CN113597471A - 使用修饰珠的小分子筛选细胞分析 - Google Patents

使用修饰珠的小分子筛选细胞分析 Download PDF

Info

Publication number
CN113597471A
CN113597471A CN202080021554.3A CN202080021554A CN113597471A CN 113597471 A CN113597471 A CN 113597471A CN 202080021554 A CN202080021554 A CN 202080021554A CN 113597471 A CN113597471 A CN 113597471A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cleavable
beads
bead
linker
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080021554.3A
Other languages
English (en)
Inventor
亚历山大·李·萨茨
格雷戈尔·德尼克
克劳迪奥·赞巴尔多
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN113597471A publication Critical patent/CN113597471A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/06—Methods of screening libraries by measuring effects on living organisms, tissues or cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种筛选DNA编码的化学结构(2)文库在细胞靶标(11)中的活性的方法，其中所述文库的化学结构(2)、相应的编码DNA(4)和任选的对响应分子(12)敏感的化学探针(7/8/9)共价连接到珠子(1)上；该方法包括提供包含细胞靶标(11)和一个或多个如上定义的珠子(1)的孵育介质(13)或其等分试样，通过切割结构接头(3)从孵育介质(13)或其等分试样中的珠子(1)释放化学结构(2)并孵育释放的化学结构(2)和细胞靶标(11)；以及对珠子(1)上存在或保留的编码DNA进行测序。还提供了适用于该方法的珠子(1)。

Description

使用修饰珠的小分子筛选细胞分析
技术领域
本发明涉及一种筛选在改变药学上感兴趣的细胞靶标的活性方面具有潜在功效的小分子的筛选分析，以及实施该分析的方法。
背景技术
大多数药学上感兴趣的靶标在细胞环境中是活跃的。当研究改变靶标活性的小分子时，在细胞环境中这样做可能是有益的，包括在筛选大量不同的化合物时。
系统对靶标调节小分子的一个期望反应可能是从细胞中释放分子。这些分子可以是酶、蛋白质、核酸或细胞的较小产物，如代谢物。释放可以通过定向释放或简单的泄漏来实现。在筛选过程中，这些释放的分子将以化合物作用的手段被检测出来。
在制药工业的细胞的分析中筛选小分子化合物通常是通过将化合物和细胞组合在一个容器中来完成的(Jones E,Michael S,Sittampalam GS.Basics of AssayEquipment and Instrumentation for High Throughput Screening.2012 May 1[Updated 2016 Apr 2].In:Sittampalam GS,Coussens NP,Brimacombe K,et al.,editors.Assay Guidance Manual[Internet].Bethesda(MD):Eli Lilly&Company andthe National Center for Advancing Translational Sciences；2004)。因此，小分子可以作用于细胞外或细胞膜中的细胞分子，或者它可以进入细胞并在细胞内执行其作用。然后通过监测可行的分析读数来确定化合物调节细胞活性的能力。这种分析读数可以是例如酶对底物的处理。底物的处理可产生荧光信号。另一种方法是，例如，通过改变荧光来监测小分子与蛋白质靶标的结合。
通过使用微隔室，例如以n孔板的形式(其中n通常为96、384或1536)，可以研究(＝筛选)大量不同的小分子其调节靶标活性或结合的能力。商业上可获得的微孔板读数器通常用于通过测量板中每个单独孔的剩余底物(或产品外观)来测量每个小分子的活性。另一种已知的将这种分析分成多个微隔室的方法是产生含有油包水乳液形式的分析试剂的水滴。
当使用微孔板读数器时，小分子板的长期储存的物流具有挑战性，尤其是在处理大量板时。此外，评估微孔板中产物形成所需的时间随着小分子的数量线性增加，这在研究数百万个小分子时是有问题的(使用目前的技术，评估200万个分子需要大约10个工作日)(Brouzes E.,Medkova M.,Savenelli N.,Marran D.,Twardowski M.,Hutchison J.B.,Rothberg J.M,Link D.R.,Perrimon N.,Samuels.M.L.,PNAS 106,pp.14195-14200(2009))。
任何这样的分析都需要容易确定发现有用的化合物的结构。这个问题的一个解决方案是以DNA编码的化学库(DEL)的形式提供待筛选的化合物(Brenner and Lerner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:5381-5383(1992))。在DEL中，每种化合物都预先与对应于其结构的独特的DNA序列相连(标记)。因此，不需要鉴定有用化合物本身的结构(这项任务可能取决于结构，甚至是不可能的)，只需要对相应的DNA标签进行测序，这是对所有有用化合物都相同的标准程序。
然而，这种基于DEL的分析滞后于与DNA标签相连的化合物在分析中的行为可能与游离化合物不同的问题。在WO 2018/087539中，建议在分析前切割化合物及其相连的DNA标签，但使游离化合物及其相连的DNA标签彼此“空间关联”。
ACS Chem.Biol.13,pp.761-771(2018)公开了一种小分子分析，其使用带有淬灭的荧光团探针和附着于其上并具有DNA标签的小分子的二氧化硅珠。在该分析中，珠子渗透到细胞靶标中，从而其自身作为微隔室。通过光将小分子从穿透的珠子上切割下来。任何对细胞靶标致命的小分子都会导致其凋亡，释放半胱天冬酶-3，并且在仍然渗透的珠子中，从荧光团中去除淬灭剂。使用流式细胞术分选出这些现在有荧光的细胞靶标(因此现在是荧光微隔室)，然后对包含在其中的任何珠子的DNA进行测序，以找出导致细胞凋亡的相应小分子。
US 5,958,703 A公开了一种带有可由报告分子修饰的系链的载体，以及相关的筛选方法。该公开“分离”具有修饰的系链的载体。因此，在用修饰的系链分离载体之前，该公开并未汇集所有载体。
WO 2013/057188 A1释放化合物，使得它们“保留在固体载体/珠子内部”或“每种化合物物理上位于其母体固体载体内部”或“释放在珠子内部”，或者甚至允许“底物”被“吸收到”载体/珠子中。因此，该公开没有将待分析的化合物释放到孵育介质中，而是将它们保留在珠子内。因此，该公开所针对的“理化或生物系统”是可溶的物质，而不是细胞靶标:在后一种情况下，将有两个异质相(含化合物的珠子和细胞靶标)，这将阻碍它们之间的相互作用。
ACS Comb.Sci.19,pp.524-532(2017)描述了基于油包水液滴的分析原理。DNA编码文库的珠子被封装在液滴中，并在测试分析中孵育。任何在孵育分析中显示阳性反应的液滴(因此任何阳性微隔室)首先被分选出来，然后进一步检查从这些分选出来的液滴中分离的珠子是否是统计相关的命中。
ACS Comb.Sci.21,pp.425-435(2019)也描述了一种基于油包水液滴的分析。DNA编码文库的珠子被封装在液滴中，并在自分泌运动因子抑制活性的筛选分析中孵育。该分析不使用细胞靶标，而是使用均匀溶解的自分泌运动因子作为靶标。该公开也是首先分选出命中的液滴:图1显示了使用荧光检测的“液滴分选连接(5)”。
在这些现有技术的基于珠子的分析中，首先选择或分选出“阳性”微隔室(如微孔、液滴、细胞或其他)，然后将分选出的微隔室中包含的所有珠子汇集在一起，并分析它们的DNA标签。然而，“阳性”微隔室可能包含一个以上的珠子，其中通常只有一个是命中的珠子(即提供活性小分子的珠子)，而其他珠子是非命中的珠子。前述公开将这些未命中的珠子指定为“乘客珠子”，并推导出了“错误发现率”的数学表达式描述此类未命中的珠子的分离和发现程度。只有在第二轮测试中，才能确认一个分离的珠子是未命中的珠子。
如下文所述，可以计算在此类现有技术分析中分离的珠子是命中的珠子的概率——Ph。
微隔室中的珠群——Pb是泊松分布的:
Figure BDA0003263668010000031
其中km是所讨论的微隔室中珠子的数量(因此为0、1、2、)。km不能超过上限阈值K，该值取决于珠子的体积、微隔室的体积以及该体积的再现性。例如，包含在微隔室中的所有珠子的总体积不可能大于微隔室本身的体积。如果微隔室的体积是可变的，并且可以达到无穷大，那么K也可以达到无穷大。然而，真正的微隔室，如微孔或液滴，非常小，而且在体积上有很好的再现性。所以对于真实的微隔室，K通常小于10。减小微隔室的体积，从而减小K也是一种常用的降低λ的方法:微隔室的平均珠群λ必须小于其最大可能珠群K。λ是微隔室的平均珠群，定义为
Figure BDA0003263668010000041
其中M是所有微隔室的数量，并且总和涵盖所有M个微隔室。所述Pb是给定微隔室实际包含(km)珠子的概率。这种类型的珠子分布是用所有已知的设备将珠群分裂成微隔室而获得的。
在给定微隔室的所述km珠子内恰好具有kp命中珠子的概率Pp是超几何分布的:
Figure BDA0003263668010000042
其中N是在DNA编码的文库中的单个化学结构的数量，r是所谓的“文库命中率”(在所讨论的分析中是“活性”化学结构的文库化合物的比例；一个接近零但未知的数字)，ε是所谓的“文库当量”(具有与其相连的相同文库化学结构的珠子的数量)，kp是命中珠子的数量，km如上定义。这里的假设是，εN、rεN和ε(1-r)N是整数，或者四舍五入为整数。
给定的微隔室包含km珠子且其中恰好kp珠子在与细胞靶标孵育后为命中珠子(这些事件彼此独立)的概率P是：
Figure BDA0003263668010000051
如果其相关的kp大于0(因此包含至少一个命中珠子)，则现有技术方法将孵育的微隔室识别为“阳性”。这种“阳性”微隔室的km也大于0。从所有此类“阳性”微隔室中获得的所有珠子(命中的和未命中的)的量Btot因此为
Figure BDA0003263668010000052
其中kp的总和涵盖微隔室中所有可能的命中珠子的数量，至多为其中珠子的总数km，并且km的总和至多为阈值K，这是微隔室可以包含的珠子的最大数量。公式(6)假设一个给定的微隔室包含一个数量km或另一个数量km'的珠子是互斥事件，并且一个具有给定数量km的珠子的给定的微隔室包含一个数量kp或另一个数量kp’的命中珠子也是互斥事件。
从所有这样的“阳性”微隔室中获得的命中珠子的量Bh为
Figure BDA0003263668010000053
其中所有符号和解释如上。公式(7)做出了与上述公式(6)相同的关于互斥的假设。
则上述的Ph是
Figure BDA0003263668010000054
该Ph小于1，因为分子中的kp小于分母中相应的km。Ph随着λ增加而变小，因为分母中的λ多项式随着λ增加比分子中的λ多项式增加得更快，这也是因为kp小于相应的km。然而Ph值在λ＝0时达到最大值。也就是说，这些现有技术的方法在微隔室的实际上不可行的平均珠子群λ中具有最低程度的未命中珠子的错误发现。实际可行的平均珠子群具有大于0的λ(应该有其中包含一个或多个珠子的微隔室)。
因此，在现有技术的方法中，对于最低程度的错误发现，以及未命中珠子和实际可行的微隔室珠子群体的分析，都没有最佳方案；必须有其它改进方法。
本发明寻求克服前述问题。
发明内容
本发明提供:
1.一种筛选DNA编码的在细胞靶标中具有活性的化学结构文库的方法；其中已知所述细胞靶标在与活性化学结构接触时释放响应分子或改变响应分子的释放；其中所述文库的化学结构、相应的编码DNA和任选的对响应分子敏感的化学探针共价连接到珠子上，其中每个珠子包括
a)文库的一个单一化学结构的多个实例，每个实例通过结构接头共价连接到所述珠子上，所述结构接头可在可切割的结构接头位点切割；和
b)编码该化学结构的DNA序列的多个实例，每个DNA序列通过标签接头共价连接到所述珠子上，所述标签接头包含可切割的标签接头位点和可被切割剂切割；
c)在切割所述可切割标签接头位点的反应条件下，所述可切割结构接头位点是不可切割的，反之亦然；
并且所述标签接头和/或所述可切割的标签接头位点和/或所述DNA序列任选地可被所述响应分子切割；条件是，如果所述编码DNA序列和/或所述可切割的标签接头位点和/或所述标签接头可被响应分子切割，那么珠子优选不含对响应分子敏感的化学探针；
所述方法包括以下步骤:
(i)要么
(i-a)为待分析的每个单独的化学结构和每个单独的细胞靶标提供包含所述细胞靶标和一个或多个如上定义的珠子的孵育介质，所述珠子具有与其连接的那个单独的化学结构，通过在可切割的结构接头位点切割结构接头从孵育介质中的珠子上释放所述化学结构，并在孵育介质中孵育所述细胞靶标和所述释放的化学结构；
或
(i-b)提供一种包含细胞靶标和如上定义的所有珠子的单一孵育介质，使文库的所有化学结构与其连接，从孵育介质中分离包含一个或多个珠子的其等分试样，通过在可切割结构接头位点切割结构接头，在每个等分试样中从包含的珠子中释放化学结构，并在孵育介质的等分试样中孵育所述细胞靶标和所述释放的化学结构；
(ii)要么，如果编码DNA序列和/或可切割的标签接头位点和/或标签接头可被响应分子切割，则:
(ii-a-1)监控孵育介质或其等分试样从任何珠子中释放任何编码DNA序列或其片段；并且如果是这样，则从所有孵育介质或其所有等分试样中分离所有珠子，并汇集所有分离的珠子；
(ii-a-2)汇集的珠子中的可切割标签接头位点被切割剂切割以释放任何编码DNA序列或其片段；
(ii-a-3)将释放的编码DNA序列或其片段进行扩增和测序，以在其中鉴定DNA编码文库的任何完整DNA序列；和
(ii-a-4)将未在步骤(ii-a-3)中鉴定的DNA编码文库的完整DNA序列的剩余部分与DNA编码文库的相应化学结构相关联；
要么，如果珠子包含对响应分子敏感的化学探针，则:
(ii-b-1)监控孵育介质或其等分试样中任何探针与响应分子的任何反应或反应的变化，并且如果是这样，则从所有孵育介质或其等分试样中分离所有珠子并将其汇集；
(ii-b-2)从所述汇集中提取显示所述探针反应或所述探针反应的变化的珠子；
(ii-b-3)从所述汇集中提取的珠子中的可切割标签接头位点被切割剂切割，以释放与分离的珠子共价连接的任何DNA序列；
(ii-b-4)扩增并测序释放的DNA序列；和
(ii-b-5)将在步骤(ii-b-3)中测序的任何DNA序列与DNA编码文库的相应化学结构相关联；
和
(iii)选择如在步骤(ii-a-4)或(ii-b-5)中关联的任何化学结构作为进一步的所述活性化学结构。
该方法的优选实施方案依据从属权利要求。
附图说明
图1是适用于本发明方法的珠子的示意图，其本身形成本发明的一部分。
图2是适用于本发明方法的另一种珠子的示意图。
图3是含有珠子和细胞靶标的孵育介质的示意图。
具体实施方式
与现有技术的方法相比，本发明的方法首先从来自所有分析隔室(无论“阳性”与否)的所有孵育介质或其等分试样中分离并汇集所有珠子(无论是命中的还是未命中的珠子)，然后在汇集的珠子中鉴定命中的珠子。在本发明的方法中，分选出来的珠子的Ph是统一的，并且与微隔室中存在的平均珠群λ无关。在即时过程中，必须基于探针反应或基于DNA测序来识别更多珠子并不重要：对于前者，有非常强大的分选自动化分选工具(例如，在荧光探针的情况下，有FACS)，对于后者，有例如自动化下一代测序(NGS)。此外，有可能仅检查珠子汇集的一部分是否有命中珠。珠子汇集的这一部分可以是其代表性部分，例如包含一定数量的珠，该数量是文库中存在的化学结构的数量乘以引言中定义的“文库当量”ε，其中ε通常可以在1至100的范围内，优选5至50。
首先汇集所有珠子，然后分选出命中珠子的有利效果将在以下四个段落中解释。
引言中提到的现有技术的方法首先分选出命中的微隔室(例如命中的液滴)。因此，所有的微隔室，无论是否含有珠子，都需要通过分选器检查活性。如果预期获得Bh命中的珠子，则在现有技术方法中必须检查活性的必要微隔室的数量M现有技术是，使用上述公式(7)，
Figure BDA0003263668010000091
本发明的方法首先从所有微隔室(孵育介质或其等分试样)中分离和汇集所有珠子(命中的和未命中的)，然后分选出命中的珠子。分离的和汇集的珠子所必需的微隔室的数量在此假设为M本发明。分离的和汇集的珠子(命中的和未命中的)的数量是λM本发明，其中λ是根据上述公式(2)计算的上述微隔室的平均珠群。然后从汇集中分选出命中的珠子，得到的命中的珠子的数量为rλM本发明，其中r是上述“文库命中率”。为了与上述现有技术方法进行比较，这个命中珠的数量再次被指定为Bh。据此得到
Figure BDA0003263668010000101
从(9)和(10)的比较可以看出，为了获得所需数量Bh的命中珠，本发明的方法需要的微隔室数量M本发明比现有技术方法所需的微隔室数量M现有技术更少，在这些情况下，其中:
Figure BDA0003263668010000102
如果上面的阈值K假设为1，那么可以从上面的不等式简单地得到e-λ＜1
其独立于N、ε和r，并且满足任何λ>0。如前所述，λ也必须小于K。对于K＝1，λ的有用的范围因此是0<λ<1，并且在这种情况下，为了获得给定数量Bh的命中珠，本发明的方法在所需的微隔室数量方面优于上述现有技术的方法。
因此，本发明方法的优选实施方案是，其中:
1a)在步骤(1-a)中，对于其中可包含的珠子的数量，孵育介质具有上限阈值K为1，即，孵育介质不允许包含多于一个珠子，或者
1b)在步骤(i-b)中，对于其中可包含的珠子的数量，来自孵育介质的每个等分试样具有上限阈值K为1，即，来自孵育介质的每个等分试样不允许包含多于一个珠子，
此外
2)平均珠群λ，定义为
Figure BDA0003263668010000111
其中
(km)i是整数，表示第i孵育介质或孵育介质的第i等分试样中的珠子数量；M分别是孵育介质或孵育介质的等分试样的数量；并且总和分别涵盖所有孵育介质或孵育介质的所有等分试样，
所述平均珠群λ大于0且小于1.0。
K＝1的上述要求很容易通过刚性微隔室，例如适当小体积的微孔来实现，因为它们的刚性加强了K。对于柔性微隔室，例如液滴，可以立即用足够小的体积产生具有珠子的液滴，以确保K＝1。可替换地或除此之外，液滴的体积可以通过如ACS Comb.Sci.21,pp.425-435(2019)中使用的“液滴分离器”进一步减小。
参考图1、2和3，本文通过将化学结构2形式的小分子结合到珠子1上来提供上述问题的解决方案，该小分子通过可裂解结构接头3连接到珠子1上。结构接头3包括可切割的结构接头位点(3a)。珠子1还包括通过标签接头5连接到珠子1的DNA条形码4。标签接头5包含可被切割剂切割的可切割标签接头位点5a(图1)。在本发明的筛选过程中，在与细胞靶标孵育并分离和汇集珠子后，使用可切割的标签接头位点5a从珠子1上切下所有的DNA条形码4，然后允许将它们测序并与文库的相应化学结构相关联。在图1的实施方案中，标签接头5和/或可切割的标签接头位点5a和/或编码DNA 4被假定为可被孵育过程中产生的响应分子12切割，因此珠子1没有(则无必要)探针。或者，如果标签接头5、可切割的标签接头位点5a和编码DNA 4都不可被响应分子12切割，则珠子1进一步包括通过间隔物10连接到珠子1的化学探针7/8/9，如图2的实施方案所示。如图2所示，本文化学探针7/8/9优选由荧光团7和荧光团7的淬灭剂8组成，其中荧光团7和淬灭剂8通过响应分子可切割的间隔物9连接在一起。参照图3，细胞靶标11与珠子1一起被结合或共包封在孵育介质13或其样品隔室的等分试样中，并且化学结构2通过切割可切割结构连接位点(3a)从珠1中释放。化学探针与响应分子的反应(图2)或未切割形式的标签接头的持续存在(图3中均未示出，但隐含地假定与珠子1相连)记录了在孵育介质13或其等分试样中的细胞靶标11释放(或以不同水平释放)的响应分子12的存在和/或活性。图3仅示出了隔室中的一个珠子1，这是本发明的优选实施方案，但是也可以有多个珠子，每个珠子包含相同的化学结构。类似地，可能存在细胞靶标11的多个实例，而不是所示的唯一实例。
本发明的筛选过程使用以文库的化学结构、相应的DNA条形码和任选的响应分子的探针修饰的珠子。为了本发明的目的，任何类型的颗粒、固体或凝胶状材料都可以用作“珠子”，只要该颗粒材料
a)对进行本发明筛选过程的孵育介质呈惰性，特别是水性介质(“惰性”是指材料不与孵育介质反应，并且基本上不溶于其中)，和
b)具有包含化学反应性部分的颗粒表面，所述化学反应性部分允许化学结构、化学探针和DNA条形码通过各自的接头共价键合到珠子的表面。
珠子的主体可以是无机颗粒材料(例如二氧化硅或氧化铝)，在这种情况下，所述化学反应性部分将主要是羟基。在另一个更优选的实施方案中，珠子的主体是有机聚合物，特别是聚苯乙烯，其可以通过引入化学反应性部分在表面上进行修饰。市场上有许多这种表面修饰的有机珠子材料，例如Rapp Polymere以商标名
Figure BDA0003263668010000121
销售的珠子。这些珠子通常可包含0.1至0.5mmol/g珠子范围内的化学反应部分的表面负载。珠子优选为近似球形，优选平均直径在50μm至500μm的范围内。这样的珠子，即使是表面用化学反应性部分修饰的珠子，也是常规的。
本文使用的术语“化学结构”是指游离形式的小分子或结合到珠子上的小分子衍生物，由此从使用该术语的上下文中可以清楚地看出这两种含义中的哪一种适用。
本发明的筛选过程首先从珠子上切割化学结构，使得游离的、无DNA标签的化学结构穿透细胞靶标。化学结构一旦渗透到细胞靶标中，就可能与细胞靶标中存在的任何系统相互作用、反应、干扰、增强或抑制。这种系统可以是例如任何类型的受体，以及涉及细胞分化、转录、翻译、呼吸、膜构建和有丝分裂的系统。
将化学结构连接到珠子上的结构接头可以是任何有机二价基团，其一侧结合到珠子表面，另一侧结合化学结构。唯一需要的特征是该结构接头含有可切割的结构接头位点，这使得化学结构可以从孵育介质中的珠子中释放出来。优选地，所述可切割的结构接头位点紧邻化学结构，使得在切割时化学结构包含尽可能少的来自结构接头的剩余残基。
这种可切割的结构接头位点的优选实例在下表1中(*表示优选连接到结构接头剩余部分的化合价，而**表示优选直接连接到化学结构的化合价):
表1
Figure BDA0003263668010000131
Figure BDA0003263668010000141
这些可切割的结构接头位点本身是常规的，文献中有更多的例子。
本发明筛选过程中使用的珠子首先具有通过可切割的结构接头共价结合到珠子表面的文库化学结构。化学结构可以是在自然界中发现的任何化学化合物，其通过合成手段或通过(修饰的)生物活性(如转录)产生。化学结构的分子量可以例如在几百道尔顿至几千或几万道尔顿的范围内。
可以形成筛选文库的一部分的化学结构的优选实例是满足以下所有a)-d)的任何药学上可接受的化合物:
a)它们包含至多五个氢原子，其能够参与氢键合，并且衍生自羟基(提供一个这样的氢原子)、伯氨基(提供两个这样的氢原子)和仲氨基(提供一个这样的氢原子)；
b)它们包含最多十个能够充当氢键受体(包含能够参与氢键的电子孤对的部分)的氧和氮原子；
c)它们的分子量最多为500道尔顿；和
d)其辛醇/水分配系数的负十进制对数(-log(c正辛醇/c水)，其中c正辛醇是化合物在正辛醇中的摩尔浓度，c水是其在水中的摩尔浓度，化合物的正辛醇溶液和化合物的水溶液在25℃下相互接触并处于热力学平衡)最多为+5；优选在-0.4到+5的范围内。
满足上述条件的化合物通常被定义为“规则5”化合物。
优选地，本发明的筛选过程可以依赖于已知的化学结构文库作为与珠子连接的候选物。J.Med.Chem.59,pp.6629-6644(2016)的表1给出了已知文库的综述。为了在使用珠子的本方法中用作化学结构，如该出版物的该表所示，通过氨基直接连接到化学结构的DNA标签将被可切割的结构接头和连接到其上的珠子代替，如本文所述。此外，本文所述的拆分-合并方法将用于同时构建化学结构的片段和构件以及相关的DNA标签片段。
珠子包含“多个”与其连接的这种化学结构。所述“多个”必须足够大，使得化学结构一旦从即使一个单独的珠子中释放出来，在数量上足够，或者在孵育介质中的浓度足够高，从而引起响应分子从细胞靶标中可检测的释放。所述“多个”受到珠子表面上存在的反应位点数量的限制。如果即使当珠子的所有反应位点都连接到化学结构上，也不可能从细胞靶标获得可检测的响应分子释放，那么该化学结构可能先验地对其预期目的无效，并且可以从分析中丢弃。此外，所述“多个”化学结构可以在0.001至0.01摩尔当量的范围内，基于具有化学反应性部分的珠子的上述表面负载。
其次，本发明方法中使用的珠子具有通过标签接头共价连接到珠子表面的编码DNA。标签接头也可以是任何合适的有机二价接头，只要它包含可切割的标签接头位点，这允许在珠子与细胞靶标孵育、它们从其中分离和汇集之后从珠子中释放出DNA条形码。可切割标签接头位点及其相关切割试剂的例子可以是如上所述的可切割结构接头位点及其相关切割试剂，或者优选是核苷酸序列。更优选地，可切割的标签接头位点是可被作为切割剂的限制性内切酶切割的核苷酸序列，在这种情况下，该核苷酸序列包含该限制性内切酶的识别位点。文献中已知许多合适的限制性内切酶及其相关识别位点的例子。例如，WO2010/94036A1的表2在第二栏中公开了各种限制性内切酶及其相关的识别和切割位点。作为切割剂的最优选的限制性内切酶是Stu1。
在可被限制性内切酶切割的可切割标签接头位点的情况下，进一步优选的是标签接头还包含紧邻可切割标签接头位点的5-10个乙二醇单元(优选8个乙二醇单元)长度的PEG二价间隔物。这可能有利于限制性内切酶切割识别位点。
优选地，所述可切割的标签接头位点紧邻编码的DNA，使得切割时编码的DNA包含尽可能少的来自标签接头的剩余残基。优选地，标签接头本身通过所谓的“点击化学”反应构建。
标签接头、可切割标签接头位点和DNA条形码的上述优选变体，任选地具有形成标签接头的一部分并紧邻可切割标签接头位点的所述PEG间隔物，优选根据以下合成方案构建：
Figure BDA0003263668010000171
在该方案中，Fmoc-PEG衍生物是商业上可获得的，例如从JenKem(美国)、Abbexa(英国)或Iris Biotech(德国)获得。其中，n为5至10，优选为8。m是0至1，k是0至2；优选地，m和k都是0，或者m是0并且k大于0。C6-氨基封端的脱氧胸苷(dT)衍生物也是可商购的，例如从GeneLink(美国)获得。此后，Fmoc保护的胺部分可以被去保护，并且游离胺可以连接到已经连接到珠子的DNA标签接头上，或者游离胺可以直接连接到具有羧基表面官能团的珠子上，在这种情况下，PEG接头本身将形成DNA标签接头。如X和/或Y的一个或两个寡聚物可作为头饰DNA，在本文所述的分离和合并方法中，其他编码DNA的片段可连续地连接到该头饰DNA上。如果X和Y都是DNA寡聚物，那么这可能随后被用于以发夹DNA的形式构建DNA标签。可切割的标签接头位点可以例如通过使用碱性过氧化氢将脱氧胸苷部分附近的双键转化成邻位二醇来形成，然后该邻位二醇将是可被NaIO4切割的可切割的标签接头位点(见上面的表1)。或者，如上所述，如X和/或Y的寡聚物可以包含限制性内切酶识别位点作为可切割的标签接头位点。
对于本发明的方法和本发明的珠子，可切割的结构接头位点和可切割的标签接头位点在反应性上是“正交的”，即可切割的结构接头位点在切割可切割的标签接头位点的反应条件下是不可切割的，反之亦然；
标签接头和/或可切割的标签接头位点和/或编码的DNA可以被孵育过程中产生的响应分子切割，在这种情况下，化学探针是不必要的。然后，可切割的标签接头位点本身必须首先被切割剂切割，此外任选地被响应分子切割。本文中，切割剂和响应分子可以不同或相同；优选地，它们不同。
编码DNA本身优选是发夹DNA。这允许仅从一条DNA链构建完全双链的DNA，因为它可以自身配对成为双链。因此，只需要构建一条编码DNA的序列。编码的DNA除了要编码的化学结构的实际编码序列特征之外，还可以包括在将编码的DNA连接到珠子和/或在可切割的标签接头位点切割标签接头时可能必要或有益的前导和/或尾缀序列。这些进一步的前导和/或尾缀序列对于所有编码的DNA实例通常是相同的。
珠子包含“多个”这样的编码DNA实例。这个数目必须足够大，使得编码的DNA实例(即使来自一个单独的珠子)在数量上足够多，以允许扩增(例如通过PCR)，以及随后的测序。此外，基于具有化学反应性部分的珠子的上述表面负载，“多个”编码DNA实例可以在0.001至0.01摩尔当量的范围内。
本发明中使用的珠任选地包含化学探针，该探针对响应分子敏感并与珠子相连。化学探针可以是释放的响应分子的底物，其可以是酶、蛋白质或分子，使得珠子在与释放的物质和适当的添加剂一起孵育后发荧光(或停止发荧光)。或者(或与之结合)，释放的酶可以降解以改变与珠子结合的DNA条形码，从而通过扩增或杂交调节其检测。探针可以包括化学指示剂，包括报告分子。例如，它可以是比色测定的(即在响应分子和探针之间导致有色反应产物，其吸收可见光范围内的光)、荧光的(例如基于将响应分子和探针转化为当被特定波长的光激发时发出荧光的反应产物的酶)和/或发光的(例如基于生物发光、化学发光和/或光致发光)。优选地，探针在与响应分子接触时通过荧光反应，并且因此是荧光团或荧光团与相关淬灭剂的组合，其中响应分子从荧光团切割淬灭剂。然而，只有当珠子不包含标签接头时，化学探针才存在，标签接头本身可被响应分子切割。
将探针连接到珠的间隔物也可以如上所述用于结构接头和/或标签接头。
细胞靶标优选为原核或真核细胞。原核细胞更优选的例子是革兰氏阳性菌、革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性球菌和革兰氏阴性菌。真核细胞更优选的例子是真菌细胞和动物细胞，特别是人类细胞。细胞靶标包含蛋白质、受体或其他易于与从细胞靶标外部渗透到细胞介质中的化学结构相互作用的物质，在这种相互作用之后，细胞靶标可以开始产生响应分子，可以增加响应分子的产生，或者可以降低甚至停止响应分子的产生。
本发明筛选过程中使用的珠子是根据已知的化学方法合成的，或者通过将编码DNA通过标签接头与化学结构直接键合至接头，形成珠子。
或者，编码的DNA和化学结构可以直接在珠子上逐步合成，例如通过裂解和汇集合成(split-and-pool synthesis)。在该替代方案中，最初将“骨架”(待测文库中所有小分子共有的化学核心结构)通过如上所述的可切割接头连接到珠子上，并且还没有任何编码DNA的标签接头也连接到珠子上。骨架通常是包含一组多样性位点的含环结构，例如通常为1至3个多样性位点。每一个这样的多样性位点都是一个官能团，在该官能团上，各种不同的取代基可以通过同一个合成途径连接。如果存在一个以上的多样性位点，则多样性位点的反应性是“正交的”，即一个多样性位点可以在其特定的反应条件下与所述各种取代基反应，而不影响其他多样性位点，其他多样性位点仅在不同于所述一个多样性位点的反应条件下具有反应性。含有如此引入的骨架的珠子批次被分成与化学文库中的第一取代基一样多的子批次，并且每个子批次用一个这样的第一取代基修饰，并且同时或随后相关的第一编码DNA增量被添加到标签接头。子批次然后被重新汇集成一个单一批次。重新拆分为数量与库的另一个取代基相等的子批次，将另一取代基和另一相关的编码DNA增量连接到已经结合到珠子上的DNA标签上，使用常规的连接酶如T4连接酶，并重复多次再汇集，直到有更多的取代基连接到骨架上，也就是说，直到骨架中的所有多样性位点都被化学文库的相应取代基修饰。
骨架的多样性位点示例如下表2所示(*表示多样性位点与骨架的可能连接点):
表2:
Figure BDA0003263668010000201
Figure BDA0003263668010000211
已知上述多样性位点和反应与存在于同一分子或反应介质中的DNA部分相容，因此可以在编码DNA的存在下被修饰(参见，A.L.,Cai,J.,Chen,Y.,Goodnow,R.,Gruber,F.,Kowalczyk,A.,Petersen,A.,Naderi-Oboodi,G.,Orzechowsky,L.,Strebel,Q.,inBioconjugate Chemistry 26,,pp.1623ff.(2015))。
在本发明的方法中，珠子和细胞靶标在孵育介质中的孵育可以通过以下任一种方式完成:方式a):提供孵育介质并在其中将一个或多个包含一个唯一确定的化学结构的多个实例及其相关编码DNA的珠子与细胞靶标组合，并在该唯一的孵育介质中进行孵育(该替代方案要求每个化学结构和每种类型的细胞靶标有一个孵育介质)。“孵育介质”在这里被理解为这样的介质体积，其足够小以容纳在微隔室中，例如微孔或分散在油中或微点样或喷墨的液滴，但是其足够大以容纳至少一个珠子。
方式b):提供一种孵育介质，将含有文库的所有化学结构的多个实例的所有珠子和细胞靶标组合在其中，并从该孵育介质中分离出等分试样(这种替代方案需要一种孵育介质用于所有化学结构和每种类型的细胞靶标)。这里，“孵育介质的等分试样”被理解为从宏观尺寸的孵育介质中分离出的小体积部分，并且不一定代表宏观孵育介质的限定体积分数，其足够小以包含在微隔室中，例如微孔或分散在油中或微点样或喷墨的液滴，但是其足够大以包含至少一个珠。
如果珠子是不同类型的，在一个等分试样中具有两个或多个珠子可能在孵育之后在现有技术的分析中给出不明确的结果。然而，这对于本发明的方法来说并不是有害的，因为本发明的方法首先分离所有的珠子(命中和未命中)，然后才分离命中和未命中。总会有许多其他等分试样，每个试样包含一个所述不同类型的单个珠子。通常会有几十个等分试样包含给定类型的珠子，无论是单独的(主要情况)还是包含该珠子与一个或多个其他类型的珠子的组合。等分试样可以存在于样品隔室中，样品隔室可以采取任何形式，包括微孔板的孔、微制造的纳米孔、油中的水性液滴或由脂质双层组成的隔室。这样的样品隔室是常规的。等分试样可以通过机械微点样在孵育介质中共同点样细胞靶标和珠子来制备，在这种情况下，样品隔室可以简单地定义为通过空间距离彼此分离的等分液滴。或者，等分试样可从包含细胞靶标、珠子和任选添加剂的大体积孵育介质中以油包水乳液的水性液滴形式产生，其中每个单分散液滴优选仅包含一个珠。
在每种孵育介质或其等分试样中，仅一个珠子就足以进行本发明的分析。因此，约1.0，优选约0.2至约0.9的平均珠群λ是优选实施方案，其中λ如引言中所述进行定义和计算。
细胞靶标可以优选在将其分成所述等分试样之前加入到孵育介质中。另一方面，如果用于从珠子上切割化学结构的切割条件对细胞靶标有害，那么在已经从包含在其中的珠子上切割掉化学结构之后，并且任选地甚至在已经使有害的切割化学物质的任何残余物失活之后，将细胞靶标添加到已经分开的等分试样中可能是优选的。
然而，从珠子上切割化学结构必须在所述分成等分试样后进行，以保持对切割的化学结构和珠子结合的编码DNA标签的限制。
孵育介质本身通常是水性介质，通常含有进行分析和/或维持细胞靶标活性所需的其它佐剂和/或营养物(包括切割化学结构的酶和潜在调节剂)。孵育通常在允许维持细胞靶标的生存力的条件下进行，例如在室温和生理pH和盐浓度下或接近室温和生理pH和盐浓度下，持续一段时间，直到在孵育介质或其一个或多个等分试样中观察到响应分子的可能释放或释放变化，无论是通过附着到珠子上的探针的反应、孵育介质中切割的DNA的出现，还是任何其他适于检测孵育介质中响应分子的存在或量的技术(例如GC-MS)。在本发明的方法中，优选或者甚至是必要的是，响应分子与探针的任何反应，或者，视情况而定，响应分子对标签接头和/或可切割标签接头位点和/或编码DNA的任何切割，在动力学上是不可逆的。即，在可逆反应的情况下，反应的探针将转化回未反应的探针；或者在切割的标签接头和/或切割的标签接头位点和/或切割的编码DNA的情况下，如上所述，一旦响应分子与珠子分离，这些将通过简单地重建热力学平衡而重新连接。
孵育后，有两种替代方法可用于汇集珠子、分离命中的珠子、表征编码的DNA以及与文库化学结构的关联:
替代方法a(如果标签接头和/或可切割的标签接头位点和/或DNA序列可被响应分子切割):一旦在孵育介质或其任何等分试样中，或在大量等分试样中检测到任何释放的编码DNA或其片段，就从所有孵育介质中或从其所有等分试样中分离珠子，然后汇集。这种汇集消除了引言中讨论的Ph对孵育介质或其等分试样中存在的平均珠群λ的依赖性。这种分离也用于从响应分子的任何残余物中分离珠子，并且这种分离不可能采用现有技术中描述的方法。从等分试样中分离珠子在期望的时间点淬灭分析，然后允许在汇集状态下对珠子进行后续分析(即PCR扩增和测序)。采用现有技术中描述的方法，这种后续分析本质上是不可能的。在没有这种分离的情况下，响应分子将继续与汇集的珠子相互作用，并进一步切割附着在所有汇集的珠子上的DNA接头，这将使得不可能鉴定附着有活性化学结构的珠子。在该替代方案a)中，通过切割可切割的标签接头位点将所有分离珠的DNA从珠子中释放出来。随后，所有释放的DNA材料被分析和测序。大多数情况下会有释放的编码DNA的全长实例(如果在孵育过程中，响应分子既不切割标签接头，也不切割可切割的标签接头位点或编码DNA)。因此，这些释放的编码DNA的全长实例已经从带有化学结构的珠子中释放出来，该化学结构在孵育过程中是无活性的。此外，还会有编码DNA的释放片段(如果在孵育过程中响应分子切割了编码DNA本身)和完全不存在于释放的DNA材料中的编码DNA序列(如果在孵育过程中反应分子切割了标签接头或可切割的标签接头位点)。因此，这些释放的编码DNA片段和在释放的DNA材料中完全不存在的任何编码DNA的全长实例来自带有在孵育过程中具有活性的化学结构的珠子。因此，与文库中活性化学结构的相关性是由释放的DNA材料中存在的编码DNA的片段和释放的DNA材料中完全不存在的编码DNA的全长实例构成的。
在筛选珠子批次的孵育过程中，编码DNA的去除程度可以基于与对照珠子批次的比较。对照批次在没有任何孵育的情况下简单地进行DNA测序，或者任选地，对照批次是在与筛选批次相同的条件下(除了不存在细胞靶标之外)，在DNA测序之前孵育的。筛选和对照都使用相同总数的珠子进行。更优选地，本文筛选批次和对照批次中的珠子数量是分析化学文库中化学结构数量的20-100倍，因此引言中定义的ε在20-100的范围内。如果本文在对照批次中发现至少5个携带一种给定化学结构的珠子(也就是说，在这至少5个珠子中可以找到完整的对应的DNA标签)，并且在筛选批次中发现少于2个携带该化学结构的珠子(也就是说，完整的对应的DNA标签只能在这少于2个珠子中找到)，那么该化学结构可以被认为是可能的命中。如果在对照批次中发现基本上所有携带一种给定化学结构的珠子(也就是说，在基本上对应于用于每种化学结构的珠子数量的多个珠子中可以发现完整的对应的DNA标签)，并且在筛选批次中基本上没有发现携带该化学结构的珠子(也就是说，在筛选批次的珠子中基本上没有发现完整的相应DNA标签)，那么该化学结构可以被认为是明确的命中。
替代方法b(如果珠子具有对共价连接到其上的响应分子敏感的化学探针):如上所述，一旦在孵育介质或其等分试样中的孵育已经充分进行，则所有珠子从所有孵育介质或其等分试样中分离，并因此从响应分子的任何残余物中分离，然后汇集。这种汇集消除了Ph对孵育介质或其等分试样中存在的平均珠群λ的依赖性。这种分离还用于将珠子与响应分子的任何残余物分离。如果没有这种分离，响应分子将继续与进一步汇集的珠子的探针相互作用，并产生进一步的反应，这将使鉴定其上附着有活性化学结构的珠子变得不可能。此外，使用现有技术中描述的方法不可能进行这种分离。从等分试样中分离珠子在期望的时间点淬灭分析，然后允许在选择的稍后时间优化和完成收集的珠子的分类。在该替代方案b)中，然后将具有反应探针的珠子与具有未反应探针的珠子分离。如果反应的探针有荧光，而未反应的探针没有荧光(反之亦然)，那么这种分选可以使用商业上可获得的荧光激活细胞分选仪来完成(1亿个珠子可以在几小时内分选，比现有技术中描述的速度大100倍)。当采用现有技术中描述的方法时，使用商业上可获得的荧光激活细胞分选仪是不可能的，并且需要其较高的通量来查询数值较大的化学库。在该替代方案b)中，通过切割可切割的标签接头位点，从珠子中释放出所有已反应探针的分离珠子的DNA。随后，所有释放的DNA材料被分析和测序。将只有释放的编码DNA的全长实例。因此，与文库中活性化学结构的相关性是由存在于释放的DNA材料中的所有全长编码DNA实例构成的。
在替代方案b)中，用于文库的每个化学结构的珠子的数量优选在5-10的范围内，因此ε在引言中被定义为在5-10的范围内。
在上述分离替代方案a)或b)中的任一个中，如果需要，可以在分离珠子的第一步之前或作为第一步终止孵育反应，例如通过破坏或失活辅助剂和/或响应分子。这种破坏或失活可以例如通过变性剂(如乙醇)、加热、蒸发、沉淀、改变pH、氧化破坏或盐析来完成。
在上述分离替代方案a)或b)中的任一个中，汇集来自所有使用的孵育介质(上述孵育方式a)或来自其所有使用的等分试样(上述孵育方式b)。
在上述分离替代方案a)或b)中，任何释放的编码DNA或其释放片段优选通过标准技术如PCR扩增，并使用标准方案测序。下一代高通量测序可以为每个测序通道提供2亿个序列读数。以这种方式，被调查样本数量增加十倍对处理时间几乎没有影响，因此一千万个小分子可以像一百万个一样容易地被调查。因此，本发明的方法在物流和加工时间方面都是可规模化的。
本发明的筛选方法可以例如用于筛选:
a)化合物库的化学结构对致病细胞靶标的致死性。在这种情况下，响应分子可以是指示细胞靶标死亡或凋亡的蛋白质，或者它可以是细胞靶标本身的降解产物。在细胞靶标与之孵育期间，响应分子开始释放是致死性的指示。
b)化合物库化学结构在细胞靶标中的有益性。在这种情况下，响应分子可以是已知由健康细胞靶标以一定水平释放的任何化合物，并且已知在受损细胞靶标中以更高(或者更低)的水平释放。在细胞靶标与之孵育期间，响应分子的释放降低(或者增加)表明有益。
c)在药物本身不能穿透细胞靶标的情况下，化学结构作为能够穿透细胞靶标的前药的适用性。
本发明方法的第一个优选应用是分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告分析。该分析使用遗传工程化的报道细胞，该报道细胞通过化学结构间接报道SEAP的增强表达的内部激活，该表达随后从细胞靶标分泌到孵育介质或其等分试样中。这种基因工程报告细胞一方面可以根据已知技术进行定制设计。已公开的例子是例如由Pan KL.,Lee JC.,Sung HW.,Chang,TY.,Hsu,JTA；Antimicrob.Agents.Chemother.53(11)pp.4825-4834(2009)描述的Huh7.5-EG(_4B5A)SEAP细胞系在丙型肝炎病毒感染时分泌SEAP)和由Durocher D.,PerretS.,Thibaudeau E.,Gaumond MH.,Kamen A.,Stocco R.,Abramovitz M.,Anal.Biochem.284,pp.316-326(2000)描述的293E/CRE-SEAP细胞系(激活G蛋白偶联受体后分泌SEAP，这是许多已知药物的重要靶点)。这种工程细胞在某些情况下甚至可以在市场上买到。因此，细胞系实例是HEK-BlueTMIFN-α/β(在用人IFN-α或IFN-β刺激时表达和分泌SEAP)，设计的细胞系是由InvivoGen销售的THP1-BlueTMISG细胞系(在干扰素基因刺激因子(STING)激活时表达和分泌SEAP，其激活在癌症和感染性疾病的治疗中很重要)。所有这些细胞系也可以同样用于本发明的SEAP分析。
在本发明的SEAP分析中用作候选物并与珠子连接的化学结构一方面可以是上述“规则5”类型的化合物。作为第二优选类别的是使用已知的与DNA相容的化学物质合成的任何化合物。第三优选类别的化学结构候选物是大环肽。例如在ACS Chem.Biol.13,pp.53-59(2017)中已经公开的环肽库。为了在替代方法和珠子中用作化学结构，在酰胺基团上直接连接到环肽上的DNA标签，如该出版物所示，将被可切割的结构接头和连接到其上的珠子替代，如本文所述。化学结构候选物的另一个示例性子集可以例如根据下表3所示的下列文库之一
表3
Figure BDA0003263668010000261
Figure BDA0003263668010000271
Figure BDA0003263668010000281
出现在它们中的多样性位点X1和X2的例子可以是彼此独立的，例如-O-、-NH-、-(CH2-)、天然或非天然氨基酸(优选通过它们的氨基连接到各自的骨架羰基上，并通过它们的羧基连接到各自的骨架氨基上)；和由天然氨基酸组成的二肽或三肽(优选通过它们的N.末端连接到各自的骨架羰基上，通过它们的C末端上连接到骨架氨基上)。
这些化学结构在可切割结构接头上的连接可以类似于上面表1中概述的方式进行。
在本发明的SEAP探针中，与珠子连接的探针一方面可以是有机的，特别是芳香族或多芳香族，含羟基的荧光团或发色团，其中羟基已经转化为易于被释放的SEAP切割的磷酸盐。当被释放到孵育介质或等分试样中的SEAP切割时，磷酸基团被水解，从而使得荧光团发荧光或发色团着色或变色。这种磷酸盐淬灭的荧光团的已知例子是1-氧代-3’,6’-二膦氧基-螺环[异苯并呋喃-3,9’-呫吨]-5-羧酸和1-氧代-3’,6’-双(膦酰氧基甲氧基)螺环[异苯并呋喃-3,9’-呫吨]-5-羧酸]。这些磷酸化的发色团或荧光团优选还包含羧酸基团，该羧酸基团能够通过使用已经连接到珠子上的合适的氨基封端的接头形成酰胺基团而连接到珠子上。与相应的相似现有技术分析一样，在汇集的珠子中容易检测到现有荧光。珠结合发色团的固有颜色或固有颜色变化可以在汇集的珠上测量，例如通过反射光谱，而不是在相应的相似现有技术分析中使用的常规光谱。
本发明筛选方法的第二优选应用是筛选抗生素。这里的细胞靶标是一种病理性细菌，它在细胞死亡时释放一种核酸酶作为响应分子。在该第一应用中，珠子可以优选地包含单一化学结构的多个实例和通过标签接头共价连接至珠子的编码DNA序列的多个实例，所述标签接头含有可被该核酸酶切割的部分。除此之外，珠子没有任何其他对该响应分子敏感、可切割和/或反应的化学部分。也就是说，珠子可能由珠核、相连的化学结构和相连的编码DNA组成，但没有其他任何东西。这种珠子本身就是本发明的目的。这里，多个可能的抗生素候选物可以在一个步骤中连接到相同数量的珠子(或相同数量的珠子批次)，同时相应的编码DNA标签可以连接到每个这样的珠子(或每个珠子批次中的珠子)。或者，可以使用合适的骨架逐步构建珠子，该骨架在被其它取代基修饰后很可能产生抗菌活性化学结构。这里，这种骨架可以是例如含有例如赖氨酸、天冬酰胺和/或丝氨酸单元的环状寡肽，其提供例如羟基和/或氨基作为连接其它取代基的多样性位点。
本发明筛选方法的第三优选应用是筛选可能的抗癌药物的小分子。一种有效的抗癌药物可以诱导靶向癌细胞的凋亡。这种凋亡伴随着胱天蛋白酶的释放。在该第二特别优选的应用中，本发明的珠子可以优选包括作为探针，类似于由Yozwiak C.E,Hirschhorn,T.和Stockwell,B.R.in ACS Chem.Biol.2018,13,761-771描述的基于微粒的系统，下式的部分:
Figure BDA0003263668010000291
其中“间隔物”是二价残基；R1是荧光团，R2是淬灭剂，通过荧光共振能量转移(FRET)或通过接触淬灭作用于荧光团(R1)。其中的肽序列是SEQ ID NO.3。当在DEVD序列最右边的D氨基酸释放半胱天冬酶-3时，该探针被切割，这去除了淬灭剂(R2)，并使R1能够发出荧光。荧光珠子可以使用商业荧光激活细胞分选仪(FACS)进行分选。将阳性分选的珠子进行DNA扩增和测序，以发现哪个小分子最初连接到这些珠子并导致细胞凋亡和半胱天冬酶释放。优选地，在上述公式中，根据下表的一行选择R1和R2:
Figure BDA0003263668010000292
Figure BDA0003263668010000301
现在将通过以下非限制性实施例来说明本发明。
实施例1：氟喹诺酮类抗菌活性的分析
该试验使用氟喹诺酮类药物，如环丙沙星或左氧氟沙星，这些药物可能会引起细菌的氧化应激。氧化应激可能导致DNA损伤，从而从氧化应激细菌中释放核酸内切酶，如BapE DNA内切酶。
步骤1:制备条形码DNA并将其附着到珠子上(每个单独的条形码DNA的方案，对应于一种待分析的氟喹诺酮)
提供了各自的头饰DNA，每个头饰DNA含有独特的核苷酸序列来“标记”一种各自的氟喹诺酮，并用8条PEG链和伯胺官能化，如本申请概述部分所述。在0℃下，向这种官能化的头饰DNA(1mM在H2O中)的溶液中加入
Figure BDA0003263668010000302
碱(5当量)和(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]非-4-yn-9-基甲基N-琥珀酰亚胺碳酸酯(3当量)以0.2M的NMP溶液提供。反应完成后，如通过ESI-TOF质谱法判断的，按照报道的沉淀程序纯化反应。得到的官能化的DNA头饰(在下面的DNA-BCN中)以1mM的浓度重新悬浮在水中，无需进一步纯化即可使用。
用叠氮戊二酸(以0.29mmol/g加载)官能化的Tentagel珠被分成多个批次，对应于待分析的氟喹诺酮的数量。每批珠子先用PBS短暂洗涤，然后用水洗涤，最后用CH3CN洗涤。前一步得到的每个DNA-BCN(0.004当量)溶解在1∶1的PBS∶CH3CN混合物中(或者可以使用10％的吡啶水溶液)，然后将其添加到具有叠氮化物的批次之一中。然后在45℃的培养箱中进行应变促进的炔烃叠氮化物环加成(SPAAC)约24小时。DNA-BCN官能化珠子批次用CH3CN、PBS洗涤，最后用分子生物学级水洗涤，并在冰浴中保持在0℃直到进一步使用。
步骤2:将氟喹诺酮类附着到珠子上
在室温下，将步骤1中获得的所有DNA-BCN官能化珠批次使用三苯基膦在DCM和H2O中将剩余叠氮基部分还原为伯胺部分。
如此获得的每个珠批次根据以下方案与一种相应的氟喹诺酮抗生素反应。将珠子进行标准的肽偶联，并用酸不稳定的Rink接头，接着是PEG8接头和两个赖氨酸残基官能化。每批珠子(1.0当量，0.0096mmol)用4-(4-(1-羟乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸(一种仲醇光不稳定接头；4.0当量，38.4μmol)，HATU(3.8当量，36.5μmol)和Hünig氏碱(6.0当量，57.6μmol)在100μl的NMP的预活化的溶液中室温下处理2-12小时。然后仔细洗涤珠子，并通过酸介导的切割用LCMS检查分析样品。氟喹诺酮抗生素溶液(10.0当量，48.0μmol)，DIAD(15.0当量，72.0μmol)三苯基膦(15.0当量，72.0μmol)溶解在150μL的无水THF和少量NMP中，以帮助溶解准备的氟喹诺酮，并且在0℃下进行Mitsunobu复合物的形成。将如此制备的溶液倒在珠子上(1.0当量，0.0048mmol)。反应最初在0℃下进行，然后在室温下进行12小时，以用氟喹诺酮的羧酸盐取代已经与珠子结合的光不稳定接头的羟基。然后仔细洗涤珠子，并通过酸介导的切割用LCMS检查分析样品。最终汇集所有批次的珠子，以获得一个包含珠子的单一汇集，每个珠子都被一种独特的氟喹诺酮/DNA-BCN组合进行修饰。
步骤3:珠子和细菌细胞的封装和分析(每个待测菌株的方案)
使用流动聚焦微流体芯片，在油中产生水滴，产生单分散液滴的乳液。水相包含所讨论的细菌菌株的细胞、如上所述制备的完全官能化和条形码化的珠子和添加剂，使得每个液滴包含0、1或几个珠子和0、1、几个或多达几万个细菌细胞。液滴被收集在一个小的反应管中。带有珠子的液滴暴露在几分钟的紫外线下，通过上述光不稳定接头的光解切割从所有珠子中释放出氟喹诺酮类。液滴被孵育几个小时。然后，液滴任选地被热灭活(取决于所需的分析反应)，或者乳液被有机溶剂破坏，这也停止了检测反应。在玻璃料上收集珠子，并通过PCR扩增滤液并测序以测试是否存在可能被细菌核酸内切酶切割的任何头饰DNA，表明与该头饰DNA相关的氟喹诺酮对该细菌具有活性。
实施例2：考虑到含有化学结构的连接文库和连接的编码DNA的珠子的裂解和汇集合成，珠子连接的编码DNA的顺序构建
在0℃下，向本申请概述部分所述的用8条PEG链和伯胺(1mM在H2O中)官能化的头饰DNA低聚物和伯胺溶液中加入Hünigs氏碱(5当量)和(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]非-4-yn-9-基甲基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(3当量)在NMP中的0.2M溶液。反应完成后，如通过ESI-TOF质谱法判断的，按照报道的沉淀程序纯化反应。得到的官能化DNA头饰(DNA-BCN)以1mM的浓度重新悬浮在水中，无需进一步纯化即可使用。
用叠氮戊二酸(以0.29mmol/g加载)官能化的Tentagel珠子用PBS简单洗涤，然后用水洗涤，最后用CH3CN洗涤。前一步的DNA-BCN(0.004当量)溶解在1∶1的PBS∶CH3CN混合物中(或者可以使用10％的吡啶水溶液)，并加入到Tentagel珠子中。应变促进的炔烃叠氮化物环加成(SPAAC)然后在45℃的培养箱中进行约24小时，得到具有连接到其上的初始头饰DNA寡聚体的珠子。
前一步得到的珠子用CH3CN、PBS洗涤，最后用分子生物学级的水洗涤。制备连接混合物时，将珠子在冰浴中保持在0℃。将要连接到现有DNA标签上的进一步标记DNA相对于来自前一步的DNA加载在无DNAse的水中稀释，加入10X T4连接缓冲液，并将混合物保持在冰上；对于10-15mgs珠子，连接最终体积约为150μL。然后加入T4 DNA连接酶，将混合物倒在珠子上。然后反应在室温下进行5至16小时。
上一段中所述的DNA标记步骤进行的次数与在裂解汇集合成中连接到固定骨架上的可变取代基一样多。
实施例3：珠子的分类
该方案可以例如应用于在本发明的分析中使用的珠子，其中珠子包含荧光团和作为探针的相关淬灭剂，并且淬灭剂被响应分子去除。孵育结束后，从孵育介质及其响应分子中分离珠子，然后将分离的珠子(带有荧光和非荧光探针)合并
用商业荧光激活细胞分选仪(FACS)通过对珠子的所需属性进行门控(荧光与否，以及潜在的其他质量控制门)对汇集的珠子进行分选。阳性分选的珠子进行DNA扩增和测序。
实施例4：基于珠子的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告分析
步骤1:淬灭的荧光素标记珠子的制备
将淬灭的荧光素衍生物(如1-氧代-3',6’-二膦氧基-螺[异苯并呋喃-3,9’-呫吨]-5-羧酸或1-氧代-3',6’-双(膦酰氧基甲氧基)螺[异苯并呋喃-3,9’-呫吨]-5-羧酸)与用5’-氨基C6修饰的单链DNA和与水相容的酰化试剂如DMT-MM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉氯化物)一起在水性缓冲液中孵育。具有珠结合的DNA条形码的DNA编码文库珠子含有单链DNA末端，其序列与上述荧光素单链DNA缀合物的序列互补。荧光素单链DNA缀合物，在与文库珠子的汇集孵育后，与珠子上的互补物退火，形成稳定的双链DNA双链体。
或者，荧光素单链DNA缀合物可以与另一种单链DNA寡聚物退火，形成带有突出端的双链体。在这种情况下，具有珠结合的DNA条形码的DNA编码文库珠子将以2-4个碱基的短突出端终止，并且该突出端将补充上述荧光素缀合双链DNA的突出端。然后使用连接酶将双链DNA寡聚体和条形码共价连接，如前所述(参见Clark等人)。使用上述任何一种方法，文库珠子可以根据需要用任何探针标记。
步骤2:珠子和真核(THP1-DualTMKI-hSTING-S154,InvivoGen)细胞的封装和分析
使用流动聚焦微流体芯片，在油中产生水滴，产生单分散液滴的乳液。水相包含所需的真核细胞、如上制备的完全官能化和条形码化的珠子(另外用磷酸化荧光素标记)和添加剂，使得每个液滴包含0、1或几个珠子和0、1、几个或多达数百个真核细胞。请注意，对于THP1-DualTMKI-hSTING-S154细胞，添加剂可能包括2'3'-cGAMP。此外，阳性对照(已知的不可逆小分子抑制剂H-151，InvivoGen)也可以用作添加剂，为以后的统计分析和珠子分选提供基线。液滴被收集在一个小的反应管中。带有珠子的液滴暴露在几分钟的紫外线下，通过上述光不稳定接头的光解切割从所有珠子中释放文库成员。液滴被孵育几个小时。然后液滴被热灭活，或者乳液被有机溶剂破坏，这也停止了检测反应。将珠子收集在玻璃料上并汇集，通过FACS从汇集中分选出具有低荧光的命中珠子。然后低荧光的珠子通过PCR扩增并测序；低荧光表明与该条形码DNA相关的释放的小分子成功地抑制了STING激活，从而阻止了SEAP的释放。
序列表
<110> 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
<120> 使用修饰珠的小分子筛选细胞分析
<130> P44572EP00 (P35234-EP)
<140> EP19169563.4
<141> 2019-04-16
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头肽亚结构
<400> 1
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头 DNA 切割序列
<400> 2
gtaacgatcc agctgtcact 20
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头切割位点
<400> 3
Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Ser Gly Lys
1 5 10

Claims (15)

1.一种用于筛选DNA编码的化学结构文库(2)在细胞靶标(11)中的活性的方法；其中已知所述细胞靶标(11)在与活性化学结构接触时释放或改变响应分子(12)的释放；其中所述文库的化学结构(2)、对应的编码DNA(4)和任选的对响应分子(12)敏感的化学探针(7/8/9)共价连接到珠子(1)上，其中每个珠子(1)包括
a)文库的一个单一化学结构(2)的多个实例，每个实例通过结构接头(3)共价连接到所述珠子(1)上，所述结构接头(3)可在可切割的结构接头位点(3a)处切割；和
b)编码该化学结构(2)的DNA序列(4)的多个实例，每个DNA序列(4)通过标签接头(5)共价连接到所述珠子(1)上，所述标签接头(5)包含可切割的标签接头位点(5a)并可被切割剂(6)切割；
其中在切割所述可切割标签接头位点(5a)的反应条件下，所述可切割结构接头位点(3a)是不可切割的，反之亦然；
并且所述标签接头(5)和/或所述可切割的标签接头位点(5a)和/或所述DNA序列(4)任选地可被所述响应分子(12)切割；条件是，如果所述编码DNA序列(4)和/或所述可切割的标签接头位点(5a)和/或所述标签接头(5)可被响应分子(12)切割，那么所述珠子(1)优选没有响应分子敏感的化学探针(7/8/9)；
该方法包括以下步骤:
(i)要么
(i-a)为待分析的每个单独的化学结构(2)和每个单独的细胞靶标(11)提供包含所述细胞靶标(11)和一个或多个如上定义的珠子(1)的孵育介质(13)，所述珠子具有与其连接的那个单独的化学结构，通过在可切割的结构接头位点(3a)切割结构接头(3)从孵育介质(13)中的珠子(1)上释放所述化学结构(2)，并在孵育介质中孵育所述细胞靶标(11)和所述释放的化学结构(2)；
或
(i-b)提供一种包含细胞靶标(11)和如上定义的所有珠子(1)的单一孵育介质(13)，使文库的所有化学结构(2)与其连接，从孵育介质中分离包含一个或多个珠子(1)的等分试样，通过在可切割结构接头位点(3a)切割结构接头(3)，在每个等分试样中从包含的珠子(1)中释放化学结构(2)，并在孵育介质(13)的等分试样中孵育所述细胞靶标(11)和所述释放的化学结构(2)；
(ii)要么，如果编码DNA序列(4)和/或可切割的标签接头位点(5a)和/或标签接头(5)可被响应分子(12)切割，则:
(ii-a-1)监控孵育介质(13)或其等分试样从任何珠子(1)中释放任何编码DNA序列(4)或其片段；并且如果是，则从所有孵育介质(13)或其所有等分试样中分离所有珠子(1)，并汇集所有分离的珠子(1)；
(ii-a-2)汇集的珠子(1)中的可切割标签接头位点(5a)被切割剂(6)切割以释放任何编码DNA序列(4)或其片段；
(ii-a-3)将释放的编码DNA序列(4)或其片段进行扩增和测序，以在其中鉴定DNA编码文库的任何完整DNA序列；和
(ii-a-4)将未在步骤(ii-a-3)中鉴定的DNA编码文库的完整DNA序列的剩余部分与DNA编码文库的相应化学结构(2)相关联；
要么，如果珠子(1)包含对响应分子敏感的化学探针(7/8/9)，则:
(ii-b-1)监控孵育介质(13)或其等分试样中任何探针(7/8/9)与响应分子(12)的任何反应或反应的变化，并且如果是这样，则从所有孵育介质(13)或其等分试样中分离所有珠子(1)并将其汇集；
(ii-b-2)从所述汇集中提取显示所述探针反应或所述探针反应的变化的珠子(1)；
(ii-b-3)从所述汇集中提取的珠子(1)中的可切割标签接头位点(5a)被切割剂(6)切割，以释放与分离的珠子(1)共价连接的任何DNA序列(4)；
(ii-b-4)扩增并测序释放的DNA序列(4)；和
(ii-b-5)将在步骤(ii-b-3)中测序的任何DNA序列与DNA编码文库的相应化学结构(2)相关联；
和
(iii)选择在步骤(ii-a-4)或(ii-b-5)中如此关联的任何化学结构(2)作为进一步的所述活性化学结构。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述孵育介质(13)或所述孵育介质(13)的等分试样具有平均珠群λ，定义为
Figure FDA0003263667000000031
其中(km)i是整数，表示第i孵育介质或孵育介质的第i等分试样中的珠子数量；M分别是孵育介质或孵育介质的等分试样的数量；并且总和分别在所有M个孵育介质或孵育介质的所有M个等分试样之上；约1.0。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中标签接头(5)和/或可切割的标签接头位点(5a)和/或DNA序列(4)可被响应分子(12)切割；并且执行步骤(ii-a-1)、(ii-a-2)、(ii-a-3)和(ii-a-4)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞靶标(11)是原核细胞，特别是细菌，已知其在与活性化学结构接触时经历细胞死亡，从而释放核酸酶作为所述响应分子(12)；并且所述标签接头(5)和/或所述可切割的标签接头位点(5a)和/或所述DNA序列(4)可被所述核酸酶切割。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述珠子(1)包括化学探针(7/8/9)，所述化学探针对所述响应分子(12)敏感并共价连接至所述珠子(1)；并且执行步骤(ii-b-1)、(ii-b-2)、(ii-b-3)、(ii-b-4)和(ii-b-5)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞靶标(11)是真核细胞，所述真核细胞被修饰，使得当所述期望的细胞靶标或途径与合适的化学结构(2)接触时，所述响应分子(12)是分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)；并且所述化学探针对分泌的胚胎碱性磷酸酶敏感。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述化学探针(7/8/9)是荧光团(7)和淬灭剂(8)的组合，所述淬灭剂通过荧光共振能量转移(FRET)或通过接触淬灭作用于所述荧光团(7)而起作用；其中所述荧光团(7)和所述淬灭剂(8)在间隔物(9)上彼此连接，该间隔物可被所述响应分子(12)切割；并且其中在步骤(ii-b-1)中，通过荧光团(7)的入射荧光，监测孵育介质(13)或其等分试样的间隔物(9)被响应分子(12)的切割。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述可切割的标签接头位点(5a)是可被作为切割剂(6)的限制性内切酶切割的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述标签接头(5)包括紧邻所述可切割标签接头位点(5a)的结构-O-(CH2-CH2-O)n-的二价间隔物(5b)，其中n是5至10的整数，优选为8。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中每个珠子(1)包括通过紫外光可切割的结构接头(3)与所述珠子(1)连接的所述化学结构(2)的多个实例。
11.一种珠子(1)，其包括:
a)有机聚合物，特别是聚苯乙烯的珠核；
b)一个单一化学结构(2)的多个实例，每个实例通过可切割结构接头(3)共价连接到珠子上，所述接头(3)可在可切割结构接头位点(3a)上切割，
c)编码唯一化学结构(2)的DNA序列(4)的多个实例，每个DNA序列(4)通过标签接头(5)共价连接到珠子(1)，所述标签接头(5)包含可被切割剂(6)切割的可切割标签接头位点(5a)；并且所述标签接头(5)和/或所述可切割的标签接头位点(5a)和/或所述DNA序列(4)可被响应分子(12)切割；其中所述可切割结构接头位点(3a)在切割所述可切割标签接头位点(5a)的反应条件下不可切割，反之亦然；
所述珠子(1)优选不含任何其他对反应分子(12)敏感、可切割和/或反应的化学部分；
或者由a)、b)和c)组成的珠子(1)。
12.根据权利要求11所述的珠子，其中所述响应分子(12)是核酸酶。
13.根据权利要求11或12所述的珠子(1)，其中可切割标签接头(5)含有核苷酸序列作为可切割部分(5a)，所述核苷酸序列可被作为切割剂(6)的限制性内切核酸酶切割。
14.根据权利要求13所述的珠子(1)，其中所述标签接头(5)包括紧邻所述可切割标签接头位点(5a)的结构-O-(CH2-CH2-O)n-的二价间隔物(5b)，并且其中n是5至10的整数，并且优选为8。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的珠子(1)，其中所述可切割结构接头位点(3a)可被紫外光切割。
CN202080021554.3A 2019-04-16 2020-04-15 使用修饰珠的小分子筛选细胞分析 Pending CN113597471A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19169563 2019-04-16
EP19169563.4 2019-04-16
PCT/EP2020/060616 WO2020212439A1 (en) 2019-04-16 2020-04-15 Small molecule screening cellular assay using modified beads

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113597471A true CN113597471A (zh) 2021-11-02

Family

ID=66217794

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080021554.3A Pending CN113597471A (zh) 2019-04-16 2020-04-15 使用修饰珠的小分子筛选细胞分析

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220213471A1 (zh)
EP (1) EP3956467A1 (zh)
JP (1) JP2022529404A (zh)
CN (1) CN113597471A (zh)
WO (1) WO2020212439A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4041310A4 (en) 2019-10-10 2024-05-15 1859, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR MICROFLUIDIC SCREENING
WO2022084486A1 (en) * 2020-10-23 2022-04-28 Eth Zurich Self-purified nucleic acid encoded libraries
WO2024173611A1 (en) * 2023-02-15 2024-08-22 Aizen Therapeutics, Inc. Compositions and methods for identifying candidate targeting biomolecules

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5958703A (en) * 1996-12-03 1999-09-28 Glaxo Group Limited Use of modified tethers in screening compound libraries
CN1378593A (zh) * 1999-08-20 2002-11-06 约翰斯霍普金斯大学医学院 构建融合文库的方法和组合物及该文库的用途
WO2013057188A1 (en) * 2011-10-19 2013-04-25 Danmarks Tekniske Universitet In-bead screening

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10202007808YA (en) 2009-02-13 2020-09-29 X Chem Inc Methods of creating and screening dna-encoded libraries
US20190264199A1 (en) 2016-11-08 2019-08-29 Nanna Therapeutics Limited Tagless encoded chemical library

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5958703A (en) * 1996-12-03 1999-09-28 Glaxo Group Limited Use of modified tethers in screening compound libraries
CN1378593A (zh) * 1999-08-20 2002-11-06 约翰斯霍普金斯大学医学院 构建融合文库的方法和组合物及该文库的用途
WO2013057188A1 (en) * 2011-10-19 2013-04-25 Danmarks Tekniske Universitet In-bead screening

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARRIE E. YOZWIAK等: "Toward a Microparticle-Based System for Pooled Assays of SmallMolecules in Cellular Contexts", ACS CHEMICAL BIOLOGY, vol. 13, no. 3, 16 March 2018 (2018-03-16), pages 762, XP055803302, DOI: 10.1021/acschembio.8b00043 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3956467A1 (en) 2022-02-23
WO2020212439A1 (en) 2020-10-22
JP2022529404A (ja) 2022-06-22
US20220213471A1 (en) 2022-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11577249B2 (en) Oligonucleotide encoded chemical libraries
EP3710594B1 (en) Methods to measure functional heterogeneity among single cells
CN113597471A (zh) 使用修饰珠的小分子筛选细胞分析
US20050070005A1 (en) High throughput or capillary-based screening for a bioactivity or biomolecule
US20040241759A1 (en) High throughput screening of libraries
US20030049841A1 (en) High throughput or capillary-based screening for a bioactivity or biomolecule
JP2005501217A (ja) 生体活性または生体分子のハイスループットスクリーニングまたはキャピラリーに基づくスクリーニング
US20030068649A1 (en) Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries
KR20020059370A (ko) 융합 라이브러리의 제작 및 사용을 위한 방법 및 조성물
WO2016160908A1 (en) Methods for combining single cell profiling with combinatorial nanoparticle conjugate library screening
CN105764490A (zh) 用于生物测定和诊断的胶囊封装的传感器和感测系统及其制造和使用方法
US20030036643A1 (en) Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries
US20090130650A1 (en) Methods for the production of highly sensitive and specific cell surface probes
EP3308164B1 (en) High throughput optimization of content-loaded nanoparticles
WO2002068698A2 (en) Use of nucleic acid libraries to create toxicological profiles
GB2593091A (en) Solid-phase N-terminal peptide capture and release
US20020025537A1 (en) High-throughput methods for generating and screening compounds that affect cell viability
JP2003515150A (ja) キャピラリーアレイに基づくサンプルスクリーニング
EP1041160A1 (en) Methods for detecting mutation in base sequence
WO2020096015A1 (ja) １種以上の被検物質と共存した細胞のゲノム関連情報を検出する方法
KR20040015804A (ko) 세포내 과정의 관측 및 신약 검색을 위한 시스템
US20220364147A1 (en) Color and bardcoded beads for single cell indexing
CN101086501A (zh) 一种蛋白质芯片
KR20120044395A (ko) 탄저균 독소의 방어항원에 특이적인 앱타머를 선별하는 방법
AU2596800A (en) Method for generating a pathway reporter system

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40058339

Country of ref document: HK

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination