CN113557058A - 靶向葡萄糖转运子和/或肠促胰岛素途径的神经调节 - Google Patents

Abstract

本公开的主题总体上涉及用于神经调节的技术，其包括将能量(例如，超声能量)施加于组织中以引起葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子变化。在一个实施方式中，神经调节作为代谢紊乱症的治疗而进行实施。

Description

靶向葡萄糖转运子和/或肠促胰岛素途径的神经调节

相关申请的引证

本申请要求享有2019年3月12日提交的题为“靶向葡萄糖转运子和/或肠促胰岛素途径的神经调节”的美国临时申请号62/817,373和2019年3月29日提交的题为“靶向葡萄糖转运子和/或肠促胰岛素途径的神经调节”的美国临时申请号62/826,517的优先权和权益，其内容出于所有目的通过引用以其全部内容结合于本文中。

关于联邦资助研究与开发的声明

本发明是由国防高级研究计划局(Defense Advanced Research ProjectsAgency)(DARPA)授予的合同号HR0011-18-C-0040之下的政府支持而完成。政府对本发明享有一定权利。

技术领域

本文公开的主题涉及通过刺激靶组织中的外周神经或分泌细胞组件进行的神经调节或分泌细胞调节，并且更具体而言，涉及通过神经调节而靶向途径，诸如葡萄糖转运子(transporter)和/或肠促胰岛素(incretin)的途径的技术。

背景技术

神经调节或神经刺激涉及使用刺激装置靶向特定神经途径而获得临床益处。例如，中枢神经系统结构的刺激可以用于治疗疼痛。某些神经刺激策略使用永久植入电极、经皮电磁场或适应脑刺激技术而刺激能够通过植入装置或靠近皮肤表面的神经进行触及的大神经。然而，位于或终止于器官的周围神经系统的较小神经比较大中枢神经系统结构更难以靶向。周围神经系统(PNS)的解剖结构提出了艰巨的挑战。在周围神经中，各个轴突紧密捆绑成组(束)并包裹于保护组织内。这使得很难选择性地刺激终止于特定器官并独特地调节该器官内通讯细胞功能的轴突子集。现仍需要新的神经刺激方法才能无创刺激特异性靶标，并将器官特异性神经活动关联于广泛的临床转化和临床病症治疗功能。

附图说明

当参考附图阅读以下详细描述时，将更好理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，其中相同的字符在整个这些附图中都代表相同的部分，其中：

图1显示了通过ELISA测量的从肝脏刺激的和假对照的Fatty Zucker动物收集的肝脏、肾脏和肠道组织中的葡萄糖钠协同转运子(肠SGLT1或肾脏SGLT2)、葡萄糖转运子2(GLUT-2)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的蛋白质浓度水平，藉此使用管腔剥离技术收集肠道组织样本，以检查葡萄糖转运子浓度或跨管腔屏障组织的易位变化；

图2显示了来自由肝脏刺激的和假对照的Fatty Zucker动物收集的肝脏、肌肉、肠和肾脏组织的mRNA、蛋白质和葡萄糖六磷酸盐浓度水平；

图3显示了从肝脏刺激的和假对照的Fatty Zucker动物收集的下丘脑组织的mRNA、蛋白质和葡萄糖六磷酸盐浓度水平；

图4显示了通过ELISA从肝脏刺激的和假对照的Fatty Zucker动物收集的肠或肾组织中测量的蛋白质浓度水平，这表明肠和肾脏中的GLUT2增加并且肠中的GLP1增加；

图5显示了从肝脏刺激的和假对照的Fatty Zucker动物收集的各种组织中的mRNA浓度水平，这表明由各种葡萄糖利用、胰岛素利用和/或代谢相关蛋白介导的并发和相互关联的变化；

图6显示了在LPS诱导的高血糖模型动物中，肝脏、胰腺或胃肠组织刺激相对于对照导致的5'AMP-活化的蛋白激酶浓度水平和肝刺激相对于对照的谷氨酸水平，这表明胰腺刺激本身导致胰岛素释放和下丘脑中的直接胰岛素信号传导；

图7A显示了体外三维(3D)神经培养中用于外周聚焦超声(pFUS)神经激活的实验平台；

图7B显示了实验时间线和成像的外周神经元网络，这表明了图7A的体外培养物中细胞的关注区域内的瞬时钙；

图7C显示了图7A的体外培养物中的细胞的脉冲超声刺激之后的荧光强度；

图7D显示了图7A的体外培养物中瞬时钙与所施加的超声压力之间的关系；

图8A显示了外周聚焦超声靶标的示意图，其中超声刺激被聚焦于包含沿着迷走神经和副交感神经系统的体(somal)和/或突触连接的多个位置处；

图8B显示了在LPS诱导的炎症和高血糖模型动物内进行的超声刺激和血样采集的时间线；

图8C显示了与单独的LPS(即，无超声)对照相比，在pFUS靶向脾和肠胆碱能抗炎途径(即，脾、骶神经节和无剂量神经节)内的不同解剖部位后的TNF(细胞因子)和葡萄糖浓度；

图8D显示了与LPS对照(LPS CTRL)相比，在三个不同解剖靶位点pFUS后神经递质(即，肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺和乙酰胆碱)的循环/血液浓度的测量结果。

图9A是pFUS-基的精确器官-基神经调节的示意图，其中已知的轴突群的神经支配点被靶向用于使用聚焦脉冲超声刺激；

图9B是在LPS诱导的高血糖模型内进行的pFUS刺激和血样采集的时间线；

图9C显示了LPS对照(无pFUS；黄色圆圈)、肝脏pFUS(蓝色圆圈)、胰腺pFUS(紫色圆圈)和GI pFUS(橙色圆圈)组在0、5、15、30和60分钟时间点所示的循环血糖浓度；

图10A显示了胰岛素受体底物1(IRS1)、磷酸化蛋白激酶B(phos-Akt)、4型葡萄糖转运子(GLUT4)和6-磷酸葡萄糖(G-6-phos)的下丘脑标志物；

图10B显示了循环激素的循环标志物和来自所收集的血样的标志物，包括胰岛素、胰高血糖素、瘦素蛋白(leptin)和GLP1浓度；

图11A显示了每个靶标刺激部位pFUS后的和LPS/无pFUS对照(LPS CTRL)的循环肾上腺素浓度；

图11B显示了每个靶标刺激部位pFUS后和LPS/无pFUS对照(LPS CTRL)的去甲肾上腺素循环浓度；

图11C显示了每个靶标刺激部位pFUS后和LPS/无pFUS对照(LPS CTRL)的多巴胺循环浓度；

图12是根据本公开实施方式使用脉冲发生器的神经调节系统的示意图；

图13是根据本公开的各实施方式的神经调节系统的框图；

图14是根据本公开的实施方式的神经调节技术的流程图；和

图15是根据本公开的实施方式的神经调节技术的流程图。

具体实施方式

下面将描述一个或多个具体实施方式。为了提供这些实施方式的简明描述，在本说明书中并未描述实际实现的所有特征。应该理解的是，在任何此类实际实现的开发中，就像在任何工程或设计项目中一样，必须做出许多实现特异性的决策才能达到开发人员的特定目标，如与系统相关和业务相关的约束的顺应性，这可能因实现而异。此外，应当理解的是，这样的开发工作可能是复杂而耗时的，但对于受益于本公开的普通技术人员而言，它仍然是设计、制作和制造的例行工作。

本文给出的任何实例或举例说明不应该以任何方式视为对与它们一起使用的任何术语的限制、局限或表达定义。相反，这些实例或举例说明将视为关于各种具体实施方式进行描述并且仅作为举例说明性的。本领域普通技术人员将会理解，与这些实例或举例说明一起使用的任何一个或多个术语将涵盖可能会或可能不会随其或本说明书中的其他地方给出的其他实施方式，并且所有此类实施方式旨在都包括于该术语或这些术语的范围内。指定此类非限制性实例和举例说明的语言包括，但不限于：“例如(for example)”、“例如(for instance)”、“如(such as)”、“例如(e.g.)”、“包括(including)”和“在一(一个)实施方式中”。

代谢途径通过复杂反馈进行控制。例如，在食物短缺期间，神经内分泌系统可能会下调以减慢新陈代谢以及增加肾脏去除多余葡萄糖的再吸收。相反，由于内分泌、外周和/或中枢神经系统的病理功能，过多的葡萄糖供应可能导致这些系统的异常激活和控制，这可能有助于甚至在2型糖尿病(T2DM)、肥胖症或其他代谢紊乱症的发展中起因果作用。

某些医药或药物治疗会刺激或抑制与负责肾脏(SGLT2)和肠(GLUT2)中的再吸收或葡萄糖摄取的葡萄糖转运子相关的分子途径和增强胰岛素刺激的葡萄糖利用的肠降血糖素/激素途径。在肾脏中，SGLT2抑制剂(一类T2DM药物)用于直接阻断葡萄糖的再吸收(在近端小管的S1段，或SGLT2蛋白的位置)。这反过来会增加尿液中的葡萄糖排泄，而因此降低血糖水平。在肠道中，SGLT1活性被认为参与了GLUT2从肠细胞基底外侧(basolateral)到顶端的易位的启动，因为钠(Na)协同转运到组织中的变化会导致去极化、L型钙通道激活、Ca流入和细胞骨架结构涉及GLUT2转运的Ca依赖性重构。餐后，这种易位的激活能够增加葡萄糖从顶端/腔到肠上皮细胞(并最终进入血液)的吸收。SGLT1抑制剂(第二类T2DM药物)可能会阻断这种增强的葡萄糖吸收机制，会将更多的葡萄糖保留于肠道内进行分泌。

此外，对于基于精制面粉/糖和低纤维的饮食，由于GLUT易位或标准SGLT1活性在小肠早期部分的快速吸收能力可能会抑制食物/糖到达回肠的远端部分。这是有问题的，因为在小肠(即，回肠)的这个下部分会驻留分泌肠促胰岛素的腺体，如GLP1，这是一类参与新陈代谢的激素。来自这些激素的信号传导可能会向其他外周组织发出信号，以调节它们对胰岛素的反应(即，胰岛素敏感性)。GLP激动剂是另一类T2DM药物，其作用是模拟肠促胰岛素和激活胰岛素分泌和致敏等功能。SGLT1和SGLT2的活性可能会通过腺苷酸环化酶与肾上腺素受体偶联而受到肾上腺素信号传导的影响。

本文提供了靶向某些代谢途径和分子的神经调节和分泌细胞调节的技术。此类代谢途径或分子可能包括通过神经途径的肠道内葡萄糖吸收与排泄(SGLT1)、肾脏内葡萄糖吸收与排泄(SGLT2)和GLP/肠促胰岛素信号传导(通过SGLT1/GLUT2活性和转运改变而肠道葡萄糖浓度)。因此，在一个实施方式中，可以施加超声能量而聚焦于代谢组织(肝脏、胃肠道、胰腺、肾脏)中的关注区域。所关注的区域或所关注的多个区域可以经受包括一个或多个剂量的一次性施加或以在一段时间内作为治疗方案一部分给药的分剂量施加的超声能量的治疗。由于该治疗，某些所关注的分子的活性、浓度和/或位置发生了变化。这些变化可能存在于关注区域所在的组织中，或者存在于对直接将能量施加于关注区域所产生的神经信号做出响应的其他组织中。在一个实施方式中，该治疗用于治疗患有代谢紊乱症或临床病症的受试者。在一个实施方式中，患有代谢紊乱症的患者通过向患者的内部组织施加超声能量进行治疗，其中超声能量通过体外能量施加装置进行施加，并且其中施加超声能量会引起患者内葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰素通路分子的变化。在另一个实施方式中，一种用于治疗代谢紊乱症的系统可以包括构造成向受试者的内部组织施加能量的能量施加装置和适于控制该能量施加装置进行能量施加而引起受试者中葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰素途径分子变化的控制器。在一个实施方式中，该治疗通过直接测量这些变化或测量这些变化的特征或指标而进行评价。

实验结果表明，以与自主神经系统的代谢组件的激活相称的水平对代谢组织进行日常刺激有助于改变葡萄糖转运子途径和/或肠促胰岛素途径分子的浓度、位置和/或活性，从而以治疗方式改变葡萄糖的摄取与排泄水平。此外，这是以局部方式完成的，不会影响与副作用相关的其他途径。因此，所公开的神经调节技术相对于实现类似生理变化/治疗结果的药物治疗可以具有更少的副作用，并且可以作为对患有代谢紊乱症的受试者的现有药物治疗的替代或补充。

图1显示了对于相对于假对照组肝脏刺激组，通过酶联免疫测定(ELISA)在FattyZucker鼠糖尿病模型的肾脏、肠和肝脏组织中测量的蛋白质浓度。在刺激组中，动物每天接受肝脏超声刺激，其功率足以激活神经途径和感觉或分泌细胞，并提供葡萄糖转运和肠促胰素在下游靶标组织(包括肠和肾脏)中的活性、浓度或位置的测量变化。假对照是通过将超声换能器放置于靶器官上，但不施加超声刺激而进行。在几天时间内的每日治疗后，在动物处死后收集组织样品。肠道中的蛋白质水平(与其他组织和/或来自肠道的mRNA数据相比)来自从肠内壁刮取的样本(因此，仅收集上皮内层的顶端或腔侧)。

肝脏的神经调节会导致循环标志物和其他组织中的代谢途径和信号分子的变化。在超声刺激组中，测量到与吸收/分泌途径改变相关的循环血糖降低。与假对照相比，每日能量施加于肝脏还会导致肾脏和肠道中的GLUT2以及肠道中的GLP-1变化。

通过所测量的蛋白质的变化伴随着通过mRNA测序所测量的RNA表达的变化。图2显示了来自如图1中所述而进行处理的肝脏刺激和假对照Fatty Zucker动物的肝脏、肌肉、肠和肾脏组织中各种所关注分子的蛋白质、mRNA和分析测试数据。图3显示了来自如图1中所述而处理的受刺激的和假对照的Fatty Zucker动物的下丘脑组织中各种所关注分子的蛋白质、mRNA和分析测试数据。虽然SGLT2是葡萄糖再吸收的重要蛋白质，但肾脏中的GLUT2是葡萄糖去除或排泄到尿液中的主要方式。大鼠模型中的每日超声刺激会导致肠道中SGLT1和GLUT2 mRNA上调，但会导致肾脏中的SGLT2和GLUT2 mRNA下调。正如上所述，葡萄糖转运子的表达和/或易位导致葡萄糖再吸收相对于排泄的改变。刺激和由此产生的效应还会调节代谢系统内GLP/肠促胰素的浓度。大鼠模型中的每日超声刺激会导致肝脏中的两种GLUT2 mRNA上调。

图4显示了通过ELISA从由肝脏刺激的和假对照的Fatty Zucker动物收集的肠或肾组织中测量的蛋白质浓度水平，这表明肠和肾中的GLUT2增加和肠中的GLP1增加。

图5显示了从肝脏刺激的和假对照的Fatty Zucker动物收集的各种组织中的mRNA浓度水平，这表明由细胞膜蛋白介导的并发和相互关联的变化。例如，肝脏中的葡萄糖调节由GLUT2介导，它会随着大鼠模型中每日肝脏超声刺激而增加。葡萄糖的骨骼肌转运由GLUT4介导。在肾脏中，一系列并发变化与大鼠模型中每日肝脏超声刺激相关。蛋白激酶C(PKC)、SGLT2、GLUT2和Irs2的下调可能与尿液中葡萄糖的排泄和循环中再吸收的阻止有关。

图6显示了在LPS-诱导的高血糖模型动物中由于肝脏、胰腺或胃肠组织刺激相对于对照所致的5'AMP-活化蛋白激酶浓度水平和由于肝脏刺激相对于对照的谷氨酸盐水平。5'AMP是一种直接向下丘脑发出胰岛素信号和胰岛素依赖途径激活的已知度量指标。

本文还提供了通过将超声刺激施加于体外三维(3D)神经培养物而验证直接外周聚焦超声(pFUS)神经激活的实验结果。与传统的切除神经束制剂相比，所公开的新型3D培养系统(图7A)提供了用于外周神经研究的体外实验平台。在培养平台内观察到复杂神经网络的形成，并使用体外系统将超声换能器和观察荧光显微镜与神经元耦合。钙指示剂染料的使用允许直接观察神经元活动。与经验证的体内神经调节相关的超声压力会导致培养系统中的直接神经激活。所述结果表明，超声刺激能够激活外周神经元。

图7A是3D体外外周神经元培养系统的示意图。分离的外周神经元(即，背根神经节细胞，DRGs)用水凝胶微粒化并共同注射到培养板中。注射后，微粒水凝胶进行退火，留下一个充满神经细胞的异质支架，为神经细胞粘附提供机械坚硬的生长表面，并为神经突长出提供互连微孔。在37℃和5％CO₂浓度的培养箱中，将DRG神经元培养于200μL NbActiv4和25ng/mL NGF中，并且每3天更换50％的培养基。DRG神经元与Fluo-4直接钙测定试剂盒一起培养，该试剂盒中包含250×10^-3M用于Ca成像的丙磺舒(probenecid)原液。简而言之，将5mL钙分析测试缓冲液与100μL丙磺舒原液混合并涡旋而产生2×负载染料溶液。然后将该染料溶液以1:1的比例与培养基一起加入到细胞中，并在成像前培养1小时以使之充分扩散通过水凝胶。

图7B显示了与3D水凝胶支架中DRG神经元细胞的相应右视野和荧光图像一起显示的实验时间线。水凝胶的直径为100μm左右，而水凝胶颗粒的孔径为1μm左右。DRG神经元细胞在水凝胶颗粒的孔道之发生三维生长。荧光图像显示了pFUS刺激期间的钙成像的逝时。pFUS刺激在从观察起点开始10秒时开启，并在开始后120秒时再次关闭。然后在重新开始刺激之前关闭超声2分钟(允许拍摄超声后或关闭的图像)。超声激发后DRG神经元细胞的钙浓度增加，正如成像神经元内荧光增加所示。pFUS模拟后，细胞的钙浓度恢复到与刺激前相同的水平。

图7C显示了成像神经元在每个时间点的平均△F/F0值和最大△F/F0值。AF/F0在没有pFUS刺激的情况下保持不变(左侧)。另一方面，在pFUS刺激期间△F/F0增加(右侧)。图7D显示了重复实验中使用的不同pFUS幅度之间的关系，而200mVpp(或0.83MPa峰值正压)显示出相同DRG培养物中荧光的更大变化(每组N>5)。这对应于已验证的神经调节的有效超声压力。

DRGs对3D培养环境反应良好，粘附于水凝胶微粒表面并将神经突投射到微孔中。除了轴突投射之外，体细胞和突触神经特征在培养物中都很明显(图7B)。轴突生长导致跨微粒之间形成的微孔间隙的神经元网络形成。通过在载有Ca²⁺指示剂(Fluo-4直接钙分析测试试剂盒)的培养基中对外周神经元网络成像，而对培养物中关注区域内的钙瞬变进行成像(图7B)。为了测量超声引起的钙信号变化(即，超声引起的神经活动增加)，超声换能器(和焦点)与光学视野(FOV)的中心对准。图7B证明了在脉冲超声刺激(使用1.1MHz、136.36μs脉冲长度、0.5ms脉冲重复周期的US脉冲)后，整个FOV的荧光强度(和由此的神经元内的平均钙浓度)增加。这些钙瞬变的出现和幅度是超声压力依赖性的，并且所施加的实现最大神经激活(图7D；0.83MPa或23mW/cm²匹配)的压力对应于动物模型中神经调节的有效超声压力。

此外，本文提供了对已知包含外周神经体和突触的替代位点的pFUS刺激，包括感觉神经节(即，迷走神经的下神经节或无剂量神经节)和混合(感觉和传出)神经支配的外周神经节(即，骶神经节)。在每个部位(即，终末器官/脾脏、无剂量和骶神经节)超声刺激后观察到胆碱能抗炎途径的激活(即，LPS诱导的循环细胞因子浓度的调节)，并且表明细胞因子减少的幅度和其他脱靶效应(即，血糖水平的同时变化)的存在是刺激部位依赖性的。最后，通过刺激与代谢控制相关的多个策略性解剖位置，实现了对特定病理状态的干预(即，减少LPS诱导的高血糖)。这些探索性刺激部位包括含有外周葡萄糖传感器的肝脏部位、与分泌胰岛素的β细胞相关的胰腺和含有分泌肠促胰素的肠内分泌细胞的肠道部位。超声诱导的高血糖衰减通过对每个解剖靶标进行刺激而实现。然而，血糖降低的幅度是刺激部位依赖性的，并且每个部位的影响可能由不同的分子机制驱动。这些数据一起证实了超声刺激能够直接激活外周神经(和其他神经内分泌细胞)，并且pFUS能够有效评价替代治疗性生物电子医学刺激部位的有效性。

图8A-C显示了pFUS在脑-脾神经途径内的多个位置激活胆碱能抗炎途径(CAP)的结果。图8A显示了激活的示意图，其中pFUS刺激集中于包含沿着迷走神经和副交感神经系统的体和/或突触连接的多个位置。这些包括无剂量神经节(即，投射到大脑的大多数迷走传入神经的躯体的位置)、骶神经节(即，混合交感神经和副交感神经躯体和突触连接的位置)和脾脏(即，CAP特异性神经元)。

图8B描绘了本文进行的体内神经调节研究的时间线，其中首先引入LPS(如本文一般公开)以产生炎症和高血糖状态。然后施加超声，并通过比较LPS对照(即，无超声刺激)与LPS+超声刺激组中的炎症或代谢标志物而测量超声神经调节的效果。

图8C表明，脾神经调节和CAP激活足以减弱LPS响应。此外，脾部位CAP的局部激活限制了使用植入物-基的VNS CAP激活通常观察到的其他(非CAP或非靶标)效应，如LPS诱导高血糖的抑制。无剂量和骶神经节的pFUS刺激也都导致了LPS反应减弱。此外，与骶骨或脾脏部位的刺激相比，无剂量超声神经调节在更大程度上减弱了LPS的影响。这证实了迷走神经传入在触发CAP激活中的重要性(即，神经元通过无剂量神经节进入中枢神经系统(CNS))，但也扩展了该途径的传出弧以包括额外的迷走神经和交感神经元。

然而，尽管细胞因子抑制水平增加，但无剂量神经节的刺激也导致LPS诱导的高血糖症的抑制(图8D)。脾脏部位的靶向或精确超声神经调节(据报道不含迷走神经传入神经元)导致CAP与其他非靶标途径(例如，肝脏中的葡萄糖感应细胞)的可分离激活。在本文中，在骶骨刺激部位，炎症与代谢途径的可分离调节也是可能的；然而，在无剂量神经节处刺激迷走神经传入，会导致多个通路的激活(类似于传统颈椎VNS)。

此外，对不同部位刺激后的循环神经递质变化的分析也与更新的CAP途径的系统观点一致。图8D显示了与LPS对照(LPS CTRL)相比，在三个不同解剖靶位点pFUS后神经递质(即，肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺和乙酰胆碱)的循环/血液浓度的测量值。星号表示使用两侧t-检验相对于仅LPS对照(p值阈值<0.05)的统计显著性；双十字表示对LPS对照和替代刺激部位数据的显著性。对于每个实验条件，N＝5。在靶向刺激脾脏部位后，血液神经递质分布以乙酰胆碱(Ach)为主，这与大量常驻胆碱乙酰转移酶(ChaT)阳性T细胞的激活一致。这伴随着脾脏部位激活ChaT T细胞的儿茶酚胺的适度增加(与无剂量刺激相比)。相比之下，无剂量刺激会导致Ach的更温和增加，但循环儿茶酚胺的增加更大(与多个传出CAP臂的系统范围激活一致，即脾和肠CAP途径)。最后，骶神经节刺激导致Ach和儿茶酚胺的适度增加(分别与脾脏或无剂量刺激部位相比)；然而，该部位的刺激导致循环多巴胺的最大增加，间接表明激活了已映射到肾上腺额外的迷走神经介导抗炎途径。综上所述，这些结果表明，图像/解剖靶向pFUS能够激活映射反射内多个位置的神经元，并可以用于评价PNS内靶神经途径与非靶神经途径的激活水平。

图9A-C显示了跨代谢系统的器官-基的外周聚焦超声神经调节(pFUS)。图9A是pFUS-基的精确器官-基神经调节的示意图，其中已知轴突群的神经支配点被靶向用于聚焦脉冲超声刺激。本文研究的靶标包括肝脏、胰尾和小肠空肠(jejunum)区域内的神经支配点和感觉终端(方法小节内描述了用于定位和靶向这些部位的方法)。图9B是在LPS-诱导的高血糖模型内进行的pFUS刺激和血液采样的时间线。图9C显示了在0、5、15、30和60分钟时间点的LPS对照(无pFUS；黄色圆圈)、肝脏pFUS(蓝色圆圈)、胰腺pFUS(紫色圆圈)和GI pFUS(橙色圆圈)组的循环血糖浓度。对于每个组，n＝6。

图10A-B显示了替代pFUS刺激位点对代谢标志物的影响的比较。图10A显示了使用pFUS刺激的动物的下丘脑标记。与胰岛素信号传导和葡萄糖利用相关的Elisa光强度或分子浓度，包括胰岛素受体底物1(IRS1)、磷酸化蛋白激酶B(phos-Akt)、4型葡萄糖转运子(GLUT4)和6-磷酸葡萄糖(G-6-磷)。所显示的是LPS对照(无pFUS；LPS CTRL)、肝脏pFUS(肝脏)、胰腺pFUS(胰腺)和胃肠道pFUS(GI)的数据。图8B显示了使用pFUS刺激的动物的循环标志物。收集的血液样本中的Elisa-基的循环激素和标志物浓度，包括胰岛素、胰高血糖素、瘦素蛋白和GLP1浓度。星号表示使用两侧t-检验与仅LPS对照(p值阈值<0.05)的统计显著性。对于每个实验条件，n-6。

与肝脏刺激结果相比，胃肠(GI)pFUS对下丘脑和循环代谢标志物具有显著不同的影响(图10A和10B)。与肝脏刺激一样，GI刺激对循环胰岛素、胰高血糖素或瘦素蛋白没有影响。然而，GI刺激对下丘脑内的IRS活性或GLUT4和6-磷酸葡萄糖水平也没有影响。因此，与胰腺或肝脏刺激不同，GI结果表明非胰岛素信号传导途径可能负责于对LPS-诱导的高血糖的GI刺激作用。尽管如此，在GI刺激的下丘脑样本中pAkt活性增加间接表明下丘脑可能直接或间接参与了这条其他途径。在本技术的某些实施方式中，GI的超声刺激可以导致小肠内肠促胰高血糖素样肽1(GLP-1)分泌的调节。

图11A显示了在每个靶刺激位点和LPS/无pFUS对照(LPS CTRL)的pFUS后的肾上腺素的循环浓度。图11B显示了每个靶刺激位点和LPS/无pFUS对照(LPS CTRL)在pFUS后的去甲肾上腺素循环浓度。图11C显示了每个目标刺激位点和LPS/无pFUS对照(LPS CTRL)在pFUS后的多巴胺循环浓度。星号表示使用两侧t-检验与仅LPS对照(p值阈值<0.05)的统计显著性。对于每个实验条件，N＝6。正如本文所提供，肝脏pFUS导致循环去甲肾上腺素增加，而胰腺刺激导致神经递质浓度没有明显变化并且肠刺激导致神经递质分布中的多巴胺特异性变化(图11A-C)。交感神经与葡萄糖和脂肪酸感应传入纤维一起共同位于肝门(portahepatis)处；这些神经可以为肝血管收缩和血压调节提供机制。多巴胺神经元存在于肠道中(但在肝脏或胰腺中的程度较小)。这些神经与产生GLP的神经内分泌细胞实现共定位，并充当代谢控制和体内平衡的额外调节组分。本文的数据表明，pFUS能够用于快速筛选(神经和神经内分泌来源)的潜在治疗刺激部位，并且特异性解剖靶标的局部精确刺激会提供一种调节和进一步了解生理系统的新技术。

正如本文所公开的用于体内和体外刺激的pFUS实验如下进行。用于pFUS刺激的系统由一个1.1MHz单晶换能器(Sonic Concepts HI 06)、一个匹配网络(Sonic Concepts)、一个射频功率放大器(ENI 350L)和一个函数发生器(Agilent 333120A)组成。70mm直径的换能器具有一个球面，曲率半径为65mm。换能器的中心具有一个直径20mm的洞，在换能器对准和解剖靶向期间，成像换能器就插入该洞中。数值模拟的压力分布的半高全宽(FWHM)振幅为横向1.8mm，深度方向12mm。使用充满脱气水的6cm锥体完成与动物的声学耦合。函数发生器用于产生脉冲正弦波形，由射频放大器放大并发送到阻抗匹配网络。本手稿中的实验使用了0.5ms脉冲重复周期(对应于2000Hz脉冲重复频率)、23W/cm²脉冲振幅(突发平均)和136微秒突发持续时间(对应于0.27的工作循环)。先前使用针式水听器(ONDA HNA-0400)实施并报告了传感器的电压-压力校准。

对于本文所提供的体内实验，在pFUS神经调节之前，使用了强烈E9或11L超声系统和探头(GE Healthcare)对解剖靶标进行成像。然后根据该初始图像将pFUS换能器放置于靶标区域上。还使用了更小成像探头(3S；GE Healthcare)进行了第二次超声扫描，该探头放置于pFUS换能器和耦合锥的开口中。该3S探头的成像光束与pFUS换能器对齐，并能够验证所关注的器官和解剖靶标。根据需要使用超声支架调整pFUS换能器焦点的深度。解剖标志物用于定位超声刺激并将其对准每个靶标刺激部位：用于定位无剂量神经节的解剖标志物包括颈内动脉(迷走神经沿着它向颅骨延伸)和已知神经节以颅底迷走神经的肿胀形式存在之处的后裂孔(posterior lacerated foramen)。对于骶神经节，定位了四块骶椎，而超声换能器则对准骶椎孔方向。用于肝脏刺激实验的解剖标志物是肝门(或门静脉进入肝脏的入口点)。对于胰腺，脾静脉(通过脾的左侧成像以避免非特异性肝脏刺激)用作胰尾的解剖标志物。胰尾入选是因为已知它含有密集的胰岛细胞群并且远离十二指肠。腹腔左上象限的成像用于识别小肠的空肠区域，在多普勒(Doppler)超声诊断成像下，该区域呈现为具有大量褶皱的高度血管化的折叠结构。图8A和图9A提供了神经节和末端器官解剖超声靶标的位置的示意图和描述。

将8-12周龄的成年雄性Sprague-Dawly大鼠(250-300g；Charles RiverLaboratories)圈养于12小时光/暗循环中并在进行实验前适应一周。养舍保持于25℃，水和常规啮齿动物饲料可以随意获取。来自大肠杆菌(0111：B4；Sigma Aldrich)的脂多糖(LPS)用于产生代谢功能障碍(即，高血糖症)。通过腹膜内注射给药10mg/kg LPS，并在给药LPS后的0、5、15、30和60分钟时间点从尾静脉收集血液。选定的时间点对应于LPS诱导细胞因子风暴和胰岛素抵抗(insulin resistance)模型中的高胰岛素血症/高血糖症的发生和进展。通过OneTouch Elite血糖仪(LifeScan；Johnson and Johnson)测量血糖浓度。在60分钟时间点后，还在终止时收集脑组织(下丘脑)样品，并在含有磷酸酶(0.2mM苯甲基磺酰氟、5μg/mL抑肽酶、1mM苯甲脒、1mM原钒酸钠和2μM斑蝥素(cantharidin))和蛋白酶抑制剂(根据Roche诊断说明书，1μL-20mg组织)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的溶液均质化。在60分钟时还获得了额外的组织样本(例如，神经节、脾脏、肝脏和肠组织)，并在液氮中快速冷冻以供后续分析。在整个研究过程中收集的血样与(乙二腈基)四乙酸(EDTA)抗凝剂一起储藏。所有样品在分析前都储存于-80℃。根据制造商的说明书，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对组织和终末血样分析TNF(肿瘤坏死因子；Invitrogen)、代谢激素或信令分子：包括胰岛素(Crystal Chem)、胰高血糖素(Aviva Systems Biology)、瘦素蛋白(Aviva SystemsBiology)、IRS1(胰岛素受体底物1；Santa Cruz)、phos-Akt(磷酸化蛋白激酶B；MyBioSource)、GLUT4(4型葡萄糖转运子；Lifespan Biosciences)和6-磷酸葡萄糖(G-6-phos；Lifespan Biosciences)。儿茶酚胺浓度使用HPLC方案从组织样品中进行测量；简而言之，血清样品直接注射到机器中，无需预处理。组织匀浆最初用0.1-M高氯酸进行匀浆并离心15分钟，然后分离出上清液，并将样品注入HPLC中。儿茶酚胺、去甲肾上腺素和肾上腺素通过带有在线紫外检测器的HPLC进行分析。该分析中使用的测试柱是SupelcoDiscovery C18(15cm×4.6mm内径，5μm粒径)。双相流动相由[A]乙腈:[B]50＝mM KH₂PO₄构成，(使用磷酸)固定于pH 3。然后将溶液用100-mg/L EDTA和200-mg/L 1-辛烷-磺酸进行缓冲。流动相混合物的最终浓度设置为5:95，A:B。使用1mL/min流速提高整体峰分辨率，而同时将色谱柱保持于一致的20℃，以最小化由于所用流动相粘度导致的色谱柱压力压缩。UV检测器保持于254nm波长，已知该波长能够捕获儿茶酚胺(包括去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺)的吸收。

为了进行刺激，用2％-4％异氟醚麻醉动物并放置于水循环加热垫上以防止手术过程中体温过高。在神经调节之前，所关注的解剖区域上方的区域用一次性剃须刀和动物毛发剪剃除。靶向(如上所述)后，施加超声刺激持续1分钟。然后在第一次超声刺激后立即给药LPS(如上所述)。然后在LPS给药后施加第二个1-分钟超声刺激，总持续时间为2分钟。然后让动物在麻醉下温育，并如上所述采集血样。温育后，对动物实施安乐死，并如上所述采集组织和血液样品。

所公开的神经调节技术可以导致不同组织(例如，肠、胃肠道和肾)中葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子产生不同变化。在一个实施方式中，肾脏中的SGLT2减少与肠中的GLP1、SGLT1、GLUT2和GLUT5增加同时发生。由于复杂的整体变化，患者血糖指数可能会降低，因为肾脏中的神经调节变化会阻止葡萄糖再吸收回血液，而肠道中的神经调节变化会增加胃排空。这些变化可能由下丘脑通过神经调节后的肝脏信号传导进行介导。

在某些实施方式中，本文提供的神经调节可以用作对患有代谢紊乱症的受试者的治疗。本文还提供了可以应用于治疗葡萄糖代谢和相关病症并且可以改变疾病进展的技术。在一个实施方式中，一个或多个关注区域的肝脏调节可以用于治疗糖尿病(即，1型或2型糖尿病)、高血糖症、败血症、外伤、感染、糖尿病相关痴呆、肥胖症或其他饮食或代谢障碍症。在一个实施方式中，被诊断患有疾病的患者可以进行神经调节治疗。治疗后，患者可以达到与健康患者相关的临床基准。例如，糖尿病患者的血糖和/或胰岛素水平可以超出正常范围。治疗后，患者的血糖和/或胰岛素水平可以处于正常范围内。异常胰岛素和葡萄糖利用的典型测量包括空腹血糖检查、口服葡萄糖耐量测定、连续葡萄糖监测、HOMA评分或指数、葡萄糖和胰岛素钳夹以及其他相关技术。

正如本文所提供，如本文所提供的神经调节治疗可以涉及作为治疗方案的部分向关注区域施加能量。治疗方案可以包括在预定治疗时间内施用的一剂或多剂。例如，神经调节可以在所关注的区域(例如，肝门)每天一次，由此每天一次的治疗可以根据预设的调节参数进行连续两天或更长时间。

在某些实施方式中，能量施加于使用电刺激技术难以触及的内部组织或器官的靶标组织。所设想的组织靶标包括胃肠(GI)组织(胃、肠)、肌肉组织(心脏、平滑和骨骼)、上皮组织(表皮、器官/胃肠道内衬)、结缔组织、腺体组织(外分泌/内分泌)等。在一个实例中，在神经肌肉连接处集中施加能量会促进神经肌肉连接处的神经递质释放，而无上游动作电位。在其他实例中，在末端轴突终端集中施加能量会提供触发感觉神经元内的动作电位的累积活性。此外，在其他实例中，在有或无神经近邻细胞的分泌细胞上集中施加能量会导致这些细胞的激活和分泌。所设想的调节靶标可以包括负责控制胰岛素释放的胰腺部分、负责葡萄糖调节的肝脏部分或负责葡萄糖再吸收或排泄的肾脏部分。

对所关注的靶标区域的神经调节可以在生理过程中施加变化以中断、减少或增强受试者中的一种或多种生理途径以产生所期望的生理结果。此外，由于局部能量施加可能导致全身变化，不同生理途径可以以不同的方式在身体的不同位置发生变化，从而导致由具体受试者的靶向神经调节引起并以此为特征的受试者生理变化的整体特征分布。虽然这些变化很复杂，但本神经调节技术会提供一种或多种可测量的靶向生理结果，其对于受治疗的受试者而言，这些结果是神经调节的结果，并且如果不对所关注的靶标区域施加能量或其他干预，则可能无法实现。此外，虽然其他类型的干预(例如，药物治疗)可能会产生由神经调节引起的生理变化的子集，但在某些实施方式中，由于神经调节引起的生理变化的分布可能是在所关注的靶标区域的神经调节(和其相关的调节参数)所独有的，并且可能因患者而异。

本文讨论的神经调节技术可以用于引起所关注分子浓度的变化(例如增加、减少)和/或所关注分子特征变化的生理结果，如葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子。正如本文所提供，葡萄糖转运子途径分子是一组促进葡萄糖跨质膜转运的膜蛋白。葡萄糖转运子途径分子可以包括一种或多种GLUT或SLC2A家族蛋白，如GLUT-1、GLUT-2、GLUT-3、GLUT-4、GLUT-5、GLUT-6、GLUT-7、GLUT-8、GLUT-9、GLUT-10、GLUT-11、GLUT-12或GLUT-13。正如本文所提供，肠降血糖素途径分子基于它们增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌的能力，可以包括一种或多种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)，称为肠促胰岛素。肠促胰素由小肠中的内分泌细胞分泌。其他方法包括刺激组织和靶向肠促胰岛素及其分泌蛋白上游分子的变化，包括与其产生或释放相关的酶，这包括DPP-4。

通过所关注的分子，即，一种或多种葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子的神经调节引起变化，可以是指由于对一个或多个组织(例如，第一组织、第二组织)中的一个或多个关注区域(例如，第一关注区域、第二关注区域等)施加能量而调节或影响分子的浓度(循环、组织)或特性(共价修饰)。葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子的调节可以包括分子特征的变化，如表达、分泌、蛋白易位和基于源自能量施加本身或由于直接影响离子通道的分子的直接活性变化。所关注分子的调节也可以是指维持所需的分子浓度，而使预期的浓度变化或波动不会由于神经调节而发生。所关注分子的调节可以是指引起分子特征的变化，如酶介导的共价修饰(磷酸化、乙酰化、核糖基化等的变化)。即，应当理解的是，所关注分子的选择性调节可以是指分子浓度和/或分子特性。所关注的分子可以是生物分子，如碳水化合物(单糖、多糖)、脂质、核酸(DNA、RNA)或蛋白中的一种或多种。在某些实施方式中，所关注的分子可以是信令分子，如激素(胺激素、肽激素或类固醇激素)。

所公开的神经调节和细胞调节技术可以与神经调节系统结合使用。图9是用于响应于能量的施加而实现神经递质释放和/或激活突触的组件(例如，突触前细胞、突触后细胞)的神经调节系统10的示意图。所描绘的系统包括耦合至能量施加装置12(例如，超声换能器)的脉冲发生器14。能量施加装置12构造成，例如，通过导线或无线连接接收能量脉冲，在使用中会被引导到受试者的内部组织或器官的关注区域，这由此导致葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子内产生变化。在某些实施方式中，脉冲发生器14和/或能量施加装置12可以植入生物相容部位(例如，腹部)，并且导线或多个导线内部耦合能量施加装置12和脉冲发生器14。例如，能量施加装置12可以是MEMS换能器，如电容微机械超声换能器。

在某些实施方式中，能量施加装置12和/或脉冲发生器14可以，例如，与控制器16无线通信，控制器16可以由此向脉冲发生器14提供指令。在其他实施方式中，脉冲发生器14可以是体外装置，例如，可以运行而从受试者体外的位置透皮或以无创方式施加能量，并且在某些实施方式中，可以集成于控制器16内。在脉冲发生器14处于体外的实施方式中，能量施加装置12可以由护理人员操作并定位于受试者皮肤上或上方的点处，而使能量脉冲经皮递送至所需的内部组织。一旦定位而向所需部位施加能量脉冲，则系统10就可以启动神经调节以实现临床效果，如代谢紊乱症的治疗。

在某些实施方式中，系统10可以包括评价装置20，其耦合于控制器16并评价指示葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子的变化是否由于神经调节已经实现。在一个实施方式中，该特征可以是局部的。例如，该调节可能导致局部组织或功能变化，如组织结构变化、某些分子浓度的局部变化、组织位移、流体运动增加等。

该调节可能导致全身或非局部变化，并且所靶向的生理结果可能与循环分子浓度的变化或不包括能量直接施加的关注区域的组织特征的变化有关。在一个实例中，该位移可以是所需调节的代理测量，并且低于预期位移值的位移测量可能导致调节参数进行修改，直到产生预期位移值。因此，在一些实施方式中，评价装置20可以构造成评价浓度变化。在一些实施方式中，评价装置20可以是构造成评价器官大小和/或位置变化的成像装置。虽然系统10的所描绘的元件是单独显示的，但应当理解的是，一些或所有元件可以彼此组合。此外，一些或所有元件可以以有线或无线方式彼此通信。

基于评价结果，可以改变控制器16的调节参数。例如，如果所期望的调节与在定义的时间窗口内(例如，能量施加程序开始后5分钟、30分钟)或在程序开始时或开始之前相对于基线测量的浓度变化(一种或多种分子的循环浓度或组织浓度)相关联，则可能需要改变调节参数如脉冲频率或其他参数，这由此可以由操作员或通过自动反馈循环提供给控制器16，用于定义或调节脉冲发生器14的能量施加参数或调节参数。

正如本文所提供的系统10可以根据各种调节参数提供能量脉冲。例如，调节参数可以包括从连续到间歇的范围内的各种刺激时间模式。对于间歇性刺激，能量在信号开启期间以特定频率传送一段时间。信号开启时间之后是一段没有能量传输的时间，称为信号关闭时间。调节参数还可以包括刺激施加的频率和持续时间。施加频率可以是连续的或以不同时间段，例如，在一天或一周内进行递送。治疗持续时间可以持续不同的时间，包括但不限于，从几分钟到几小时不等。在某些实施方式中，具有指定刺激模式的治疗持续时间可以持续一小时，以例如72小时的间隔重复。在某些实施方式中，治疗可以以更高的频率，比如每三小时，递送更短的持续时间，例如，30分钟。根据调节参数，如治疗持续时间和频率，可以可调节地控制能量施加而实现所需的结果。

图10是系统10的某些组件的框图。如本文所提供，用于神经调节的系统10可以包括脉冲发生器14，其适于产生多个能量脉冲而施加于受试者的组织。脉冲发生器14可以是单独的或可以集成到外部装置，如控制器16中。控制器16包括用于控制装置的处理器30。软件代码或指令存储于控制器16的存储器32中以供处理器30执行而控制该装置的各组件。控制器16和/或脉冲发生器14可以通过一根或多根导线33或无线连接至能量施加装置12。

控制器16还包括具有输入/输出电路34和显示器36的用户界面，该显示器36适配于允许临床医生向调节程序提供选择输入或调节参数。每个调节程序可以包括一组或多组调节参数，包括脉冲幅度、脉冲宽度、脉冲频率等。脉冲发生器14响应于来自控制器装置16的控制信号而修改其内部参数以改变向能量施加装置12所施加的受试者通过导线33传输的能量脉冲的刺激特性。任何合适类型的脉冲生成电路都可以采用，包括但不限于，恒流、恒压、多重独立的电流或电压源等。所施加的能量是电流幅度和脉冲宽度持续时间的函数。控制器16允许通过在特定时间改变调节参数和/或启动能量施加或在特定时间取消/抑制能量施加进行能量的可调节控制。在一个实施方式中，能量施加装置的可调节控制基于关于受试者中一种或多种分子(例如，循环分子)的浓度的信息。如果信息来自评价装置20，则反馈回路可以驱动可调控制。例如，如果由评价装置20测量的血液或尿液中的循环葡萄糖浓度高于预定阈值或范围，则控制器16可以启动对关注区域(例如，肝脏)的能量施加并且采用与循环葡萄糖减少有关的调节参数。能量施加的启动可以由葡萄糖浓度漂移超过预定(例如，所需的)阈值或超出预定范围而触发。在另一个实施方式中，当初始施加能量在预定时间框架(例如，1小时、2小时、4小时、1天)内没有导致靶标生理结果(例如，所关注分子的浓度)的预期变化时，可调节性控制可以是以改变调节参数的形式。

在一个实施方式中，存储器32存储可以由操作者选择的不同操作模式。例如，存储的操作模式可以包括用于执行与具体治疗部位，如肝脏、胰腺、胃肠道、脾脏中的关注区域相关联的一组调节参数的指令。不同的位点可能具有不同的相关调节参数。代替让操作者手动输入模式的是，控制器16可以构造成基于选择而执行合适的指令。在另一个实施方式中，存储器32存储用于不同类型的治疗的操作模式。例如，相对于与抑制或阻断组织功能相关的刺激压力或频率范围，激活可能与不同的刺激压力或频率范围相关。在一个具体的实例中，当能量施加装置是超声换能器时，时间平均的功率(时间平均强度)和峰值正压处于1mW/cm²-30,000mW/cm²(时间平均强度)和0.1MPa-7MPa(峰值压力)的范围内。在一个实例中，关注区域中的时间平均的强度小于35W/cm²，以避免与热损伤和烧蚀/空化相关的水平。在另一个具体实例中，当能量施加装置是机械致动器时，振幅处于0.1-10mm的范围内。所选频率可以取决于能量施加模式，例如，超声或机械致动器。

在另一个实施方式中，存储器32存储允许调节或修改调节参数以实现所需结果的校准或设置模式。在一个实例中，刺激以较低的能量参数开始并且自动地或在接收到操作者输入时逐渐增加。按照这种方式，操作者可以实现由于调节参数改变而对所诱导的效应的调谐。

该系统还可以包括有助于聚焦能量施加装置12的成像装置。在一个实施方式中，该成像装置可以与能量施加装置12集成至一起或与能量施加装置12相同，而使不同的超声参数(频率、孔径或能量)用于选择(例如，在空间上选择)关注区域并将能量聚焦于用于靶向和随后神经调节的所选择的关注区域。在另一实施方式中，存储器32存储用于空间选择器官或组织结构内的关注区域的一种或多种靶向或聚焦模式。空间选择可以包括选择器官的子区域以识别对应于关注区域的器官体积。空间选择可以依赖于本文提供的图像数据。基于空间选择，能量施加装置12可以聚焦于与关注区域对应的选定体积。例如，能量施加装置12可以构造成首先在靶向模式下运行而施加用于捕捉识别关注区域的图像数据的靶向模式能量。靶向模式能量不处于适合优先激活的水平和/或采用适合优先激活的调节参数进行施加。然而，一旦关注区域确定，则控制器16随后可以根据与优先激活相关联的调节参数而以治疗模式运行。

控制器16还可以构造成接收与靶标生理结果相关的输入作为对调节参数的选择的输入。例如，当成像模态用于评价组织特性时，控制器16可以构造成接收所计算的特性指数或参数。基于指数或参数是高于还是低于预定义的阈值，就可以修改调节参数。在一个实施方式中，该参数能够是受影响组织的组织位移的量度或受影响组织的深度的量度。其他参数可以包括评价一种或多种所关注分子的浓度(例如，评价浓度相对于阈值或基线/对照的一种或多种变化、变化率、确定浓度是否处于所需范围内)。此外，能量施加装置12(例如，超声换能器)可以在控制器16的控制下运行以：a)获取可以用于空间选择靶标组织内的关注区域的组织的图像数据；b)将调节能量施加于所关注的区域；和c)采集图像而(例如，通过位移测量)确定与葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子的变化相关的靶向生理结果已经发生。在这样的实施方式中，成像装置、评价装置20和能量施加装置12可以是相同的装置。

在另一实施方式中，所需的调节参数集也可以由控制器16存储。按照这种方式，可以确定受试者特异性的参数。此外，可以随时间评价这些参数的有效性。如果一组特定的参数随着时间的推移变得不太有效，则受试者坑发育出对所激活的途径不敏感。如果系统10包括评价装置20，则评价装置20可以向控制器16提供反馈。在某些实施方式中，可以从用户或评价装置20接收指示靶标生理结果的特性的反馈。控制器16可以构造成使能量施加装置根据调节参数进行施加能量并且基于反馈而动态改变调节参数。例如，基于反馈，处理器16可以响应于来自评价装置20的反馈实时地自动改变调节参数(例如，超声波束或机械振动的频率、幅度或脉冲宽度)。

在一个实例中，本技术可以用于治疗患有代谢紊乱症的受试者。本技术可以用于调节患有葡萄糖调节障碍症的受试者的血糖水平。因此，本技术可以用于促进所关注分子的稳态或促进一种或多种所关注分子(例如，葡萄糖、胰岛素、胰高血糖素或其组合)的所需循环浓度或浓度范围。在一个实施方式中，本技术可以用于控制循环(即，血液)葡萄糖水平。在一个实施方式中，以下阈值可以用于将血糖水平维持于正常范围内的动态平衡中：

禁食：

低于50mg/dL(2.8mmol/L)：胰岛素休克

50-70mg/dL(2.8-3.9mmol/L)：低血液糖/低血糖

70-110mg/dL(3.9-6.lmmol/L)：正常

110-125mg/dL(6.1-6.9mmol/L)：升高/受损(糖尿病前期)

125(7mmol/L)：糖尿病

非禁食(餐后约2小时)：

70-140mg/dL：正常

140-199mg/dL(8-11mmol/L)：升高或“临界”/糖尿病前期

超过200mg/dL：(11mmol/L)：糖尿病

例如，该技术可以用于将循环葡萄糖浓度维持于约200mg/dL以下和/或约70mg/dL以上。该技术可以用于将葡萄糖维持于约4-8mmol/L或约70-150mg/dL之间的范围内。该技术可以用于维持受试者(例如，患者)的正常血糖范围，其中正常血糖范围可以是基于患者个体因素如体重、体重指数、年龄、性别、遗传学、临床病史的个体化范围。因此，基于所关注分子的所需最终浓度，可以实时调节对一个或多个关注区域的能量(例如，超声能量)施加，并且可以基于来自评价装置20的输入而在反馈回路中进行调节。例如，如果评价装置20是葡萄糖监测器(例如，血糖、排泄葡萄糖)，则实时葡萄糖测量可以用作控制器16的输入。

在另一个实施方式中，本技术可以用于诱导生理变化的特性分布。例如，特性分布可以包括一组由于施加能量而在组织和/或血液中的浓度增加的所关注的分子和在组织和/或血液中浓度降低的另一组所关注的分子作为能量施加的结果。特性分布可以包括一组不因施加能量而改变的分子。特性分布可以定义与所需的生理结果相关联的并发变化。例如，该分布可以包括循环葡萄糖的减少以及尿液中排泄葡萄糖的增加。

所需的靶组织可以是内部组织或器官，其包括外周神经和非神经元细胞的轴突末端的突触。突触可以通过将能量直接施加于聚焦于靶标组织或器官的关注区域上的超声换能器的聚焦场内的轴突末端而进行刺激，以引起分子向突触空间中的释放。例如，神经递质的释放和/或离子通道活性的变化由此会引起下游效应，如葡萄糖代谢激活。关注区域可以进行选择而包括某种类型的轴突末端，如特定神经元类型的轴突末端和/或与某种类型的非神经元细胞形成突触的轴突末端。因此，关注区域经过选择热对应于具有所需的轴突末端(和相关联的非神经元细胞)的靶标组织的部分。能量施加可以进行选择而优先触发一种或多种分子如来自突触内的该神经的神经递质或通过直接能量转导(即，非神经元内的机械转导或电压激活蛋白)直接激活非神经元细胞本身，或在神经元和非神经元细胞中引起激活，从而引发所需的生理效应。关注区域可以作为神经进入器官的部位而入选。在一个实施方式中，肝脏刺激或调节可以是指在肝门处或邻近肝门处的关注区域的调节。

能量可以集中或基本集中于所关注的区域上并且仅集中于内部组织或内部器官的部分(即，子区域)上，例如，小于组织或器官总体积的约50％、25％、10％或5％。在一个实施方式中，可以将能量施加于靶标组织中的两个或多个关注区域，并且两个或多个关注区域的总体积可以小于组织总体积的约90％、50％、25％、10％或5％。在一个实施方式中，能量仅施加于组织总体积的约1％-50％，仅施加于组织总体积的约1％-25％，仅施加于组织总体积的约1％-10％，或仅施加于组织总体积的约1％-5％。在某些实施方式中，只有靶标组织的关注区域中的轴突末端46将会直接接收所施加的能量并释放神经递质，而同时关注区域外的未受刺激的轴突末端并未接收大量能量，而因此不会以同样的方式受到激活/刺激。在一些实施方式中，直接接收能量的组织部分中的轴突末端46将诱导所改变的神经递质释放。按照此方式，可以以颗粒方式靶向该组织子区域进行神经调节，例如，可以选择一个或多个子区域。在一些实施方式中，能量施加参数可以进行选择而诱导直接接收能量的组织内的神经或非神经元组件的优先激活，以诱导所需的组合生理效应。在某些实施方式中，能量可以集中或聚焦于小于约25mm³的体积内。在某些实施方式中，能量可以集中或聚焦于约0.5mm³-50mm³的体积内。用于在关注区域内聚焦或集中能量的聚焦体积和聚焦深度可以受到能量施加装置12的尺寸/构造结构的影响。能量施加的聚焦体积可以由能量施加装置12的焦点场界定。

正如本文所提供，能量可以基本上仅施加于所关注的一个或多个区域，以优先以靶向方式激活突触而实现靶向生理结果并且基本上不以一般或非特异性方式跨整个组织施加能量。因此，仅该组织中多种不同类型轴突末端的子集暴露于直接能量施加。组织或器官的成像数据可以用于确定靶标器官的关注区域，而使能量可以集中于关注区域而非周围组织上。例如，包含血管、神经或其他解剖标志物的器官内的关注区域可以进行空间选择，并用于确定具有特定轴突末端和突触的区域。所公开的使用成像信息对关注区域的选择可以与器官或组织结构(例如，肝脏、胰腺、胃肠组织)结合使用。

所公开的技术可以用于评价神经调节或细胞调节的效果，其由此可以用作用于选择或修改神经调节参数的输入或反馈。所公开的技术可以使用组织状况或功能的直接评价作为所靶向的生理结果。该评价可以在神经调节之前(即，基线评价)、期间和/或之后进行。

该评价技术可以包括功能磁共振成像、扩散张量磁共振成像(diffusion tensormagnetic resonance imaging)、正发射断层扫描或声学监测、热监测中的至少之一。该评价技术还可以包括蛋白质和/或标志物浓度评价。系统可以接收来自评价技术的图像而进行自动或手动评价。基于图像数据，还可以修改调节参数。例如，器官尺寸或位移的变化可以用作局部神经递质浓度的标志物，并用作局部细胞暴露于表型调节神经递质的替代标志物，并有效地作为对葡萄糖代谢途径的预测效应的标志物。局部浓度可以是指能量施加的焦点场内的浓度。

另外或可替代地，该系统可以评价一种或多种分子在组织中或在血液循环中的存在或浓度。组织中的浓度可以称为局部浓度或常驻浓度。组织可以通过细针抽吸采集，并且可以通过普通技术人员已知的任何合适技术，例如，酶联免疫测定法、mRNA测序法，评价所关注的分子(例如，代谢分子、代谢途径标志物、肽递质、儿茶酚胺)的存在或水平。

在其他实施方式中，靶标生理结果可以包括，但不限于，组织位移、组织尺寸变化、一种或多种分子的浓度(局部、非局部或循环浓度)变化、基因或标志物表达、传入活性和细胞迁移等的变化。例如，组织位移(例如，肝脏位移)可以作为对组织施加能量的结果而发生。通过评价组织位移(例如，通过成像)，可以估计其他影响。例如，某种位移可以是分子浓度特定变化的特征。在一个实例中，基于经验数据，5％肝脏位移可以指示或关联循环葡萄糖浓度的所需降低。在另一个实例中，通过将参考图像数据(在对组织施加能量之前的组织图像)与治疗后图像数据(在对组织施加能量之后拍摄的组织图像)进行比较，而确定位移参数以评价该组织位移。该参数可以是组织的最大或平均位移值。如果位移参数大于阈值位移，则能量的施加可以评价为可能已经引起了所需的靶向生理结果。

图11是用于治疗患者(即，治疗受试者)的方法50的流程图。在方法50中，受试者被确定52。该受试者可以是患有本文所提供的代谢紊乱症的患者，并且这种确定可以通过合适的诊断技术进行。一旦确定，该受试者会被通过向受试者的靶标组织施加能量而治疗受试者的代谢紊乱症54。在一个实施方式中，能量施加装置(超声能、机械能)进行定位而使能量脉冲聚焦于步骤54的内部组织(例如，肝脏、胃肠道、肾脏、胰腺)的所关注的所需区域，并且脉冲发生器将一个或多个能量脉冲施加于靶标组织的关注区域以优先激活靶组织中的突触子集，例如，刺激轴突末端以改变本文提供的葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子。在某些实施方式中，方法50可以包括评价能量施加的效果的步骤。例如，可以使用一种或多种直接或间接评价。基于所述评价，一个或多个能量脉冲的调节参数可以进行修改(例如，动态地或可调节地控制)以实现对受试者的治疗。

在一个实施方式中，在施加能量脉冲之前和之后可以进行评价，以评价作为调节结果的葡萄糖浓度的变化。如果葡萄糖浓度高于或低于阈值，则可以对调节参数进行适当修改。例如，如果葡萄糖浓度具有所需的生理结果，则在神经调节期间施加的能量可以逐步回到支持所需结果的最低水平。如果特性相对于阈值的变化与葡萄糖浓度的不充分变化相关，则某些调节参数，包括但不限于调制幅度或频率、脉冲形状、刺激模式和/或刺激位置，就可以进行改变。图12是方法60的流程图，其中一旦确定(框62)，则该受试者就可以通过将无创超声能量施加于肝脏中的关注区域(框64)而进行治疗。由于肝脏神经调节，无创超声能量的施加会改变体内一个或多个组织中的葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子。由此，这些变化可能导致指示治疗成功或达到靶标生理结果的循环葡萄糖的变化(例如，减少)和尿液中排泄葡萄糖的变化(例如，增加)。应当理解的是，神经调节可以引起与葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子的变化相关的许多生理学效应，并可以对这些变化中的一种或多种进行评价。

所评价的特性或条件可以是值或指数，例如，流速、浓度、细胞群或其任何组合，其由此可以通过合适的技术进行分析。例如，可以使用超过阈值的相对变化确定调节参数是否要进行修改。通过测量的临床结果可以评价所需的调节，如组织结构大小(例如，淋巴结大小)是否增加或一种或多种释放分子的浓度变化(例如，相对于神经调节前的基线浓度)。在一个实施方式中，所需的调节可以涉及超过阈值的浓度增加，例如，浓度相对于基线的约50％、100％、200％、400％、1000％增加。对于阻断治疗，该评价可以涉及跟踪分子浓度随时间的降低，例如，所关注的分子至少降低10％、20％、30％、50％或75％。此外，对于某些受试者，所需的阻断治疗可能涉及在可能趋于增加分子浓度的其他临床事件的背景下保持特定分子的相对稳定浓度。即，所需的阻断可以阻断潜在的增加。在治疗开始后的某个时间窗内，例如，在约5分钟内、约30分钟内，可以测量这种增加或减少或其他诱导和可测量的效果。在某些实施方式中，如果确定需要进行神经调节，则神经调节的变化是停止施加能量脉冲的指令。在另一个实施方式中，如果不需要神经调节，则改变神经调节的一个或多个参数。例如，调节参数的变化可以是脉冲重复频率的增加，如1-10000Hz频率的逐步增加和所需特性的评价，直到实现所需的神经调节。在另一实施方式中，可以改变脉冲宽度。在其他实施方式中，两个或多个参数可以进行一起、并联或串联变化。如果在多个参数变化后不需要进行神经调节，则可以更改能量施加的焦点(即，位点)。

本发明的技术效果包括通过神经调节诱导代谢途径和/或分子的靶向变化以治疗受试者。

该书面描述使用了实施例，以公开本发明，包括最佳模式，并且还使本领域技术人员能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统以及执行任何所引入的方法。本发明的可专利范围由权利要求书界定，并且可以包括本领域技术人员想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有与权利要求书的字面语言没有区别的结构要素，或如果它们包括与权利要求书的字面语言没有实质性差异的等效结构要素，则这些其他实施例旨在都落入权利要求书的范围内。

Claims (22)

1.一种治疗患有代谢紊乱症的受试者的方法，其包括：

向患有代谢紊乱症的受试者的内部组织施加超声能量而引起所述受试者中葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子变化以治疗代谢紊乱症，其中所述超声能量通过体外能量施加装置进行施加，

测量所述受试者的变化或变化的迹象；和

基于所述测量而判定所述超声能量引起所述葡萄糖转运子途径分子和/或所述肠促胰岛素途径分子变化以治疗所述受试者。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述内部组织是肝脏。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述施加包括将所述超声能量仅施加于肝脏的子区域。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述子区域是肝门。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述内部组织是胃肠组织。

6.根据权利要求1所述的方法，其包括对所述内部组织进行成像以识别所述内部组织的关注区域并将所述超声能量施加于所述关注区域。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述代谢紊乱症是2型糖尿病。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述代谢紊乱症是高血糖症。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述代谢紊乱症是胰岛素抵抗。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述变化包括所述葡萄糖转运子途径分子和/或所述肠促胰岛素途径分子的浓度变化、活性变化和/或位置变化。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述变化包括非内部组织的内部器官中的所述葡萄糖转运子途径分子和/或所述肠促胰岛素途径分子的浓度变化。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述葡萄糖转运子途径分子和/或所述肠促胰岛素途径分子是葡萄糖钠协同转运子2蛋白(SGLT2)、葡萄糖转运子2(GLUT-2)、葡萄糖转运子4(GLUT-4)或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。

13.根据权利要求1所述的方法，其中测量所述变化的指示包括测量尿液中的排泄葡萄糖相对于所述施加前采集的基线测量的增加。

14.一种用于治疗受试者的代谢紊乱症的系统，所述系统包括：

能量施加装置，其构造成向所述受试者的内部组织施加能量；

控制器，其适于控制所述能量施加装置以施加引起所述受试者体内葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子变化的能量；和

评价装置，其构造成接收指示所述变化的输入。

15.根据权利要求14所述的系统，其中所述评价装置是葡萄糖监测器。

16.根据权利要求14所述的系统，其中所述能量施加装置包括超声换能器或机械致动器。

17.根据权利要求14所述的系统，其中所述控制器构造成改变一个或多个基于所述输入而控制所述能量施加的参数。

18.一种治疗患有代谢紊乱症的受试者的方法，其包括：

在所述受试者的肝脏中选择关注区域；

向所述肝脏的所述关注区域施加超声能量以引起所述受试者体内葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子变化；

测量所述受试者的血糖浓度、排泄葡萄糖浓度或这两者；和

基于所述血糖浓度、排泄葡萄糖浓度或这两者而判定所述超声能量引起所述葡萄糖转运子途径分子和/或所述肠促胰岛素途径分子变化，以治疗所述受试者。

19.根据权利要求18所述的方法，其中判定所述超声能量引起所述变化包括判定所述血糖浓度相对于基线或阈值已经降低并且所述排泄葡萄糖浓度相对于基线或阈值已经增加。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述受试者没有接受代谢紊乱症的药物治疗。

21.一种治疗患有代谢紊乱症的受试者的方法，其包括：

在所述受试者的胃肠组织中选择关注区域；

向所述胃肠组织中的所述关注区域施加超声能量以引起葡萄糖转运子途径分子和/或肠促胰岛素途径分子变化；

测量所述受试者的血糖浓度、胰高血糖素样肽1浓度或这两者；和

基于所述血糖浓度、血胰高血糖素样肽1浓度或这两者而判定所述超声能量引起所述葡萄糖转运子途径分子和/或所述肠促胰岛素途径分子变化，以治疗所述受试者。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述关注区域处于小肠的空肠区域中。

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