CN113534434A - 一种基于led阵列的光谱显微成像装置及其实现方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于LED阵列的光谱显微成像装置及其实现方法，光谱显微成像装置包括依次设置的15×15单光源窄光谱红光光源LED阵列，载物台，显微物镜，视场光阑，4F中继透镜，阿米西棱镜，带通滤波器，微透镜阵列和CCD阵列工业相机；所述的4F中继透镜共有两组，分别设置在视场光阑和阿米西棱镜之间以及带通滤波器和微透镜阵列之间；本发明装置通过光路设计，达到15×15单光源窄光谱红光光源LED阵列中单一波长的LED灯逐一点亮225次即可同时获得观测样本多路单个连续光谱通道，可以实时获得观察样本单个光谱图像视频信息，无时间延时，无计算耗时；本发明装置采用了阿米西棱镜，其体积较小并且可以使物镜和目镜位于一条直线上，且阿米西棱镜不会受限于全反射的临界角，能接受较大角度的入射光。

Description

一种基于LED阵列的光谱显微成像装置及其实现方法
技术领域
本发明涉及光谱成像领域，具体涉及一种快速光谱显微成像装置。
背景技术
相比于传统的成像技术，光谱成像在拍摄样品的二维图像的同时，并将其一维的光谱信息和二维的空间信息一并记录下来。光谱成像技术可以提升增加所记录信息的丰富程度，有利于简便后期进一步的分析与处理。在光谱成像技术应用初期，使用的是传统的实验方法来获取光谱信息——即通过窄带滤光片来记录对应波长处的二维空间信息信息与以及一维光谱信息。该方法优点为精度高，易于实现。但同时其存在的缺点是该系统只能够获取样品的有限多个光谱通道信息，且所获得的光谱信息并不连贯。并且，这种方法无法同时记录样品不同光谱通道上的光谱信息，因而只能实现样品在静态场景下的光谱成像。
快速光谱显微成像技术则可以实现连续多个单个光谱通道的信息获取，因此所获得的光谱数据更加丰富也更为精准。因此，快速光谱显微成像技术可以有效地解决早期光谱成像技术中所存在的光谱通道少混乱，无法处理动态场景图像混叠获取的问题。
发明内容
针对现有技术所存在的不足，本发明提出一种基于LED阵列的光谱显微成像装置及其实现方法。该方法可以连续记录多个单个光谱通道信息，并且可以用于记录动态静态场景的光谱显微成像。
一种基于LED阵列的光谱显微成像装置，包括依次设置的15×15单光源窄光谱红光光源LED阵列(1)，载物台(2)，显微物镜(3)，视场光阑(4)，4F中继透镜(5)，阿米西棱镜(6)，带通滤波器(7)，微透镜阵列(8)和CCD阵列工业相机(9)。所述的4F中继透镜(5)共有两组，分别设置在视场光阑(4)和阿米西棱镜(6)之间以及带通滤波器(7)和微透镜阵列(8)之间；
显微物镜(3)的成像镜头用于获取载物台(2)上样本的二维图像信息并成像在视场光阑(4)所在平面，再通过第一组4F中继透镜(5)中继到阿米西棱镜(6)表面。阿米西棱镜(6)将像沿中线切开并将左右两部分互换，带通滤波器(7)将阿米西棱镜(6)亮度最高的+1级中待记录的光谱波段单独通过，并将其波段以及其它光栅级上的光线屏蔽掉。此时光栅色散后的光线经过第二组4F中继透镜(5)重新汇聚在微透镜阵列(8)所在平面，不同波长的光线在微透镜阵列(8)后方于微透镜焦距f距离处聚焦，并且连续光谱沿光栅色散方向一字展开，展开后的像重新成像在CCD阵列工业相机(9)上。整个光路系统前后需要数值孔径匹配，即投射到微透镜阵列(8)上的光与微透镜阵列(8)本身的数值孔径大小不能超过设定阈值，并且尽量接近，以免产生图像重叠混淆。
通过采用上述结构，由于微透镜阵列对视场内成像进行了采样分割，因此不同光谱通道的成像会聚焦在不同的像素坐标中，选取子像素中对应位置的像素重新组合即可得到对应光谱信息。
本发明有益效果如下：
本发明装置通过光路设计，达到15×15单光源窄光谱红光光源LED阵列中单一波长的LED灯逐一点亮225次即可同时获得观测样本多路单个连续光谱通道，可以实时获得观察样本单个光谱图像视频信息，无时间延时，无计算耗时；本发明装置采用了阿米西棱镜，其体积较小并且可以使物镜和目镜位于一条直线上，且阿米西棱镜不会受限于全反射的临界角，能接受较大角度的入射光。
附图说明
图1为本发明实施例FPM重建示意图；
图2为本发明实施例光谱显微成像装置结构示意图。
附图标记：15×15单光源窄光谱红光光源LED阵列1，载物台2，显微物镜3，视场光阑4，4F中继透镜5，阿米西棱镜6，带通滤波器7，微透镜阵列8，CCD阵列工业相机9，微透镜焦平面10，子像素11。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本发明进行进一步描述。
一种基于LED阵列的光谱显微成像装置，本发明特征在于15×15LED阵列中间隔相同的LED灯从不同位置连续点亮225次以实现高频信号的像素恢复，进而获取生物样本连续多个光谱信息，包括以下步骤：
如图2所示，一种基于LED阵列的光谱显微成像装置包括：15×15单光源窄光谱红光光源LED阵列1，载物台2，显微物镜3，视场光阑4，4F中继透镜5，阿米西棱镜6，带通滤波器7，微透镜阵列8和CCD阵列工业相机9，且自左向右依次设置；所述的4F中继透镜5共有两组，分别设置在视场光阑4和阿米西棱镜6之间、带通滤波器7和微透镜阵列8之间；
15×15单光源窄光谱红光光源LED阵列1中间隔相同、排列为15×15方阵的225个LED灯从不同位置发出单一光谱光线，将载物台2上的观测物体连续照亮255次。显微物镜3的成像镜头将观测物体的实像成像在视场光阑4所在平面，经过第一组4F中继透镜5映射在阿米西棱镜6表面。
映射在阿米西棱镜6表面的观测物体的实像发生色散，带通滤波器7将阿米西棱镜6亮度最高的+1级中待记录的光谱波段单独通过，经过4F中继透镜5重新汇聚到微透镜阵列8上。然后在微透镜焦平面10上沿着一个维度发生色散，观测物体色散后的实像成像在CCD阵列工业相机9的像素阵列上。
一种基于LED阵列的光谱显微成像装置的实现方法，包括如下步骤：
步骤一：15×15单光源窄光谱红光光源LED阵列1照射物体时，其中间隔相同、排列为15×15方阵的225个LED灯从不同角度发出特定单色波长光线将载物台2上的观测物体从接连照亮255次，显微物镜3的成像镜头将观测物体的实像成像在视场光阑4所在平面，经过第一组4F中继透镜5映射在阿米西棱镜6表面。
步骤二：映射在阿米西棱镜6表面的观测物体的实像发生色散，带通滤波器7将阿米西棱镜6亮度最高的+1级中待记录的光谱波段L1至Ln单独通过，经过第二组4F中继透镜5重新汇聚到微透镜阵列8上。
步骤三：由于映射在阿米西棱镜6表面的观测物体的实像存在色散角度，因此不同波长的光重新汇聚在微透镜阵列8上实像存在不同的出射角，并且在微透镜焦平面10上沿着一个维度发生色散，观测物体色散后的实像成像在CCD阵列工业相机9的像素阵列上。
步骤四：微透镜阵列8中每一个微透镜对应CCD阵列工业相机9的像素阵列中的一块子像素11区域，子像素11大小为N×N个像素，其中N为奇数，且3<N<13。并且经过该微透镜的出射光会投射到子像素11位于中间的一行像素上。此时，将子像素11中中间一行对应位置的像素重新组合，组合方式为，将每个微透镜对应的子像素11中的第(N+1)/2行的第i个像素按照微透镜位置排序组合为第i张图Ai，其中i＝1,2……N，即可得到载物台2上观测物体在λi波长下对应的光谱图像Ai，其中；
λi＝L1+(i-0.5)×(Ln-L1)/N。
步骤五：利用事先编程的MATLAB图像截取函数脚本实现CCD阵列相机自动截取15×15个LED灯点亮后的图片，生成225张图片，并对图片进行重命名和排序以便于下一步的图像分析与处理。相机所产生的的图片像素为C×D(C、D数值为所得图像横纵像素数，可以查询相应相机的具体参数)。
步骤六：
①将每个LED灯的时域坐标转换为频域坐标；
②利用先前求得的光瞳函数在物体高分辨频谱上截取对应子孔径内的频谱信息；
③利用相应倾斜平面波下记录的低分辨强度图像来更新目标光场的振幅信息；
④对图片的光瞳函数进行进一步的归一化处理；
⑤通过更新前后目标光场的频谱分布差异来更新物体高分辨频谱中对应子孔径内的频谱信息以及光瞳函数；
⑥对图片的信息不断进行迭代和重构；
⑦计算误差参数；
⑧由得到的K×K个图像信息和重构后重新生成新的225张图片，再进而得到图像的信息。详细步骤如下：
输入为225(225＝15×15)张原始图像，图像编号为
Figure BDA0003141918120000041
K为组数，(m,n)表示第几行第几列LED所产生的的图像，
Figure BDA0003141918120000042
为图像原始频谱函数。通过计算得出光路系统的光瞳函数P(u,v)＝|P(u,v)|*exp[i*2π*W(u,v,xt,yt)]。式中(u,v)代表频域坐标，|P(u,v)|为光瞳函数的振幅，(xt,yt)为视场中某一位置处的空间坐标；
(1)对LED阵列进行坐标转换。令中心点LED灯坐标为(x0,y0)，第m行、第n列的LED灯单位坐标为LEDm,n＝(xm,n，ym,n)。设λ为入射光的波长，h为LED阵列中心点位置LED灯距样品中心点的距离，则LEDm,n对应的倾斜平面波的空间频率为(um,n,vm,n)；
Figure BDA0003141918120000043
Figure BDA0003141918120000044
(2)在LEDm,n阵列单个灯的照明下，利用先前求得的光瞳函数P(u,v)在物体高分辨频谱Оk上截取对应子孔径内的频谱信息
Figure BDA0003141918120000051
并通过傅里叶逆变换生成像面上相应的低分辨复振幅函数
Figure BDA0003141918120000052
称为目标光场；
Figure BDA0003141918120000053
Figure BDA0003141918120000054
(3)保持目标光场的相位信息不变，利用相应倾斜平面波下记录的低分辨强度图像
Figure BDA0003141918120000055
更新目标光场的振幅信息
Figure BDA0003141918120000056
Figure BDA0003141918120000057
(4)装置为有着圆形孔径的显微成像装置，因此可将装置表示为一圆形低通滤波器，滤波器的截止频率为uc＝NAobj/λ,其中NAobj为装置的数值孔径，λ是射入光的波长。对图片的光瞳函数P(u,v)进行进一步的归一化处理，处理式子如下；
Figure BDA0003141918120000058
(5)利用傅里叶变换求出更新后的目标光场的频谱
Figure BDA0003141918120000059
Figure BDA00031419181200000510
并通过更新前后目标光场的频谱分布差异
Figure BDA00031419181200000511
来更新物体高分辨频谱中对应子孔径内的频谱信息以及光瞳函数:
Figure BDA00031419181200000512
Figure BDA0003141918120000061
其中*为复共轭运算符。
(6)利用步骤(3)所得到的目标光场对图像进行相位恢复，从中心点灯左上角开始以螺旋线方式进行迭代，利用各个图像的目标光场来扩大截止频率。螺旋线的具体迭代方法如图1所示。在重叠处，对低通信道叠加部分重叠区域的相位信息做除二处理；
(7)重复步骤(2)～(5)H次来更新其他照明角度所对应的频谱成分。当所有照明角度都更新过一遍之后，则完成了一次迭代过程。经过H次后，直到重建算法收敛，从而获得物体的高分辨下复振幅的最优解。一般情况下，利用每次迭代后物体振幅的误差值E作为算法循环的终止条件,j为迭代次数，若其小于所设阈值(通常为1％)，则跳出循环，完成重建过程。
Figure BDA0003141918120000062
进一步的，H的取值为2-3。
(8)对步骤(7)中收敛后的目标光场进行重建并得到目标光强图，该重建图是第K个光谱波段的超分辨率图。由第K个光谱波段的超分辨率图得到K×K个图像信息，并将其重组为新的225张图像，进而得到图像的信息。

Claims (5)

1.一种基于LED阵列的光谱显微成像装置，其特征在于，包括依次设置的15×15单光源窄光谱红光光源LED阵列(1)，载物台(2)，显微物镜(3)，视场光阑(4)，4F中继透镜(5)，阿米西棱镜(6)，带通滤波器(7)，微透镜阵列(8)和CCD阵列工业相机(9)；所述的4F中继透镜(5)共有两组，分别设置在视场光阑(4)和阿米西棱镜(6)之间以及带通滤波器(7)和微透镜阵列(8)之间；
2.根据权利要求1所述的一种基于LED阵列的光谱显微成像装置，其特征在于，显微物镜(3)的成像镜头用于获取载物台(2)上样本的二维图像信息并成像在视场光阑(4)所在平面，再通过第一组4F中继透镜(5)中继到阿米西棱镜(6)表面；阿米西棱镜(6)将像沿中线切开并将左右两部分互换，带通滤波器(7)将阿米西棱镜(6)亮度最高的+1级中待记录的光谱波段单独通过，并将其波段以及其它光栅级上的光线屏蔽掉；此时光栅色散后的光线经过第二组4F中继透镜(5)重新汇聚在微透镜阵列(8)所在平面，不同波长的光线在微透镜阵列(8)后方于微透镜焦距f距离处聚焦，并且连续光谱沿光栅色散方向一字展开，展开后的像重新成像在CCD阵列工业相机(9)上；整个光路系统前后需要数值孔径匹配，即投射到微透镜阵列(8)上的光与微透镜阵列(8)本身的数值孔径大小不能超过设定阈值，并且尽量接近，以免产生图像重叠混淆。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于LED阵列的光谱显微成像装置的实现方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：15×15单光源窄光谱红光光源LED阵列(1)照射物体时，其中间隔相同、排列为15×15方阵的225个LED灯从不同角度发出特定单色波长光线将载物台(2)上的观测物体从接连照亮255次，显微物镜(3)的成像镜头将观测物体的实像成像在视场光阑(4)所在平面，经过第一组4F中继透镜(5)映射在阿米西棱镜(6)表面；
步骤二：映射在阿米西棱镜(6)表面的观测物体的实像发生色散，带通滤波器(7)将阿米西棱镜(6)亮度最高的+1级中待记录的光谱波段L1至Ln单独通过，经过第二组4F中继透镜(5)重新汇聚到微透镜阵列(8)上；
步骤三：由于映射在阿米西棱镜(6)表面的观测物体的实像存在色散角度，因此不同波长的光重新汇聚在微透镜阵列(8)上实像存在不同的出射角，并且在微透镜焦平面(10)上沿着一个维度发生色散，观测物体色散后的实像成像在CCD阵列工业相机(9)的像素阵列上；
步骤四：微透镜阵列(8)中每一个微透镜对应CCD阵列工业相机(9)的像素阵列中的一块子像素(11)区域，子像素(11)大小为N×N个像素，其中N为奇数，且3<N<13；并且经过该微透镜的出射光会投射到子像素(11)位于中间的一行像素上；此时，将子像素(11)中中间一行对应位置的像素重新组合，组合方式为，将每个微透镜对应的子像素(11)中的第(N+1)/2行的第i个像素按照微透镜位置排序组合为第i张图Ai，其中i＝1,2……N，即可得到载物台(2)上观测物体在λi波长下对应的光谱图像Ai，其中：
λi＝L1+(i-0.5)×(Ln-L1)/N；
步骤五：利用事先编程的MATLAB图像截取函数脚本实现CCD阵列相机自动截取15×15个LED灯点亮后的图片，生成225张图片，并对图片进行重命名和排序以便于下一步的图像分析与处理；相机所产生的的图片像素为C×D；
步骤六：
①将每个LED灯的时域坐标转换为频域坐标；
②利用先前求得的光瞳函数在物体高分辨频谱上截取对应子孔径内的频谱信息；
③利用相应倾斜平面波下记录的低分辨强度图像来更新目标光场的振幅信息；
④对图片的光瞳函数进行进一步的归一化处理；
⑤通过更新前后目标光场的频谱分布差异来更新物体高分辨频谱中对应子孔径内的频谱信息以及光瞳函数；
⑥对图片的信息不断进行迭代和重构；
⑦计算误差参数；
⑧由得到的K×K个图像信息和重构后重新生成新的225张图片，再进而得到图像的信息。
4.根据权利要求3所述的一种基于LED阵列的光谱显微成像装置的实现方法，其特征在于，步骤六详细步骤如下：
输入为225(225＝15×15)张原始图像，图像编号为
Figure FDA0003141918110000031
K为组数，(m,n)表示第几行第几列LED所产生的的图像，
Figure FDA0003141918110000032
为图像原始频谱函数；通过计算得出光路系统的光瞳函数P(u,v)＝|P(u,v)|*exp[i*2π*W(u,v,xt,yt)]；式中(u,v)代表频域坐标，|P(u,v)|为光瞳函数的振幅，(xt,yt)为视场中某一位置处的空间坐标；
(1)对LED阵列进行坐标转换；令中心点LED灯坐标为(x0,y0)，第m行、第n列的LED灯单位坐标为LEDm,n＝(xm,n，ym,n)；设λ为入射光的波长，h为LED阵列中心点位置LED灯距样品中心点的距离，则LEDm,n对应的倾斜平面波的空间频率为(um,n,vm,n)；
Figure FDA0003141918110000033
Figure FDA0003141918110000034
(2)在LEDm,n阵列单个灯的照明下，利用先前求得的光瞳函数P(u,v)在物体高分辨频谱Оk上截取对应子孔径内的频谱信息
Figure FDA0003141918110000035
并通过傅里叶逆变换生成像面上相应的低分辨复振幅函数
Figure FDA0003141918110000036
，称为目标光场；
Figure FDA0003141918110000037
Figure FDA0003141918110000038
(3)保持目标光场的相位信息不变，利用相应倾斜平面波下记录的低分辨强度图像
Figure FDA0003141918110000039
更新目标光场的振幅信息
Figure FDA00031419181100000310
Figure FDA00031419181100000311
(4)装置为有着圆形孔径的显微成像装置，因此可将装置表示为一圆形低通滤波器，滤波器的截止频率为uc＝NAobj/λ,其中NAobj为装置的数值孔径，λ是射入光的波长；对图片的光瞳函数P(u,v)进行进一步的归一化处理，处理式子如下；
Figure FDA0003141918110000041
(5)利用傅里叶变换求出更新后的目标光场的频谱
Figure FDA0003141918110000042
Figure FDA0003141918110000043
并通过更新前后目标光场的频谱分布差异
Figure FDA0003141918110000044
来更新物体高分辨频谱中对应子孔径内的频谱信息以及光瞳函数:
Figure FDA0003141918110000045
其中*为复共轭运算符；
(6)利用步骤(3)所得到的目标光场对图像进行相位恢复，从中心点灯左上角开始以螺旋线方式进行迭代，利用各个图像的目标光场来扩大截止频率；在重叠处，对低通信道叠加部分重叠区域的相位信息做除二处理；
(7)重复步骤(2)～(5)H次来更新其他照明角度所对应的频谱成分；当所有照明角度都更新过一遍之后，则完成了一次迭代过程；经过H次后，直到重建算法收敛，从而获得物体的高分辨下复振幅的最优解；利用每次迭代后物体振幅的误差值E作为算法循环的终止条件,j为迭代次数，若其小于所设阈值，则跳出循环，完成重建过程；
Figure FDA0003141918110000046
(8)对步骤(7)中收敛后的目标光场进行重建并得到目标光强图，该重建图是第K个光谱波段的超分辨率图；由第K个光谱波段的超分辨率图得到K×K个图像信息，并将其重组为新的225张图像，进而得到图像的信息。
5.根据权利要求4所述的一种基于LED阵列的光谱显微成像装置的实现方法，其特征在于，H的取值为2-3。
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