，n＝12；单因素方差分析)。
图17：a为在30分钟的旷场试验中的代表性的运动轨迹(灰线)。方框显示中心区域。b为成鱼在中心区域内的累计停留时间(3m，n＝18，22m，n＝11；22m MPH，n＝10；22m-DT-061，n＝9；单因素方差分析)。
图18：a为用或不用MPH或DT-061处理3天的22个月大的鱼的脑中Neun(绿色)和γH2AX(红色)共染色的代表性共焦图像(比例尺，5μm)。b为γH2AX阳性核的定量(正值表明至少有5个γH2AX病灶)(WT-vehicle，n＝4；WT-MPH，n＝7；WT-DT-061，n＝3；非配对双侧t检验)。
图19：a为用或不用MPH或DT-061处理3天的22个月龄WT鱼的SA-β-gal染色的代表性图像(比例尺，15μm)。b为SA-β-gal阳性细胞百分比的定量(WT-vehicle和WT-MPH，n＝6；WT-DT-061，n＝4；单因素方差分析)。
图20：用MPH或DT-061处理老年鱼后的PP2A磷酸酶测定(n＝3个独立的生物样品，每组含有两个大脑；单因素方差分析)。数据以平均数±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01。
5、MPH能改善老年小鼠的行为障碍，恢复PP2A活性，清除DDR和衰老的神经细胞(图21、图22、图23、图24、图25、图26、图27、图28)。
图21：3月龄和14月龄小鼠经MPH治疗后的行为学实验设计。
图22：明暗转换试验中明室和暗室之间的转换次数(n＝5，3m；n＝8，14m；n＝8，14m-MPH；单因素方差分析)。
图23：Morris水迷宫实验的最长潜伏期。
图24：小鼠Morris水迷宫实验中跨越平台的频率。
图25：Morris水迷宫测试中正确象限的时间花费(3m，n＝4；14m，n＝4；14m-MPH，n＝5；单因素方差分析)。
图26：a为与3个月大的小鼠相比，14个月大的小鼠用MPH或vehicle治疗后，其大脑额叶和颞叶中Neun(绿色)和γH2AX(红色)共染色的代表性共焦图像(比例尺，25μm)。b为3m、14m和14m-MPH额叶或颞叶γH2AX阳性核的定量(3m，n＝6；14m，n＝3；14m-MPH，n＝3；非配对双侧t检验)。
图27：a为与3月龄小鼠相比，14月龄WT小鼠经MPH处理或不经MPH处理后大脑额叶和颞叶SA-β-gal染色的代表性图像(比例尺，25μm)。b为SA-β-gal染色阳性细胞百分比的定量(n＝3/组；非配对双侧t检验)。
图28：小鼠大脑额叶和颞叶的PP2A磷酸酶测定(3m，n＝5；14m，n＝8；14m-MPH，n＝8；非配对双侧t检验)。数据以平均数±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01。
6、ABT263和其他抑制细胞衰老的途径可以改善ppp2r2cm/m精神行为障碍(图29、图30、图31)。
图29、图30和图31展示了WT和ppp2r2cm/m使用或不使用ABT263治疗3天，ppp2r2cm/ mp53-/-(ppp2r2cm/m与p53-/-杂交得到)以及ppp2r2cm/mp21-/-(ppp2r2cm/m与p21-/-杂交得到)六月龄的行为测试结果。
图29：a为光刺激试验的30秒光照期间运动活动代表性结果。b为30秒的光照期间对突发运动状态进行量化(ppp2r2cm/mp53-/-，n＝11；WT、ppp2r2cm/m和ppp2r2cm/mp21-/-，n＝10；WT-ABT263，n＝9；ppp2r2cm/m-ABT263，n＝8；单因素方差分析)。
图30：a为在镜像攻击实验中WT和ppp2r2cm/m使用或不使用ABT263治疗3天，以及ppp2r2cm/mp53-/-和ppp2r2cm/mp21-/-的代表性运动轨迹(灰线)。b为5分钟间隔内镜像攻击次数的量化(ppp2r2cm/mp53-/-，n＝11；WT、ppp2r2cm/m和ppp2r2cm/mp21-/-组，n＝10；WT-ABT263和ppp2r2cm/m-ABT263，n＝9；单因素方差分析)。
图31：a为在30分钟的旷场试验中WT和ppp2r2cm/m使用或不使用ABT263治疗3天，ppp2r2cm/mp53-/-以及ppp2r2cm/mp21-/-的代表性运动轨迹(灰线)。方框显示中心区域。b为在中心区域内停留的累积时间的量化(WT、ppp2r2cm/m和ppp2r2cm/mp21-/-组，n＝10；WT-ABT263、ppp2r2cm/m-ABT263和ppp2r2cm/mp53-/-，n＝9；单因素方差分析)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院
<120> 清除和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物用于治疗精神障碍
<130> /
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggcagagat acc 13
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtaatgggc cgactagg 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caggcagtgt tgaagat 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgctgagag gccactaa 18
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctgtgattg tgtg 14
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagtgcacat cgttc 15

Claims (10)

1.清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物在制备防治精神障碍的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述精神障碍是DNA损伤累积和/或神经细胞衰老增加介导的精神障碍，所述DNA损伤累积和/或神经细胞衰老增加是由正常年龄增长导致的，或由PP2A活性和/或表达降低导致的。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述精神障碍选自认知障碍、情感障碍和/或行为障碍。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述精神障碍其表型为对外界反应能力变弱、对新事物探索能力变弱、易激惹、焦虑、抑郁、社交能力下降、认知功能减退、学习能力下降或记忆能力下降。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物为小分子化合物或生物大分子。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物选自ABT263，引起PP2A活性和/或表达下降的化合物，引起p53活性和/或表达下降的化合物，以及引起p21活性和/或表达下降的化合物。
7.一种防治有需要的受试者的精神障碍的方法，其特征在于，包括向所述受试者施用清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述精神障碍是DNA损伤累积和/或神经细胞衰老增加介导的精神障碍，所述DNA损伤累积和/或神经细胞衰老增加是由正常年龄增长导致的，或由PP2A活性和/或表达降低导致的。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述精神障碍选自认知障碍、情感障碍和/或行为障碍。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述清除衰老细胞和/或溶解衰老细胞和/或抑制细胞衰老的化合物选自ABT263，引起PP2A活性和/或表达下降的化合物，引起p53活性和/或表达下降的化合物，以及引起p21活性和/或表达下降的化合物。
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