CN113533462A - 一种基于离子电流信号的活细胞检测方法 - Google Patents

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陈明伟
李安琪
庄健
周洁君
李萌
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Abstract

本发明公开了一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，在纳米探针安装完成后，将探针电极置于纳米探针中的导电溶液中，参比电极置入培养皿溶液中，即形成导电回路，在探针电极和参比电极之间施加电势产生离子电流，电流信号被电流放大器放大，放大的电流用作反馈信号来控制探针尖端与待测细胞之间的距离，以实现纳米探针尖端相对于细胞表面的非接触式位置控制，利用依赖于距离变化的离子电流信号，以实现纳米探针尖端相对于细胞表面的非接触式位置控制，从而实现对于活细胞的无创检测，同时扫描效率高，可在短时间内重复扫描，可实现持续实时监测细胞变化，结合倒置显微镜，可定位于单个细胞扫描，达到高分辨率精准扫描。

Description

一种基于离子电流信号的活细胞检测方法
技术领域
本发明涉及一种活细胞研究领域，具体涉及一种基于离子电流信号的活细胞检测方法。
背景技术
细胞是构成生物体结构和进行各种生命活动的基本单位，生命体的生长发育依靠细胞增殖、细胞分化与细胞凋亡来实现，一切疾病的发病机制也以细胞病变研究为基础，对细胞生命活动的基本规律研究是一切生命科学的重要基础，精准的细胞研究对于临床医学发展具有重要意义。
目前常用的细胞成像技术包括光学显微镜、电子显微镜以及原子力显微镜等，但这些方法均需要对研究样本进行预处理，如细胞固定，这些技术存在侵入性、耗时长、只能获取静态图像等缺点，难以动态无创的获得活细胞的形态变化等信息，因此研发一种无创的动态监测活细胞变化的细胞成像技术，在不影响细胞本身状态下进行科学研究，对于医学研究具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是基于离子电流信号变化，提出一种非接触式的活细胞检测方法，以解决对体外活细胞生理及病理等生命过程进行实时监测的问题。
本发明采用如下技术方案来实现的：
一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，包括以下步骤：
步骤一：使用PC-10拉针仪拉制尖端直径200nm的纳米探针，向纳米探针中注入导电溶液，在显微镜下观察探针尖端有无气泡，如无气泡证明成功；
步骤二：将纳米探针固定在装有电机的实验台上，外界电源的电极分别接通探针固定器和培养皿的溶液，形成导电回路；
步骤三：将细胞培养皿置入载物台，通过倒置显微镜观察确定待测的细胞，移动X轴调节器和Y轴调节器将纳米探针移动至待测细胞的边缘，设定扫描间隔距离、扫描像素以及扫描范围；
步骤四：设置初始Z轴调节器位置，启动后装置将自行按照步骤三的设置参数开始扫描，Z轴调节器位置不断接近细胞表面，当Z轴调节器与细胞表面的距离为探针尖端直径的一半时，此时离子电流会出现剧烈变化，该位置为探针尖端与细胞表面的相对固定距离，在后续扫描中探针尖端将始终与细胞表面保持该距离；
步骤五：根据设置的扫描像素及范围，装置最快可在10～20s进行一次扫描，此后可进行重复扫描，也可通过参数设定使探针悬停至感兴趣区域，进行持续监测，整个过程扫描过程细胞在细胞培养基中，且探针与细胞表面无直接接触，可实现无创动态监测活细胞变化。
一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，在纳米探针安装完成后，将探针电极置于纳米探针中的导电溶液中，参比电极置入培养皿溶液中，即形成导电回路，在探针电极和参比电极之间施加电势产生离子电流，电流信号被电流放大器放大，放大的电流用作反馈信号来控制探针尖端与待测细胞之间的距离，以实现纳米探针尖端相对于细胞表面的非接触式位置控制；
本发明进一步的改进在于，纳米探针的材质为石英玻璃管，其尖端直径最小可达200nm，探针内导电溶液为0.1mol/L氯化钾溶液，具有良好的导电性能；
本发明进一步的改进在于，当纳米探针远离细胞表面时，在探针电极和参比电极之间可记录到稳态离子电流，当纳米探针向细胞表面下降时，由于接近细胞表面阻碍了离子流动，离子电流开始下降，当纳米探针和细胞表面之间的距离与纳米探针的尖端半径相近时，离子电流对距离的变化非常敏感，因此可以得到离子电流和探针尖端-细胞表面距离之间的关系(见图3)，利用依赖于距离变化的离子电流，可以建立电子反馈回路来获取细胞表面形貌；
本发明进一步的改进在于，培养皿中溶液可为细胞培养基，细胞在培养基中能保持良好状态，检测过程中探针不接触细胞表面，避免了外界因素的干扰，使测量结果更加准确可靠；
本发明进一步的改进在于，载物台被X轴调节器和Y轴调节器调控，可手动调节位置；
本发明进一步的改进在于，物镜位于培养皿下方，采用倒置显微镜的原理用于观察活细胞，便于初步定位扫描位置；
本发明进一步的改进在于，控制显示系统可以设置扫描间隔距离、扫描像素以及扫描范围，其分辨率可达到2nm，同时可以显示扫描图像及离子电流信号。
本发明具有如下有益的技术效果：
本发明提供的一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，利用依赖于距离变化的离子电流信号，在确定了探针尖端与细胞表面的固定相对距离后，在扫描过程中始终保持该相对距离，最终可描绘出细胞的形貌图，且扫描过程中探针与细胞不发生接触，测量过程不需要对样品进行特殊处理，细胞处于培养基的正常状态即可进行检测，避免其他因素干扰，可直观检测活细胞的形态变化以及细胞表面电流变化情况，为医学研究提供了一种可靠的研究方法；
进一步，本发明用于活细胞观察研究，可对培养基中的细胞进行检测，在外界环境中可持续监测150min，可持续检测观察时间内细胞的变化情况，可对比观察细胞在用药前后的形态及细胞表面电流的变化情况，为药物机制研究提供新思路；
进一步，本发明结合了纳米探针和倒置显微镜，可在显微镜下定位到单个细胞，对单个细胞进行测量，实现了精准测量，控制了混杂因素干扰，同时具有高分辨率，最小可达到2nm。
附图说明
图1为本发明一种基于离子电流信号的活细胞检测方法的示意图；
图2为导电回路示意图；
图3距离依赖的离子电流变化图；
图4单细胞形貌及细胞表面电流图；
附图标记说明：
1-纳米探针，2-导电回路，3-培养皿，4-目镜，5-载物台，6-调节旋钮，7-物镜，8-X轴调节器，9-Y轴调节器，10-数据采集系统，11-控制显示系统，12-电流放大器，13-Z轴调节器，14-探针固定器，15-光源，16-探针电极，17-参比电极，18-电源，19-电流检测器，20-导电线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定；
图1和图2为本发明提供的一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，具体包括以下步骤：
本实施例首先需要拉制纳米探针1，利用PC-10拉针仪进行拉制，然后向纳米探针1内注入0.1mol/L氯化钾溶液，在显微镜下观察尖端有无气泡，如无气泡证实成功；
本实施例在纳米探针1准备完成后，将待测的细胞培养皿3放置于载物台5上，将纳米探针1安装至探针固定器14上，同时将电源18的两端电极探针电极16和参比电极17分别接至纳米探针1和培养皿2溶液中，形成导电回路2，在探针电极16和参比电极17之间施加电势产生离子电流，此时在控制显示系统11中可观察到电流信号波动，在目镜4中观察培养皿2中的细胞，找到待测的单个细胞，通过调节旋钮6使图像清晰，通过调节X轴调节器8和Y轴调节器9移动载物台，使纳米探针1尖端位于待测细胞的边缘位置，然后在控制显示系统11设置参数，设置扫描间隔距离、扫描像素以及扫描范围，设置初始Z轴调节器13位置，设置完成后开始扫描，当纳米探针1在不断接近细胞表面的过程中，离子电流信号发生变化，当探针尖端与细胞表面距离为探针尖端直径的一半时，离子电流发生剧烈变化，此时装置确定了Z轴调节器13的位置，此过程需要十几分钟左右，此后可开始进行细胞形貌测定，扫描过程最快可达10～20s，即可得到细胞的形貌图及离子电流数据(见图4)，同理在药物干预后可再次对细胞进行扫描，可对比观察用药前后的变化，或者对细胞进行持续监测，整个过程的数据均保存在数据采集系统10中，实验结束后可导出数据进行进一步分析。

Claims (8)

1.一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：使用PC-10拉针仪拉制尖端直径200nm的纳米探针，向纳米探针中注入导电溶液，在显微镜下观察探针尖端有无气泡，如无气泡证明成功；
步骤二：将纳米探针固定在装有电机的实验台上，外界电源的电极分别接通探针固定器和培养皿的溶液，形成导电回路；
步骤三：将细胞培养皿置入载物台，通过倒置显微镜观察确定待测的细胞，移动X轴调节器和Y轴调节器将纳米探针移动至待测细胞的边缘，设定扫描间隔距离、扫描像素以及扫描范围；
步骤四：设置初始Z轴调节器位置，启动后装置将自行按照步骤三的设置参数开始扫描，Z轴调节器位置不断接近细胞表面，当Z轴调节器与细胞表面的距离为探针尖端直径的一半时，此时离子电流会出现剧烈变化，该位置为探针尖端与细胞表面的相对固定距离，在后续扫描中探针尖端将始终与细胞表面保持该距离；
步骤五：根据设置的扫描像素及范围，装置最快可在10～20s进行一次扫描，此后可进行重复扫描，也可通过参数设定使探针悬停至感兴趣区域，进行持续监测，整个过程扫描过程细胞在细胞培养基中，且探针与细胞表面无直接接触，可实现无创动态监测活细胞变化。
2.根据权利要求1所述的一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，其特征在于，探针电极(16)置于纳米探针(1)中的氯化钾溶液中，参比电极(17)置入培养皿培养基溶液中，形成导电回路(2)，当纳米探针(1)安装完成后，在探针电极(16)和参比电极(17)之间施加电势产生离子电流，电流信号被电流放大器(12)放大，放大的电流用作反馈信号来控制探针尖端与待测细胞之间的距离，以实现纳米探针尖端相对于细胞表面的非接触式位置控制。
3.根据权利要求1所述的一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，其特征在于，纳米探针(1)的材质为石英玻璃管，其尖端直径最小可达200nm，探针内导电溶液为0.1mol/L氯化钾溶液，具有良好的导电性能。
4.根据权利要求1所述的一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，其特征在于，当纳米探针(1)远离细胞表面时，在探针电极(16)和参比电极(17)之间可记录到稳态离子电流，当纳米探针(1)向细胞表面下降时，由于接近细胞表面阻碍了离子流动，离子电流开始下降，当纳米探针(1)和细胞表面之间的距离与纳米探针的尖端半径相近时，离子电流对距离的变化非常敏感，得到离子电流和探针尖端-细胞表面距离之间的关系，利用依赖于距离变化的离子电流，建立电子反馈回路来获取细胞表面形貌。
5.根据权利要求1所述的一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，其特征在于，培养皿(3)中溶液可为细胞培养基，细胞在培养基中能保持良好状态，检测过程中探针不接触细胞表面，避免了外界因素的干扰，使测量结果更加准确可靠。
6.根据权利要求1所述的一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，其特征在于，载物台(5)被X轴调节器(8)和Y轴调节器(9)调控，可手动调节位置。
7.根据权利要求1所述的一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，其特征在于，物镜(7)位于培养皿下方，采用倒置显微镜的原理用于观察活细胞，便于初步定位扫描位置。
8.根据权利要求2所述的一种基于离子电流信号的活细胞检测方法，其特征在于，控制显示系统(11)可以设置扫描间隔距离、扫描像素以及扫描范围，其分辨率可达到2nm，同时可以显示扫描图像及离子电流信号。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114674897A (zh) * 2022-03-28 2022-06-28 深圳大学 一种用于检测单细胞外pH值的探针型有机电化学晶体管传感器及其制备方法、检测方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114674897A (zh) * 2022-03-28 2022-06-28 深圳大学 一种用于检测单细胞外pH值的探针型有机电化学晶体管传感器及其制备方法、检测方法
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