CN113637049A - 一种缺血心肌靶向的线粒体导向肽复合物的制备与应用 - Google Patents

一种缺血心肌靶向的线粒体导向肽复合物的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种缺血心肌靶向的线粒体导向肽复合物的制备与应用，属于生物医药技术领域。本发明将线粒体识别分子和缺血心肌细胞靶向肽结合，并与活性线粒体反应形成线粒体‑TPP+CSTSMLKAC复合物，通过静脉移植治疗缺血性心肌损伤；导向肽CSTSMLKAC可将线粒体导向心肌缺血区域，受损心肌细胞通过摄取外源线粒体增强自身能量代谢，改善心肌能量依赖的心肌细胞的机械收缩与舒张功能，抑制心肌细胞凋亡引起的损伤，延缓心衰的发生；线粒体‑TPP+CSTSMLKAC复合物静脉移植后可缓解心功能障碍。通过静脉移植线粒体能够显著简化线粒体移植途径，降低线粒体移植应用成本，具有重要的临床推广与应用价值。

Description

一种缺血心肌靶向的线粒体导向肽复合物的制备与应用
技术领域
本发明涉及一种缺血心肌靶向的线粒体导向肽复合物的制备与应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
线粒体对细胞的稳态和功能的维持具有重要的作用。作为一种高耗氧的细胞器，线粒体功能障碍将直接影响细胞功能最终导致器官功能损伤。心脏作为一种具有高能需求的器官对线粒体具有更强的依赖性。线粒体在心肌细胞中所占的30％的比例也从发育或者进化角度说明线粒体对于心肌细胞的重要性。线粒体每天能产生30公斤的ATP来维持正常的心脏机械功能。线粒体通过氧化磷酸化为心肌细胞收缩舒张功能提供保障。线粒体结构和功能障碍，主要表现为线粒体体积膨胀，脊面积增加，同时线粒体基质的体积也会增加，此外，线粒体电子传递链复合物活性降低，线粒体内钙累积增加，伴随着这些变化线粒体DNA转录调节功能也会下降。因此对心肌损伤后线粒体的及时补充及其功能的修复，能缓解以上这些因素导致的心肌损伤。
目前已经证实线粒体保护分子乙醛脱氢酶2(ALDH2)活化在线粒体移植治疗过程中发挥着重要作用。线粒体移动的靶向性是推进线粒体移植临床应用面临的关键问题。实现心肌细胞更有效地摄取外源线粒体，血液是最好的媒介，因此静脉注射是最优的选择。那么外源线粒体在血液中是否可以存活，并直接到达作用靶点？三苯基磷(TPP+)是线粒体的特异性靶向分子，利用TPP+能够有效将探针，抗氧化剂和药物基团等传递到线粒体，在生物学系统中，TPP+结合基团同时具备亲水和亲脂性，并且纯化合成简单，不易与细胞内成分发生化学反应，因此TPP+基础的修饰能够加速该研究背景下的线粒体靶向性。因此，可将TPP+作为线粒体有效的识别分子。那么如何实现线粒体静脉注射后到心肌细胞的靶向性。有研究显示导向肽CSTSMLKAC序列能够有效的识别缺血的心脏组织，可以作新的分子工具通过与TPP+连接进而与线粒体结合，通过全身静脉注射将生物活性线粒体输送到损伤心肌。借助生物材料靶向性移动的线粒体，从能量代谢角度治疗心衰。
发明内容
本发明的目的是为解决如何实现心肌细胞更有效地摄取外源线粒体的技术问题。
为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种TPP+与导向肽CSTSMLKAC结合的靶向肽，其化学结构如式(I)所示；
Figure BDA0003206712150000021
本发明提供一种线粒体导向肽复合物，包括TPP+、导向肽CSTSMLKAC和线粒体；TPP+、导向肽CSTSMLKAC和线粒体结合形成线粒体-TPP++CSTSMLKAC导向肽复合物。
本发明提供一种线粒体导向肽复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将TPPh3即5-羧基戊基-三苯基溴化磷与心肌导向肽CSTSMLKAC结合，化学合成TPP++CSTSMLKAC导向肽；
步骤2：应用组织线粒体分离试剂盒分离纯化线粒体；
步骤3：将溶解后的TPP++CSTSMLKAC导向肽重悬提纯的线粒体沉淀，避光4℃摇床孵育20分钟，随后4℃静置孵育20分钟使线粒体与TPP++CSTSMLKAC导向肽充分结合，形成线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物，离心后用磷酸盐缓冲液重悬到使用浓度7.5-10×104个/ml线粒体悬液，冰上放置待用。
本发明提供一种TPP+与导向肽CSTSMLKAC结合的靶向肽的应用。
本发明提供一种TPP+与导向肽CSTSMLKAC结合的靶向肽在线粒体靶向移动中的应用。
本发明提供一种线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物在制备治疗和预防线粒体功能障碍的药物中的应用。
本发明提供一种线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物在制备治疗和预防心肌损伤、心衰的药物中的应用，所述心肌损伤包括缺血性心肌损伤。
本发明提供一种线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物在制备缓解心功能障碍，增加心肌能量的药物中的应用。
优选地，所述药物的制剂包括喷雾剂、滴剂和注射剂。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明通过使用TPP+与导向肽CSTSMLKAC连接合成一种新的可与线粒体结合的缺血心肌特异性靶向工具，再将线粒体与该靶向分子体外结合形成线粒体-TPP-CSTSMLKAC聚合物，通过静脉注射包装后的线粒体复合物，导向肽CSTSMLKAC可将线粒体导向心肌缺血区域，受损心肌细胞通过摄取外源线粒体增强自身能量代谢，从而改善心肌细胞的机械收缩与舒张功能，抑制心肌细胞凋亡引起的损伤，延缓心衰的发生。线粒体功能障碍是心肌损伤的始动因素，实施靶向性线粒体移植策略能有效弥补并强化心肌细胞代谢功能，进而通过增加心肌细胞线粒体产能，降低心肌活性氧产生，抑制心肌细胞代谢转变，从而有效增强心室收缩功能，减缓心衰的发生。
本发明将线粒体识别分子和缺血心肌细胞靶向肽结合，并与活性线粒体反应形成线粒体-TPP+CSTSMLKAC复合物，通过静脉移植治疗缺血性心肌损伤；线粒体-TPP+CSTSMLKAC复合物静脉移植缓解心功能障碍，增加心肌能量依赖的收缩与舒张功能的有效性。通过静脉移植线粒体能够显著简化线粒体移植途径，降低线粒体移植应用成本，具有重要的临床推广与应用价值。
附图说明
图1为本发明线粒体-TPP+CSTSMLKAC复合物，通过静脉移植治疗缺血性心肌损伤技术路线示意图。
图2为TPP+CSTSMLKAC靶向肽合成示意图。
图3为小鼠心肌线粒体提取后透射电镜检测纯度分析图。
图4为超声心动图检测线粒体移植后缺血再灌注损伤小鼠心功能的改善效果。
其中A图为小鼠超声心动图,Sham组(假手术组)，IR组(缺血再灌注损伤小鼠组)，IR+PEP-MIO(线粒体移植干预组)；B图为线粒体移植后显著增加缺血再灌注损伤小鼠心脏左室射血分数(EF增加17.17％)。C图为线粒体移植后显著增加缺血再灌注损伤小鼠心脏短轴缩短率(FS增加10.87％)。*p<0.05，**p<0.01。
图5为线粒体移植对缺血再灌注损伤小鼠心脏梗死面积Evans blue/TTC染色评估图。
线粒体移植后显著降低缺血再灌注损伤小鼠心脏梗死面积；
白色为心肌梗死区(不能被Evans blue和TTC染液染色)，红色为心肌缺血区(不能被Evans blue但能被TTC染色)，蓝色为非缺血区(被Evans blue和TTC染液染色)。
图6为冰冻切片免疫荧光分析图。
检测到线粒体的绿色荧光图。结果证实线粒体能够有效定位到缺血心肌。DAPI:定位细胞核；GFP:线粒体特异性定位的绿色荧光蛋白；cTnT:心肌肌钙蛋白T。
图7为线粒体静脉移植对缺血再灌注损伤小鼠心肌凋亡蛋白分析图。
缺血再灌注损伤小鼠心肌凋亡蛋白C-C3表达显著上调，线粒体导向肽静脉移植后显著降低C-C3在缺血再灌注损伤小鼠心肌的表达。图中C-C3:cleaved-caspase 3(活化的凋亡蛋白)；β-Actin:内参蛋白。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：
本发明提供一种TPP+与导向肽CSTSMLKAC结合的靶向肽，其化学结构如式(I)所示；
Figure BDA0003206712150000041
本发明提供一种线粒体导向肽复合物，包括TPP+、导向肽CSTSMLKAC和线粒体；TPP+、导向肽CSTSMLKAC和线粒体结合形成线粒体-TPP++CSTSMLKAC导向肽复合物。
本发明提供一种线粒体导向肽复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将TPPh3即5-羧基戊基-三苯基溴化磷与心肌导向肽CSTSMLKAC结合，化学合成TPP++CSTSMLKAC导向肽；
步骤2：应用组织线粒体分离试剂盒分离纯化线粒体；
步骤3：将溶解后的TPP++CSTSMLKAC导向肽重悬提纯的线粒体沉淀，避光4℃摇床孵育20分钟，随后4℃静置孵育20分钟使线粒体与TPP++CSTSMLKAC导向肽充分结合，形成线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物，离心后用磷酸盐缓冲液重悬到使用浓度7.5-10×104个/ml线粒体悬液，冰上放置待用。
本发明提供一种TPP+与导向肽CSTSMLKAC结合的靶向肽的应用。
本发明提供一种TPP+与导向肽CSTSMLKAC结合的靶向肽在线粒体靶向移动中的应用。
本发明提供一种线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物在制备治疗和预防线粒体功能障碍的药物中的应用。
本发明提供一种线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物在制备治疗和预防心肌损伤、心衰的药物中的应用，所述心肌损伤包括缺血性心肌损伤。
本发明提供一种线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物在制备缓解心功能障碍，增加心肌能量的药物中的应用。
上述药物的制剂包括喷雾剂、滴剂和注射剂。
发明的目的是将线粒体与心肌靶向肽体外结合形成线粒体-TPP-CSTSMLKAC聚合物，通过静脉注射实施包装后的线粒体移植，导向肽CSTSMLKAC可将线粒体导向心肌缺血区域，从而被心肌细胞摄取，改善缺血心肌细胞的能量代谢和机械收缩与舒张功能，延缓心衰的发生。
实验验证过程：
本发明通过应用线粒体分离试剂盒(碧云天生物技术有限公司，C3606)将心肌经酶消化，线粒体分离试剂重悬后适当研磨，600g 4℃离心10分钟，取上清，转移到新的EP管中，继续离心(11000g,10min)获得的纯化线粒体备用。
TPP+CSTSMLKAC导向肽复合物按照10mg/ml的浓度用磷酸盐缓冲液溶解，用溶解后的TPP+CSTSMLKAC导向肽重悬提纯的线粒体沉淀，避光4℃摇床孵育20分钟，随后4℃静置孵育20分钟使线粒体与TPP+CSTSMLKAC导向肽充分结合，形成线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物，离心后用磷酸盐缓冲液重悬到使用浓度(7.5-10×104个/ml)，备用。
最后制备小鼠的心肌缺血再灌注损伤模型(缺血45min,再灌注24小时)，与缺血时尾静脉注射200微升线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物(7.5-10×104个/ml)，缺血再灌注损伤组只注射相同体积的PBS，对照组实施假手术。灌注24小时后行超声心动图检测小鼠心脏功能，免疫荧光检测移植后线粒体的定位，Evans blue/TTC染色检测小鼠心肌的梗死面积。
实施例
如附图1：为本发明线粒体-TPP+CSTSMLKAC复合物，通过静脉移植治疗缺血性心肌损伤技术路线示意图。
1.将TPPh3(TPPh3＝5-羧基戊基-三苯基溴化磷)与心肌导向肽CSTSMLKAC结合化学合成TPP+CSTSMLKAC导向肽，按着10mg/ml用PBS溶解制备TPP+CSTSMLKAC导向肽悬液。
2.获取线粒体特异性绿色荧光小鼠的心肌，应用组织线粒体分离试剂盒分离纯化线粒体(碧云天生物技术有限公司，C3606)，用溶解后的TPP+CSTSMLKAC导向肽重悬提纯的线粒体沉淀，避光4℃摇床孵育20分钟，随后4℃静置孵育20分钟使线粒体与TPP+CSTSMLKAC导向肽充分结合形成：线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物，离心后用磷酸盐缓冲液重悬到使用浓度7.5-10×104个/ml线粒体悬液，冰上放置待用。以上皆为无菌操作。
3.尾静脉移植200微升线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物悬液后，给予胸部脱毛处理的成年C57BL/6小鼠2％的异氟烷气体以麻醉小鼠，左胸开胸后用止血钳将胸大肌与胸小肌分离暴露心脏，挤出心脏，使用6-0丝线对其前左降支进行活结结扎缺血45min，随后解开结扎线实施心肌再灌注24小时。再灌注24小时后行超声心动图检测小鼠心脏功能，组织病理学检测小鼠心肌结构变化，免疫荧光检测移植后线粒体的定位，Evans blue/TTC染色检测小鼠心肌的梗死面积。
如图1所示，为本发明线粒体-TPP+CSTSMLKAC复合物，通过静脉移植治疗缺血性心肌损伤技术路线示意图。
如图2所示，为TPP+CSTSMLKAC靶向肽合成示意图。
如图3所示，为小鼠心肌线粒体提取后透射电镜检测纯度分析图。
如图4所示，为超声心动图检测线粒体移植后缺血再灌注损伤小鼠心功能的改善效果。其中A图为小鼠超声心动图,Sham组(假手术组)，IR组(缺血再灌注损伤小鼠组)，IR+PEP-MIO(线粒体移植干预组)；B图为线粒体移植后显著增加缺血再灌注损伤小鼠心脏左室射血分数(EF增加17.17％)。C图为线粒体移植后显著增加缺血再灌注损伤小鼠心脏短轴缩短率(FS增加10.87％)。*p<0.05，**p<0.01。
如图5所示，为线粒体移植对缺血再灌注损伤小鼠心脏梗死面积Evans blue/TTC染色评估图。线粒体移植后显著降低缺血再灌注损伤小鼠心脏梗死面积；其中白色为心肌梗死区(不能被Evans blue和TTC染液染色)，红色为心肌缺血区(不能被Evans blue但能被TTC染色)，蓝色为非缺血区(被Evans blue和TTC染液染色)。
如图6所示，为冰冻切片免疫荧光分析图。从中检测到线粒体的绿色荧光图。结果证实线粒体能够有效定位到缺血心肌。图中DAPI:定位细胞核；GFP:线粒体特异性定位的绿色荧光蛋白；cTnT:心肌肌钙蛋白T。
如图7所示，为线粒体静脉移植对缺血再灌注损伤小鼠心肌凋亡蛋白分析图。其中缺血再灌注损伤小鼠心肌凋亡蛋白C-C3表达显著上调，线粒体导向肽静脉移植后显著降低C-C3在缺血再灌注损伤小鼠心肌的表达。图中C-C3:cleaved-caspase 3(活化的凋亡蛋白)；β-Actin:内参蛋白。
对于临床上的缺血性心血管病患者实施线粒体心肌靶向静脉移植能够保障心肌供能，抑制线粒体功能障碍引起的心肌细胞损伤，从而改善心肌收缩舒张功能，降低再灌注损伤，抑制心衰发生。
线粒体对细胞的稳态和功能的维持具有重要的作用。缺血导致线粒体一定程度的损伤，缺血引起线粒体代谢物累积激活再灌注时的活性氧大量产生，进一步损伤线粒体功能。线粒体作为一种高耗氧高产能细胞器。线粒体的功能损伤直接影响正常的心脏机械功能。此外，线粒体还可以通过调节离子浓度，通过线粒体自噬，线粒体相关的凋亡信号产生引起心肌细胞损伤并走向死亡。
由此可见线粒体功能障碍引起的功能不足是心肌损伤各方面信号调控的主要靶点，基于这一点，本发明通过外源补充线粒体能够有效缓解缺血再灌注心肌损伤。本发明涉及线粒体-TPP+CSTSMLKAC复合物的制备与静脉移植，方法真实可靠，并且该研究结果已证实线粒体-TPP+CSTSMLKAC复合物静脉移植确实能有效定位心肌，改善缺血再灌注损伤。本发明提供使用的线粒体-TPP+CSTSMLKAC复合物制备条件成熟，线粒体移植后的心肌功能改善效果明，具有重要的临床转化意义。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种TPP+与导向肽CSTSMLKAC结合的靶向肽，其特征在于,其化学结构如式(I)所示；
Figure FDA0003206712140000011
2.一种线粒体导向肽复合物，其特征在于,包括TPP+、导向肽CSTSMLKAC和线粒体；TPP+、导向肽CSTSMLKAC和线粒体结合形成线粒体-TPP++CSTSMLKAC导向肽复合物。
3.一种线粒体导向肽复合物的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：
步骤1：将TPPh3即5-羧基戊基-三苯基溴化磷与心肌导向肽CSTSMLKAC结合，化学合成TPP++CSTSMLKAC导向肽；
步骤2：应用组织线粒体分离试剂盒分离纯化线粒体；
步骤3：将溶解后的TPP++CSTSMLKAC导向肽重悬提纯的线粒体沉淀，避光4℃摇床孵育20分钟，随后4℃静置孵育20分钟使线粒体与TPP++CSTSMLKAC导向肽充分结合，形成线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物，离心后用磷酸盐缓冲液重悬到使用浓度7.5-10×104个/ml线粒体悬液，冰上放置待用。
4.如权利要求1所述的一种TPP+与导向肽CSTSMLKAC结合的靶向肽在非诊断方法和非治疗方法上的应用。
5.如权利要求1所述的一种TPP+与导向肽CSTSMLKAC结合的靶向肽在线粒体靶向移动中非诊断方法和非治疗方法上的应用。
6.如权利要求2所述的一种线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物在制备治疗和预防线粒体功能障碍的药物中的应用。
7.如权利要求2所述的一种线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物在制备治疗和预防心肌损伤、心衰的药物中的应用，其特征在于：所述心肌损伤包括缺血性心肌损伤。
8.如权利要求2所述的一种线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物在制备缓解心功能障碍，增加心肌能量的药物中的应用。
9.如权利要求6-8中任一项所述的一种线粒体-TPP-CSTSMLKAC导向肽复合物的应用,其特征在于：所述药物的制剂包括喷雾剂、滴剂和注射剂。
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