CN113604463B - 法拉第波多波长合成的细胞组装方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种法拉第波多波长合成的生物组装方法及应用，本方法具有系统易搭建、操控简单、图案动态可调以及生物相容性良好等优势。本方法区别于现有声学生物组装方法单一波长条件下的细胞操控原理，通过把不同波长的正弦或余弦信号进行合成，将传统法拉第波频域下单一波长组装模式提升为多波长组装模式，实现液底多尺度细胞复杂、任意图案排列，使其更加适合组织工程及生物制造中对于细胞复杂排列的需求，具有巨大的应用前景和商业化价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程下属的组织工程和生物制造技术领域，具体涉及一种法拉第波多波长合成的生物组装方法及应用。
背景技术
在人体组织器官中，细胞通过自组织实现相互连接并形成高度有序的细胞结构。体外还原结构中细胞的排列方式以及结构的几何形状不仅在宏观尺度上模拟体内组织器官的形态方面扮演着关键角色，同时在调节细胞的微环境方面起着重要作用。
近年来，生物制造在构建高度还原人体组织器官的复杂性和功能性的细胞微结构方面展现出巨大的潜力。生物制造是利用生物打印或生物组装以及随后的组织成熟过程，将活细胞、生物材料和刺激因子构建成具有特异性结构和功能的生物产品。其中，生物组装被认为是生物制造的一种重要构建策略，其优势在于，相较于生物打印，生物组装能够在构建细胞结构中具有更好的生物相容性和更高的效率。截至目前为止，一系列的生物组装技术利用外部物理场与细胞的相互作用来操控细胞在空间中的排布。这些物理场包括重力场、磁场和电场等。然而，基于上述原理的生物组装技术所构建的细胞结构往往只具有如球形、条形、环形等简单几何形状，难以满足构建多尺度、复杂、任意细胞结构的需求。
相较于其他生物组装技术，声学生物组装具有声场动态可调的独特优势，因此可以提供更好的细胞结构多样性。其中，声全息技术已被用于构建复杂，任意的细胞结构，然而该技术存在系统复杂，操作流程繁琐，对于复杂细胞结构无法实现实时调节等问题。相较于该技术，法拉第波生物组装技术具有系统易搭建、操控简单、图案动态可调以及生物相容性良好等优势，在生物组织工程领域拥有广阔的应用前景。然而，公开发明授权专利号(US20160145566A1，WO2016069493A2)中，原有法拉第波生物组装技术仅在其频域下进行单一波长细胞组装，能够构建的单一尺度下有限的细胞结构，未能满足对于构建多尺度、复杂、任意细胞结构的需求。
因此，提供一种能够满足生物组织工程研究中实现多尺度细胞复杂、任意排列的需求的生物组装方法具有重要的应用前景和技术推广及应用价值。
发明内容
本发明要解决的问题在于针对现有生物组装技术中的不足，提供一种法拉第波多波长合成的细胞组装方法及应用。旨在通过合成多个不同波长的正弦或余弦信号，进而激发形成多波长合成的法拉第波，将传统法拉第波频域下单一波长组装模式拓展为多波长组装模式，实现液底多尺度细胞复杂、任意图案排列，从而使法拉第波生物组装更具技术推广及应用价值。
为实现上述目的，本发明的工作原理如下：
建立多波长合成的声学生物组装理论。液底的细胞在法拉第波声场中受到声学压力、浮力和重力的共同作用，其中声学压力对细胞平衡位置起着决定性作用，细胞最终平衡到声压场中势能最低的位置，即势阱处。任何复杂声学压力场都可利用傅里叶级数进而简化为一系列正弦或余弦声学压力场的叠加。因此，可通过将多个不同波长的正弦或余弦信号合成形成复杂波形，从而实现多尺度细胞复杂、任意排列的需求。多波长合成多尺度复杂结构如图1所示。举例说明，肝脏是一个具有独特多尺度结构的重要器官，成人的肝脏是由50-100万个六边形的肝小叶构成，肝脏组织周期性的肝小叶结构单元以及多尺度的微生理结构如图2所示。因此，可将复杂的肝脏组织结构简化为空间上重复排列的肝小叶结构。通过多波长合成，在空间上实现复杂的声学压力场分布，进而实现多尺度的肝脏细胞结构的构建。此外，人体还有大量组织器官包含特定的多尺度结构单元，例如，肺泡主要是由单层上皮细胞构成的半球状的囊泡；肾小管主要是由肾小管上皮细胞自组织形成空心管状结构。这些特定的组织器官生理结构均可通过法拉第波多波长合成组装实现体外构建。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种法拉第波多波长合成的细胞组装方法，包括以下步骤：
S1：根据目标组装排列的细胞图案，在波形创建和编辑工具软件中实现不同波长法拉第波的合成，频率选择在1-1000Hz之间。例如双波长法拉第波的合成，写入的正弦信号函数为y＝A1*sin(f1*2*π*x)+A2*sin(f2*2*π*x)；写入的余弦信号函数为y＝A1*cos(f1*2*π*x)+A2*cos(f2*2*π*x)。其中f1为低驱动频率，f2为高驱动频率，低驱动频率正弦信号函数对应幅值A1与高驱动频率正弦信号函数对应幅值A2的比例范围为1:1-1:5。对于多波长法拉第波的合成，写入的正弦信号函数为y＝A1*sin(f1*2*π*x)+A2*sin(f2*2*π*x)+A3*sin(f3*2*π*x)+A4*sin(f4*2*π*x)+A5*sin(f5*2*π*x)+…；写入的余弦信号函数为y＝A1*cos(f1*2*π*x)+A2*cos(f2*2*π*x)+A3*cos(f3*2*π*x)+A4*cos(f4*2*π*x)+A5*cos(f5*2*π*x)+…。其中，频率f1＜f2＜f3＜f4＜f5；幅值A1≤A2≤A3≤A4≤A5，较低幅值与较高幅值的比例范围为1:1-1:5。将合成的多波长信号文件导入任意波形/函数信号发生器中。
S2：用于组装的含细胞组装单元，选用细胞为诱导多能干细胞、癌症干细胞、间充质干细胞一种或几种混合；或者，选用细胞为脑、肝、肾、胰、血管、心脏、皮肤、骨髓、骨、软骨和肌肉的组织器官原代细胞、祖细胞、前体细胞以及其疾病细胞任一种或几种混合。含细胞组装单元为单细胞、微组织块、类器官、细胞微球、含细胞的水凝胶微球和含细胞的载体微粒一种或几种混合，直径在2-5000μm。含细胞组装单元数量为2-1012个。将含细胞组装单元均匀分散在磷酸缓冲液、细胞培养基、天然水凝胶、合成水凝胶以及混合水凝胶中待用。
S3：打开合成的多波长信号文件，通过任意波形/函数信号发生器输出特定的电信号，电信号转入至功率放大器进行功率放大，放大后的保真电信号转入激振器中产生稳定的、周期性的振动。将组装腔室与激振器连接并进行水平校准。组装腔室可为圆形、正方形、长方形、三角形、梯形、菱形、六边形、八边形；各形状组装腔室外接圆直径为0.5-20cm；高度为0.2-10mm。
S4：将待组装的含细胞组装单元悬液均匀加入至组装腔室中，待含细胞组装单元沉降至组装腔室底部后进行法拉第波多波长合成组装。
第二方面，本发明提供一种上述的法拉第波多波长合成的细胞组装方法的应用，其特征在于：该方法应用于组织器官生理和病理模型构建、生理和病理机制研究、药物筛选。
本发明的优点及产生的有益效果如下：
本发明法拉第波多波长合成的细胞组装方法具有系统易搭建，操控简单，图案动态可调，生物相容性良好等优势。本发明区别于现有声学生物组装方法单一波长条件下的细胞操控原理，通过将多个不同波长的正弦或余弦信号合成，进而激发形成多波长合成的法拉第波，将传统法拉第波频域下单一波长组装模式拓展为多波长组装模式，实现液底多尺度细胞复杂、任意图案排列，使其更加适应组织工程及生物制造中对于细胞复杂排列的需求，具有巨大的应用前景及商业转化潜力。
附图说明
图1为多波长合成多尺度复杂结构示意图；
图2为肝脏组织周期性结构单元以及多尺度的微生理结构示意图；
图3为本发明实施例1中液底组装得到的单波长、双波长、三波长聚苯乙烯微球图案示意图；
图4为本发明实施例2中液底组装得到的单波长、双波长HepG2细胞微球图案示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1：法拉第波多波长合成组装用于聚苯乙烯微球的排列
将聚苯乙烯微球加入含0.05％吐温20的0.01M磷酸盐缓冲液中，充分分散。聚苯乙烯微球颜色为红色，直径为100μm，密度为1.05g/cm3，其物理性质与含细胞的组装单元相似，聚苯乙烯微球浓度为30mg/mL。本实施例中，用聚苯乙烯微球模拟含细胞的组装单元。
1、单波长条件下聚苯乙烯微球的排列，步骤如下：
设定波形为连续的正弦波后，设定驱动频率为20Hz，28Hz，58Hz，信号幅值为60-100mVpp，通过调节任意波形/函数信号发生器(Tecktronix,AFG3052C)输出特定的电信号，电信号通过BNC母转RCA公线转入至功率放大器(DAYTONAUDIO,DTA-120)进行功率放大，放大后的保真电信号通过RCA公转四芯插座将转入激振器(无锡世敖科技有限公司，SA-JZ005T)中产生稳定的、周期性的振动。将圆形组装腔室(Φ＝3cm)通过M5×30与激振器钢性连接后，通过气泡圆盘水平仪进行360°水平校准。最终将待组装的聚苯乙烯微粒悬液均匀加入至圆形组装腔室中，待聚苯乙烯微粒沉降至组装腔室底部后进行法拉第波组装。单波长条件下聚苯乙烯微球组装得到的图案如图3中a所示，仅能够形成较为简单的发散状、花瓣状、同心圆环状图案。
2、双波长合成条件下聚苯乙烯微球的排列，步骤如下：
利用“ArbExpress”软件实现两个不同波长正弦信号的合成。驱动频率为20Hz和28Hz对应波长下的合成正弦信号的波函数为y＝1.5*sin(20*2*π*x)+sin(28*2*π*x)；驱动频率为20Hz和58Hz对应波长下的合成正弦信号的波函数为y＝1.2*sin(20*2*π*x)+sin(58*2*π*x)；驱动频率为28Hz和28Hz对应波长下的合成正弦信号的波函数为y＝sin(20*2*π*x)+sin(28*2*π*x)。将合成的双波长正弦信号保存为“TFW”格式文件，导入任意波形/函数信号发生器(Tecktronix,AFG3052C)中。
设定波形为任意波形后，依次打开合成的双波长正弦信号文件，信号幅值为140-160mVpp，通过任意波形/函数信号发生器的输出特定的电信号，电信号通过BNC母转RCA公线转入至功率放大器(DAYTONAUDIO,DTA-120)进行功率放大，放大后的保真电信号通过RCA公转四芯插座将转入激振器(无锡世敖科技有限公司，SA-JZ005T)中产生稳定的、周期性的振动。将圆形组装腔室(Φ＝3cm)通过M5×30与激振器钢性连接后，通过气泡圆盘水平仪进行360°水平校准。最终将待组装的聚苯乙烯微粒悬液均匀加入至圆形组装腔室中，待聚苯乙烯微粒沉降至组装腔室底部后进行法拉第波组装。双波长条件下聚苯乙烯微球组装得到的图案如图3中b所示，实现将单波长条件下对应的图案进行叠加，得到发散状、花瓣状、同心圆环状图案两两相互叠加的图案。
3、三波长合成条件下聚苯乙烯微球的排列，步骤如下：
利用“ArbExpress”软件实现三个不同波长正弦信号的合成。驱动频率为20Hz，28Hz和58Hz对应波长下的合成正弦信号的波函数为y＝1.4*sin(20*2*π*x)+sin(28*2*π*x)+sin(58*2*π*x)。将合成的三波长正弦信号保存为“TFW”格式文件，导入任意波形/函数信号发生器(Tecktronix,AFG3052C)中。
设定波形为任意波形后，打开合成的三波长正弦信号文件，信号幅值为200mVpp，通过任意波形/函数信号发生器的输出特定的电信号，电信号通过BNC母转RCA公线转入至功率放大器(DAYTONAUDIO,DTA-120)进行功率放大，放大后的保真电信号通过RCA公转四芯插座将转入激振器(无锡世敖科技有限公司，SA-JZ005T)中产生稳定的、周期性的振动。将圆形组装腔室(Φ＝3cm)通过M5×30与激振器钢性连接后，通过气泡圆盘水平仪进行360°水平校准。最终将待组装的聚苯乙烯微粒悬液均匀加入至圆形组装腔室中，待聚苯乙烯微粒沉降至组装腔室底部后进行法拉第波组装。三波长条件下聚苯乙烯微球组装得到的图案如图3中c所示，进一步实现多尺度条件下聚苯乙烯微粒复杂、任意图案排列，组装图案同时具有发散状、花瓣状、同心圆环状图案特征。
实施例2：法拉第波多波长合成组装用于HepG2细胞微球的排列
单波长条件下HepG2细胞微球的排列，步骤如下：
将HepG2细胞加入六孔低粘附板中(Corning，3471)，每孔2*106个细胞，加入DMEM完全培养基2mL。将六孔低粘附板放置在平板摇床上，转速为75rpm，培养三天成球。收集一孔HepG2细胞微球加入0.01M磷酸盐缓冲液中待用。
设定波形为连续的正弦波后，设定驱动频率为42Hz，45Hz，信号幅值为60-80mVpp，通过调节任意波形/函数信号发生器(Tecktronix,AFG3052C)输出特定的电信号，电信号通过BNC母转RCA公线转入至功率放大器(DAYTONAUDIO,DTA-120)进行功率放大，放大后的保真电信号通过RCA公转四芯插座将转入激振器(无锡世敖科技有限公司，SA-JZ005T)中产生稳定的、周期性的振动。将黑色背景圆形组装腔室(Φ＝2cm)通过M5×30与激振器钢性连接后，通过气泡圆盘水平仪进行360°水平校准。最终将待组装的HepG2细胞微球悬液均匀加入至圆形组装腔室中，待HepG2细胞微球沉降至组装腔室底部后进行法拉第波组装。单波长条件下HepG2细胞微球组装得到的图案如图4中a所示，仅能够形成较为简单的发散状、四叶花瓣状图案。
双波长条件下HepG2细胞微球的排列，步骤如下：
利用“ArbExpress”软件实现两个不同波长正弦信号的合成。驱动频率为42Hz和45Hz对应波长下的合成正弦信号的波函数为y＝2.1*sin(42*2*π*x)+sin(45*2*π*x)。将合成的双波长正弦信号保存为“TFW”格式文件，导入任意波形/函数信号发生器(Tecktronix,AFG3052C)中。
设定波形为任意波形后，打开合成的双波长正弦信号文件，信号幅值为140-160mVpp，通过上述法拉第波声学生物组装系统完成双波长条件下HepG2细胞微球组装，双波长条件下HepG2细胞微球组装得到的图案如图4中b所示，实现将单波长条件下对应的图案进行叠加，在多尺度条件下HepG2细胞微球复杂、任意图案排列，组装图案同时具有发散状、四叶花瓣状图案特征。
综上可知，本发明创新性地通过将多个不同波长的正弦或余弦信号进行合成，进而激发形成多波长合成的法拉第波，实现多尺度条件下复杂且任意的细胞排列图案。本方法系统易搭建，操控简单，图案动态可调，并且具有更好的生物相容性。更为重要的是，本方法区别于现有声学生物组装方法单一波长条件下的细胞操控原理，通过激发形成多波长合成的法拉第波，将传统法拉第波频域下单一波长组装模式拓展为多波长组装模式，实现液底多尺度细胞复杂、任意图案排列，为组织工程及生物制造中对于多尺度细胞复杂、任意排列的需求提供了一种创新解决方案。
Claims (10)
1.一种法拉第波多波长合成的生物组装方法，其特征在于：基于任何复杂的周期性图案均可利用傅里叶级数简化为一系列正弦波或余弦波的叠加，所述生物组装方法采用将多个不同波长的正弦或余弦信号合成，进而激发形成多波长合成的法拉第波，最终实现多尺度细胞复杂、任意排列；包括如下步骤：
S1：根据拟构建的生物组装图案，在波形创建和编辑工具软件中实现不同波长正弦或余弦信号的合成，将合成的多波长信号文件导入任意波形/函数信号发生器中；
S2：在任意波形/函数信号发生器中打开S1中合成的多波长信号文件，通过任意波形/函数信号发生器输出对应的电信号，电信号转入至功率放大器进行功率放大，放大后的保真电信号转入激振器中产生稳定的、周期性的振动，将组装腔室与激振器连接并进行水平校准；
S3：将待组装的含细胞组装单元悬液均匀加入至组装腔室中，待含细胞组装单元沉降至组装腔室底部后进行法拉第波多波长合成组装。
2.根据权利要求1所述的法拉第波多波长合成的生物组装方法，其特征在于：
所述步骤S1中，多个正弦或余弦信号的合成具体为：
对于双波长法拉第波的合成，写入的正弦信号函数为y＝A1*sin(f1*2*π*x)+A2*sin(f2*2*π*x)；其中f1为低驱动频率，f2为高驱动频率，A1为低驱动频率正弦信号函数对应幅值，A2为高驱动频率正弦信号函数对应幅值；写入的余弦信号函数为y＝A1*cos(f1*2*π*x)+A2*cos(f2*2*π*x)；其中f1为低驱动频率，f2为高驱动频率，A1为低驱动频率正弦信号函数对应幅值，A2为高驱动频率正弦信号函数对应幅值；对于多波长法拉第波的合成，写入的正弦信号函数为y＝A1*sin(f1*2*π*x)+A2*sin(f2*2*π*x)+A3*sin(f3*2*π*x)+A4*sin(f4*2*π*x)+A5*sin(f5*2*π*x)+…；写入的余弦信号函数为y＝A1*cos(f1*2*π*x)+A2*cos(f2*2*π*x)+A3*cos(f3*2*π*x)+A4*cos(f4*2*π*x)+A5*cos(f5*2*π*x)+…。
3.根据权利要求2所述的法拉第波多波长合成的生物组装方法，其特征在于：所述驱动频率选择为1-1000Hz之间。
4.根据权利要求3所述的法拉第波多波长合成的细胞组装方法，其特征在于：在双波长法拉第波的合成中，低驱动频率正弦或余弦信号函数对应幅值A1与高驱动频率正弦或余弦信号函数对应幅值A2的比例范围为1:1-1:5；在多波长法拉第波的合成中，驱动频率f1＜f2＜f3＜f4＜f5，幅值A1≤A2≤A3≤A4≤A5，较低幅值与较高幅值的比例范围为1:1-1:5。
5.根据权利要求1至4中任一所述的法拉第波多波长合成的细胞组装方法，其特征在于：
所述步骤S2中，组装腔室的形状为：圆形、正方形、长方形、三角形、梯形、菱形、六边形或八边形中任一种，各形状组装腔室外接圆直径为0.5-20cm；高度为0.2-10mm。
6.根据权利要求5所述的法拉第波多波长合成的细胞组装方法，其特征在于：
所述步骤S3中，所述含细胞组装单元为单细胞、微组织块、类器官、细胞微球、含细胞的水凝胶微球和含细胞的载体微粒任一种或几种混合，直径为2-5000μm。
7.根据权利要求6所述的法拉第波多波长合成的细胞组装方法，其特征在于：
所述步骤S3中，所述含细胞组装单元数量为2-1012个。
8.根据权利要求7所述的法拉第波多波长合成的细胞组装方法，其特征在于：所述步骤S3中，选用细胞为诱导多能干细胞、癌症干细胞和间充质干细胞任一种或几种混合；或者，选用细胞为脑、肝、肾、胰、血管、心脏、皮肤、骨髓、骨、软骨和肌肉的组织器官原代细胞、祖细胞、前体细胞以及其疾病细胞任一种或几种混合。
9.根据权利要求8所述的法拉第波多波长合成的细胞组装方法，其特征在于：
所述步骤S3中，混悬体系为磷酸缓冲液、细胞培养基、天然水凝胶、合成水凝胶或混合水凝胶中任一种。
10.一种如权利要求1至4或6至9中任一所述的法拉第波多波长合成的细胞组装方法的应用，其特征在于：该方法应用于组织器官生理和病理模型构建、生理和病理机制研究、药物筛选。
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