CN113613644A - 胃肠疾病及其症状的治疗 - Google Patents

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Abstract

本文公开了减轻患有炎性肠病(IBD)的受试者的肠道中的炎症和慢性疼痛的方法。特别公开的是施用无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref‑1)抑制剂APX3330的方法，APX3330阻断APE1并调节参与炎症的转录因子(TF)，从而减轻炎症或慢性疼痛。

Description

胃肠疾病及其症状的治疗
相关申请的交叉到用
本申请要求于2018年12月17日提交的美国临时申请第62/780,574号和于2019年6月18日提交的美国临时申请第62/862,808号的优先权，两者均通过引用整体并入本文。
背景技术
本公开大体上涉及降低神经元敏感性从而减轻肠道中的炎症和慢性疼痛的方法。特别地，本文已经发现，通过阻断APE1途径，经由施用无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂(例如APX3330)，调节参与胃肠道炎症的转录因子(TF)，从而减轻患有胃肠道疾病，特别是炎性肠病(IBD)的受试者的肠道中的炎症或慢性疼痛。
肠神经系统(ENS)控制或调节重要的胃肠功能，包括运动性、分泌、局部免疫和炎症，并且代表了大脑外最大的自主神经元集合。涉及ENS的疾病(例如，炎性肠病(IBD))是全世界造成健康负担的常见和主要因素。
炎性肠病(IBD)与ENS的损伤有关，其特征是导致复发性腹泻和腹痛的小肠和/或结肠的慢性严重炎症。克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是IBD的两种主要临床病理亚型。尽管二者都是慢性和复发性肠炎性疾病，但它们可以通过胃肠道中的炎症位置和肠壁中组织学改变的性质来进行区分。从解剖学上讲，CD可以影响从口腔到肛门的整个胃肠道，虽然它通常会影响末端回肠和结肠。UC则限于直肠、结肠和盲肠。在显微镜下，CD是透壁的并且通常是不连续的，而UC仅以连续模式影响肠粘膜。
由于与炎症症状相关的疲劳以及由于患者经受的慢性疼痛，IBD是一种非常致残的疾病。目前约有160万美国人患有IBD，自2011年以来增加了约200,000人。IBD的发病机制仅被部分了解；涉及各种环境和宿主(例如，遗传、上皮、免疫和非免疫)因素。免疫系统、肠道共生细菌/病原体和宿主基因型之间复杂的相互作用被认为是IBD发展的基础。这些复发性慢性炎症似乎是由针对环境因素和/或寄生在遗传上易感宿主远端回肠和结肠的共生细菌/病原体亚群的过度侵袭性T细胞反应引起的。
在IBD中，基因易损性(genetic vulnerability)的存在导致肠道抗原向效应细胞的识别和呈递中断。随之而来的不适当适应性免疫反应导致对共生菌的耐受性丧失以及对肠道病原体的炎症反应的放大和维持，尤其是在免疫系统薄弱的CD中。与炎症相同，免疫细胞在肠粘膜和神经末梢附近的浸润导致肠道神经免疫直接接触。这些相互作用导致内脏传入的激活，这是继炎症后慢性腹痛发展的第一步。
目前，对于被诊断为功能性胃肠病(如IBD)的患者，尚无治愈方法或有效治疗方法。目前IBD治疗的主要目标是通过关注症状来诱导临床缓解，然后长期维持，以实现最佳的可获得的生活质量。由于目前的疗法疗效有限，用于治疗患有IBD的受试者肠道中的炎症和慢性疼痛的新疗法具有临床意义。因此，本公开提供了对减轻炎症和/或慢性疼痛的途径的思考。进一步地，本公开提供了一种化合物APX3330，以降低神经元敏感性和氧化应激，从而减轻肠道中的炎症和慢性疼痛。
发明内容
本公开大体上涉及调节参与肠道炎症的转录因子(TF)的方法，从而减轻患有胃肠疾病，特别是诸如IBD的疾病的受试者的肠道中的炎症和慢性疼痛。特别地，本文已经发现，通过阻断APE1，经由施用APX3330(和/或其类似物)，在APE1氧化还原控制下诸如STAT3、AP-1、NFκB等TF受到调节，从而降低神经元对炎症介质的敏感性并且减轻患有胃肠疾病(例如，胃肠(GI)道炎症、刺激性肠、未定型结肠炎(IC)、功能性GI疾病、炎性肠病(IBD)和对肠神经系统(ENS)的影响)的受试者的肠道中的炎症和慢性疼痛。此外，这些GI疾病被认为是结直肠癌(CRC)的前兆，使得APX3330不仅可以缓解GI疾病，还可以预防CRC。
此外，氧化应激在参与炎症诱导的肠神经元缺失和损伤(即肠神经病变)的病理生理机制中起着重要作用。无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1/氧化还原因子-1(APE1/Ref-1)是一种重要的双重功能蛋白，其作为细胞对氧化应激反应的重要调节剂。
基于上述内容，在一个方面，本公开涉及治疗患有功能性胃肠疾病的受试者的炎症和慢性疼痛的方法，该方法包括向受试者施用有效量的无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
在另一个方面，本公开涉及减少患有功能性胃肠疾病的受试者的神经元缺失的方法，该方法包括向受试者施用有效量的无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
在又一个方面，本公开涉及增强患有功能性胃肠疾病的受试者的神经发生的方法，该方法包括向受试者施用有效量的无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物，其选择性抑制APE1的氨基末端部分。
在又一个方面，本公开涉及在有需要的受试者中保护肠肌和肠神经元的方法，该方法包括向受试者施用有效量的无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
附图说明
当考虑以下对其的详细描述时，将更好地理解本公开，并且除了上述那些之外的特征、方面和优点将变得清楚。此类详细描述参考以下附图，其中：
图1A-1C显示了Winnie小鼠的疾病活动，其用作IBD的鼠模型。图1A描绘了在对照、Winnie-Sham和Winnie-APX3330处理的小鼠中相对于处理前的初始体重的体重减轻或增加。图1B描绘了由直肠脱垂伴随血管增生和水肿的存在所指示的肠道炎症的严重程度。在对照、Winnie-Sham和Winnie-APX3330处理的小鼠处理第14天拍摄图像。图1C描绘了在14天期间反复处理后的粪便含水量。排出粪球后立即测量新鲜粪球的湿重。然后将粪球在室温下脱水过夜并测量干重。粪便含水量以湿重和干重之间的差值计算。
图2A-2E显示了如实施例中分析的硫酸钡的胃肠通过。图2A描绘了对照、Winnie-Sham和Winnie-APX3330处理的小鼠中的胃肠通过时间，在口服灌胃硫酸钡灌胃给药后通过体内X射线成像测量，第一小时每5分钟获得一次，对于第二小时每10分钟获得一次，最后一小时每20分钟获得一次。一旦小鼠排出含有硫酸钡的粪球，就停止X射线成像。图2B描绘了硫酸钡从胃移动到盲肠的通过时间(分钟)(口-盲肠通过时间(OCTT))。图2C描绘了硫酸钡从盲肠移动到肛门的通过时间(分钟)(结肠通过时间(CTT))。图2D描绘了通过CTT和OCTT之差计算的盲肠保留时间。图2E描绘了总通过时间，其以从灌胃给药硫酸钡到排出含有硫酸钡的粪球的时间计算。
图3A-3D显示了如实施例中分析的Winnie小鼠的结肠收缩活动。在从对照、Winnie-Sham和Winnie-APX3330处理的小鼠切除的整个结肠中结肠运动的离体分析。图3A描绘了描绘全长结肠的结肠收缩(红色通道)和结肠松弛(蓝色通道)的时空图的示例。图3B描绘了相对于结肠总长度的结肠收缩长度。图3C描绘了相对于结肠总长度的短收缩长度(＜结肠长度的50％)。图3D描绘了相对于结肠总长度的结肠迁移运动复合体的长度(＞结肠长度的50％)。
图4A-4C显示了如实施例中分析的Winnie小鼠的结肠平滑肌细胞。图4A描绘了通过用DAPI复染的抗平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体免疫标记的来自对照、Winnie-Sham和Winnie-APX3330处理的小鼠的结肠横切面。在结肠的环状肌层内分析平滑肌细胞。比例尺＝50μm。图4B描绘了与对照C57BL/6(n＝5)和Winnie-APX3330处理的(n＝5)小鼠相比，在Winnie-sham处理的(n＝5)小鼠中观察到的死亡的α-SMA-IR细胞的大小。图4C描绘了在对照C57BL/6(n＝5)、Winnie-sham处理的(n＝5)和Winnie-APX3330处理的(n＝5)小鼠中计数的环状肌内的α-SMA-IR细胞数。当与对照C57BL/6相比时，数据表示为平均值±SEM，**P＜0.01，****P＜0.0001；当与Winnie-sham处理的小鼠相比时，^^^^P＜0.0001。
图5A和5B显示APX3330处理改善了Winnie小鼠的神经纤维密度。图5A显示了通过使用标记物β-微管蛋白(III)(紫色通道)抗体进行免疫荧光染色的神经元微管蛋白，以在横切面中鉴定神经支配结肠的神经纤维处理。图5B描绘了对照C57BL/6(n＝9)、Winnie-sham处理的(n＝8)小鼠和Winnie-APX3330处理的(n＝5)小鼠中标准化为结肠厚度的β-微管蛋白(III)-IR神经纤维的密度。当与对照C57BL/6相比时，数据表示为平均值±SEM，****P＜0.0001；当与Winnie-sham处理的小鼠相比时，^^^P＜0.001。
图6A-6D描绘了如在实施例中分析的Winnie小鼠的形态学变化。图6A描绘了在来自对照、Winnie-Sham和Winnie-APX3330处理的小鼠的结肠横切面中通过H&E染色分析的总体形态学变化。图6B描绘了在来自对照、Winnie-Sham和Winnie-APX3330处理的小鼠的结肠横切面中通过阿尔新蓝(A1cian Blue)染色分析的杯状细胞密度(Goblet cell density)。图6C基于以下参数描述了结肠形态学损伤的组织学评分：腺窝(crypt)结构的变化(0-5)、腺窝长度的减少(0-5)、粘膜溃疡(0-5)和免疫细胞浸润(0-5)(总分20)。图6D描绘了在横切面的远端结肠粘膜中测定的杯状细胞密度。当与对照C57BL/6相比时，数据表示为平均值±SEM，**P＜0.014，***P＜0.001，****P＜0.0001；当与Winnie-sham处理的小鼠相比时，^^P＜0.01，^^^^P＜0.0001。
图7A和7B显示了如实施例中分析的Winnie小鼠的肠通透性和炎症。图7A描绘了在第14天对所有处理组通过血清中脂肪酸结合蛋白1(FABP1)的水平测量的肠通透性。图7B是通过在第14天测量来自对照、Winnie-Sham和Winnie-APX3330处理的小鼠的粪便样品中的粪便脂质运载蛋白(Lcn)-2水平来评估结肠炎症。
图8A和8B描绘了APX3330处理对Winnie小鼠肠肌神经丛中神经胶质细胞密度的影响。图8A描绘了在来自对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的小鼠的肠肌神经丛中用针对GFAP(橙色通道)的免疫荧光标记物染色的神经胶质细胞。(比例尺＝100μm)。图8B描绘了在对照C57BL/6(n＝5)、Winnie-sham处理的(n＝5)和Winnie-APX3330处理的小鼠(n＝4)中相对于神经节大小的GFAP-IR神经胶质细胞的密度。当与对照C57BL/6相比时，数据表示为平均值±SEM，**P＜0.01：当与Winnie-sham处理的小鼠相比，^P＜0.05。
图9A和9B显示了来自如实施例中分析的来自Winnie小鼠的肠肌神经元。图9A描绘了在结肠整体制备物中通过抗微管相关蛋白2(MAP2)抗体对肠肌神经元的免疫标记，暴露对照、Winnie-Sham和Winnie-APX3330处理的小鼠的肠肌神经节。比例尺＝50μm。图9B描绘了肠肌神经节中的MAP2-免疫反应性神经元。
图10A和10B描绘了对Winnie小鼠肠肌神经丛中超氧化物产生的APX3330处理。图10A显示了远端结肠的LMMP制备物用指示氧化应激的免疫荧光标记物MitoSOX(红色通道)染色。与对照C57BL/6(n＝4)相比，在Winnie-sham处理的神经节(n＝4)中Mitosox的表达明显增加。这在Winnie-APX3330处理的(n＝4)小鼠中有所缓解(比例尺＝100μm)。图10B描绘了相对于神经节面积评估的MitoSOX荧光强度的量化。当与对照C57BL/6相比时，数据表示为平均值±SEM，****P＜0.0001；当与Winnie-sham处理的小鼠相比时，^^^^P＜0.0001。
图11A和11B描绘了对Winnie小鼠肠肌神经丛中HMGB1易位的APX3330处理。图11A描绘了在肠肌神经丛中与DAPI(蓝色通道)共定位的HMGB1-IR细胞(绿色通道)。与对照C57BL/6相比，在Winnie-sham处理的(n＝4)中观察到核HMGB1-IR向胞质溶胶的Retniret易位(n＝5)。Winnie-APX3330处理的小鼠(n＝4)中避免了HMGB1的易位(比例尺＝100μm)。图11B描绘了在肠肌神经节中量化的HMBG1-IR细胞的易位。当与对照C57BL/6相比时，数据表示为平均值±SEM，**P＜0.01：当与Winnie-sham处理的小鼠相比时，^^P＜0.01。
图12A-12C显示了Winnie小鼠的肠肌神经丛中APE1的表达。图12A描绘了来自对照、Winnie-Sham和Winnie-APX3330处理的小鼠的结肠整体制备物中肠肌神经丛内的无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶(APE1)免疫反应性。比例尺＝50μm。图12B描绘了通过Image J软件分析的肠肌神经节内APE1免疫反应性的密度。图12C描绘了肠肌神经节内APE1-免疫反应性神经元的比例。
图13A-13C显示了如在实施例中分析的Winnie小鼠肠肌神经元中的DNA损伤。图11A描绘了在结肠整体制备物中通过抗微管相关蛋白2(MAP2)抗体和抗DNA损伤(氧代-8-dG((8-氧代-7，8-二氢-2′-脱氧鸟苷)(Oxo-8-dG((8-Oxo-7，8-dihydro-2′-deoxyguanosine)))抗体的肠肌神经元的共免疫标记，暴露来自对照、Winnie-Sham和Winnie-APX3330处理的小鼠的肠肌神经节。比例尺＝50μm。图11B描绘了通过Image J软件分析的肠肌神经节内Oxo-8-dG-免疫反应性的密度。图11C描绘了肠肌神经节中DNA损伤神经元相对于MAP2免疫反应性神经元总数的比例。
图14A和14B描绘了APX3330处理对Winnie小鼠远端结肠中炎症和氧化基因调节子的影响。特别地，图14A和14B显示了汇集的远端结肠(对照C57BL/6，n＝6；Winnie-sham处理，n＝6和Winnie-APX3330，n＝6)样品的RNA测序，确定了APX3330处理对炎症和氧化应激标记物的上调表达的功效。Winnie-sham处理的动物测量到S100a8、Khdc1a、Lrg1、Retnlb、Nos2、Ido1和REG3B的倍数变化增加。相对于对照C57BL/6小鼠，在Winnie小鼠中的APX3330处理导致这些RNA表达的显著下调(倍数变化＞±2)。
具体实施方式
除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文中描述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料，但是优选的方法和材料描述如下。
本公开大体上涉及减轻患有功能性胃肠疾病并且特别是诸如IBD的疾病的受试者的肠道中的炎症和慢性疼痛的方法。特别地，本文已经发现，通过阻断APE1，经由施用APX3330(和/或其类似物)，参与炎症的转录因子(TF)被调节，从而减轻肠道中的炎症或慢性疼痛。此外，由于APE1/Ref-1是一种作为细胞对氧化应激的重要调节剂的双重功能蛋白，该应激在参与炎症诱导的肠道神经元缺失和损伤的病理生理机制中起着重要作用，通过施用APX3330阻断APE1来进一步降低了氧化应激，从而进一步减轻炎症和慢性疼痛。
更特别地，ENS是自主神经系统的一个分支，其具有内在肠神经元，在无需中枢神经系统的协助的情况下控制胃肠(GI)功能。ENS由大约2-6亿个神经元构成，相当于脊髓。ENS包含位于在肠神经节内的胃肠道的神经元和神经胶质细胞的复杂网络，形成两个不同的丛：粘膜下神经丛和肠肌神经丛。肠肌神经元主要参与运动功能的协调，而粘膜下神经元主要控制参与血流和吸收的内分泌激素和外分泌激素的分泌。
GI功能由ENS维持稳态。对ENS的损伤与GI功能障碍有关。在具有GI炎症的实验动物模型中，已经证明肠神经病变、神经元形态学损伤和肠过度兴奋的发生。从IBD患者切除的肠组织中的肠肌神经丛炎和粘膜下神经丛炎(丛中的炎症)已被用于预测疾病的术后复发。
由于肠神经元和免疫细胞之间的连接在正常和病理条件下都相关，因此ENS在GI免疫中的作用得到加强。肠神经元和免疫细胞通过免疫和神经介质的产生和释放相互作用。肠神经纤维在淋巴组织和位于胃肠道(GItract)的多层内的免疫细胞中形成连接，建立功能连接。肠神经胶质细胞产生细胞因子和神经递质，其功能是通过细胞因子受体形成神经免疫相互作用。肠神经元显示了由细胞因子和趋化因子组成的可溶性免疫介质的受体，相比之下，免疫细胞具有神经肽的受体。
此外，肠神经元已被证明会产生包括白细胞介素8(IL-8)在内的促炎细胞因子。由炎性细胞因子驱动的神经元电生理活动改变GI运动性和神经控制的分泌功能，因为它们容易受到免疫和神经免疫相互作用的折衷调节。了解炎症条件下的神经免疫相互作用对于延长缓解至关重要，使ENS成为开发未来疗法的理想目标。
肠道炎症引起的ENS损伤与折衷的GI抗氧化能力有关。研究表明，化疗和糖尿病引起的氧化应激会导致肠神经病变。研究炎症条件下的氧化应激将包括深入了解IBD的发病机制和治疗方法。
APE1/Ref-1作为双重功能分子，包含氧化还原活性域和DNA修复域。APE1/Ref-1氧化还原活性域调节细胞应激反应、血管生成、炎症和增殖。在氧化应激中，由APE1/Ref-1经由促存活信号通过减弱促凋亡肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号传导来控制NO水平和细胞分化。
在合适的实施方案中，本公开包括向有需要的受试者施用有效量的APE1抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物，APE1抑制剂能够与APE1蛋白相互作用，从而导致APE1蛋白解折叠在APE1的氨基末端部分，抑制APE1与神经元中其他蛋白质相互作用或执行其氧化还原信号传导功能的能力。更特别地，本公开中所使用的APE1抑制剂具有抗炎作用，阻断APE1/Ref-1将NF-κB和AP-1从氧化态转化为还原态的能力，从而改变它们的转录活性。这些抑制剂已被证明抑制小鼠巨噬细胞中促炎细胞因子和炎症介质的产生。这导致NF-κB和AP-1无法与其目标DNA序列结合。此外，所述抑制允许直接下调炎性细胞因子分泌和ROS激活。
由于研究表明了炎症诱导的神经元敏感性变化的逆转，因此靶向APE1/Ref-1氧化还原途径的特异性抑制并利用DNA修复域可以导致可能的IBD和肠神经病治疗。
因此，在特别合适的实施方案中，APE1抑制剂具有下式：
Figure BDA0003170718520000061
其中R1选自于由烷基、烷氧基、羟基和氢组成的组；R3和R6独立地选自于由取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基和氧代组成的组；R4和R5独立地选自于由烷氧基和芳基组成的组，或R4和R5两者一起形成取代或未取代的萘醌；
X选自于由CH＝CR2和NCH组成的组，其中R2选自于由C1-C10烷基和CF3CH2CH2组成的组；并且
Y选自于由N(Rz)R2或NR^OR^组成的组，其中每个Rz独立地选自于由C1-C6烷基、杂烷基、环烷基和环杂烷基、直链或支链或任选取代的、或Rz和R2与连接的氮一起形成任选取代的杂环；其中每个R^独立地选自于由氢、烷基、杂烷基、环己基和环杂烷基组成的组，其中每个基团被任选地取代，或两个R^与连接的氮和氧一起形成任选取代的杂环。
特别合适的APE1抑制剂包括3-[(5-(2，3-二甲氧基-6-甲基1，4-苯醌基)]-2-壬基-2-丙酸(3-[(5-(2，3-dimethoxy-6-methyl1，4-benzoquinoyl)]-2-nony1-2-proprionic acid)，(以下称为“E3330”或“3330”或“APX3330”)，和/或其类似物(例如，[(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N，N-二乙基戊酰胺](以下称为“APX2009”)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N，N-二甲基戊酰胺](以下称为“APX2007”)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](以下称为“APX2014”)、(2E)-2-(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)-N，N，2-三甲基丙-2-烯酰胺](以下称为“APX2032”)。其他合适的类似物如下文和表1中所示。有关APX3330的进一步信息可以参见Abe等人的美国专利第5,210,239号，有关APX2009的信息可以参见Kelley等人，J Pharmacol Exp Ther.，2016年11月，359(2)：300-309，各自均通过引用以与本文一致的程度并入本文。
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在本文中已经发现，APX3330(和/或其类似物)的施用抑制APE1蛋白与神经元中的其他蛋白相互作用。这种相互作用抑制通过还原氧化机制阻断转录因子(TF)的激活。TF激活的阻断导致其与参与炎症的基因的启动子区域结合相关的功能活性缺失。此外，所述抑制使得APE1自由以在受损DNA中的氧化或脱碱基位点(被炎症和神经元疼痛通路诱导的其他效应子损坏)执行增强的DNA修复功能，从而修复DNA并允许正常细胞功能所需的基因正常活动。因此，该机制是双重的；阻断炎性TF的活性并增强受损DNA的修复，导致肠神经系统(ENS)的神经元细胞的正常功能，该系统控制重要的胃肠功能，例如局部免疫和炎症以及疼痛。
用于本公开的方法的APE1抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物的合适剂量将取决于许多因素，包括例如个体的年龄和体重、炎症或慢性疼痛的严重程度、组合物的性质、给药途径及其组合。最终，本领域技术人员如医师、兽医、科学家和其他医学和研究专业人员可以容易地确定合适的剂量。例如，本领域技术人员可以从低剂量开始，该低剂量可以增加直到达到期望的治疗效果或结果。或者，本领域技术人员可以从高剂量开始，该高剂量可以降低直到达到实现所需治疗效果或结果所需的最小剂量。
在合适的实施方案中，向受试者施用约1.0μM抑制剂至约125μM抑制剂范围内的量的APEl/Ref-1抑制剂，包括约1.0μM至约50μM抑制剂。在一个特定的实施方案中，抑制剂是APX3330，并且向受试者施用约1.0μM至约50μM的量的APX3330。
在一些实施方案中，APE1抑制剂经由包括APE1抑制剂和药学上可接受的载体的组合物进行施用。药学上可接受的载体可以是例如赋形剂、载体、稀释剂及其组合。例如，在组合物是口服给药的情况下，它们可以配制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉末或糖浆剂；或者对于肠胃外给药，它们可以配制成注射剂(肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、玻璃体内)、滴注制剂或栓剂。这些组合物可以通过常规方式制备，并且如果需要，活性化合物(例如，APX3330)可以与任何常规添加剂混合，所述添加剂比如为赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、增溶剂、悬浮助剂、乳化剂、包衣剂或其组合。
应当理解，本公开的药物组合物可以进一步包括用于减轻、介导、预防和治疗本文所述的疾病、紊乱和病症的额外已知的治疗剂、药物、将合成化合物修饰为前药等。例如，在一个实施方案中，APE1抑制剂可以与一种或多种目前用于治疗IBD的治疗剂和药物(例如，5-氨基水杨酸(5-ASA)、皮质类固醇、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、环孢菌素、他克莫司、抗TNF药物(例如英夫利昔单抗、赛妥珠单抗、阿达木单抗和戈利木单抗)、维多珠单抗(vedolizumab)、那他珠单抗、优特克单抗、益生菌、抗生素和抗炎药(例如，氨水杨酸(Asacol HD、Delzicol等)、巴柳氮(Colazal)和奥沙拉秦(Dipentum)等)一起施用。
在本公开的方法中使用的包括APE1抑制剂和/或药物载体的药物组合物可以施用于有需要的个体/受试者的子集。如本文所用，“有需要的受试者”是指处于肠道炎症和/或慢性疼痛的风险中的或患有炎症和/或慢性疼痛的个体，或处于与炎症和/或慢性疼痛相关的疾病或紊乱(例如，功能性胃肠疾病、未定型结肠炎(IC)、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎(UC、克罗恩病(CD)))的风险中的或患有与炎症和/或慢性疼痛相关的疾病或病症的个体。此外，“有需要的受试者”在本文中还用于指处于患有炎性或慢性疼痛的风险中的或被医学专业人员诊断为患有炎性或慢性疼痛的个体。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法针对一般人群的子集，使得在这些实施方案中，并非所有一般人群都可以受益于所述方法。基于前述内容，因为本公开的一些方法实施方案针对所识别个体的特定子集或亚类(即，在解决本文中提到的一个或多个特定情况时“需要”帮助的受试者的子集或亚类)，并非所有个体都落入本文所述的个体子集或亚类的范围内。特别地，有需要的个体是人。有需要的个体也可以是例如研究动物，比如非人灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、牛、猪和在本领域已知的其他类型的研究动物，或家养动物，比如狗、猫和本领域技术人员已知的其他家养动物。
本公开的这些和其他实施方案的各种功能和优点将从以下所示的实施例中被更充分地被理解。实施例旨在说明本公开的益处，但并不举例说明本公开的全部范围。
实施例
在本实施例中，使用名为Winnie的IBD小鼠模型来分析IBD的症状和用APX3330进行处理的效果，模型中自发性慢性结肠炎是由Muc2粘蛋白基因突变引起的原发性肠上皮缺陷导致的。
材料和方法
尽管已经开发了其他慢性肠道炎症模型(例如，IL-10敲除)，但它们中的大多数是环境依赖性的(仅在病原菌存在的情况下才会发生炎症)。此外，与其他模型不同的是，在无病原体条件下，所有Winnie小鼠在6周龄时(年轻成人)会在结肠直肠中发展出轻度自发性炎症；它会随着时间的推移而发展，并在12-16周龄时导致严重的结肠炎。这是由于较薄的粘液层允许肠的通透性增加，从而增强了对通常在肠道内的腔毒素的敏感性。在人类中，Muc2的产生和分泌减少，导致粘膜层变薄和肠的通透性增加。Winnie小鼠(Win/Win)在结肠炎的急性阶段表现出与人类IBD中相似的腹泻(非水样)、溃疡、直肠出血和疼痛的症状。
APX3330(在本文中也称为“E3330”)是根据以前的出版物(例如，J Med Chem.，2010年2月11日；53(3)：1200-1210)合成的，溶解在N，N-二甲基甲酰胺(Sigma-Aldrich)中，并在-80℃下储存为40mM储备液。来自大肠杆菌0111：B4的脂多糖(LPS)购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州)，溶解在MPL中并在-20℃下以50mM储存一个月。重组大鼠CCL2/MCP-1蛋白购自R&D Systems(明尼阿波利斯，明尼苏达州)，溶解在PBS中并在-20℃下储存长达一个月。TLR4拮抗剂LPS-RS购自Invivogen，溶解在MPL中并储存在-80℃下。CCR2拮抗剂RS 504393购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州)，溶解在MPL中并在-20℃下储存一个月。在药物处理前，将储备液稀释在F-12生长培养基中，加至培养物，按指示培养2-96小时。
动物
Winnie小鼠慢性结肠炎模型(12w.o.；15-35g；n＝24)从维多利亚大学威勒比动物所(Victoria University Werribee Animal Facility)(墨尔本，澳大利亚)获得，以确定APX3330对氧化应激机制的有效性。处理过的Winnie小鼠与包括雌性和雄性小鼠在内的对照C57BL/6组(12w.o.；20-30g；n＝12)平行。所有小鼠在接受体内腹膜内(IP)注射之前都适应了3天。所有小鼠都在一个昼夜周期为12小时、温度可控的环境中饲养在西部健康、研究和教育中心(WCHRE，墨尔本，维多利亚，澳大利亚)。所有动物都可以自由地获得食物和水，而仅需要付出最少的努力来减少任何痛苦。本实施例中的所有实验程序均按照澳大利亚国家健康和医学研究委员会(NHMRC)指南进行，并经维多利亚大学动物实验伦理委员会(AEEC)根据动物伦理AEETH 13/001和AEC 17/016批准。
施用APX3330
小分子APE1/Ref-1拮抗剂APX3330经由IP注射在Winnie小鼠中，以25mg/kg(30G针头，最大体积200μl)的剂量进行施用，其溶解在Cremphore(2％)(Sigma-Aldrich)：乙醇(2％)的无菌水中(96％)。在肠道炎症为主的两周时间里，小鼠每天以12小时的间隔接受交替IP注射两次。Winnie-sham处理的小鼠接受了不包括APX3330药物的载体注射。在治疗过程中对所有小鼠进行监测、称重并收集粪球。
胃肠通过
GI通过是经由非侵入性放射学方法获得的。简而言之，对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的小鼠经由口服灌胃法接受硫酸钡给药(2.5mg/mL；最大体积为200μl；X-OPAQUE-HD)。通过HiRay Plus Porta610HF X射线仪(JOC公司，神奈川，日本；50kV，0.3mAs，曝光时间60ms)在硫酸钡给药后(0分钟)立即获得连续X射线，第一个小时每5分钟一次，第二个小时为10分钟，然后每20分钟到250分钟。Fujifilm FCR Capsule XL11并对eFilm 4.2.0软件显影图像进行分析。通过时间(分钟)测量GI通过参数，以确定造影剂穿过整个胃肠道(整个通过时间)、胃到盲肠(口-盲肠通过时间；OCTT)、离开盲肠到肛门(结肠通过时间；CTT)和盲肠保留时间。
肠的通透性评估
在第14天，在收获结肠组织之前，小鼠接受了过量的Lethobarb(1∶16稀释，30G，100μl/20g)IP注射以收集血液。穿刺允许经由26G针头收集最少600μl的血液。血液在冰上保持2小时，在4℃下以12×G离心15分钟，收集血浆并储存在-20℃以用于后续的ELISA实验。Quantikine ELISA(小鼠/大鼠FABP1/L-FABP)(Abcam)测量了脂肪酸结合蛋白(FABP)-1的血清水平。所有样品一式两份重复用于统计值。将检测稀释物RD1-17(50μL)添加到每个孔中，然后加入50μL标准品，10μl从对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的小鼠血清中获得。将板短暂混合，在设置为200±50RPM的水平轨道微孔板振荡器上在室温下孵育2小时。然后在添加100μL小鼠/大鼠FABP1偶联物之前，将每个孔抽吸并用400μL洗涤缓冲液洗涤。样品如上孵育。然后将每个孔抽吸并浸入100μL底物溶液，并在室温避光孵育30分钟，然后加入100μL终止溶液。能够测量450nm处吸光度的酶标仪(校正波长设置为540nm)用于检测血清中的FABP-1蛋白(ng/mL)。
肠道炎症的评估
粪便脂质运载蛋白(Lcn)-2ELISA试剂盒(Abcam)用于检测APX3330对结肠炎症水平的功效。在处理第14天从对照C57BL/6、Winnie-Sham处理的和Winnie-APX3330处理的小鼠收集的粪便样品在PBS-0.1％的吐温(TWEEN)20(100mg/mL)中重组以形成均质的粪便悬浮液。均质悬浮液在4℃下以12000RPM离心10分钟。在澄清的上清液中测定Lcn-2。所有样品一式两份重复用于统计值。将测定稀释物5B(50μL)添加到每个孔中，然后加入50μL标准品、10μl从对照C57BL/6、Winnie-sham处理的或Winnie-APX3330处理的小鼠中获得。将板短暂混合，在设置为400±50RPM的水平轨道微孔板振荡器上在室温下孵育1小时。然后在加入100μL的TMB底物之前，将每个孔抽吸并用350μL洗涤缓冲液洗涤。样品如上孵育。然后将每个孔抽吸并用100μL底物溶液浸泡，并在室温避光孵育10分钟，然后加入100μL终止溶液。能够测量450nm处吸光度的酶标仪(校正波长设置为540nm)用于检测粪便颗粒上清液中的Lcn-2蛋白(pg/mL)。
离体结肠运动性的全器官浴实验
在体外完成结肠运动性实验。从对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的小鼠中去除整个结肠。在用碳气化的(carbogenated)(组分以mM计：NaCl118、KCl4.6、CaCl23.5、MgSO41.2、NAH2PO41、NaHCO325和d-葡萄糖；用95％O2和5％CO2碳气化)×1Krebs溶液浇盖的同时保持在37℃的温度的器官浴中，结肠水平放置并在在口腔和肛门末端插管。口腔插管与装有1×Krebs溶液的储液器连接，该溶液经过调整以保持管腔内压力(0至+2cmH2O)。肛门末端与最大2cmH2O背压的流出管相连。通过放置在器官浴上方的摄像机进行记录，这记录了结肠收缩活动。在增加管腔内压力的情况下进行2×20分钟记录之前，让组织平衡30分钟。使用Scribble v2.0软件将视频转换为时空图，并使用MATLABv2017a软件分析，以评估结肠运动性参数。
组织收集
在充氧的生理盐水中收获远端结肠组织，冲洗粪便内容物并沿肠系膜边界切割。将组织钉在(pinned)衬有Slygard的培养皿(Slygard-lined petri dish)中，粘膜面朝上，并在4℃下用Zamboni’s固定剂(含0.2％苦味酸的2％甲醛)短暂固定过夜。通过使用二甲基亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich，悉尼，澳大利亚)进行一系列洗涤(3×10分钟)，然后使用1×磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤(3×10分钟)，去除Zamboni’s固定剂。组织被处理用于横切面整体纵向肌肉-肠肌制品(LMMP)。对于组织学染色，β-微管蛋白III和α-平滑肌肌动蛋白(SMA)标记的远端结肠组织如上所述被钉住并固定，不拉伸，并储存在50∶50最佳切割温度(OCT)化合物(Tissue Tek，加利福尼亚，美国)中，在液氮冷却的异戊烷和OCT中冷冻，并在-80℃下储存，直到冷冻切片(20μm)到载玻片上进行免疫组织化学(IHC)。对于免疫标记神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白-2(MAP2)、HMGB1和APE1，远端结肠LMMP被拉伸到最大容量而不会在衬有Slygard的培养皿中撕裂，并如上进行固定和洗涤。为了暴露肠肌神经丛，在IHC之前进行去除粘膜、粘膜下层和环状肌。
免疫组织化学和组织学
完成免疫组织化学(IHC)。样品在室温下用10％标准化驴血清(NDS)(MerckMillipore，澳大利亚)孵育一小时，然后在远端结肠横切面和LMMP中用一抗(primary antibody)(表2)标记。切面和制备物用1×PBS(3×10分钟)洗涤，然后用荧光团缀合的二抗(fluorophore-conjugated secondary antibodies)(表2)短暂孵育。所有样品均用4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染色以鉴定免疫反应细胞。组织用荧光封固剂(DAKO，北，悉尼，新南威尔士州，澳大利亚)封固在载玻片上。用于组织学组织以10μm冷冻切片，在分级乙醇浓度下清洗和再水化。对于标准苏木精和伊红染液(H&E)和阿尔新蓝染液，将切片浸入histolene(3×4分钟)、100％乙醇(2分钟)、95％乙醇(2分钟)、70％乙醇(2分钟)、用自来水冲洗(30秒)，然后浸入苏木精(Sigma-Aldrich)(1分钟)或阿尔辛蓝(Sigma-A1drich)(30分钟)，用自来水冲洗，浸入Scott′s自来水(1分钟)和伊红(Sigma-Aldrich)(5分钟)，用自来水冲洗，浸入100％乙醇(2×1分钟)和histolene(4分钟)，最后用DPX封固剂固封在载玻片上。组织学分级系统在限制条件下评估了总体形态学损伤，包括粘膜变平(0＝正常，3＝严重变平)、出血部位的表现(0＝无，3＝频繁)、环状肌的损伤或变形(0＝正常，3＝肌肉层显著增厚和解体)和杯状细胞缺失(0＝无，3＝清除的细胞)。对所有载玻片进行编码，进行盲分析。
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成像和定量分析
共聚焦显微镜(Nikon Eclipse Ti多通道共聚焦激光扫描系统，Nikon，日本)获得免疫标记切面。通过使用FITC、Alexa 594和Alexa 647(分别为488-am、559-nm或640.4-nm激发)的滤波器组合对三重标记的样品进行可视化和成像。图像(512×512像素)是在20×(干，0.75)或40×(油浸，1.3)镜头下获得的。在结肠横切面中定量神经纤维密度和IR-a-SMA的百分比(总面积为1mm2面积，在x20放大倍数下随机拍摄的4×图像)。所有图像都是在相同的采集、曝光时间条件下获得的，校准到标准的最小基线荧光并转换为二进制。在结肠横切面和LMMP改变中，分别通过分析荧光变化来评估神经纤维和IR-GFAP神经胶质细胞的变化，转化为二进制，并使用ImageJ软件(国家卫生研究所，贝塞斯达，马里兰州，美国)以百分比(％)测量荧光变化。MAP2、APE1-IR和HMGB1-IR细胞的肠肌神经元IR总数用DAPI共标记，并用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)在×40放大倍数下对每个制备物在10个神经节内进行定量。使用Zeiss Axio成像显微镜在H&E和Alican蓝染色切面中评估结肠形态学损伤，并使用MetaSystems Metafer程序捕获图像。VSlider软件将图像拼接在一起。
肠肌神经丛中超氧化物的产生
MITOSOXTMRedM36008(Invitrogen，澳大利亚)在肠肌神经节中获得了线粒体来源的超氧化物产生。简而言之，来自对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的小鼠的远端结肠制备物新鲜切除以暴露肠肌神经丛。将样品与5μM MITOSOXTM RedM36008在37℃下孵育40分钟。将组织用充氧的生理盐水洗涤，并用Zamboni’s固定剂固定1小时，然后用1×PBS洗涤(3×10分钟)。将准备的组织以用于成像的封固剂DAKO荧光固封在载玻片上。如上所述捕获图像。将图像转换为二进制，并使用ImageJ软件(国立卫生研究院)以任意单位(arb.Units)测量相对于神经节面积的荧光变化。
RNA分离和NGS阵列
收集对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330新鲜结肠组织并速冻到液氮中。然后将样品送到澳大利亚基因组研究所(AGRF)，在那里完成下一代测序(NGS)。通过每个样品去除2-3μgRNA(≥100ng/μl)来进行NGS。RNA的完整性将由生物分析仪评估，因为样品的RNA完整性数(RIN)值≥8.0。RNA样品经过DNase处理，为文库制备做好准备。将运行生物信息学以确定生物学意义并通过RNA测序进行筛选以进行表达分析。样品经过质量和适配器修整、校准、定量和标准化。从生物信息学收集的结果由序列、比对、比对后、转录子组装和基因计数文件组成。分析和解释从AGRF获得的最终数据以确定APE1/Ref-1相关路径。
结果
APX3330改善Winnie小鼠的临床症状
测量动物体重的变化、由直肠脱垂的存在指示的肠道炎症的严重程度和粪便含水量，以评估治疗效果。在第14天观察实验组中的临床症状(图1A-1C)。从对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的小鼠获得在14天期间的体重(表3，图1A)。具体而言，与对照C57BL/6小鼠相比，Winnie-sham处理的小鼠从第6天到第14天表现出体重逐渐降低(表3，图1A)。在第14天，与Winnie-sham处理的小鼠相比，Winnie-APX3330处理的小鼠体重有所改善(P＜0.05)，但与对照C57BL/6小鼠没有可比性(表3，图1A)。在Winnie-sham处理的动物中观察到明显的直肠突出的脱垂，具有直肠脱垂明显表现为突出伴随水肿和出血(图1B)。相反，Winnie-APX3330处理的小鼠在处理的第14天表现出减少的直肠脱垂、水肿和出血(图1B)。在第14天收集新鲜粪便颗粒以评估水含量(图1C)。与对照C57BL/6小鼠(57.3+0.6％，n＝7)相比，Winnie-sham处理的小鼠具有高水平的粪便含水量(83.4+2.7％，P＜0.0001，n＝7)(图1C)。相反，当与Winnie-sham处理的动物相比时，Winnie-APX3330处理的小鼠(73.2+2.1％，P＜0.01，n＝7)的粪便具有较低的粪便保水性(图1C)。然而，与对照C57BL/6小鼠相比，从Winnie-APX3330处理的动物获得的粪便颗粒表现出更高的保水性(P＜0.0001)(图1C)。
表3：14天期间的每日体重评估
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APX3330改善Winnie小鼠的GI功能
APX3330的功效是根据GI通过和结肠运动性的参数进行评估的。在对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的小鼠中，射线照相图像捕获硫酸钡从胃到第一个粪球(图2A)。实验组之间在OCTT时间中没有观察到变化(图2B)；然而，在Winnie-sham处理的小鼠中发现GI通过的其他参数受到损害，并且GI通过的其他参数在Winnie-APX3330处理的小鼠中恢复。与对照C57BL/6小鼠(38.0±4.2分钟，n＝10)相比，Winnie-sham处理的小鼠表现出加速的CTT时间(18.0±2.0分钟，P＜0.01，n＝10)。然而，与Winnie-sham处理的小鼠相比，Winnie-APX3330处理的小鼠表现出改善的CTT时间(图4C)。很明显，与对照C57BL/6(85.0±11.0分钟)和Winnie-APX3330处理的小鼠(86.4+17.8分钟，P＜0.05)相比，Winnie-sham处理的小鼠(36.7±6.7分钟，P＜0.05，n＝7)在盲肠中的保留时间延长(140.5±13.2分钟，P＜0.05)(图4D)。APX3330处理将Winnie小鼠的总通过时间(173.3±24.6分钟，P＜0.05)降低到C57BL/6小鼠的水平(图4E)。
体外全器官浴实验评估了APX3330对结肠收缩活动的影响(图3A-3D)。结肠迁移运动复合体(CMMC)被确定为大于从口腔开始到肛门末端的结肠长度50％的收缩。然而，短收缩被定义为小于结肠长度50％的收缩。视频记录被转换成时空图，收缩被视为一条线(图3A)。总体而言，与对照C57BL/6小鼠(79.9±4.5％，n＝5)和Winnie-APX3330小鼠(62.3±2.4％，P＜0.0001，n＝5)的结肠收缩总长度相比，Winnie-sham小鼠的结肠收缩总长度(17.9±1.4％，P＜0.0001，n＝5)(虽然没有达到对照C57BL/6小鼠的结肠水平(P＜0.01))显著减小(图3B)。在对照C57BL/6小鼠(11.8±1.4％，n＝7)和Winnie-sham处理的小鼠(7.9±0.5％，n＝7)之间没有观察到短收缩长度的变化(图5C)。然而，与对照C57BL/6小鼠(P＜0.0001)和Winnie-sham处理的动物(P＜0.0001)相比，Winnie-APX3330处理的小鼠(33.9±3.8％，n＝5)比例短收缩长度显著增加(图3C)。与对照C57BL/6小鼠(68±3％，n＝5)相比，Winnie-sham处理的小鼠(50±7.0％，P＜0.05，n＝5)中的CMMC长度显著减小(图3D)。与Winnie-sham处理的小鼠相比，APX3330处理使CMMC的比例长度恢复(73±1.0％，P＜0.01，n＝5)至对照C57BL/6小鼠的水平(图3D)。
APX3330减弱Winnie小鼠中平滑肌细胞形态和数量的变化
平滑肌细胞的改变可能会导致发炎结肠中可预见的功能变化。与DAPI共标记的抗α-SMA抗体鉴定了从对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的动物获得的远端结肠横切面中的平滑肌细胞(图4A-4C)。与对照C57BL/6小鼠(62.6±1.7％，n＝5)相比，Winnie-sham处理的动物(31.1±2.6％，P＜0.01，n＝5)显示出α-SMA免疫反应性(IR)大小减小至细胞核大小(图4B)。然而，与大小与对照C57BL/6小鼠相似的Winnie-sham处理的动物相比，Winnie-APX3330处理的小鼠的平滑肌细胞得到改善(75.7±6.4％，P＜0.0001，n＝5)(图4B)。当与对照C57BL/6小鼠(40.4±2.5，n＝5)相比时，在Winnie-sham处理的小鼠(93.8±7.3，P＜0.0001，n＝4)中，环状肌内定量的α-SMA-IR共标记DAPI平滑肌细胞数量增加(图4C)。相反，在远端结肠的环状肌中，与Winnie-sham处理的小鼠相比，Winnie-APX3330处理的小鼠的α-SMA-IR细胞数量显著减少(45.2±3.1，P＜0.05，n＝5)，但与对照组C57BL/6小鼠环肌相似(图2C)。
APX3330处理恢复Winnie小鼠的神经纤维密度
对神经元微管蛋白特异的β-微管蛋白(III)抗体染色的神经纤维分布于来自对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的动物的远端结肠的横切面中(图5A和5B)。与对照C57BL/6小鼠(13.4±0.8％，n＝8)相比，Winnie-sham处理的小鼠在远端结肠中表现出神经纤维密度显著降低(5.7±0.9％，P＜0.0001，n＝9)(图5A和5B)。然而，与对照C57BL/6小鼠水平相比，Winnie-APX3330处理的小鼠在结肠中神经纤维密度恢复(13.3±0.8，P＜0.001，n＝5)(图5A和5B)。
APX3330处理改善Winnie小鼠结肠中的总体形态学和杯状细胞密度
经由H&E染色评估发炎结肠中结肠的总体形态学变化(图6A)。在对照C57BL/6小鼠中观察到正常上皮组织具有细长腺窝。相反，Winnie-sham处理的动物表现出粘膜变平、白细胞表现和平滑肌壁增生。在Winnie小鼠中APX3330处理似乎可以减轻对结肠的损伤，并预见到结构恢复。此外，进行阿尔辛蓝染色以确定对照C57BL/6、Winne-sham处理的和Winnie-APX3330处理的动物中杯状细胞的缺失(图6B)。很明显，与对照C57BL/6小鼠(1.2±0.2，n＝5)相比，Winnie-sham处理的小鼠显示出更高的组织学分级(10.8±0.4，P＜0.0001，n＝5)(图6A和6C)。然而，当与Winnie-sham小鼠(P＜0.0001)相比时，Winnie-APX3330处理的小鼠显示出改善的组织学分级(4.8±0.7，n＝5)，而与对照C57BL/6小鼠(P＜0.001)相比没有可比性(图6A和6C)。定量与对照C57BL/6小鼠(65.7±2.7％，n＝5)相比在Winnie-Sham处理的小鼠(22.0±3.3％，P＜0.0001，n＝5)中杯状细胞密度的缺失(图6B和6D)。然而，与Winnie-sham处理的小鼠(P＜0.01)相比，Winnie-APX3330处理的小鼠显示出改善的杯状密度(46.5±4.3％，n＝4)，然而与对照C57BL/6小鼠(P＜0.01)相比没有可比性(图6B和6D)。
APX3330处理减轻Winnie小鼠的肠的通透性和炎症
FABP1在磷脂合成和支持肠道中上皮屏障完整性方面具有重要作用。血清中FABP1水平升高是由于肠的通透性增加所致。在Winnie-sham处理的小鼠中，与对照小鼠(0.6±0.1ng/mL，n＝5)相比，血清中的FABP1更高(2.3±0.7ng/mL，P＜0.05，n＝4)(图7A)。然而，与Winnie-sham处理的动物相比，Winnie-APX3330小鼠中FABP1在血清中的水平降低(0.6±0.2ng/mL，P＜0.05，n＝5)(图7A)。Lcn-2是肠道炎症的非侵入性生物标记物。在第14天，与对照C57BL/6小鼠(28±1.7pg/mL，n＝8)相比，Winnie-sham小鼠显示出Lcn-2粪便水平增加(47±2.5pg/mL，P＜0.0001，n＝8)(图7B)。与Winnie-sham处理的小鼠相比，APX3330处理降低了Lcn-2粪便水平(36±2.0pg/mL，P＜0.01，n＝5)(图7B)。
APX3330治疗改善肠肌神经丛中的神经胶质细胞密度
评估在远端结肠的肠肌神经丛中GFAP的神经胶质细胞IR的密度(图8A和8B)。表示来自对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的小鼠的LMMP制备物中，相对于神经节面积的神经胶质细胞密度(图8A)。与对照C57BL/6小鼠(70.2±6.5％，n＝5)相比，Winnie-sham处理的小鼠的神经胶质细胞密度显著降低(36.3±3.6％，P＜0.01，n＝5)(图8A和8B)。当与Winnie-sham处理的小鼠相比时，Winnie小鼠的APX3330处理恢复了GFAP密度(64.2±8.8％，P＜0.05，n＝4)(图8A和8B)。
APX3330处理减轻远端结肠的肠肌神经元缺失
在来自对照C57BL/6、Winnie-sham和Winnie-APX3330小鼠的LMMP制备物中，用抗MAP2泛神经元标记物鉴定肠肌神经元(图9A)。在Winnie-sham处理的小鼠(22.9±2.4，P＜0.01，n＝6)中，与对照C57BL/6小鼠(37.6±3.3，n＝4)相比，肠肌神经元的比例数显著降低(图9A和9B)。与Winnie-sham小鼠相比，Winnie-APX3330处理的小鼠(31.9±2.2％，P＜0.05，n＝7)减轻了肠肌神经元的完全缺失(图9A和9B)。
APX3330处理降低Winnie小鼠发炎肠肌神经节中超氧化物的产生
荧光线粒体超氧化物标记物MITOSOXTM Red探测远端结肠肠肌神经节以评估对照C57BL/6、Winnie-sham处理的、Winnie-APX3330处理的动物的超氧化物产生水平(图10A)。当与对照小鼠(48.4±3.2％，n＝4)相比时，在来自Winnie-sham处理的小鼠(159.0±14％，P＜0.0001，n＝4)的肠肌神经丛中MitoSOX荧光明显增加(图10A和10B)。与Winnie-sham处理的小鼠相比，在Winnie-APX3330处理的小鼠(19.2±7.5％，P＜0.0001，n＝4)中远端结肠肠肌神经丛中超氧化物产生的增加得到缓解(图10A和10B)。
APX3330处理减弱HMGB1的细胞质易位
在发炎结肠的肠肌神经丛中，通过针对HMGB1的抗体评估炎症下游通路(图11A和11B)。通过IR在来自对照、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的小鼠的LMMP制备物中测量HMGB1从细胞核到细胞质的易位(图11A)。在Winnie-sham处理的小鼠中，当与对照C57BL/6小鼠(0.5±0.3，n＝5)相比时，存在大量被定量有HMGB1易位进入细胞溶质的细胞(16.6±4.8，P＜0.01，n＝4)(图11A和11B)。与Winnie小鼠(图11A和11B)相比，APX3330处理减弱了肠肌神经节中HMGB1的细胞质易位(0.9±0.3，P＜0.01n＝4)。
APX3330处理降低了肠肌神经节中APE1的过度表达
通过IR确定来自对照C57BL/6、Winnie-sham处理的和Winnie-APX3330处理的小鼠的结肠LMMP制备物中肠肌神经丛内的APE1表达(图12A-12C)。观察到在Winnie-sham处理的小鼠中，APE1不仅受到细胞核的影响，而且存在于细胞溶质中(图12A)。在Winnie-Sham处理的小鼠中，与对照C57BL/6小鼠(9.6±1.0％，n＝5)相比，APE1强度显著增加(14.7±1.0％，P＜0.05，n＝4)(图12A和12B)。相反，与Winnie-sham小鼠相比，Winnie-APX3330处理的小鼠的肠肌神经节中APE1的过度表达减少(6.0±1.4％，P＜0.01，n＝4)(图12A和12B)。进一步的评估定量了LMMP制备物中APE1-IR细胞的数量(图12C)。在对照C57BL/6小鼠(22.3±2.1％，n＝5)和Winnie-sham处理的小鼠(21.8±1.6％，P＜0.01，n＝4)之间未发现APE1阳性细胞的变化(图12A和12C)。然而，与对照C57BL/6(P＜0.01)和Winnie-sham处理的小鼠(P＜0.01)相比，Winnie-APX3330处理的小鼠中APE1-IR细胞的数量显著减少(图12A和12C)。
APX3330处理修复远端结肠中肠肌神经元的DNA损伤
对具有泛神经元标记物MAP2和氧化性DNA损伤标记物Oxo-8-dG的共免疫标记的肠肌神经元进行定量(图13A)。总体而言，当与对照C57BL/6小鼠(2.97±0.7％，n＝4)相比时，在Winnie-sham处理的动物(18.1±1.6％，P＜0.001，n＝6)中Oxo-8dG-IR的表达显著增加(图13A和13B)。当与Winnie-sham处理的小鼠相比时，该表达在Winnie-APX3330处理的小鼠中减弱(2.0±0.9％，P＜0.001，n＝6)至与对照相当的水平(图13A和13B)。当与对照C57BL/6小鼠(0.2±0.2，n＝4)相比时，Winnie-sham处理的小鼠(49±9.1，P＜0.0001，n＝6)中Oxo-8dG的肠肌神经元IR数量显著增加(图13A和13C)。这在Winnie-APX3330处理的小鼠(0.9±0.7，P＜0.001，n＝6)中得到避免，与Winnie-sham处理的小鼠相比，肠肌神经元中的DNA损伤表达减少(图13A和13C)。
APX3330处理使上调的RNA表达接近基线
为了分析与炎症、结直肠癌易感性、微生物群改变和氧化应激反应相关的基因表达的变化，使用合并的结肠样品进行结肠RNA的PCR阵列。分析了S100钙结合蛋白A8(S100a8)、含KH同源域的蛋白1A(Khdcla)、抵抗素样β(Retnlb)、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白(Lrg1)、一氧化氮合酶(Nos2)的水平。
总之，该实施例证明了在IBD的临床前Winnie小鼠模型中应用APX3330处理减轻了临床症状和GI通过。阻碍APE1/Ref-1分子的氧化还原活性域设想通过恢复细胞体内平衡来恢复抗氧化剂与氧化剂的平衡，这与腹泻和体重减轻的临床前景改善相吻合。此外，ROS和RNS水平升高与GI功能受损引起的折衷的免疫反应相关。
对APE1/Ref-1分子氧化还原功能的特异性抑制显示出对氧化应激诱导的肠神经病变的预防作用和减轻肠道炎症。尽管有大量证据支持IBD中的肠道失调，但氧化应激的影响和APE1/Ref-1在ENS中的作用机制尚未阐明。因此，APE1/Ref-1拮抗剂APX3330为靶向与肠道炎症相关的氧化应激反应的特定氧化还原机制提供了机会。因此，获得了对APX3330在抗炎反应、肠神经病变、疾病严重程度、胃肠功能和IBD症状中的作用的理解。
在临床相关模型中靶向APE1/Ref-1氧化还原途径的特异性抑制导致在人体试验中可能治疗IBD和炎症诱导的肠神经病变。

Claims (28)

1.一种治疗患有功能性胃肠疾病的受试者的炎症和慢性疼痛的方法，该方法包括向受试者施用有效量的无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂具有下式：
Figure FDA0003170718510000011
其中R1选自于由烷基、烷氧基、羟基和氢组成的组；R3和R6独立地选自于由取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基和氧代组成的组；R4和R5独立地选自于由烷氧基和芳基组成的组，或R4和R5两者一起形成取代或未取代的萘醌；
X选自于由CH＝CR2和NCH组成的组，其中R2选自于由C1-C10烷基和CF3CH2CH2组成的组；并且
Y选自于由N(Rz)R2或NR^OR^组成的组，其中每个Rz独立地选自于由C1-C6烷基、杂烷基、环烷基和环杂烷基、直链或支链或任选取代的、或Rz和R2与连接的氮一起形成任选取代的杂环；其中每个R^独立地选自于由氢、烷基、杂烷基、环己基和环杂烷基组成的组，其中每个被任选地取代，或两个R^与连接的氮和氧一起形成任选取代的杂环。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂选自表1所列的抑制剂。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂选自于由3-[(5-(2，3-二甲氧基-6-甲基1，4-苯醌基)]-2-壬基-2-丙酸(APX3330)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N，N-二甲基戊酰胺](APX2007)、[(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N，N-二乙基戊酰胺](APX2009)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](APX2014)、(2E)-2-(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)-N，N，2-三甲基丙-2-烯酰胺(APX2032)、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物，及其组合组成的组。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂是APX3330，并且向所述受试者施用约1.0μM至约50μM的APX3330。
6.如权利要求1所述的方法，进一步包括向受试者施用至少一种额外的治疗剂。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述额外的治疗剂选自于由5-氨基水杨酸(5-ASA)、皮质类固醇、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、环孢霉素、他克莫司、抗TNF药物维多珠单抗、那他珠单抗、优特克单抗、益生菌、抗生素、抗炎药及其组合组成的组。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有炎性肠病、克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)以及未定型结肠炎(IC)中的一种或多种。
9.一种减少患有功能性胃肠疾病的受试者的神经元缺失的方法，该方法包括向受试者施用有效量的无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂具有下式：
Figure FDA0003170718510000021
其中R1选自于由烷基、烷氧基、羟基和氢组成的组；R3和R6独立地选自于由取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基和氧代组成的组；R4和R5独立地选自于由烷氧基和芳基组成的组，或R4和R5两者一起形成取代或未取代的萘醌；
X选自于由CH＝CR2和NCH组成的组，其中R2选自于由C1-C10烷基和CF3CH2CH2组成的组；并且
Y选自于由N(Rz)R2或NR^OR^组成的组，其中每个Rz独立地选自于由C1-C6烷基、杂烷基、环烷基和环杂烷基、直链或支链或任选取代的，或Rz和R2与连接的氮一起形成任选取代的杂环；其中每个R^独立地选自于由氢、烷基、杂烷基、环己基和环杂烷基组成的组，其中每个被任选地取代，或两个R^与连接的氮和氧一起形成任选取代的杂环。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂选自表1所列的抑制剂。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂选自于由3-[(5-(2，3-二甲氧基-6-甲基1，4-苯醌基)]-2-壬基-2-丙酸(APX3330)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N，N-二甲基戊酰胺](APX2007)、[(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N，N-二乙基戊酰胺](APX2009)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](APX2014)、(2E)-2-(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)-N，N，2-三甲基丙-2-烯酰胺(APX2032)、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物，及其组合组成的组。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述APE1/Rcf-1抑制剂是APX3330，并且向所述受试者施用约1.0μM至约50μM的APX3330。
14.如权利要求9所述的方法，进一步包括向受试者施用至少一种额外的治疗剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述额外的治疗剂选自于由5-氨基水杨酸(5-ASA)、皮质类固醇、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、环孢霉素、他克莫司、抗TNF药物维多珠单抗、那他珠单抗、优特克单抗、益生菌、抗生素、抗炎药及其组合组成的组。
16.一种增强患有功能性胃肠疾病的受试者中神经发生的方法，该方法包括向受试者施用有效量的无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物，其选择性抑制APE1的氨基末端部分。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂具有下式：
Figure FDA0003170718510000031
其中R1选自于由烷基、烷氧基、羟基和氢组成的组；R3和R6独立地选自于由取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基和氧代组成的组；R4和R5独立地选自于由烷氧基和芳基组成的组，或R4和R5两者一起形成取代或未取代的萘醌；
X选自于由CH＝CR2和NCH组成的组，其中R2选自于由C1-C10烷基和CF3CH2CH2组成的组；并且
Y选自于由N(Rz)R2或NR^OR^组成的组，其中每个Rz独立地选自于由C1-C6烷基、杂烷基、环烷基和环杂烷基、直链或支链或任选取代的、或Rz和R2与连接的氮一起形成任选取代的杂环；其中每个R^独立地选自于由氢、烷基、杂烷基、环己基和环杂烷基组成的组，其中每个被任选地取代，或两个R^与连接的氮和氧一起形成任选取代的杂环。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂选自表1所列的抑制剂。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂选自于由3-[(5-(2，3-二甲氧基-6-甲基1，4-苯醌基)]-2-壬基-2-丙酸(APX3330)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N，N-二甲基戊酰胺](APX2007)、[(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N，N-二乙基戊酰胺](APX2009)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](APX2014)、(2E)-2-(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)-N，N，2-三甲基丙-2-烯酰胺(APX2032)、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物，及其组合组成的组。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂是APX3330，并且向所述受试者施用约1.0μM至约50μM的APX3330。
21.如权利要求16所述的方法，进一步包括向受试者施用至少一种额外的治疗剂。
22.一种保护有需要的受试者中肠肌神经元和肠神经元的方法，该方法包括向受试者施用有效量的无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1氧化还原因子1(APE1/Ref-1)抑制剂、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂具有下式：
Figure FDA0003170718510000041
其中R1选自于由烷基、烷氧基、羟基和氢组成的组；R3和R6独立地选自于由取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基和氧代组成的组；R4和R5独立地选自于由烷氧基和芳基组成的组，或R4和R5两者一起形成取代或未取代的萘醌；
X选自于由CH＝CR2和NCH组成的组，其中R2选自于由C1-C10烷基和CF3CH2CH2组成的组；并且
Y选自于由N(Rz)R2或NR^OR^组成的组，其中每个Rz独立地选自于由C1-C6烷基、杂烷基、环烷基和环杂烷基、直链或支链或任选取代的，或Rz和R2与连接的氮一起形成任选取代的杂环；其中每个R^独立地选自于由氢、烷基、杂烷基、环己基和环杂烷基组成的组，其中每个被任选地取代，或两个R^与连接的氮和氧一起形成任选取代的杂环。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂选自表1所列的抑制剂。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂选自于由3-[(5-(2，3-二甲氧基-6-甲基1，4-苯醌基)]-2-壬基-2-丙酸(APX3330)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N，N-二甲基戊酰胺](APX2007)、[(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N，N-二乙基戊酰胺](APX2009)、(2E)-2-[(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)亚甲基]-N-甲氧基戊酰胺](APX2014)、(2E)-2-(3-甲氧基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2-基)-N，N，2-三甲基丙-2-烯酰胺(APX2032)、其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物，及其组合组成的组。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述APE1/Ref-1抑制剂是APX3330，并且向所述受试者施用约1.0μM至约50μM的APX3330。
27.如权利要求22所述的方法，进一步包括向受试者施用至少一种额外的治疗剂。
28.如权利要求22所述的方法，其中所述受试者患有炎性肠病、克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)以及未定型结肠炎(IC)中的一种或多种。
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