CN113575968B - 一种超声辅助糖基化修饰卵转铁蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种超声辅助糖基化修饰卵转铁蛋白的方法，将卵转铁蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，得到混合溶液；后向混合溶液中添加黄原胶并搅拌混合均匀，配制成卵转铁蛋白/黄原胶混合液；卵转铁蛋白/黄原胶混合液搅拌均匀后，放置；放置后的卵转铁蛋白/黄原胶混合液进行超声处理；将超声处理后的卵转铁蛋白/黄原胶置于水浴中加热搅拌，迅速冷却至室温得到超声卵转铁蛋白/黄原胶复合物溶液，然后冷冻干燥得卵转铁蛋白/黄原胶复合物。超声辅助糖基化修饰提高了OVT的起泡性质，OVT发泡能力由43.54%提高到了96.73%，发泡稳定性也显著提升。扩宽了卵转铁蛋白的加工适用性。

Description

一种超声辅助糖基化修饰卵转铁蛋白的方法

技术领域

本发明涉及食品加工领域，具体涉及一种超声辅助糖基化修饰卵转铁蛋白的方法。

背景技术

蛋白质作为蛋清的主要成分，对其物理和生物学特性起着重要作用。蛋清蛋白是一种常见的、经济有效的食品成分，具有很高的营养价值。蛋清主要由水和多种蛋白质组成，包括卵白蛋白(54％)、OVT(13％)、卵类粘蛋白(11％)、溶菌酶(3.5％)和卵粘蛋白(3.5％)。卵转铁蛋白(OVT)是一种糖蛋白，作为一种食品级蛋白，具有良好的生物相容性，是制作口服食物系统的理想选择。然而，目前对于OVT的改性研究落脚点多集中于生物活性方面，如对OVT进行了磷酸化改性处理后发现其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用上升，说明磷酸化修饰提高了其抑菌活性。但目前由于OVT同时对热极为敏感，在53℃～65℃发生变性和聚集，导致蛋白粘度和初始凝胶性的改变，乳化特性和起泡性很差，不利于在食品加工中的作为原料或者添加剂的开发利用，因此需要对卵转铁蛋白的稳定性以及加工适应性进行深入的研究。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种超声辅助糖基化修饰卵转铁蛋白的方法。

本发明提供所采用的技术方案是：

一种超声辅助糖基化修饰卵转铁蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

S1:将卵转铁蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，得到混合溶液；

S2：后向混合溶液中添加黄原胶并搅拌混合均匀，配制成卵转铁蛋白/黄原胶混合液；

S3：卵转铁蛋白/黄原胶混合液搅拌均匀后，放置；

S4：经步骤S3放置后的卵转铁蛋白/黄原胶混合液进行超声处理；

S5：将超声处理后的卵转铁蛋白/黄原胶置于水浴中加热搅拌，迅速冷却至室温(20-28℃)得到超声卵转铁蛋白/黄原胶复合物溶液，然后冷冻干燥得卵转铁蛋白/黄原胶复合物。

优选地，所述步骤S1：卵转铁蛋白的浓度为0.8-1.2mg/mL，磷酸盐缓冲液的浓度为0.05-0.15mol/L，pH为7.2-7.6。

优选地，所述步骤S2：黄原胶添加的量为溶液中卵转铁蛋白质量的三分之一至二分之一。

优选地，所述步骤S3：4℃放置10-14小时。

优选地，所述步骤S4中，超声处理条件为：超声功率为200-400W，处理时间为10-40min，超声处理模式为工作1.5-2.5s、间歇3-54s。

优选地，所述步骤S5中，水浴温度为65-95℃，水浴时间0.8-1.2h。

本发明的有益效果是：

1、超声辅助糖基化修饰提高了OVT在溶剂中的分散性，使粒径减小，电负性增大，溶液体系更稳定。可显著提高OVT的糖基化程度，在超声辅助糖基化处理20min时，OVT的接枝度最高为20.98％。同时使OVT的变性温度从54.9℃提升到70.1-85℃左右，其热稳定性上升。可以有效提高OVT的溶解度，并且在20min时达到最大溶解度为78.18％，且与糖基化程度变化规律一致。且明显提高OVT的起泡性质，OVT发泡能力由43.54％提高到了96.73％，发泡稳定性也显著提升。使OVT表面张力快速下降，表面压上升，使得蛋白粒子具有较快的吸附速率，从而有利于具有粘弹特性的薄膜的形成，因此具有较高的起泡性和起泡稳定性。黄原胶与卵转铁蛋白结合后，会改变蛋白质的表面疏水性，提高蛋白质的溶解度。扩宽了卵转铁蛋白的加工适用性。

2、在超声波操作之前的水化静置处理和加热对于溶解性和起泡性也是有较大作用的，水化可以使得卵转铁蛋白和黄原胶充分进行反应交联，且超声处理只有在原料充分溶解反应后再结合超声处理，才能显著提高混合的溶解性和起泡性，因为如果超声在前期卵铁蛋白溶液配制的过程中处理后后期加入黄原胶的过程中，形成的反应体系被破坏需要重新结合，而在超声波反应后再进行水化后进行美拉德反应，也不利于起泡性能的增加。

附图说明

图1不同超声时间下的接枝度；

图2不同超声时间下的电泳图(1～6依次代表N-OVT、U-OVT/XG-0MIN、U-OVT/XG-5MIN、U-OVT/XG-10MIN、U-OVT/XG-20MIN、U-OVT/XG-40MIN)

图3不同超声时间下粒径分布(A)；电位(B)

图4不同超声时间下的A420和A294(A)；近紫外光谱(B)；发射荧光光谱(C)

图5不同超声时间下的红外光谱图

图6不同超声时间下的DSC变化曲线

图7不同超声时间下的溶解度

图8不同超声时间下的起泡性(A)和起泡稳定性(B)

图9不同超声时间下的表面张力(A)和表面压(B)

图10不同超声时间下的E-π曲线(A)和粘弹模量(B)

图11不同超声时间下的泡沫界面结构

图12不同超声时间下的起泡能力与泡沫半衰期(A)；泡沫高度的变化曲线(B)；气泡大小随着时间的变化图(C)

具体实施方式

实施例1

一种超声辅助糖基化修饰卵转铁蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

S1:将卵转铁蛋白(1mg/mL)溶于磷酸盐缓冲液(0.1mol/L、pH 7.4)中，得到混合溶液；

S2：后向混合溶液中添加OVT质量一半的黄原胶并搅拌混合均匀，配制成卵转铁蛋白/黄原胶混合液；

S3：卵转铁蛋白/黄原胶混合液搅拌均匀后，4℃放置12小时；

S4：经步骤S3放置后的卵转铁蛋白/黄原胶混合液进行超声处理，控制超声功率为300W，分别对混合液进行5、10、20、40min超声预处理。超声处理模式为工作2s、间歇4s；

S5：将超声处理后的卵转铁蛋白/黄原胶置于95℃水浴中加热搅拌1h，迅速冷却至室温(25℃)得到超声卵转铁蛋白/黄原胶复合物溶液，然后冷冻干燥得卵转铁蛋白/黄原胶复合物。分别记作U-OVT/XG-5MIN、U-OVT/XG-10MIN、U-OVT/XG-20MIN和U-OVT/XG-40MIN。相同的混合液未经超声预处理直接进行95℃水浴热处理，随后与超声OVT/XG复合物的处理方式相同，记作U-OVT/XG-0MIN。以不添加糖的OVT样品为对照组，所得样品记作N-OVT。

一、检测方法

1、接枝度测定

采用OPA试剂法测定接枝度。将80mg OPA溶解在2mL体积分数95％乙醇溶液中，并依次加入50mL10mmol/L四硼酸钠缓冲液、5mL质量分数20％SDS溶液以及200μLβ-巯基乙醇，充分混匀后用UP水稀释至100mL配成OPA试剂。将200μL待测样品溶液(2mg/mL)与4mL OPA试剂在室温下反应5min，然后测定其在340nm波长处的紫外吸光度，以天然OVT作为对照样，接枝度(DG)的计算公式如下。

式中：Ac为对照样的吸光度；As为样品的吸光度。

2、SDS-PAGE

利用SDS-PAGE对蛋白质分子量变化进行分析。将1mg/mL的蛋白溶液与上样缓冲液等体积混合，煮沸5min后以10000r/min的速度离心2min。浓缩胶与分离胶的浓度分别采用4％与12％，电压分别设置为70V和100V。电泳结束后，采用考马斯亮蓝R-250染色4h。后利用甲醇、冰醋酸、双蒸水的混合液进行脱色持续12h，每3h换一次脱色液。

3、粒径和电位的测定

溶于蒸馏水和PBS缓冲液(50mmol/L，pH 7.4)中，配成0.1mg/mL蛋白溶液，充分溶解后水化过夜。通过Zetasizer Nano-ZS型纳米粒度在平衡时间1min、25℃条件下测定其粒径及电位。

4、紫外分光光度的测定

将冻干后的蛋白-糖复合物溶于磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中，浓度为5mg/mL，在420nm波长下测定其吸光值，可将其视为糖基化反应的最后阶段。后将样品浓度稀释至0.5mg/mL溶液，在295nm波长下测定其吸光值，该值可视为糖基化反应中间阶段。同时，采用同样方法配置浓度为1mg/mL的蛋白-糖复合物溶液，并在200nm～800nm波长范围下扫描其紫外光谱。

5、内源荧光光谱的扫描

用荧光光谱测量法进行固有色氨酸荧光测量。蛋白样品溶于磷酸盐缓冲液(pH7.4)中稀释至最终浓度为0.1mg/mL。激发波长设定为295nm，发射波长范围为300nm～500nm,狭缝宽度为5nm，电压为400V。

6、傅里叶红外(FTIR)光谱

采用Andor SR-500i拉曼光谱仪进行拉曼激光散射。设定参数条件：激光光斑大小为直径2μm，功率为1.5mW，积分时间为30s，在514nm激发波长下，测定波数范围3378cm^-1～50cm^-1的拉曼光谱。

7、差示扫描量热分析

用差示扫描量热法(DSC)测定热变性温度。分别称样品置于铝坩埚中，压片密封。将装有样品的铝坩埚放入加热炉内，以空铝坩埚作为参照，氮气作保护气体，从25℃升温至120℃，加热速度控制为5K/min，并在120℃时平衡5min。

8、溶解性的测定

采用考马斯亮兰法测定蛋白质溶解度。使用BSA制作标准曲线。称取不同功率超声条件下的样品溶于蒸馏水中，浓度为1mg/mL，在4℃、15000r/min下离心15min后，取上清液和考马斯亮蓝G-250蛋白试剂(比例1:4)充分混合，放置2min后在595nm波长下测定其吸光度，以同比例UP水和考马斯亮蓝混合液做空白对照。将吸光度代入标准曲线中计算出可溶性蛋白含量。溶解度计算公式如下：NSI＝可溶性蛋白量(mg)/总蛋白量(mg)×100％

9、起泡性质的测定

对原单白和修饰后的蛋白的发泡性能进行了测定。分别称取0.1g冻干后的蛋白粉沫分散至20mL UP水中(浓度为5mg/mL)，后将溶液转移到100mL的圆筒中，然后在室温下用高速剪切机以8000r/min的速度剪切1min。分别读取搅打后30s的样品的体积(V₁)和常温下放置30min后搅打样品的体积(V₃₀)。发泡能力和发泡稳定性根据下面等式计算：FA(％)＝V₁/20×100

10、界面性质的测定

利用Tracker界面流变仪通过通过振荡模式测量了气-水界面的表面张力和膨胀模量。在室温条件下，将带有U形针的彻底清洁的注射器浸入含有原蛋白或超声辅助糖基化处理的蛋白溶液(0.1％w/w)的石英样品池中。样品池位于光源和高速电荷耦合器件照相机之间。通过针头向液体中打入体积约0.5μL的气泡，在0.05Hz的振荡频率和5％的相对振幅下，气泡的表面积随时间呈正弦波动，测定时间为12000s。

11、泡沫界面结构观察

通过Olympus激光共聚焦显微镜观察原蛋白和超声辅助糖基化修饰稳定的泡沫的微观形态。取配制好的样品溶液，添加尼罗蓝染液(1mg/mL)，在室温下用高速剪切机以8000r/min的速度剪切1min，制备染色均匀且细腻的泡沫。取样制片后迅速观察，采用同样制片方法观察30min后泡沫的微观形态，激光共聚焦显微镜的激发波长为633nm(尼罗蓝)。

12、泡沫特性的测定

使用DFA100动态泡沫分析仪对动态泡沫特性(发泡性和泡沫稳定性)进行测定，可同时测量观察泡沫高度和泡沫结构随时间的变化情况。实验时，配制3mg/mL样品溶液，取50mL加入测量容器中，空气流速为0.3L/min，发泡程序设置为当总高度达到180mm处停止发泡并开始测量，测量时间为7200s。

二、实验结果

1接枝度

接枝度和褐变程度是用来评估糖基化效果的两个因素，美拉德反应是一个复杂的过程，中间体众多，最终产物复杂，受多种因素的影响。活性氨基酸含量可用于判断美拉德反应的程度，并以接枝度的形式表示。如图1所示，接枝度(DG)随超声辅助糖基化处理时间显著增加，在超声20min处理时，达到了最大值为20.98％。可能的原因是适当超声处理改变了蛋白质的空间构象，暴露出更多的反应基团(ε氨基酸赖氨酸残基组)，使得OVT和黄原胶之间可以更好地形成共价键，因此引起接枝度的增加，在下面的红外图谱中也可以得到证实。但超声时间过长，可能会引起蛋白质聚合，隐蔽一些反应基团，从而导致接枝度降低。

2分子量分布

SDS-PAGE通常用于分析蛋白质亚基的分子量组成。从反应的角度来看，认为蛋白质的较高分子量是形成偶联物的重要指标，为了进一步确认OVT和XG是否结合成功，在非还原条件下进行SDS-PAGE图谱分析。如图2可知，产物的分子量集中在55kDa～70kDa之间，且随着超声辅助糖基化反应处理时间的增加，条带的颜色逐渐加深且向上偏移。产生这一现象的原因可能是OVT的亚基与黄原胶反应形成大分子聚合物，表明在美拉德反应过程中蛋白质的结构发生了变化，在一定程度上说明OVT与黄原胶结合成功。

3粒径及电位

溶液粒径在很大程度上受超声处理时间以及糖基化等改性手段的影响。超声辅助糖基化处理后，蛋白质粒径明显减小，可能由于超声引起的空化作用和微流束作用破坏了OVT分子之间的非共价键造成的，也可能是糖基化阻碍了超声处理过程产生的热效应而引起的蛋白质的变性，从而减少了蛋白质分子的聚集，导致粒径减小。Zeta电位表示溶液粒子表面所带电荷量的情况，是影响蛋白质的稳定性和发泡性能的一个重要参数。如图3B所示，改性处理后的蛋白电位绝对值由4.14mV增大到16.07mV，可能是因为带负电黄原胶的引入，与OVT共价结合，增大了蛋白表面电负性，从而使电位绝对值增大。

4紫外分光光度及荧光光谱

褐色色素(类黑素)的形成发生在美拉德反应的后期，可以在紫外420nm波长处监测到。如图4A所示，糖基化后，OVT在420nm处的吸光度值从0.11增加到0.24，超声辅助糖基化处理后，吸光度进一步增加。说明超声辅助糖基化修饰使OVT发生褐变反应，但超声时间为40min时，吸光度值显著降低，说明过度超声处理可能通过抑制形成初级或中间产物的聚合而干扰类黑素的形成，从而导致褐变程度的降低。超声辅助糖基化修饰的溶液在294nm波长处的吸光值反应了糖基化的中间反应阶段速率变化情况，从图4中可以看到，吸光度由0.13升到超声处理20min时的0.50，表明超声可促进糖基化反应，同时也证明了OVT和XG结合成功。

为了进一步验证OVT-XG之间的共价结合，在200nm～800nm波长范围内扫描获得了紫外光谱。图4B明确区分了N-OVT、OVT/XG和U-OVT/XG形成的缀合物的糖基化程度。与N-OVT相比，处理后的蛋白在280nm处的吸收强度增加，这归因于酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺等氨基酸在美拉德反应中的参与，超声辅助糖基化处理使OVT的结构展开，有利于色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸的暴露，从而使OVT与XG之间发生美拉德反应。

利用荧光光谱技术来评估色氨酸残基的构象变化，并表征蛋白质的三级结构。在338nm处出现了明显的吸收峰(图4C)，且超声辅助糖基化使荧光强度明显降低，OVT的荧光峰较N-OVT也发生了轻微的蓝移，可能是因为蛋白的轻微聚集，使生色基团暴露在溶剂中发生荧光猝灭，荧光强度降低。结合前期实验结果表明，糖基化程度越高，超声辅助糖基化处理对色氨酸残基的屏蔽效果越强，因此蛋白质构象产生更大的变化。

5 FT-IR

对超声辅助糖基化修饰的产物进行了红外结构测定，可用来观察蛋白质的二级结构的变化。如图5(a～f依次代表N-OVT、U-OVT/XG-0MIN、U-OVT/XG-5MIN、U-OVT/XG-10MIN、U-OVT/XG-20MIN、U-OVT/XG-40MIN)(核对下这个是否正确，)所示，在波长3700cm^-1～3200cm^-1范围内，U-OVT/XG的峰形相比N-OVT明显增强，这可能是由于在美拉德反应后-OH键的伸缩振动强度増加所引起的，美拉德反应使蛋白侧链引入多糖分子，进而导致羟基振动峰增强。OVT/XG复合物在1639cm-1(酰胺I带)、1542cm-1(酰胺II带)和1405cm-1(酰胺III带)附近的吸收峰均发生不同程度的变化，归因于C＝O伸缩振动和N-H弯曲振动，这也表明蛋白质结构发生改变，从侧面说明了糖基化反应的发生。1260cm-1～1000cm-1波数范围内出现明显且相比N-OVT较强的吸收峰，这是糖分子以共价键与蛋白质形成复合物的典型特征，表明在美拉德反应前后，OVT是以共价键的形式与XG结合。

6热稳定性分析

利用DSC探究超声辅助糖基化修饰对OVT热性能的影响。如图6所示，N-OVT的变性温度在54.9℃左右，随着超声辅助糖基化修饰时间增长，蛋白的变性温度峰值逐渐向右偏移，且在20min时达到最高变性温度为70.1℃，这可能是是由于适当超声处理促进糖基化反应，抑制了蛋白质之间的交联反应，形成更多聚合物，表明超声辅助糖基化修饰可以提高OVT的变性温度，提高了其热稳定性。但超声时间在40min时，变性温度峰值向左偏移，变性温度下降至65.8℃，表明过度超声可能会导致蛋白质折叠产生聚集结构。

7溶解性分析

图7显示了OVT、OVT-XG和U-OVT/XG在常温条件下的溶解度，超声辅助糖基化修饰可以有效提高OVT的溶解度，并且在20min时达到最大溶解度为78.18％，且与糖基化程度变化规律一致。表明，黄原胶与卵转铁蛋白结合后，会改变蛋白质的表面疏水性，提高蛋白质的溶解度。

8起泡性质分析

图8表明了N-OVT和超声辅助糖基化的OVT在气-水界面上的发泡性质，在图8A可以看出，超声辅助糖基化处理后的OVT发泡能力由43.54％提高到了96.73％，然后又下降，在超声辅助糖基化处理20min达到最大值。由图8B可知，发泡稳定性由68.92％提高到89.19％。发泡能力提高的原因可能是在美拉德反应过程中，蛋白质的结构展开，疏水基团暴露，柔性增加。肽链的展开可以使疏水残基之间的相互作用强于自然状态，从而提高发泡稳定性。

9界面性质分析

9.1界面吸附行为和表面压

图9A显示了原蛋白和改性后蛋白在气-水界面上的表面张力随吸附时间(t)的变化，可以看出，在开始的500s内，蛋白-多糖复合物快速的吸附到气-水界面上，导致表面张力迅速下降。500s～1000s，表面张力缓慢降低直至恒定。但是不同样品的表面张力衰减速率不同，说明了样品的扩散和吸附速率不同，N-OVT的表面张力衰减速率最慢，表面张力平衡值最高，说明表面活性物质较差，吸附动力学较慢。相反，超声辅助糖基化处理以后，表面张力衰减速率大大提升，在超声辅助处理20min时表现最为明显，因此具有更快的吸附速率，起泡性能就更好。图9B显示了不同超声辅助糖基化处理时间的OVT在气-水界面上的表面压(π)随吸附时间(t)的变化。在最开始吸附的1000s内，表面压快速增加，当吸附时间为1000s～12000s时，表面压增加较为缓慢。界面张力和表面压的结果相呼应，说明超声辅助糖基化修饰处理使体系在界面上的快速吸附有利于较快地形成弹性界面膜，从而提高泡沫稳定性。

9.2表面膜扩张流变学

图10A为不同超声辅助糖基化修饰时间下的OVT在气-水界面上的E-π曲线，超声糖基化处理以后，当π值高于17mN/m时，OVT在界面形成界面膜的E随着π的增加而快速增加，此时，E-π曲线斜率均显著大于1(理想气体的E-π曲线斜率)，说明吸附于界面的蛋白质分子残基间发生了较强的相互作用。但超声作用40min时，可能粒子之间的静电排斥作用增强，抑制了粒子之间的相互作用，从而导致斜率的下降。图10B表示了不同超声辅助糖基化修饰时间下的OVT吸附在气-水界面上的粘弹模量(E)随吸附时间(t)的变化，超声处理20min条件下，OVT/XG的E值最大，说明此时的蛋白-多糖在界面形成的吸附层最有弹性和刚性，有利于泡沫性质的稳定。

采用激光共聚焦显微镜观察气泡的形态变化，可一定程度上从微观的角度来反映超声辅助糖基化修饰OVT的气泡特性，从而揭示其界面结构。结果如图11显示，新鲜制备的泡沫被尼罗蓝均匀染色，荧光蛋白(标记红色)都位于泡沫周围，可以看到N-OVT的泡沫形状不规则且较大，尺寸不均一，随着黄原胶的加入和超声辅助糖基化修饰时间递增，泡沫数量逐渐增多，且大小均，分布更为均匀，在气-水界面上趋向于形成更均匀、更完整的界面膜，即黄原胶的加入和超声辅助糖基化修饰对OVT起泡性的促进作用。由于泡沫在放置过程中会发生排水、聚合、歧化等现象，所以由图可观察到，剪切制备好的泡沫在放置30min后，数量均有不同程度的减少，且直径增大。但相比N-OVT，改性后蛋白泡沫相对数量较多且形状相对规则，所以超声辅助糖基化修饰可提高OVT的泡沫稳定性。

9.3泡沫特性分析

通过DFA 100动态泡沫分析仪来测定泡沫的起泡能力、泡沫半衰期(即泡沫高度降至初始值一半的时间)、泡沫的动态变化情况以及泡沫高度随时间变化规律。起泡能力是通过最大泡沫体积与其发泡所消耗气体体积的比值来评估的。如图12A所示，与N-OVT起泡能力(0.3)相比，改性后蛋白的起泡能力(1.2)是其4倍左右，说明超声辅助糖基化修饰的OVT具有良好的起泡性质，这可能是由于超声辅助条件下，通过共价键形成的蛋白聚合物更加松散和有弹性，可以快速地吸附到气-水界面上形成吸附层，从而提高其起泡能力。通过测量泡沫高度随时间的衰减来评估泡沫的稳定性，并通过泡沫半衰期来反应这一变化情况。由图12A可以看出，OVT的起泡性和泡沫稳定性均较差，泡沫半衰期仅为456.9s，且在不到1000s时就已完全消泡，超声辅助糖基化修饰的转铁蛋白的泡沫半衰期明显高于原始单白，且随着超声时间延长泡沫半衰期呈现先增大后降低的趋势，在超声20min时达到最大，为5314.9s，可见经过超声辅助糖基化处理的OVT起泡性和稳定均得到了显著提升。图12B为在不同超声辅助处理时间下，泡沫高度随时间的衰减曲线。由于水的重力较大，在泡沫形成后液体排水会立即开始，泡沫的聚合和歧化作用也会引起泡沫的不稳定，随时间延长，液体体积增加，泡沫的聚合与消泡加剧，泡沫高度逐渐下降。但在10、20min时，泡沫高度下降相对缓慢，这可能是由于流动相的粘度较大、界面张力下降较快引起的，泡沫与泡沫之间不容易发生聚合，排水速度减弱，从而提高了泡沫的稳定性，这与前面界面性质研究结果一致。

通过实时监测气泡的数量与大小等动态变化来进一步反映蛋白改性前后的起泡特性，如图12C所示，横向对比后发现，随着时间的延长，气泡的数量减少，大小也随之增大，这是由于空气的扩散沥水，凝集及歧化等反应而导致的。纵向对比可知，随着超声时间增大，泡沫性能先增大后减小，这也与CLSM观察到的现象相吻合。

即，最优条件U-OVT/XG-20MIN为：

一种超声辅助糖基化修饰卵转铁蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

S1:将卵转铁蛋白(1mg/mL)溶于磷酸盐缓冲液(0.1mol/L、pH 7.4)中，得到混合溶液；

S2：后向混合溶液中添加OVT质量一半的黄原胶并搅拌混合均匀，配制成卵转铁蛋白/黄原胶混合液；

S3：卵转铁蛋白/黄原胶混合液搅拌均匀后，4℃放置12小时；

S4：经步骤S3放置后的卵转铁蛋白/黄原胶混合液进行超声处理，控制超声功率为300W，分别对混合液进行20min超声预处理。超声处理模式为工作2s、间歇4s；

S5：将超声处理后的卵转铁蛋白/黄原胶置于95℃水浴中加热搅拌1h，迅速冷却至室温得到超声卵转铁蛋白/黄原胶复合物溶液，然后冷冻干燥得卵转铁蛋白/黄原胶复合物。测试结果即为U-OVT/XG-20MIN。

在最优条件U-OVT/XG-20MIN基础上，改变反应条件。具体包括：

对比例1(不经过水化放置)

与最优条件U-OVT/XG-20MIN基础上，经过步骤S2处理直接进行S4处理，步骤S3步骤不要。测试结果记录为对比例1。

对比例2(不经过加热处理)

与最优条件U-OVT/XG-20MIN基础上，S5步骤中：将超声处理后的卵转铁蛋白/黄原胶迅速冷却至室温得到超声卵转铁蛋白/黄原胶复合物溶液，然后冷冻干燥得。测试结果即为U-OVT/XG-20MIN。测试结果记录为对比例2。

对比例3

与最优条件U-OVT/XG-20MIN基础上，超声处理步骤S4在步骤S3前进行操作。

对比例4

最优条件U-OVT/XG-20MIN基础上，超声处理步骤S4在步骤S2前进行操作。

检测上述对比例1-2的溶解性和起泡性能。结果见表1。

表1 不同条件对溶解度的影响

表2 不同条件对起泡性的影响

由表1-2可知，在超声波操作之前的水化静置处理和加热对于溶解性和起泡性也是有较大作用的，水化可以使卵转铁蛋白和黄原胶充分进行反应交联，且超声处理只有在原料充分溶解反应后再结合超声处理，才能显著提高混合的溶解性和起泡性，因为如果超声在前期卵铁蛋白溶液配制的过程中处理后后期加入黄原胶的过程中，形成的反应体系被破坏需要重新结合，而在超声波反应后再进行水化后进行美拉德反应，也不利于起泡性能的增加。另外，加热进行美拉德反应也是影响起泡性能增加的必备条件之一。

红色是上次加的，也再看看有没有需要补充的实施例2

在实施例1最优条件的基础上(U-OVT/XG-20MIN)，改变步骤S5的水浴温度，65、75、85℃，分别搅拌1h。利用DSC测定卵转铁蛋白/黄原胶复合物的热变性温度。

表3 水浴条件对热性能的影响

水浴温度(℃)	热变性温度(℃)
		95(实施例1最优条件)	70.1
85	73.2
		75	84.5
65	75.4

由表3可知，结合N-OVT的变性温度在54.9℃对比，超声辅助糖基化修饰可以提高OVT的变性温度，提高了其热稳定性。但是也发现在较低的温度范围内(75℃)进行糖基化反应，反而比在高温(95℃)或低温(75℃)的热变性温度要高，其在75℃，热变性温度为80.5℃，相对于54.9℃(N-OVT的)相比，提高了55.74％，而在高温(95℃)的70.1℃，相对于54.9℃(N-OVT的)相比，也提高了27.69％，这个温度范围提高的幅度是非常高的，且在75℃用于糖基化反应时，相对于高温(95℃)也节约能源，方便工业化生产操作。常规的巴氏杀菌两种方式，一种是加热到62℃-65℃，保持30min。第二种方法将牛奶加热到75℃-90℃，保温15s-16s。采用本申请的处理方式，在65-75℃水浴加热，可以采用第二种方式，改产品在用于后期食品加工过程中经过高温杀菌处理时，产品性能稳定，对于卵转铁蛋白的加工适应性得到了显著提升。这可能是由于在超声波的协同作用下，黄原胶的粘度随着温度的升高(60-75℃)，超过其临界温度(40℃左右)后，粘度迅速下降，黄原胶处于无序柔性构象，更加更有利于与蛋白结合发生糖基化反应，形成的卵转铁蛋白/黄原胶复合物更加稳定，热变性温度性能较高，但是在高温阶段(95℃)后，由于粘度降低太多以及超声波的空化效应，导致黄原胶侧链上的负电荷过多，侧链之间的斥力增加，反而不利于糖基化的反应，得到的卵转铁蛋白的热稳定性降低。

Claims (3)

1.一种超声辅助糖基化修饰卵转铁蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1: 将卵转铁蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，得到混合溶液；

S2：后向混合溶液中添加黄原胶并搅拌混合均匀，配制成卵转铁蛋白/黄原胶混合液；

S3：卵转铁蛋白/黄原胶混合液搅拌均匀后，4 ℃放置10-14小时；

S4：经步骤S3放置后的卵转铁蛋白/黄原胶混合液进行超声处理，超声功率为200-400W，处理时间为10-40 min，超声处理模式为工作2 s、间歇4 s；

S5：将超声处理后的卵转铁蛋白/黄原胶置于水浴中加热搅拌，水浴温度为65-95℃，水浴时间0.8-1.2h，迅速冷却至室温得到超声卵转铁蛋白/黄原胶复合物溶液，然后冷冻干燥得卵转铁蛋白/黄原胶复合物。

2.根据权利要求1所述的超声辅助糖基化修饰卵转铁蛋白的方法，其特征在于，所述步骤S1：卵转铁蛋白的浓度为0.8-1.2 mg/mL，磷酸盐缓冲液的浓度为0.05-0.15 mol/L，pH为7.2-7.6。

3.根据权利要求1所述的超声辅助糖基化修饰卵转铁蛋白的方法，其特征在于，所述步骤S2：黄原胶添加的量为溶液中卵转铁蛋白质量的三分之一至二分之一。