CN113557301A - 编码Trk片段的核酸构建体及其利用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种编码Trk家族的功能性片段的新型核酸构建体及其利用。本发明的一实施方式的核酸构建体编码包含Trk的胞内区及膜定位序列的融合多肽。

Description

编码Trk片段的核酸构建体及其利用

技术领域

本发明涉及一种编码Trk家族的功能性片段的核酸构建体及其利用。

背景技术

作为在神经细胞的存活、轴突生长及中枢神经系统的发育等中具有重要作用的神经营养因子，已知有nerve growth factor(NGF)、brain-derived neurotrophic factor(BDNF)、Neurotrophin-3(NT-3)、及NT-4/5等(非专利文献1)。

作为上述BDNF的高亲和力受体，已知有TrkB，通常，其胞外区形成二聚体，从而能够接受BDNF。其中，TrkB还存在缺少细胞内的酪氨酸激酶结构域的截短形式，其功能尚未充分阐明(非专利文献2)。

发明人等长年进行神经营养因子的研究，报道了胶质-胶质细胞及胶质-神经细胞间的信号控制对神经保护较为重要(非专利文献3～5)。

并且，在继续进行与利用TrkB信号的神经保护及轴突再生相关的研究的过程中，还注意到作为由TrkB信号激活的鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchangefactor：GEF)的Dock3的功能等(非专利文献6～9)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO 2018/185468(国际公开日：2018年10月11日)

非专利文献

非专利文献1：Park H,Poo MM.Neurotrophin regulation of neural circuitdevelopment and function.Nat Rev Neurosci 14(1):7-23,2013.

非专利文献2：Fenner BM.Truncated TrkB:beyond a dominant negativereceptor.Cytokine Growth Factor Rev 23(1-2):15-24,2012.

非专利文献3：Harada T,Harada C,Nakayama N,Okuyama S,Yoshida K,KohsakaS,Matsuda H,Wada K.Modification of glial-neuronal cell interactions preventsphotoreceptor apoptosis during light-induced retinal degeneration.Neuron 26(2):533-541,2000.

非专利文献4：Harada T,Harada C,Kohsaka S,Wada E,Yoshida K,Ohno S,Mamada H,Tanaka K,Parada LF,Wada K.Microglia-Muller glia cell interactionscontrol neurotrophic factor production during light-induced retinaldegeneration.JNeurosci 22(21):9228-9236,2002.

非专利文献5：Harada C,Guo X,Namekata K,Kimura A,Nakamura K,Tanaka K,Parada LF,Harada T.Glia-and neuronspecific functions of TrkB signallingduring retinal degeneration and regeneration.Nat Commun 2:189,2011.

非专利文献6：Namekata K,Harada C,Taya C,Guo X,Kimura H,Parada LF,Harada T.Dock3 induces axonal outgrowth by stimulating membrane recruitmentof the WAVE complex.Proc Natl Acad Sci USA 107(16):7586-7591,2010.

非专利文献7：Namekata K,Harada C,Guo X,Kimura A,Kittaka D,Watanabe H,Harada T.Dock3 stimulates axonal outgrowth via GSK-3β-mediated microtubuleassembly.J Neurosci 32(1):264-274,2012.

非专利文献8：Namekata K,Kimura A,Kawamura K,Harada C,Harada T.DockGEFs and their therapeutic potential:neuroprotection and axonregeneration.Prog Retin Eye Res 43:1-16,2014.

非专利文献9：行方和彦、原田高幸，神经轴突的再生中的Dock3的功能，生物化学84(5),368-373,2012.

发明内容

发明所要解决的技术问题

如上所述，已经开始从各种观点阐明TrkB在神经保护等中起到的重要作用。

然而，在插入有TrkB全长基因的基因载体中，难以诱导TrkB的高表达。这是因为TrkB全长基因具有相对较大的尺寸，因此可使用的启动子尺寸等受到限制。

并且，在治疗神经相关疾病时，认为不仅需要过量表达TrkB，同时需要定期施用BDNF，因此，至今为止有效利用TrkB的基因治疗研究尚未实用化。

最近，报道了插入有编码BDNF与TrkB的融合蛋白的基因的表达载体(专利文献1)。然而，从该融合蛋白质的分子尺寸可推测出表达水平并没有那么高。

本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供一种编码Trk家族的功能性片段的新型核酸构建体及其利用。

用于解决问题的技术手段

为了解决上述问题，本发明包括以下所示的方面。

(i)一种核酸构建体，其编码包含Trk的胞内区及膜定位序列的融合多肽。

(ii)一种细胞激活方法，其包括以下步骤：在细胞内通过膜定位序列使Trk的胞内区定位于细胞膜。

(iii)一种融合多肽，其包含Trk的胞内区及膜定位序列。

发明效果

根据本发明的一个方面，可提供一种编码Trk家族的功能性片段的新型核酸构建体及其利用等。

附图说明

图1是示出组成型激活TrkB(CA-TrkB)的结构的图。

图2是示出实施例1中制备的腺相关病毒载体的图。

图3是示出实施例1的结果(CA-TrkB的表达量)的图。

图4是示出实施例1的其他结果(利用CA-TrkB的细胞内信号传导)的图。

图5是示出实施例2的结果(CA-TrkB对视网膜神经节细胞的保护)的图。

图6是示出实施例2的结果(利用CA-TrkB的视神经轴突再生)的图。

图7是示出实施例3的结果(使用青光眼模型小鼠的CA-TrkB对视网膜神经节细胞的保护)的图。

图8是示出实施例4的结果(使用CA-TrkB的变体的信号传导的验证)的图。

图9是示出实施例5相关的组成型激活TrkA及TrkC的结构、及实施例5的结果(利用CA-TrkA及CA-TrkC的细胞内信号传导)的图。

图10是示出编码实施例中的iSH-TrkB的基因片段的碱基序列的图。

图11是示出编码实施例中的CA-TrkA的基因片段的碱基序列的图。

图12是示出编码实施例中的CA-TrkC的基因片段的碱基序列的图。

图13是示出实施例6的结果(视觉诱发电位的测量)的图。

具体实施方式

[术语等的定义]

在本说明书中，“多核苷酸”也可以称为“核酸”或“核酸分子”。若无特别说明，“多核苷酸”包括含有能够与天然存在的核苷酸同样地发挥功能的天然存在的核苷酸的已知类似物的多核苷酸。另外，“碱基序列”也可以称为“核酸序列”或“核苷酸序列”。只要未特别提及，“碱基序列”是指脱氧核糖核苷酸的序列或核糖核苷酸的序列。并且，多核苷酸可以是单链或双链结构，若为单链，则可以是正义链或反义链。

在本说明书中，“基因”是指编码蛋白质的“多核苷酸”。

在本说明书中，基因的“表达控制区”是指控制基因的表达的“多核苷酸”。作为“表达控制区”的一个例子，可列举启动子区、增强子区等。

在本说明书中，“表达盒”是指包括在表达宿主内发挥功能的表达控制区、以及与该表达控制区可操作地连接的多核苷酸的表达单位。在表达盒中，该多核苷酸优选为基因或基因片段。作为一个例子，表达盒是在基因工程学上将上述表达控制区与上述多核苷酸连结而成。“可操作地连接”是指多核苷酸的表达受控于表达控制序列的状态。表达盒也可以是表达载体的形态。

在本说明书中，“多肽”也可以称为“蛋白质”。“多肽”包含氨基酸通过肽键结合而成的结构，还可以包含例如糖链或类异戊二烯基等结构。若无特别说明，“多肽”包括含有能够与天然存在的氨基酸同样地发挥功能的天然存在的氨基酸的已知类似物的多肽。

[1.核酸构建体]

本发明的一实施方式的核酸构建体是编码包含Trk的胞内区及膜定位序列的融合多肽的核酸构建体。本发明是基于如下惊人发现完成的：通过使该核酸构建体在细胞内表达，即使不施用神经营养因子(Neurotrophin)，也能够激活Trk的下游的细胞内信号传导途径。即，本案发明涉及一种细胞激活的新方法，通过由该核酸构建体编码的融合多肽所具有的膜定位序列，使Trk的胞内区定位于细胞膜。

本实施方式的核酸构建体例如起到以下的代表性效果。

1)不需要过量表达或施用对应的神经营养因子。

2)与Trk全长相比，能够大幅减小激活所需要的分子尺寸。由此，能够实现分子的高表达化。此外，核酸构建体的设计自由度大幅增加，因此，例如能够更容易地实现高表达化或基因导入效率的提升等。

(融合多肽)

本实施方式的由核酸构建体编码的融合多肽包含下述的1)Trk的胞内区、及2)膜定位序列。膜定位序列根据其特性，有时优选配置于融合多肽的N末端侧或融合多肽的C末端侧。在与Trk的胞内区的关系上，膜定位序列既可以相对于该胞内区的N末端侧(靠近跨膜区的一侧)配置，也可以相对于C末端侧配置。另外，在实施例所示的组成型激活Trk中，膜定位序列配置于融合多肽的C末端侧，且相对于Trk的胞内区的C末端侧配置。由此，实施例所示的组成型激活Trk使Trk的胞内区相对于细胞膜位于与通常相反的位置(另参考图1及图9)。

在一个例子中，融合多肽也可以包含除“Trk的胞内区及膜定位序列”以外的“其他序列”。作为“其他序列”，例如可列举间隔序列、p85的SH2序列等。插入“其他序列”的位置根据其目的设定即可，例如，Trk的胞内区与膜定位序列之间、融合多肽的N末端侧(在该情况下，膜定位序列有时优选配置于C末端侧)、或融合多肽的C末端侧(在该情况下，膜定位序列有时优选配置于N末端侧)。

在优选的一个例子中，融合多肽的氨基酸数在300个以上650个以下的范围内，有时更优选在330个以上630个以下的范围内。另外，在优选的一个例子中，融合多肽中的“Trk的胞内区及膜定位序列”的氨基酸数为300个以上450个以下，有时更优选在330个以上且440个以下、或者350个以上440个以下、或者360个以上(或370个以上)440个以下、或者360个以上(或370个以上)410个以下的范围内。若融合多肽的尺寸较小，则例如具有如下优点：1)核酸构建体中的其他构成(即，除编码融合多肽的区域以外的构成)的设计自由度增加，2)融合多肽的表达效率得以提升等。尤其是核酸构建体中的启动子等的选项变多，大大有助于融合多肽的表达效率的提升。

在一个例子中，融合多肽也可以包含Trk的胞外区的一部分、和/或跨膜区的一部分。在优选的一个例子中，融合多肽不包含Trk的胞外区、和/或跨膜区。在更优选的一个例子中，融合多肽不包含Trk的胞外区及跨膜区这两者。

(Trk的胞内区)

在本实施方式中，Trk的胞内区是指作为一次跨膜型的蛋白质的与神经营养因子的高亲和力受体(Trk)的胞内区相当的多肽、及与该多肽在功能上等同的多肽。胞内区也被称为胞质结构域。

作为Trk的家族，迄今为止，报道了TrkA、TrkB及TrkC这三种。TrkA、TrkB及TrkC均为其胞外区接受神经营养因子的结构域，其胞内区具有酪氨酸激酶活性。在神经系统细胞中，TrkA、TrkB及TrkC均以接受对应的神经营养因子为契机，激活其下游的细胞内信号传导途径。另外，TrkA是NGF的受体，TrkB是BDNF及NT-4/5的受体，TrkC是NT-3的受体。

Trk的胞内区只要能够1)具有酪氨酸激酶活性、和/或2)当定位于细胞膜时激活Trk的下游的细胞内信号传导途径即可。Trk的下游的细胞内信号传导途径的激活可理解为已知的方法，例如使选自Ras、ERK1/2、PI3K、Akt及磷脂酶C-γ等中的至少一个的表达增加。

Trk的胞内区并无特别限定，例如优选为如下多肽。

1)由序列编号2、6、9、12或14中任一者所记载的氨基酸序列表示的多肽。另外，序列编号2是来源于人类的TrkB的胞内区的氨基酸序列的一个例子，序列编号6是来源于小鼠的TrkA的胞内区的氨基酸序列的一个例子，序列编号9是来源于小鼠的TrkC的胞内区的氨基酸序列的一个例子，序列编号12是来源于人类的TrkA的胞内区的氨基酸序列的一个例子，序列编号14是来源于人类的TrkC的胞内区的氨基酸序列的一个例子。

2)与由序列编号2、6、9、12或14中任一者所记载的氨基酸序列表示的多肽在功能上等同的多肽。作为在功能上等同的多肽，例如可列举由与序列编号2、6或9中的任一者所记载的氨基酸序列显示出90％以上的序列同一性的氨基酸序列表示的多肽。另外，序列同一性更优选为91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上。

另外，序列编号6所示的氨基酸序列中的第104位氨基酸(Lys)是酪氨酸激酶活性或TrkA的下游的细胞内信号传导途径的激活不可缺少的氨基酸，因此，优选没有突变。

同样地，序列编号2所示的氨基酸序列中的第134位氨基酸(Lys)是酪氨酸激酶活性或TrkB的下游的细胞内信号传导途径的激活不可缺少的氨基酸，因此，优选没有突变。

同样地，序列编号9所示的氨基酸序列中的第118位氨基酸(Lys)是酪氨酸激酶活性或TrkC的下游的细胞内信号传导途径的激活不可缺少的氨基酸，因此，优选没有突变。

同样地，序列编号12所示的氨基酸序列中的第104位氨基酸(Lys)是酪氨酸激酶活性或TrkA的下游的细胞内信号传导途径的激活不可缺少的氨基酸，因此，优选没有突变。

同样地，序列编号14所示的氨基酸序列中的第118位氨基酸(Lys)是酪氨酸激酶活性或TrkC的下游的细胞内信号传导途径的激活不可缺少的氨基酸，因此，优选没有突变。

(膜定位序列)

膜定位序列是用于使上述融合多肽定位于细胞膜的肽序列。膜定位序列优选诱导氨基酸的脂质修饰的序列。氨基酸的脂质修饰的种类并无特别限定，可列举例如1)脂肪酰化、2)异戊二烯化、3)糖基磷脂酰肌醇化、或4)胆固醇化等，更具体来说，可列举豆蔻酰化、棕榈酰化、法尼基化、或香叶基香叶基化等，其中，优选列举法尼基化、或香叶基香叶基化。

作为构成膜定位序列的氨基酸序列基序，具体来说，例如可列举以下序列。另外，X是指任意氨基酸，A是指aliphatic氨基酸(例如，异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、蛋氨酸)，C是指半胱氨酸。

1)Met-Gly-X-X-X-Ser-X-X-X(N末端侧脂质修饰基序(N豆蔻酰化))、2)CAAX基序、CC基序、CXC基序、CCXX基序(C末端侧脂质修饰基序)。

(核酸构建体的形态)

本实施方式的核酸构建体的一形态是编码包含Trk的胞内区及膜定位序列的上述融合多肽的基因。其一个例子是具有序列编号4、5、8或11所示的任一碱基序列的基因，或者是具有与序列编号4、5、8或11所示的碱基序列的任一者显示出85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的序列同一性的碱基序列的基因。另外，编码构成上述融合多肽的Trk的胞内区的基因的一个例子是具有序列编号3、7、10、13或15所示的任一碱基序列的基因，或者是具有与序列编号3、7、10、13或15所示的碱基序列的任一者显示出85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的序列同一性的碱基序列的基因。

本实施方式的核酸构建体的其他形态是表达上述基因的表达盒。表达盒优选为表达载体，更优选为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体等病毒载体。其中，从用于对神经相关疾病的基因治疗的观点来看，优选腺相关病毒载体，其中，从用于对神经相关疾病的基因治疗的观点来看，有时优选显示出对中枢神经系统等的组织嗜性的血清型1(AAV1)、组织嗜性较广的血清型2(AAV2)、显示出对中枢神经系统或视网膜等的组织嗜性的血清型5(AAV5)等的腺相关病毒载体。

上述表达盒包括在表达宿主内发挥功能的任意表达控制区。作为表达控制区的启动子的种类并无特别限定，具体来说，例如有时优选CAG启动子、CMV启动子、SYN(突触蛋白)I等在哺乳类(尤其是人类)中引起高表达、或在特定组织中选择性地发挥功能的启动子。作为启动子，其中，有时更优选为CAG启动子。在表达盒中，启动子配置于基因的上游侧。

上述表达盒还可以视需要包括功能性序列，该功能性序列具有提高通过转录产生的mRNA的稳定性等的作用，且在基因的表达增加等方面发挥功能。作为功能性序列的一个例子，可列举WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatoryelement，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)序列。在表达盒中，WPRE序列配置于基因的下游侧。

上述表达盒也可以包括的功能性序列的其他例子是聚A尾的添加信号序列。聚A尾的添加信号序列的一个例子可列举猿猴病毒40的相应序列、人类生长激素的相应序列等，有时更优选为人类生长激素的相应序列。在表达盒中，WPRE序列配置于基因的下游侧。

上述表达盒还可以具有ITRs(inverted terminal repeat sequences，反向末端重复序列)等。ITRs以夹着整个转录单位(从启动子到聚A尾的添加信号序列)的方式配置于表达盒内。

[2.医药组合物]

本发明的一实施方式的医药组合物是包含上述核酸构建体而成的基因治疗药物。在一个例子中，该医药组合物是神经相关疾病药物，在更具体的一个例子中，该医药组合物用于神经保护或神经再生。该医药组合物能够发挥很强的神经保护效果及轴突再生效果，用于神经相关疾病的治疗和/或预防。在本发明的范畴内，包括对给药对象施用有效量的该医药组合物的神经相关疾病的治疗和/或预防方法。

(给药对象)

作为给药对象的人类或非人类动物优选为选自由包括人类在内的哺乳类组成的组中的任一者。作为给药对象的哺乳类的种类并无特别限定，可列举小鼠、大鼠、兔、豚鼠、除人类外的灵长类等实验动物、狗、猫等宠物、牛、马等家畜、人类，尤其优选为人类。作为给药对象的人类或非人类动物例如具有下述神经相关疾病。

(神经相关疾病)

作为治疗和/或预防对象的神经相关疾病的种类并无特别限定，是指由于神经系统细胞的变性、和/或神经系统细胞的细胞死亡而使其功能受损的病症。神经系统细胞的变性或细胞死亡的原因并无特别限定，也包括由事故等引起的神经系统的损伤。

作为视觉神经系统的神经相关疾病，可列举青光眼、视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病等神经变性疾病、及由事故等引起的视觉神经系统的损伤等，其中，以青光眼为代表的伴有视网膜神经节细胞的变性的疾病、及视觉神经系统的损伤(视神经外伤)有时可更优选作为应用本发明的对象疾病。作为听觉神经系统的神经相关疾病，可列举神经性耳聋等感觉神经变性疾病、及由事故等引起的听觉神经系统的损伤等。

(给药方法、给药量、给药次数等)

医药组合物的给药方法并无特别限定，既可以通过注射(利用注射器或输液泵等)、滴眼给药、经皮给药、舌下给药等方法局部给药，也可以通过口服给药、静脉内或动脉内的血管内给药、肠内给药等方法全身给药。在优选的一个给药形态中，对作为治疗等的对象的神经系统附近局部给药。

医药组合物的给药量(有效量)根据作为给药对象的上述人类或动物的年龄、性别、症状、给药途径、给药次数等适当设定即可。并且，若需要，事先进行使用该医药组合物的体内测定，便可以确定上述给药量而无需过多实验。

医药组合物的给药次数也无特别限定，只要可获得效果即可，例如，根据上述给药量、给药途径、症状、人类或动物的年龄或性別适当设定即可。

(除核酸构建体以外的成分)

本发明的一实施方式的医药组合物也可以构成为至少包含上述核酸构建体、以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体并无特别限定，优选具有如下性质：实质上不抑制上述核酸构建体的功能，且不会对作为给药对象的人类或非人类动物带来实质性的不利影响。另外，该医药组合物有时优选为包含水等液体载体，在一个例子中，也可以是脂质体制剂。

作为构成上述医药组合物的成分，可进一步列举例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于调节渗透压的盐类、缓冲剂、着色剂、抗氧化剂、粘度调节剂，但并不限于这些。

[3.细胞激活的方法等]

本发明的一实施方式的细胞激活方法包括以下步骤(定位步骤)：在细胞内通过膜定位序列使Trk的胞内区定位于细胞膜。典型地，该定位步骤可以通过使选自[1.核酸构建体]栏所述的核酸构建体、及[2.医药组合物]栏所述的医药组合物中的任一者在神经系统细胞内表达来进行。此处，神经系统细胞的种类并无特别限定，包括中枢神经系统的细胞、周围神经系统的细胞、这些细胞的祖细胞等。神经系统细胞既可以被分离，也可以存在于人类或非人类动物的体内。

根据上述细胞激活方法，即使不施用神经营养因子，也能够激活Trk的下游的细胞内信号传导途径。并且，作为细胞激活的结果，发挥出很强的神经保护效果及轴突再生效果，可用于神经相关疾病的治疗和/或预防。

本发明的一实施方式还提供一种可表达地导入了[1.核酸构建体]栏所述的核酸构建体的神经系统细胞、或具有该神经系统细胞的非人类动物等。

[4.总结]

如上所述，本发明包括如下所示的形态。

(1)一种核酸构建体，其编码包含Trk的胞内区及膜定位序列的融合多肽。

(2)根据(1)所述的核酸构建体，其中，Trk的胞内区选自下述中的任一者：1)由序列编号2、6、9、12或14中的任一者所记载的氨基酸序列表示的多肽；

2)由与序列编号2、6、9、12或14中的任一者所记载的氨基酸序列显示出90％以上的同一性的氨基酸序列表示的多肽。

(3)根据(1)或(2)所述的核酸构建体，其中，膜定位序列诱导氨基酸的脂质修饰。

(4)根据(3)所述的核酸构建体，其中，膜定位序列是法尼基化序列。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的核酸构建体，其中，该核酸构建体为载体。

(6)根据(5)所述的核酸构建体，其中，核酸构建体为腺相关病毒载体。

(7)一种医药组合物，其包含上述(1)～(6)中任一项所述的核酸构建体。

(8)根据(7)所述的医药组合物，其中，该医药组合物为神经相关疾病药。

(9)根据(8)所述的医药组合物，其中，该医药组合物用于神经保护或神经再生。

(10)一种神经系统细胞，其可表达地导入了上述(1)所述的核酸构建体。

(11)一种细胞激活方法，其包括以下步骤：在细胞内通过膜定位序列使Trk的胞内区定位于细胞膜。

(12)根据(11)所述的方法，其中，上述步骤是通过使选自(1)至(6)中任一项所述的核酸构建体、及(7)至(9)中任一项所述的医药组合物中的任一者在神经系统细胞内表达来进行。

(13)一种融合多肽，其包含Trk的胞内区及膜定位序列。该融合多肽也可以由上述(1)至(4)中任一项所述的核酸构建体编码。

下面示出实施例，对本发明的实施方式更详细地说明。当然，本发明并不限于以下实施例，细节可有各种形态。此外，本发明并不限于上述实施方式，可在权利要求所示的范围内进行各种变更，适当组合分别揭示的技术手段所获得的实施方式也包含在本发明的技术范围内。另外，本说明书中所记载的文献全部作为参考被引用。

实施例

[实施例1]组成型激活TrkB(constitutive active TrkB(以下，CA-TrkB))载体的制作

(方法)

以如下方式制作表达TrkB分子的胞内区的AAV载体(称为AAV-CA-TrkB)。插入编码CA-TrkB的基因片段的AAV载体是使用Applied Viromics公司制的pAAV-CAG-shuttle-WPRE。准备编码如下蛋白质的DNA片段作为编码CA-TrkB的基因片段：在TrkB的胞内区的N末端添加了myc-标签，且在该区域的C末端添加了法尼基化(Farnecyl)化信号序列(另参考图1)。即，CA-TrkB不含TrkB的胞外区及跨膜区，仅使用TrkB的胞内区，在该胞内区内添加myc-标签及法尼基化信号序列而构成。

另外，法尼基化信号序列(序列编号1表示其碱基序列)是用于使蛋白质定位于膜的信号序列。另外，将TrkB的胞内区的氨基酸序列表示为序列编号2，将编码TrkB的胞内区的基因(DNA)的碱基序列表示为序列编号3。并且，将编码CA-TrkB的基因片段(插入至AAV载体的基因片段的全长)的碱基序列表示为序列编号4。

AAV-CA-TrkB使用CAG启动子作为编码CA-TrkB的基因片段用的表达控制系统，进一步通过使WPRE序列与来源于人类生长激素(Human Growth hormon)的聚A序列融合来实现高表达(参考图2)。WPRE序列及来源于人类生长激素的聚A序列在该AAV载体中设置于法尼基化信号序列的下游侧。另外，CAG启动子、WPRE序列、及来源于人类生长激素的聚A序列从一开始就插入在原始AAV载体中。

接着，将所获得的AAV-CA-TrkB转染至Cos7细胞，并对其表达量或活性进行评价。

(结果)

图3及图4中示出了将AAV-CA-TrkB转染至Cos7细胞的结果。图3示出了如下结果：将AAV-CA-TrkB转染至Cos7细胞，培养24小时后使细胞裂解，使用抗myc抗体(Santa Cruz公司制的c-Myc抗体(9E10))进行蛋白质印迹。经确认，与进行同样实验的全长TrkB载体相比，AAV-CA-TrkB的表达量明显增加。另外，全长TrkB载体是指与AAV-CA-TrkB的结构相比，插入了编码全长TrkB的基因片段来代替编码CA-TrkB的基因片段的腺相关病毒载体。

图4示出了如下结果：将AAV-CA-TrkB转染至Cos7细胞，培养24小时后使细胞裂解，使用抗pERK抗体(Cell Signaling公司制的Phospho-p44/42(Erk1/2)(Thr202/Thr204))、抗pAKT抗体(Cell Signaling公司制的Phospho-Akt(Ser473)(587F11))、抗ERK抗体(CellSignaling公司制的p44/42 MAPK(Erk1/2)(137F5))、抗AKT抗体(Cell Signaling公司制的Akt antibody)进行蛋白质印迹。发现在表达AAV-CA-TrkB的Cos7细胞中，pERK及pAKT的产生增加，两个信号被激活。其中，ERK及AKT的总量均无变化。另外，pERK及pAKT均是位于TrkB的下游的细胞内信号。另外，图4中的对照是使用空载体(从AAV-CA-TrkB载体中除去CA-TrkB序列)进行同样实验的结果，几乎未发现pERK及pAKT的产生。

[实施例2]视神经夹伤模型的病理学分析

(方法)

＝神经保护效果的评价方法＝

对于小鼠(系统名称C57BL/6：购自查尔斯河(Charles River)公司)，在视神经夹伤的14天前，将2μL的AAV-DsRed(对照组)或AAV-CA-TrkB施用至眼内。另外，AAV-DsRed是指与AAV-CA-TrkB的结构相比，插入了编码荧光蛋白质DsRed的基因片段来代替编码CA-TrkB的基因片段的腺相关病毒载体。

接着，露出上述小鼠的视神经，在眼球后的约1mm的部位物理性夹伤视神经(方法的详细内容另参考非专利文献6及7)。然后，在视神经夹伤14天后制作视网膜的展开标本，对残留的视网膜神经节细胞的数量进行定量计数。另外，在视神经采集的10天前(与制作视网膜的展开标本的10天前意思相同)，从脑的上丘注射染料Fluoro-Gold(Fluorocrome公司制的商品名)，来逆行标记视网膜神经节细胞。

＝视神经再生的评价方法＝

对于小鼠(系统名称C57BL/6：购自查尔斯河公司)，在视神经夹伤的14天前，将2μL的AAV-DsRed(对照组)或AAV-CA-TrkB施用至眼内。

以与上述“神经保护效果的评价方法”相同的方式进行视神经夹伤。然后，在视神经夹伤14天后对小鼠进行灌流固定，制作视神经的病理标本，对来自夹伤部位的轴突再生量进行定量。另外，在视神经采集的3天前(与制作视神经的病理标本的3天前意思相同)，从眼球注射荧光染料CTB，使再生轴突纤维显色。

(结果)

＝神经保护效果＝

在视神经夹伤14天后，对残留的视网膜神经节细胞的数量进行定量。在AAV-CA-TrkB给药组(1720±72cells/mm²)中，与AAV-DsRed给药组(664±14cells/mm²)相比，残留的视网膜神经节细胞数显著增加(图5)。p<0.01(one-tailed Student’s t test)。

＝视神经再生＝

在视神经夹伤14天后计量CTB标记的再生轴突，结果发现在AAV-CA-TrkB给药组中，与AAV-DsRed给药组相比，在再生轴突数及伸长距离两个方面都有显著改善(图6)。另外，图6所示的曲线图的X轴是指距视神经夹伤部位的距离(μm)，Y轴是指轴突数。p<0.05(one-tailed Student’s t test)。

[实施例3]CA-TrkB对视网膜神经节细胞的保护作用(青光眼模型小鼠)

(方法)

作为青光眼模型小鼠的GLAST基因敲除小鼠(参考论文：Harada T,et al.Thepotential role of glutamate transporters in the pathogenesis of normaltension glaucoma.The Journal of Clinical Investigation 117:1763-1770,2007.)在3-5周龄期间视网膜神经节细胞消失，引起视觉功能下降。对于10日龄的GLAST基因敲除小鼠，将1μL的AAV-DsRed(对照组)或AAV-CA-TrkB施用至眼球内(另参考实施例2)。接着，制作达到12周龄的这些基因敲除小鼠的视网膜的展开标本，对残留的视网膜神经节细胞的数量进行计数。在视网膜神经节细胞的检测中使用利用RBPMS抗体(Merck Millipore公司制的anti-RBPMS antibody)的免疫染色。RBPMS是视网膜神经节细胞的标志物。

(结果)

如图7所示，在AAV-CA-TrkB给药组中，与对照组相比，残留的视网膜神经节细胞数显著增加。P<0.05(one-tailed Student’s t test)。

[实施例4]

(方法)

接着，使用表达CA-TrkB的如下变体(另参照图8)的载体，对信号传导的活性进行研究。

·“Cyto-TrkB”载体：将编码在TrkB的胞内区的N末端添加了myc-标签的蛋白质的DNA片段插入至实施例1的AAV载体所得。与实施例1的AAV-CA-TrkB相比，仅有一点不同，即，在TrkB的胞内区的C末端未添加法尼基化信号序列。

·“KD-TrkB”载体：与实施例1的AAV-CA-TrkB相比，仅有一点不同，即，编码的蛋白质在TrkB的胞内区产生了使其激酶活性消失的单一氨基酸突变(第134位氨基酸从赖氨酸突变为天冬酰胺)。

·“iSH-TrkB”载体：与实施例1的AAV-CA-TrkB相比，仅有一点不同，即，编码的蛋白质在TrkB的胞内区的N末端与myc-标签之间还插入有p85的SH2序列。另外，SH2序列是形成PI3K的构成因子p110及复合体所需的序列。将编码iSH-TrkB的基因片段(插入至AAV载体的基因片段的全长)的碱基序列表示为序列编号5及图10。

接着，与实施例1同样地，将这些载体转染至Cos7细胞，在培养24小时使细胞裂解，通过蛋白质印迹法研究对ERK及AKT的激活的影响。

(结果)

如图8所示，明确可知当转染“Cyto-TrkB”载体及“KD-TrkB”载体时，未见pERK及pAKT的增加，没有发现两个信号的激活。另一方面，当转染“iSH-TrkB”载体时，与转染AAV-CA-TrkB时(在图中表示为CA-TrkB)相比，发现AKT活性有显著增加的趋势。另外，图8中的对照与实施例1的对照相同。

[实施例5]组成型激活TrkA载体及组成型激活TrkC载体的制作

(方法)

按照实施例1的方法制作表达TrkA分子的胞内区的AAV载体(称为AAV-CA-TrkA)。即，编码TrkA的胞内区来代替TrkB的胞内区，除此以外，使用与编码CA-TrkB的基因片段(参考实施例1)具有相同结构的片段，按照实施例1所述的方法制作AAV-CA-TrkA(另参考图9)。

将TrkA的胞内区的氨基酸序列表示为序列编号6，将编码TrkA的胞内区的基因(DNA)的碱基序列表示为序列编号7。并且，将编码CA-TrkA的基因片段(插入至AAV载体的基因片段的全长)的碱基序列表示为序列编号8及图11。

同样地，按照实施例1的方法制作表达TrkC分子的胞内区的AAV载体(称为AAV-CA-TrkC)。即，编码TrkC的胞内区来代替TrkB的胞内区，除此以外，使用与编码CA-TrkB的基因片段(参考实施例1)具有相同结构的片段，按照实施例1所述的方法制作AAV-CA-TrkC(另参考图9)。

将TrkC的胞内区的氨基酸序列表示为序列编号9，将编码TrkC的胞内区的基因(DNA)的碱基序列表示为序列编号10。并且，将编码CA-TrkC的基因片段(插入至AAV载体的基因片段的全长)的碱基序列表示为序列编号11及图12。

接着，与实施例1同样地，将这些载体转染至Cos7细胞，培养24小时后使细胞裂解，通过蛋白质印迹法研究TrkB的同源物TrkA及TrkC对ERK及AKT的激活的影响。

(结果)

如图9所示，当转染AAV-CA-TrkA及AAV-CA-TrkC时，发现pERK及pAKT增加，两个信号被激活。另外，图9中的对照与实施例1的对照相同。

[实施例6]CA-TrkB对视觉功能的恢复作用(视神经夹伤模型小鼠)

(方法)

对于成熟小鼠，按照实施例2的方法获得AAV-CA-TrkB给药组。在给药14天后夹伤视神经，在夹伤14天后及28天后，通过手术将电极端口安装至脑的上丘，测定由闪光刺激引起的视觉诱发电位(F-VEP：Flash-Visual Evoked Potential)。

(结果)

如图13所示，在夹伤2周后，视觉诱发电位的反应消失，但在夹伤4周后发现产生视觉诱发电位，经确认，部分视觉功能恢复。

产业上的可利用性

本发明例如可用于以神经相关疾病等为对象的医疗用途。

序列表

<110> 公益财团法人东京都医学综合研究所

<120> 编码Trk片段的核酸构建体及其利用

<130> AJ20648PT2102

<150> JP 2019-038503

<151> 2019-03-04

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号序列

<400> 1

gccatgagca aagatggtaa aaagaagaaa aagaagtcaa agacaaagtg tgtaattatg 60

taa 63

<210> 2

<211> 384

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Lys Leu Ala Arg His Ser Lys Phe Gly Met Lys Asp Phe Ser Trp Phe

1 5 10 15

Gly Phe Gly Lys Val Lys Ser Arg Gln Gly Val Gly Pro Ala Ser Val

20 25 30

Ile Ser Asn Asp Asp Asp Ser Ala Ser Pro Leu His His Ile Ser Asn

35 40 45

Gly Ser Asn Thr Pro Ser Ser Ser Glu Gly Gly Pro Asp Ala Val Ile

50 55 60

Ile Gly Met Thr Lys Ile Pro Val Ile Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Gly

65 70 75 80

Ile Thr Asn Ser Gln Leu Lys Pro Asp Thr Phe Val Gln His Ile Lys

85 90 95

Arg His Asn Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly

100 105 110

Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu Cys Pro Glu Gln Asp Lys

115 120 125

Ile Leu Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Asp Ala Ser Asp Asn Ala Arg

130 135 140

Lys Asp Phe His Arg Glu Ala Glu Leu Leu Thr Asn Leu Gln His Glu

145 150 155 160

His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Val Glu Gly Asp Pro Leu Ile

165 170 175

Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Asn Lys Phe Leu Arg

180 185 190

Ala His Gly Pro Asp Ala Val Leu Met Ala Glu Gly Asn Pro Pro Thr

195 200 205

Glu Leu Thr Gln Ser Gln Met Leu His Ile Ala Gln Gln Ile Ala Ala

210 215 220

Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe Val His Arg Asp Leu Ala

225 230 235 240

Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Leu Leu Val Lys Ile Gly Asp

245 250 255

Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Val Gly

260 265 270

Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ser Ile Met

275 280 285

Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp Ser Leu Gly Val Val

290 295 300

Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro Trp Tyr Gln Leu Ser

305 310 315 320

Asn Asn Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln Gly Arg Val Leu Gln Arg

325 330 335

Pro Arg Thr Cys Pro Gln Glu Val Tyr Glu Leu Met Leu Gly Cys Trp

340 345 350

Gln Arg Glu Pro His Met Arg Lys Asn Ile Lys Gly Ile His Thr Leu

355 360 365

Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ala Ser Pro Val Tyr Leu Asp Ile Leu Gly

370 375 380

<210> 3

<211> 1152

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

aagttggcaa gacactccaa gtttggcatg aaagatttct catggtttgg atttgggaaa 60

gtaaaatcaa gacaaggtgt tggcccagcc tccgttatca gcaatgatga tgactctgcc 120

agcccactcc atcacatctc caatgggagt aacactccat cttcttcgga aggtggccca 180

gatgctgtca ttattggaat gaccaagatc cctgtcattg aaaatcccca gtactttggc 240

atcaccaaca gtcagctcaa gccagacaca tttgttcagc acatcaagcg acataacatt 300

gttctgaaaa gggagctagg cgaaggagcc tttggaaaag tgttcctagc tgaatgctat 360

aacctctgtc ctgagcagga caagatcttg gtggcagtga agaccctgaa ggatgccagt 420

gacaatgcac gcaaggactt ccaccgtgag gccgagctcc tgaccaacct ccagcatgag 480

cacatcgtca agttctatgg cgtctgcgtg gagggcgacc ccctcatcat ggtctttgag 540

tacatgaagc atggggacct caacaagttc ctcagggcac acggccctga tgccgtgctg 600

atggctgagg gcaacccgcc cacggaactg acgcagtcgc agatgctgca tatagcccag 660

cagatcgccg cgggcatggt ctacctggcg tcccagcact tcgtgcaccg cgatttggcc 720

accaggaact gcctggtcgg ggagaacttg ctggtgaaaa tcggggactt tgggatgtcc 780

cgggacgtgt acagcactga ctactacagg gtcggtggcc acacaatgct gcccattcgc 840

tggatgcctc cagagagcat catgtacagg aaattcacga cggaaagcga cgtctggagc 900

ctgggggtcg tgttgtggga gattttcacc tatggcaaac agccctggta ccagctgtca 960

aacaatgagg tgatagagtg tatcactcag ggccgagtcc tgcagcgacc ccgcacgtgc 1020

ccccaggagg tgtatgagct gatgctgggg tgctggcagc gagagcccca catgaggaag 1080

aacatcaagg gcatccatac cctccttcag aacttggcca aggcatctcc ggtctacctg 1140

gacattctag gc 1152

<210> 4

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CA-TrkB的核酸序列

<400> 4

atggcatcaa tgcagaagct gatctcagag gaggacctga agttggcaag acactccaag 60

tttggcatga aagatttctc atggtttgga tttgggaaag taaaatcaag acaaggtgtt 120

ggcccagcct ccgttatcag caatgatgat gactctgcca gcccactcca tcacatctcc 180

aatgggagta acactccatc ttcttcggaa ggtggcccag atgctgtcat tattggaatg 240

accaagatcc ctgtcattga aaatccccag tactttggca tcaccaacag tcagctcaag 300

ccagacacat ttgttcagca catcaagcga cataacattg ttctgaaaag ggagctaggc 360

gaaggagcct ttggaaaagt gttcctagct gaatgctata acctctgtcc tgagcaggac 420

aagatcttgg tggcagtgaa gaccctgaag gatgccagtg acaatgcacg caaggacttc 480

caccgtgagg ccgagctcct gaccaacctc cagcatgagc acatcgtcaa gttctatggc 540

gtctgcgtgg agggcgaccc cctcatcatg gtctttgagt acatgaagca tggggacctc 600

aacaagttcc tcagggcaca cggccctgat gccgtgctga tggctgaggg caacccgccc 660

acggaactga cgcagtcgca gatgctgcat atagcccagc agatcgccgc gggcatggtc 720

tacctggcgt cccagcactt cgtgcaccgc gatttggcca ccaggaactg cctggtcggg 780

gagaacttgc tggtgaaaat cggggacttt gggatgtccc gggacgtgta cagcactgac 840

tactacaggg tcggtggcca cacaatgctg cccattcgct ggatgcctcc agagagcatc 900

atgtacagga aattcacgac ggaaagcgac gtctggagcc tgggggtcgt gttgtgggag 960

attttcacct atggcaaaca gccctggtac cagctgtcaa acaatgaggt gatagagtgt 1020

atcactcagg gccgagtcct gcagcgaccc cgcacgtgcc cccaggaggt gtatgagctg 1080

atgctggggt gctggcagcg agagccccac atgaggaaga acatcaaggg catccatacc 1140

ctccttcaga acttggccaa ggcatctccg gtctacctgg acattctagg cgcggccgcg 1200

gccatgagca aagatggtaa aaagaagaaa aagaagtcaa agacaaagtg tgtaattatg 1260

taa 1263

<210> 5

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码iSH-TrkB的核酸序列

<400> 5

atggcatcaa tgcagaagct gatctcagag gaggacctgg tgtccaaata ccaacaggat 60

caagttgtca aagaagataa tattgaagct gtagggaaaa aattacatga atataacact 120

caatttcaag aaaaaagtcg ggaatatgat agattatatg aagactatac ccgaacttcc 180

caggaaatcc aaatgaaaag aacagctatt gaagcattta atgaaaccat aaaaatattt 240

gaagaacagt gccaaaccca ggagcggtac agcaaagaat acatagaaaa gttcaaacgt 300

gaaggcaacg agacggaaat ccaaaggatt atgcataatt atgaaaagtt aaagtctcga 360

atcagtgaaa ttgtcgatag cagaaggaga ttggaagagg acttgaagaa gcaggcggct 420

gagtatcgtg agattgacaa acgcatgaac agcattaaac cagacctcat tcagctaaga 480

aagacgagag accaatactt gatgtggttg actcagaaag gtgttcggca gaagaaattg 540

aacgagtggc tgggcaatga aaacactgaa gaccaatatt cgctggtaga agatgatgag 600

gatctgcccc accacgatga gaagactaag ttggcaagac actccaagtt tggcatgaaa 660

gatttctcat ggtttggatt tgggaaagta aaatcaagac aaggtgttgg cccagcctcc 720

gttatcagca atgatgatga ctctgccagc ccactccatc acatctccaa tgggagtaac 780

actccatctt cttcggaagg tggcccagat gctgtcatta ttggaatgac caagatccct 840

gtcattgaaa atccccagta ctttggcatc accaacagtc agctcaagcc agacacattt 900

gttcagcaca tcaagcgaca taacattgtt ctgaaaaggg agctaggcga aggagccttt 960

ggaaaagtgt tcctagctga atgctataac ctctgtcctg agcaggacaa gatcttggtg 1020

gcagtgaaga ccctgaagga tgccagtgac aatgcacgca aggacttcca ccgtgaggcc 1080

gagctcctga ccaacctcca gcatgagcac atcgtcaagt tctatggcgt ctgcgtggag 1140

ggcgaccccc tcatcatggt ctttgagtac atgaagcatg gggacctcaa caagttcctc 1200

agggcacacg gccctgatgc cgtgctgatg gctgagggca acccgcccac ggaactgacg 1260

cagtcgcaga tgctgcatat agcccagcag atcgccgcgg gcatggtcta cctggcgtcc 1320

cagcacttcg tgcaccgcga tttggccacc aggaactgcc tggtcgggga gaacttgctg 1380

gtgaaaatcg gggactttgg gatgtcccgg gacgtgtaca gcactgacta ctacagggtc 1440

ggtggccaca caatgctgcc cattcgctgg atgcctccag agagcatcat gtacaggaaa 1500

ttcacgacgg aaagcgacgt ctggagcctg ggggtcgtgt tgtgggagat tttcacctat 1560

ggcaaacagc cctggtacca gctgtcaaac aatgaggtga tagagtgtat cactcagggc 1620

cgagtcctgc agcgaccccg cacgtgcccc caggaggtgt atgagctgat gctggggtgc 1680

tggcagcgag agccccacat gaggaagaac atcaagggca tccataccct ccttcagaac 1740

ttggccaagg catctccggt ctacctggac attctaggcg cggccgcggc catgagcaaa 1800

gatggtaaaa agaagaaaaa gaagtcaaag acaaagtgtg taattatgta a 1851

<210> 6

<211> 356

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 6

Lys Cys Gly Gln Arg Ser Lys Phe Gly Ile Asn Arg Pro Ala Val Leu

1 5 10 15

Ala Pro Glu Asp Gly Leu Ala Met Ser Leu His Phe Met Thr Leu Gly

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Ser Pro Thr Glu Gly Lys Gly Ser Gly Leu Gln Gly

35 40 45

His Ile Met Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Ser Asp Thr Cys Val His His

50 55 60

Ile Lys Arg Gln Asp Ile Ile Leu Lys Trp Glu Leu Gly Glu Gly Ala

65 70 75 80

Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu Leu Asn Asp Gln

85 90 95

Asp Lys Met Leu Val Ala Val Lys Ala Leu Lys Glu Ala Ser Glu Asn

100 105 110

Ala Arg Gln Asp Phe Gln Arg Glu Ala Glu Leu Leu Thr Met Leu Gln

115 120 125

His Gln His Ile Val Arg Phe Phe Gly Val Cys Thr Glu Gly Gly Pro

130 135 140

Leu Leu Met Val Phe Glu Tyr Met Arg His Gly Asp Leu Asn Arg Phe

145 150 155 160

Leu Arg Ser His Gly Pro Asp Ala Lys Leu Leu Ala Gly Gly Glu Asp

165 170 175

Val Ala Pro Gly Pro Leu Gly Leu Gly Gln Leu Leu Ala Val Ala Ser

180 185 190

Gln Val Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Leu His Phe Val His

195 200 205

Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Gln Gly Leu Val Val

210 215 220

Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Ile Tyr Ser Thr Asp Tyr

225 230 235 240

Tyr Arg Val Gly Gly Arg Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro

245 250 255

Glu Ser Ile Leu Tyr Arg Lys Phe Ser Thr Glu Ser Asp Val Trp Ser

260 265 270

Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro Trp

275 280 285

Tyr Gln Leu Ser Asn Thr Glu Ala Ile Glu Cys Ile Thr Gln Gly Arg

290 295 300

Glu Leu Glu Arg Pro Arg Ala Cys Pro Pro Asp Val Tyr Ala Ile Met

305 310 315 320

Arg Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro Gln Gln Arg Leu Ser Met Lys Asp

325 330 335

Val His Ala Arg Leu Gln Ala Leu Ala Gln Ala Pro Pro Ser Tyr Leu

340 345 350

Asp Val Leu Gly

355

<210> 7

<211> 1068

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 7

aaatgtggac agaggagcaa atttgggatc aaccgccctg ctgtattagc tccagaggat 60

gggctggcca tgtccctaca cttcatgaca ctgggtggca gttctctttc ccctactgag 120

ggcaaaggct ccggactcca gggccacatc atggagaacc cacagtactt cagtgatacc 180

tgtgtccatc acatcaagcg ccaggacatc attctcaagt gggagctagg ggagggagcc 240

tttggaaagg tctttctcgc tgagtgctac aaccttctga atgatcagga caagatgctc 300

gtggctgtca aggcactgaa ggaggcatcc gagaatgctc ggcaggactt tcagcgtgag 360

gccgagctgc tcaccatgct acagcaccag cacatcgtgc gcttctttgg agtctgcacc 420

gagggtggcc cgttgctcat ggtctttgag tacatgcgcc acggggacct caaccgtttc 480

ctccggtccc acggacctga tgcaaagctg ctggctggtg gtgaggatgt ggctcctggt 540

cctctgggcc ttgggcagct tctggctgtg gctagccagg tggctgctgg tatggtatat 600

ctagccagcc tgcactttgt gcaccgggat ctggccacac gcaactgtct ggtgggtcag 660

ggactagtgg tgaagattgg agactttggc atgagcagag acatctatag cacagactat 720

taccgagtgg gaggtcggac catgctgccc atccgctgga tgccacccga gagcatcctc 780

taccgcaagt tcagcaccga gagcgatgtg tggagctttg gggtggtgct ctgggagatc 840

ttcacctatg gaaagcagcc ctggtaccag ctctccaaca ctgaggcgat cgagtgtatc 900

acgcagggcc gggagctgga gcggccgcgc gcctgccctc ctgatgtcta cgccatcatg 960

cgaggctgct ggcagcgaga accgcagcaa cgcctcagca tgaaggatgt gcacgcgcgt 1020

ctgcaggccc tggcacaggc gccacccagt tacctggacg ttctgggc 1068

<210> 8

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CA-TrekA的核酸序列

<400> 8

atggcatcaa tgcagaagct gatctcagag gaggacctgg tcgacaaatg tggacagagg 60

agcaaatttg ggatcaaccg ccctgctgta ttagctccag aggatgggct ggccatgtcc 120

ctacacttca tgacactggg tggcagttct ctttccccta ctgagggcaa aggctccgga 180

ctccagggcc acatcatgga gaacccacag tacttcagtg atacctgtgt ccatcacatc 240

aagcgccagg acatcattct caagtgggag ctaggggagg gagcctttgg aaaggtcttt 300

ctcgctgagt gctacaacct tctgaatgat caggacaaga tgctcgtggc tgtcaaggca 360

ctgaaggagg catccgagaa tgctcggcag gactttcagc gtgaggccga gctgctcacc 420

atgctacagc accagcacat cgtgcgcttc tttggagtct gcaccgaggg tggcccgttg 480

ctcatggtct ttgagtacat gcgccacggg gacctcaacc gtttcctccg gtcccacgga 540

cctgatgcaa agctgctggc tggtggtgag gatgtggctc ctggtcctct gggccttggg 600

cagcttctgg ctgtggctag ccaggtggct gctggtatgg tatatctagc cagcctgcac 660

tttgtgcacc gggatctggc cacacgcaac tgtctggtgg gtcagggact agtggtgaag 720

attggagact ttggcatgag cagagacatc tatagcacag actattaccg agtgggaggt 780

cggaccatgc tgcccatccg ctggatgcca cccgagagca tcctctaccg caagttcagc 840

accgagagcg atgtgtggag ctttggggtg gtgctctggg agatcttcac ctatggaaag 900

cagccctggt accagctctc caacactgag gcgatcgagt gtatcacgca gggccgggag 960

ctggagcggc cgcgcgcctg ccctcctgat gtctacgcca tcatgcgagg ctgctggcag 1020

cgagaaccgc agcaacgcct cagcatgaag gatgtgcacg cgcgtctgca ggccctggca 1080

caggcgccac ccagttacct ggacgttctg ggctctagag ccatgagcaa agatggtaaa 1140

aagaagaaaa agaagtcaaa gacaaagtgt gtaattatgt aa 1182

<210> 9

<211> 371

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 9

Lys Tyr Gly Arg Arg Ser Lys Phe Gly Met Lys Gly Pro Val Ala Val

1 5 10 15

Ile Ser Gly Glu Glu Asp Ser Ala Ser Pro Leu His His Ile Asn His

20 25 30

Gly Ile Thr Thr Pro Ser Ser Leu Asp Ala Gly Pro Asp Thr Val Val

35 40 45

Ile Gly Met Thr Arg Ile Pro Val Ile Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Arg

50 55 60

Gln Gly His Asn Cys His Lys Pro Asp Thr Tyr Val Gln His Ile Lys

65 70 75 80

Arg Arg Asp Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly

85 90 95

Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys

100 105 110

Met Leu Val Ala Val Lys Ala Leu Lys Asp Pro Thr Leu Ala Ala Arg

115 120 125

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130 135 140

His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Gly Asp Gly Asp Pro Leu Ile

145 150 155 160

Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Asn Lys Phe Leu Arg

165 170 175

Ala His Gly Pro Asp Ala Met Ile Leu Val Asp Gly Gln Pro Arg Gln

180 185 190

Ala Lys Gly Glu Leu Gly Leu Ser Gln Met Leu His Ile Ala Ser Gln

195 200 205

Ile Ala Ser Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe Val His Arg

210 215 220

Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Ala Asn Leu Leu Val Lys

225 230 235 240

Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr

245 250 255

Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu

260 265 270

Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp Ser Phe

275 280 285

Gly Val Ile Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro Trp Phe

290 295 300

Gln Leu Ser Asn Thr Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln Gly Arg Val

305 310 315 320

Leu Glu Arg Pro Arg Val Cys Pro Lys Glu Val Tyr Asp Val Met Leu

325 330 335

Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro Gln Gln Arg Leu Asn Ile Lys Glu Ile

340 345 350

Tyr Lys Ile Leu His Ala Leu Gly Lys Ala Thr Pro Ile Tyr Leu Asp

355 360 365

Ile Leu Gly

370

<210> 10

<211> 1113

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 10

aagtatggtc gccggtccaa atttggaatg aagggtcctg tggctgttat cagtggagag 60

gaggactcag ccagcccact gcatcacatc aaccatggca tcactacacc atcatcgttg 120

gatgctgggc ctgacacagt ggtcattggc atgacccgca tcccagtcat tgagaacccc 180

cagtacttcc gtcagggtca caattgccac aagccagaca catatgttca gcacatcaag 240

aggagagaca tcgtgttgaa gagagaattg ggtgagggag cctttgggaa ggtcttcctg 300

gctgagtgct acaatctaag ccccaccaaa gacaagatgc tagtggcagt gaaggccctg 360

aaggatccca ccttggctgc caggaaggat ttccagaggg aggctgagct gctcacgaac 420

ctgcagcatg agcatattgt caagttctat ggggtgtgtg gtgatggtga cccactcatc 480

atggtctttg aatacatgaa gcatggagac cttaacaagt tcctcagggc ccatgggcca 540

gatgccatga tcctcgtgga tggacagcca cgtcaggcca agggggagct agggctctct 600

cagatgctcc acatcgccag tcagatagcc tcgggcatgg tgtacctggc ttcccagcac 660

tttgtacacc gggacctggc cacgaggaac tgcctggttg gagccaatct actagtgaag 720

attggagatt ttggcatgtc cagggacgtc tacagtactg attactacag ggtgggagga 780

cacaccatgc tccccatccg ctggatgccc cctgaaagca taatgtaccg gaagttcacc 840

acagagagtg atgtctggag cttcggggtt attctttggg agatctttac ctatgggaag 900

caaccatggt tccagctttc caacacggag gtcattgaat gcatcaccca aggccgtgtc 960

ttggagagac ccagagtctg ccctaaagaa gtgtatgatg tcatgctggg gtgctggcag 1020

agggaaccac agcagcggct gaatattaag gagatctaca aaatcctcca tgctttgggg 1080

aaggccaccc cgatctacct ggacattctt ggc 1113

<210> 11

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码CA-TrkC的核酸序列

<400> 11

atggcatcaa tgcagaagct gatctcagag gaggacctgg tcgacaagta tggtcgccgg 60

tccaaatttg gaatgaaggg tcctgtggct gttatcagtg gagaggagga ctcagccagc 120

ccactgcatc acatcaacca tggcatcact acaccatcat cgttggatgc tgggcctgac 180

acagtggtca ttggcatgac ccgcatccca gtcattgaga acccccagta cttccgtcag 240

ggtcacaatt gccacaagcc agacacatat gttcagcaca tcaagaggag agacatcgtg 300

ttgaagagag aattgggtga gggagccttt gggaaggtct tcctggctga gtgctacaat 360

ctaagcccca ccaaagacaa gatgctagtg gcagtgaagg ccctgaagga tcccaccttg 420

gctgccagga aggatttcca gagggaggct gagctgctca cgaacctgca gcatgagcat 480

attgtcaagt tctatggggt gtgtggtgat ggtgacccac tcatcatggt ctttgaatac 540

atgaagcatg gagaccttaa caagttcctc agggcccatg ggccagatgc catgatcctc 600

gtggatggac agccacgtca ggccaagggg gagctagggc tctctcagat gctccacatc 660

gccagtcaga tagcctcggg catggtgtac ctggcttccc agcactttgt acaccgggac 720

ctggccacga ggaactgcct ggttggagcc aatctactag tgaagattgg agattttggc 780

atgtccaggg acgtctacag tactgattac tacagggtgg gaggacacac catgctcccc 840

atccgctgga tgccccctga aagcataatg taccggaagt tcaccacaga gagtgatgtc 900

tggagcttcg gggttattct ttgggagatc tttacctatg ggaagcaacc atggttccag 960

ctttccaaca cggaggtcat tgaatgcatc acccaaggcc gtgtcttgga gagacccaga 1020

gtctgcccta aagaagtgta tgatgtcatg ctggggtgct ggcagaggga accacagcag 1080

cggctgaata ttaaggagat ctacaaaatc ctccatgctt tggggaaggc caccccgatc 1140

tacctggaca ttcttggctc tagagccatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 1200

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 1227

<210> 12

<211> 357

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Lys Cys Gly Arg Arg Asn Lys Phe Gly Ile Asn Arg Pro Ala Val Leu

1 5 10 15

Ala Pro Glu Asp Gly Leu Ala Met Ser Leu His Phe Met Thr Leu Gly

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Ser Pro Thr Glu Gly Lys Gly Ser Gly Leu Gln Gly

35 40 45

His Ile Ile Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Ser Asp Ala Cys Val His His

50 55 60

Ile Lys Arg Arg Asp Ile Val Leu Lys Trp Glu Leu Gly Glu Gly Ala

65 70 75 80

Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys His Asn Leu Leu Pro Glu Gln

85 90 95

Asp Lys Met Leu Val Ala Val Lys Ala Leu Lys Glu Ala Ser Glu Ser

100 105 110

Ala Arg Gln Asp Phe Gln Arg Glu Ala Glu Leu Leu Thr Met Leu Gln

115 120 125

His Gln His Ile Val Arg Phe Phe Gly Val Cys Thr Glu Gly Arg Pro

130 135 140

Leu Leu Met Val Phe Glu Tyr Met Arg His Gly Asp Leu Asn Arg Phe

145 150 155 160

Leu Arg Ser His Gly Pro Asp Ala Lys Leu Leu Ala Gly Gly Glu Asp

165 170 175

Val Ala Pro Gly Pro Leu Gly Leu Gly Gln Leu Leu Ala Val Ala Ser

180 185 190

Gln Val Ala Ala Gly Met Val Tyr Leu Ala Gly Leu His Phe Val His

195 200 205

Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Gln Gly Leu Val Val

210 215 220

Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Ile Tyr Ser Thr Asp Tyr

225 230 235 240

Tyr Arg Val Gly Gly Arg Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro

245 250 255

Glu Ser Ile Leu Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp Ser

260 265 270

Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro Trp

275 280 285

Tyr Gln Leu Ser Asn Thr Glu Ala Ile Asp Cys Ile Thr Gln Gly Arg

290 295 300

Glu Leu Glu Arg Pro Arg Ala Cys Pro Pro Glu Val Tyr Ala Ile Met

305 310 315 320

Arg Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro Gln Gln Arg His Ser Ile Lys Asp

325 330 335

Val His Ala Arg Leu Gln Ala Leu Ala Gln Ala Pro Pro Val Tyr Leu

340 345 350

Asp Val Leu Gly Glx

355

<210> 13

<211> 1071

<212> DNA

<213> 智人

<400> 13

aaatgtggac ggagaaacaa gtttgggatc aaccgcccgg ctgtgctggc tccagaggat 60

gggctggcca tgtccctgca tttcatgaca ttgggtggca gctccctgtc ccccaccgag 120

ggcaaaggct ctgggctcca aggccacatc atcgagaacc cacaatactt cagtgatgcc 180

tgtgttcacc acatcaagcg ccgggacatc gtgctcaagt gggagctggg ggagggcgcc 240

tttgggaagg tcttccttgc tgagtgccac aacctcctgc ctgagcagga caagatgctg 300

gtggctgtca aggcactgaa ggaggcgtcc gagagtgctc ggcaggactt ccagcgtgag 360

gctgagctgc tcaccatgct gcagcaccag cacatcgtgc gcttcttcgg cgtctgcacc 420

gagggccgcc ccctgctcat ggtctttgag tatatgcggc acggggacct caaccgcttc 480

ctccgatccc atggacctga tgccaagctg ctggctggtg gggaggatgt ggctccaggc 540

cccctgggtc tggggcagct gctggccgtg gctagccagg tcgctgcggg gatggtgtac 600

ctggcgggtc tgcattttgt gcaccgggac ctggccacac gcaactgtct agtgggccag 660

ggactggtgg tcaagattgg tgattttggc atgagcaggg atatctacag caccgactat 720

taccgtgtgg gaggccgcac catgctgccc attcgctgga tgccgcccga gagcatcctg 780

taccgtaagt tcaccaccga gagcgacgtg tggagcttcg gcgtggtgct ctgggagatc 840

ttcacctacg gcaagcagcc ctggtaccag ctctccaaca cggaggcaat cgactgcatc 900

acgcagggac gtgagttgga gcggccacgt gcctgcccac cagaggtcta cgccatcatg 960

cggggctgct ggcagcggga gccccagcaa cgccacagca tcaaggatgt gcacgcccgg 1020

ctgcaagccc tggcccaggc acctcctgtc tacctggatg tcctgggcta g 1071

<210> 14

<211> 372

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Lys Tyr Gly Arg Arg Ser Lys Phe Gly Met Lys Gly Pro Val Ala Val

1 5 10 15

Ile Ser Gly Glu Glu Asp Ser Ala Ser Pro Leu His His Ile Asn His

20 25 30

Gly Ile Thr Thr Pro Ser Ser Leu Asp Ala Gly Pro Asp Thr Val Val

35 40 45

Ile Gly Met Thr Arg Ile Pro Val Ile Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Arg

50 55 60

Gln Gly His Asn Cys His Lys Pro Asp Thr Tyr Val Gln His Ile Lys

65 70 75 80

Arg Arg Asp Ile Val Leu Lys Arg Glu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly

85 90 95

Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys

100 105 110

Met Leu Val Ala Val Lys Ala Leu Lys Asp Pro Thr Leu Ala Ala Arg

115 120 125

Lys Asp Phe Gln Arg Glu Ala Glu Leu Leu Thr Asn Leu Gln His Glu

130 135 140

His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys Gly Asp Gly Asp Pro Leu Ile

145 150 155 160

Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Asn Lys Phe Leu Arg

165 170 175

Ala His Gly Pro Asp Ala Met Ile Leu Val Asp Gly Gln Pro Arg Gln

180 185 190

Ala Lys Gly Glu Leu Gly Leu Ser Gln Met Leu His Ile Ala Ser Gln

195 200 205

Ile Ala Ser Gly Met Val Tyr Leu Ala Ser Gln His Phe Val His Arg

210 215 220

Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val Gly Ala Asn Leu Leu Val Lys

225 230 235 240

Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp Val Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr

245 250 255

Arg Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu

260 265 270

Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp Ser Phe

275 280 285

Gly Val Ile Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly Lys Gln Pro Trp Phe

290 295 300

Gln Leu Ser Asn Thr Glu Val Ile Glu Cys Ile Thr Gln Gly Arg Val

305 310 315 320

Leu Glu Arg Pro Arg Val Cys Pro Lys Glu Val Tyr Asp Val Met Leu

325 330 335

Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro Gln Gln Arg Leu Asn Ile Lys Glu Ile

340 345 350

Tyr Lys Ile Leu His Ala Leu Gly Lys Ala Thr Pro Ile Tyr Leu Asp

355 360 365

Ile Leu Gly Glx

370

<210> 15

<211> 1116

<212> DNA

<213> 智人

<400> 15

aaatatggtc gacggtccaa atttggaatg aagggtcccg tggctgtcat cagtggtgag 60

gaggactcag ccagcccact gcaccacatc aaccacggca tcaccacgcc ctcgtcactg 120

gatgccgggc ccgacactgt ggtcattggc atgactcgca tccctgtcat tgagaacccc 180

cagtacttcc gtcagggaca caactgccac aagccggaca cgtatgtgca gcacattaag 240

aggagagaca tcgtgctgaa gcgagaactg ggtgagggag cctttggaaa ggtcttcctg 300

gccgagtgct acaacctcag cccgaccaag gacaagatgc ttgtggctgt gaaggccctg 360

aaggatccca ccctggctgc ccggaaggat ttccagaggg aggccgagct gctcaccaac 420

ctgcagcatg agcacattgt caagttctat ggagtgtgcg gcgatgggga ccccctcatc 480

atggtctttg aatacatgaa gcatggagac ctgaataagt tcctcagggc ccatgggcca 540

gatgcaatga tccttgtgga tggacagcca cgccaggcca agggtgagct ggggctctcc 600

caaatgctcc acattgccag tcagatcgcc tcgggtatgg tgtacctggc ctcccagcac 660

tttgtgcacc gagacctggc caccaggaac tgcctggttg gagcgaatct gctagtgaag 720

attggggact tcggcatgtc cagagatgtc tacagcacgg attattacag ggtgggagga 780

cacaccatgc tccccattcg ctggatgcct cctgaaagca tcatgtaccg gaagttcact 840

acagagagtg atgtatggag cttcggggtg atcctctggg agatcttcac ctatggaaag 900

cagccatggt tccaactctc aaacacggag gtcattgagt gcattaccca aggtcgtgtt 960

ttggagcggc cccgagtctg ccccaaagag gtgtacgatg tcatgctggg gtgctggcag 1020

agggaaccac agcagcggtt gaacatcaag gagatctaca aaatcctcca tgctttgggg 1080

aaggccaccc caatctacct ggacattctt ggctag 1116

Claims (13)

1.一种核酸构建体，其编码包含Trk的胞内区及膜定位序列的融合多肽。

2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，Trk的胞内区选自下述中的任一者：

1)由序列编号2、6、9、12或14中的任一者所记载的氨基酸序列表示的多肽；

2)由与序列编号2、6、9、12或14中的任一者所记载的氨基酸序列显示出90％以上的同一性的氨基酸序列表示的多肽。

3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体，其中，膜定位序列诱导氨基酸的脂质修饰。

4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其中，膜定位序列是法尼基化序列。

5.根据权利要求1至4中的任一项所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体为载体。

6.根据权利要求5所述的核酸构建体腺，其中，所述核酸构建体为腺相关病毒载体。

7.一种医药组合物，其包含权利要求1～6中任一项所述的核酸构建体。

8.根据权利要求7所述的医药组合物，其中，所述医药组合物为神经相关疾病药物。

9.根据权利要求8所述的医药组合物，其中，所述医药组合物用于神经保护或神经再生。

10.一种神经系统细胞，其中可表达地导入了权利要求1所述的核酸构建体。

11.一种细胞激活方法，其包括以下步骤：在细胞内通过膜定位序列使Trk的胞内区定位于细胞膜。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，上述步骤是通过使选自权利要求1～6中任一项所述的核酸构建体、及权利要求7～9中任一项所述的医药组合物中的任一者在神经系统细胞内表达来进行。

13.一种融合多肽，其包含Trk的胞内区及膜定位序列。

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