CN113474467A - 生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测玉米赤霉烯酮(ZEN)影响的新方法，所述方法包括测定测试样品中至少一种miRNA的表达水平，以及涉及至少一种miRNA用于检测测试样品中玉米赤霉烯酮(ZEN)影响的新用途。

Description

生物标志物
技术领域
本发明涉及一种用于检测玉米赤霉烯酮(ZEN)影响的新方法，所述方法包括测定测试样品中至少一种miRNA的表达水平，以及至少一种miRNA用于检测测试样品中玉米赤霉烯酮(ZEN)影响的新用途。
背景技术
霉菌毒素是霉菌的次级代谢产物，其导致动物中浓度依赖性不良健康影响。在北欧和中欧，最常在动物饲料中检测到由诸如禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)或黄色镰刀菌(F.culmorum)的田间真菌产生的霉菌毒素(Streit等，2012.Toxins,4,788-809)。玉米赤霉烯酮(ZEN)被认为是，特别是在猪生产中，最相关的镰刀菌(Fusarium)霉菌毒素之一。ZEN是玉米的常见污染物，但也可能存在于诸如小麦、大麦或燕麦的各种其他农产品中。在最近的一项研究中，88％的测试的饲料样品检测为ZEN阳性，中浓度和最大浓度分别为20μg/kg和11,192μg/kg(Kovalsky等，2016.Toxins,8,E363)。猪特别易受ZEN影响，这是由于该霉菌毒素的物种特异性代谢(Fink-Gremmels和Malekinejad.2007.Animal Feed Scienceand Technology,137,326-341)。ZEN具有低急性毒性但分别是雌激素受体α和β的全部和部分激动剂(Zinedine等，2007.Food and Chemical Toxicology,45,1-18)。结果，猪的ZEN暴露导致生殖和生育障碍。例如，青春期前的小母猪饲喂含有1-5ppm ZEN的饮食会触发乳腺发育。此外，还观察到外阴阴道炎、外阴水肿、直肠脱垂(Osweiler,G.1999.Mycotoxins.In:STRAW,B.,
Figure BDA0003197690610000012
S.,MENGELING,W.&TAYLOR,D.(eds.)8th Diseases ofswine.Ames,Iowa,USA:Iowa State University Press；Osweiler,G.D.2000.Mycotoxins:Contemporary issues of food animal health and productivity.Veterinary Clinicsof North America:Food Animal Practice,16,511-530)。在成熟母猪中，ZEN的影响取决于其在饲料中的浓度、暴露的时间和妊娠期，并且该影响有从无情欲期到活胚胎减少、死产仔猪和流产增加(
Figure BDA0003197690610000011
等，1992.Journal of environmental pathology,toxicologyand oncology:official organ of the International Society for EnvironmentalToxicology and Cancer,11,53-55)。在暴露母猪的新生仔猪中，记录到外生殖器增大和具有外翻腿和颤抖的仔猪的发生率更高(Osweiler,G.1999.Mycotoxins.In:STRAW,B.,
Figure BDA0003197690610000022
S.,MENGELING,W.&TAYLOR,D.(eds.)8th Diseases of swine.Ames,Iowa,USA:Iowa State University Press)。此外，ZEN使不同的受体活化，最显著的为孕烷X受体，参与体外细胞色素P450异构体的的调节，从而潜在地影响各种内源性和外源性生物质的I期代谢(Ayed-Boussema等，2011.Environmental Toxicology and Pharmacology,31,79-87)。
截止目前，ZEN霉菌毒素中毒的检测主要基于临床症状的观察和饲料分析。然而，正如许多其他霉菌毒素一样，在临床症状变得明显之前，ZEN就对家畜产生了不良健康影响。饲料样品的分析伴随着一定的挑战：需要考虑霉菌毒素在一个批次内的不均匀分布以及取样的时间点(由于在取样和霉菌毒素诱导的影响初始发作之间饲料的批次可能发生变化)来收集代表性饲料样品。此外，需要考虑饲料样品的霉菌毒素共同污染，这可能会导致动物中的累加、协同或拮抗作用(Grenier和Oswald.2011.World Mycotoxin Journal,4,285-313)。另外，修改形式的ZEN的存在并没有受到常规监测，但却增加了个体的总ZEN负担(Binder等，2017.Toxins,9,56)。与饲料分析相对地，猪的生物基质，比如尿液、粪便、胆汁或组织中特异性生物标志物的检测允许在个体水平上检测霉菌毒素中毒。在霉菌毒素研究中使用两类生物标志物：基于暴露的生物标志物和基于机制的生物标志物(Baldwin等，2011.World Mycotoxin Journal,4,257-270)。前者涉及霉菌毒素本身和/或其代谢物的测量，后者涉及可能与霉菌毒素摄入有关的特异性生物应答，如蛋白质水平或细胞代谢物水平的增高/降低。关于ZEN，过去几年一直努力在猪中建立基于暴露的生物标志物。在受控的条件下，许多研究探索了增加毒素浓度对血液、尿液和胆汁中以及粪便、肠液、肝脏或背部脂肪中ZEN和/或其代谢物水平的影响。通常，自胆汁和尿液中回收最高浓度的ZEN及其代谢物，与其他诸如血液的基质相比，胆汁和尿液作为基质具有更好的摄入的ZEN与回收的ZEN的相关系数(
Figure BDA0003197690610000021
等，2003.Archives of Animal Nutrition,57,311-334；Goyarts等，2007.Food Additives and Contaminants,24,369-380；Brezina等，2014.Archives ofanimal nutrition,68,425-447)。相应地，最近的一项现场研究未能将母猪饲料中的ZEN水平与其在血浆中的水平关联起来，因为血浆中的毒素浓度低于大多数样品中定量限(VanLimbergen等，2017.Veterinary Record,181,539)。由于由广泛的ZEN暴露水平可以得到胆汁、血液或尿液中可比较的ZEN浓度，因此，在现场条件下仍然不推荐将基于暴露的生物标志物用于预测NEN摄入(
Figure BDA0003197690610000031
和Winkler.2015.Food and Chemical Toxicology,84,225-249)。最重要的是，正如如由ZEN暴露后胆汁中ZEN总水平与子宫重量之间不存在相关性所证明的，ZEN残留并不提供由ZEN诱导的不良健康影响的严重程度的指示(
Figure BDA0003197690610000032
和Winkler.2015.Food and Chemical Toxicology,84,225-249)。对于基于机制的ZEN生物标志物，当体内ZEN暴露后发现几个生物学参数发生了改变，所述生物学参数比如血液学和生化参数(Goyarts等，2007.Food Additives and Contaminants,24,369-380；
Figure BDA0003197690610000033
等，2016.Research in Veterinary Science,109,169-180)或mRNA表达(Dai等，2016.AnimalReproduction Science,168,126-137；Reddy等，2017.Asian-Australasian Journal ofAnimal Sciences,31,595-606；Zhou等，2018.Asian-Australasian Journal of AnimalSciences,31,32)。然而，所研究的参数的重现性和特异性是有限的，到目前为止，还未在血液、尿液或胆汁中这些生物学参数的增加/减少与ZEN摄入量之间建立明确的剂量-应答关系。He等(He等，2018.Endocrinology,159,2993-3006)描述了每天腹膜内注射112.5mg ZEN后，切除卵巢的猪的垂体组织中微小RNA(miRNA)miR-7的表达增加。然而，He等使用了不能反映由于污染的饲料而导致的天然ZEN暴露的实验设置，因为112.5mg ZEN的量远远超出了实际的暴露水平。此外，通过注射的施用不能反映经由饲料的天然摄入。此外，由于ZEN暴露通常与生殖和生育障碍有关，因此切除卵巢的猪不是健康的、未切除卵巢的猪的ZEN暴露的良好模型。进一步地，需要识别一种生物标志物，该生物标志物可用于在比垂体组织更容易获得的样品(比如血清)中检测ZEN暴露。
发明内容
本发明是根据上述现有技术做出的。一般而言，本申请的发明人发现，基于机制的生物标志物由于检测方法更简单和与个体中霉菌毒素影响直接相关，因此比暴露的生物标志物更适合在霉菌毒素中毒检测领域中应用，然而截止目前，还未识别合适的效应生物标志物(biomarker-of-effect)或基于机制的生物标志物。
本发明提供一种用于检测玉米赤霉烯酮(ZEN)影响的方法，所述方法包括测定测试样品中本文所述的至少一种miRNA的表达水平；并将所述表达水平与对照样品中所述至少一种miRNA的表达水平进行比较。miRNA(也称为微小RNA)是一种长度通常为约19至约24个核苷酸的短RNA分子。miRNA为能够阻断mRNA翻译成蛋白质或能够降解mRNA分子的基因表达的负调节因子。通过提供一种用于检测ZEN影响的方法，所述方法包括测定测试样品中本文所述的至少一种miRNA的表达水平；并将所述表达水平与参照值进行比较，发明人惊讶地识别了一种通过适合在本领域应用的效应生物标志物来检测ZEN影响的可靠方法。
术语比如如mRNA分子或miRNA的多核苷酸的“表达水平”是指所述多核苷酸的相对或绝对量。可以通过本领域技术人员已知的合适的策略来测定多核苷酸的表达水平，所述策略包括但不限于微阵列实验、定量实时PCR或如由Illumina、Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies等提供的所谓的下一代测序(NGS)技术。
玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种具有以下结构式的非甾体大环内酯，其可通过聚酮化合物代谢途径的方式合成：
Figure BDA0003197690610000041
根据IUPAC命名法，其名称为(2E,11S)-15,17-二羟基-11-甲基-12-氧杂二环[12.4.0]十八烷-1(18),2,14,16-四烯-7,13-二酮。自然界中还存在各种ZEN衍生物，这些衍生物可以通过ZEN的酶促或化学修饰形成。实例包括但不限于糖苷ZEN缀合物或含有硫酸盐的、由真菌、植物或哺乳动物的新陈代谢形成的那些，以及在人或动物生物体中形成的ZEN代谢物等。在下文中将ZEN衍生物理解为天然存在的或通过化学或生物化学合成法合成的ZEN缀合物或ZEN代谢物，但特别理解为α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL；(2E,7R,11S)-7,15,17-三羟基-11-甲基-12-氧杂二环[12.4.0]-十八烷-1(18),2,14,16-四烯-13-酮)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL；(2E,7S,11S)-7,15,17-三羟基-11-甲基-12-氧杂二环[12.4.0]十八烷-1(18),2,14,16-四烯-13-酮)、α-玉米赤霉醇(α-ZAL；(7R,11S)-7,15,17-三羟基-11-甲基-12-氧杂二环[12.4.0]十八烷-1(18),14,16-三烯-13-酮)、β-玉米赤霉醇(β-ZAL；(7S,11S)-7,15,17-三羟基-11-甲基-12-氧杂二环[12.4.0]十八烷-1(14),15,17-三烯-13-酮)、玉米赤霉烯酮14-硫酸盐(Z14S；[(2E,11S)-15-羟基-11-甲基-7,13-二氧-12-氧杂二环[12.4.0]十八烷-1(18),2,14,16-四烯-17-基]硫酸氢盐)、玉米赤霉烯酮-14-糖苷(Z14G；(2E,11S)-15-羟基-11-甲基-17-[(3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)-四氢吡喃-2-基]氧-12-氧杂二环[12.4.0]十八烷1(18)2,14,16-四烯-7,13-二酮)以及玉米赤霉酮(ZAN；(11S)-15,17-二羟基-11-甲基-12-氧杂二环-[12.4.0]十八烷-1(18),14,16-三烯-7,13-二酮)。由于ZEN以及ZEN衍生物，特别是α-ZEL、β-ZEL、Z14S、α-ZAL、β-ZAL、Z14G和ZAN的高化学和物理稳定性，还可以在加工食品和动物饲料产品，比如面包或啤酒中检测到它们。
如本文所用，术语“玉米赤霉烯酮影响”或“ZEN影响”指玉米赤霉烯酮对生物系统的暴露或玉米赤霉烯酮对生物系统的(生理)影响。所述生物系统可以是任何生物系统，比如细胞、细胞培养物、组织或动物。在一些实施方案中，“玉米赤霉烯酮影响”可进一步指玉米赤霉烯酮衍生物或类似物对生物系统的暴露或玉米赤霉烯酮衍生物或类似物对生物系统的(生理)影响。优选地，玉米赤霉烯酮衍生物为上文公开的一种。应理解，优选地，玉米赤霉烯酮衍生物或类似物为对生物系统具有与玉米赤霉烯酮相同或相似影响的一种。优选地，“玉米赤霉烯酮影响”涉及玉米赤霉烯酮暴露。
如本文所用“测试样品”优选涉及一种样品，对于该样品，应确定其是否已与ZEN(或ZEN类似物或衍生物)接触或自其获得该样品的受试者是否已暴露于ZEN(或ZEN类似物或衍生物)。因此，本发明的方法可包括提供测试样品的步骤(b)。
参照值可以对应于根据本发明的所述至少一种miRNA的表达水平，所述表达水平在一种或多种对照样品中测定。根据样品的类型，此类对照样品可能已经接触过(优选已知量的)ZEN或ZEN类似物或衍生物，或为未接触过ZEN或ZEN类似物或衍生物的对照样品。此类对照样品可自已经暴露于(优选已知量的)ZEN或ZEN类似物或衍生物的受试者获得，或可自未暴露于ZEN或ZEN类似物或衍生物的受试者获得。因此，使样品与不可生物利用的ZEN或ZEN类似物或衍生物(如由于它们与阻止ZEN或ZEN类似物或衍生物与生物系统相互作用的另一物质结合)接触，或使受试者暴露于不可生物利用的ZEN或ZEN类似物或衍生物，相当于未使ZEN或ZEN类似物或衍生物与样品接触或未使受试者暴露于ZEN或ZEN类似物或衍生物。参照值也可以是在多个对照样品中测定的平均(average/mean)值。根据本发明所述的至少一种miRNA可选自ssc-miR-1、ssc-miR-125a、ssc-miR-125b、ssc-miR-127、ssc-miR-129a、ssc-miR-133a-5p、ssc-miR-135、ssc-miR-136、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-146b、ssc-miR-181c、ssc-miR-182、ssc-miR-183、ssc-miR-187、ssc-miR-195、ssc-miR-204、ssc-miR-206、ssc-miR-22-3p、ssc-miR-22-5p、ssc-miR-335、ssc-miR-34a、ssc-miR-369、ssc-miR-378、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-486、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-493-5p、ssc-miR-497、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-708-3p、ssc-miR-758、ssc-miR-7135-3p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-301a-5p、put-miR-300。优选地，根据本发明所述的至少一种miRNA可选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-129a-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-182、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-183、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-7135-3p、ssc-miR-204、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-187、ssc-miR-335、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-497。本发明的至少一种miRNA还可以是选自上述的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、或甚至更多种、或全部miRNA的组合。
优选地，根据本发明所述的至少一种miRNA选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-129a-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-182、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-183和ssc-miR-140-3p。本发明的至少一种miRNA还可以是选自上述的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种或全部15种miRNA的组合。由此，可以以特别高的可靠性测定玉米赤霉烯酮影响。优选地，根据本发明所述的至少一种miRNA选自ssc-miR-542-3p、ssc-miR-1、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-432-5p和ssc-miR-455-5p。本发明的至少一种miRNA还可以是选自上述的2种、3种、4种、5种或全部6种miRNA的组合。选自上述的2种miRNA的优选组合包括选自ssc-miR-542-3p和ssc-miR-1、ssc-miR-542-3p和ssc-miR-493-3p、ssc-miR-135和ssc-miR-432-5p以及ssc-miR-455-5p和ssc-miR-493-3p的配对。优选的组合还可包含上述配对的2种、3种或4种。由此可以增加所述方法结果的精确度。
优选地，根据本发明所述的至少一种miRNA选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-7135-3p、ssc-miR-204、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-187、ssc-miR-335、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p和ssc-miR-497。本发明的至少一种miRNA还可以是选自上述的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或全部16种miRNA的组合。优选地，根据本发明所述的至少一种miRNA为ssc-miR-542-3p和/或ssc-miR-1。
除非另有说明，否则在整个申请中，miRNA由2014年6月21日发布的版本中的miRBase序列数据库的登录号表示(Kozomara A,Griffiths-Jones S.Nucleic AcidsRes.2014 42:D68-D73；Kozomara A,Griffiths-Jones S.Nucleic Acids Res.2011 39:D152-D157；Griffiths-Jones S,Saini HK,van Dongen S,Enright AJ.Nucleic AcidsRes.2008 36:D154-D158；Griffiths-Jones S,Grocock RJ,van Dongen S,Bateman A,Enright AJ.Nucleic Acids Res.200634:D140-D144；Griffiths-Jones S.Nucleic AcidsRes.2004 32:D109-D111)。以下表格中汇总了一些本发明的miRNA。
Figure BDA0003197690610000071
Figure BDA0003197690610000081
Figure BDA0003197690610000091
本发明的方法还包括将在测试样品中测定的至少一种miRNA的水平与参照值进行比较。如果所述至少一种miRNA包含大于一种miRNA，那么比较这些miRNA之间的水平可包括比较所述miRNA中两种之间的比率。例如，当所述至少一种miRNA包含选自以下组的2种、3种、4种或5种miRNA时，所述组包含ssc-miR-542-3p、ssc-miR-1、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-432-5p和ssc-miR-455-5p的至少一些、优选全部，或由其组成，比较水平可以是指比较ssc-miR-542-3p和ssc-miR-1之间、ssc-miR-542-3p和ssc-miR-493-3p之间、ssc-miR-135和ssc-miR-432-5p之间和/或ssc-miR-455-5p和ssc-miR-493-3p之间的比率。比较水平还可以指比较图7所示的任意miRNA配对之间的比率。
比较所述至少一种miRNA的水平可以是基于比较一种或多种miRNA的个体值。例如，测试样品与参照值之间miRNA的表达水平的偏差可指示玉米赤霉烯酮影响(例如玉米赤霉烯酮暴露)，特别是当参照值对应于未接触过玉米赤霉烯酮或自未暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中所述miRNA的表达水平。表达水平的偏差可能指示玉米赤霉烯酮暴露。可以以正常比例，或优选地以log-倍数比例，比如log2倍比例表示偏差。优选地，偏差具有统计学显著性。用于测试结果的统计显著性的一些技术是技术人员已知的，并且选择和应用最合适的方法来分析统计学显著性在本领域技术人员的技术范围内。统计学显著性可以以如p-值或FDR p调整值来表示，所述显著性水平可以为≤0.07，优选地为≤0.05，或更优选地为≤0.001。偏差可以是增加或降低。与对应于未接触过玉米赤霉烯酮或自未暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的样品的参照值相比，指示ZEN暴露的偏差可以为如至少约1.3-倍，更优选地至少约1.5-倍和最优选地至少约2-倍。
可选地，当参照值对应于在已接触过ZEN或ZEN类似物或ZEN衍生物的或自已暴露于ZEN或ZEN类似物或ZEN衍生物的受试者获得的对照样品中测定的表达水平，则测试样品的值与参照值之间的无偏差、非显著的偏差或(不典型的)低偏差可指示玉米赤霉烯酮影响，比如玉米赤霉烯酮暴露。
当在本文中用在检测玉米赤霉烯酮影响的上下文时，术语“检测”一般指定量或定性检测。例如，“检测”可指定性检测，如基于比较步骤检测是否存在玉米赤霉烯酮影响。“检测”还可指定量检测，如基于比较步骤检测玉米赤霉烯酮影响的程度。
如本文所用“样品”是指生物样品。样品可包含细胞。可以从受试者获得样品。生物样品包括、但不限于，血液、血清、外周血单核细胞(PBMC)、尿液、粪便、精液或诸如子宫组织的组织。为了能够快速检测受试者中ZEN暴露并由此实现该领域的最大适用性，优选地，检测方法适用于能够以尽可能少的努力获得的样品。因此，优选地，所述样品为血液样品，特别地为血清样品。通过提供一种其中以血清样品为样品的方法，可以最方便地评估受试者潜在的ZEN暴露。可以通过如颅腔静脉(vena cava cranialis)或颈静脉(vena jugalaris)的点刺(punctuation)获得样品。可以将血清样品储存在-80℃下以用于之后的分析。另一优选的样品是子宫样品。样品还可以是细胞培养物样品。细胞培养物样品可包含完整的细胞，但也可以包含破坏的细胞和/或完整或破坏的细胞的上清，或由其组成。包含在细胞培养物中的细胞可表达雌激素受体α和/或β，优选表达诸如人或猪的哺乳动物的雌激素受体α和/或β。用于细胞培养物样品的优选细胞系可以是MCF-7、T47D、SUM159、HeLa或Ishikawa。此外，诸如如猪颗粒细胞的原代细胞可以是细胞培养样品的优选细胞。
当样品为子宫组织样品时，优选地所述至少一种miRNA选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-7135-3p、ssc-miR-204、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-187、ssc-miR-335、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p和ssc-miR-497，其中优选地，所述至少一种miRNA为ssc-miR-542-3p和/或ssc-miR-1。
当样品为诸如血清样品的血液样品时，所述至少一种miRNA可选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-129a-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-182、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-183和ssc-miR-140-3p，优选地选自ssc-miR-542-3p、ssc-miR-1、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-432-5p和ssc-miR-455-5p。
可还以基于比较多种miRNA的单个值来比较所述至少一种miRNA的水平。在此，可以将测试样品的表达水平和参照值的相对(或次优选的绝对)偏差组合以得到比仅比较一种miRNA的水平甚至更显著的结果。可选地，根据在玉米赤霉烯酮影响的情况下的预期偏差方向，偏差值可以彼此相乘或相除。
比较所述至少一种miRNA的水平还涉及两种miRNA的比率的比较。可以通过如本领域技术人员已知的将一种miRNA的水平除以第二种miRNA的水平来测定比率。发明人发现，如前所述的miRNA比率偏差的测定允许在暴露于玉米赤霉烯酮(ZEN)的样品和未暴露于玉米赤霉烯酮(ZEN)的样品之间进行令人惊讶的良好区分。如果通过qPCR分析单个测量的miRNA，一种可能的方式是通过测定每个miRNA的ΔCt(如Ct miRNA–Ct UniSp4)以计算比率来计算比率。作为示例性实例，可以通过ΔCt miRNA 135a–ΔCt miRNA 1a来计算miR-135a与miR-1a之间的比率。
当两种miRNA之间的表达水平的至少一个比率为选自miR-542-3p和miR-1、miR542-3p和miR493-3p、miR-135a-5p和miR-432-5p以及miR-455-5p和miR-493-3p之间的比率时，可以实现非常好的ZEN影响检测。如果用于区分ZEN暴露与非ZEN暴露的接受者操作特性(ROC)分析(Grund和Sabin.2010.Current Opinion in HIV and AIDS,5,473-479)得到大于或等于0.7的曲线下面积(AUC)值，则可以认为该比率是本文所述方法所优选的。可选地或另外地，与未接触ZEN的或自未暴露于ZEN的受试者获得的样品相比，含ZEN样品中miRNA比率的倍数改变优选地为至少约1.3倍，更优选地为至少约1.5倍，最优选地为至少约2倍。倍数改变可以是正向的也可以是负向的，即与对照样品相比上调或下调。至少一种miRNA的水平甚至更优选地包含选自miR-542-3p和miR-1、miR-542-3p和miR-493-3p、miR-135a-5p和miR-432-5p以及miR-455-5p和miR-493-3p的两种miRNA之间的表达水平的至少一个比率。由此，可以以特别好的可靠性和重现性检测ZEN暴露。
还可以，特别是当涉及多种miRNA时，采用复合方法，比如计算机辅助方法，特别是涉及机器学习的方法来进行所述至少一种miRNA的水平与参照值的比较。作为示例性实例，可以将人工神经网络系统用于对表达水平与参照值进行比较。可以通过提供一种或多种参照值的值来训练神经网络，这些参照值可以对应于来自一种或多种样品的miRNA水平。优选地，ZEN暴露的参照值和非ZEN暴露的参照值两者都可以用于训练神经网络。然后，经训练的神经网络可用于检测玉米赤霉烯酮影响。基于此目的，可以将测试样品的各miRNA的miRNA水平的值作为神经网络的输入，并且神经网络可以提供玉米赤霉烯酮影响的指示，比如定性信息、定量信息、得分、概率或可用于检测或表征玉米赤霉烯酮影响的任何其他类型的信息。本领域技术人员熟知构建、训练和应用神经网络的方法。其它(计算机辅助)方法也可以适用于在本发明中应用并且也是技术人员已知的，比如如Bayesian网络或决策树。
通常，比较步骤(d)的结果可以是指示样品是否已与ZEN(或ZEN类似物或衍生物)接触或自其获得样品的受试者是否已暴露于ZEN(或ZEN类似物或衍生物)的任何类型的信息。该种信息可以是定性信息、定量信息、得分、概率或任何其它类型的有用信息。因此，本发明的方法可包括提供与玉米赤霉烯酮影响有关的信息的另外的步骤(e)。该信息可以由技术人员已知的任何合适手段提供。
如本文所用的“受试者”是指脊椎动物，优选哺乳动物。如本文所用的术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括、但不限于人，家养和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，比如绵羊、狗、马、猫、牛、大鼠、猪，灵长类动物比如食蟹猴，仅举几个示例性的实例。优选的受试者为猪(Sus)属，优选地为野猪(Sus scrofa)种。另一优选的受试者为人。
尤其是在哺乳动物受试者中，ZEN影响，特别是暴露于ZEN，本身表现为不良健康影响(比如生殖和生育障碍)，并且在猪(Sus)属受试者中以特别显著的方式表现出来。为了能够在所述受试者中最快速地检测ZEN影响，本发明还涉及如上所述的方法，其中受试者优选为哺乳动物，更优选地为猪(Sus)属的哺乳动物。
本发明的方法还可以用于诊断，特别是用于诊断受试者的玉米赤霉烯酮暴露。此类方法的目的可能是确定受试者的身体状况，以便决定是否采取或采取何种措施以便保持或改善受试者的健康。
本发明的方法也可以是非诊断性的。作为示例性实例，非诊断性方法可以是饲料取样方法。由于饲料中霉菌毒素的非均匀分布和用于此分析的典型样本量，因此饲料取样通常不是很准确。由于受试者(如猪)对饲料的摄取量相对较大，因此与直接分析饲料相比，确定受试者的ZEN暴露可能给出更可靠的饲料是否被玉米赤霉烯酮污染的测试结果。因此，本发明的方法可以是用于检测饲料或食品中的玉米赤霉烯酮的方法。本发明的方法还可包括，在自受试者获得测试样品之前，用怀疑含有玉米赤霉烯酮的饲料饲喂所述受试者的步骤(a)。
为了避免长期暴露于玉米赤霉烯酮的不良后果，在于受试者中检测到玉米赤霉烯酮影响的情况下，用ZEN中和试剂处理ZEN污染的饲料或食品，或应用ZEN中和方法可能是必要的。因此，本发明进一步涉及一种如上所述的方法，其中所述方法用于选择用于与玉米赤霉烯酮中和试剂接触或用于应用玉米赤霉烯酮中和方法的食品或饲料。通过应用所描述的用于选择用于与ZEN中和试剂接触或用于应用ZEN中和方法的食品或饲料的方法，至少可以减轻或完全避免不良健康影响。因此，本发明的方法可包括步骤(a)：在自受试者获得测试样品之前，用怀疑含有玉米赤霉烯酮的饲料饲喂所述受试者。本发明的方法还可包括步骤(f)：如果所述测试样品和对照样品之间至少一种miRNA的表达水平的偏差指示玉米赤霉烯酮暴露，那么选择所述饲料以用于与玉米赤霉烯酮中和试剂接触或以用于应用玉米赤霉烯酮中和方法。因此，本发明的方法可包括提供玉米赤霉烯酮中和试剂或应用玉米赤霉烯酮中和方法。本发明的方法还可包括使通过所述方法选择的饲料或食品与玉米赤霉烯酮中和试剂接触或对所述饲料应用玉米赤霉烯酮中和方法。
玉米赤霉烯酮中和试剂或玉米赤霉烯酮中和方法可指一种如通过改变其分子结构来降解玉米赤霉烯酮的试剂或方法，上述改变分子结构可以通过与玉米赤霉烯酮中和试剂的化学、酶或物理相互作用引起。此类处理的结果可能是毒性较小的分子。玉米赤霉烯酮中和试剂或玉米赤霉烯酮中和方法还可降低玉米赤霉烯酮的生物利用度，如使玉米赤霉烯酮对于受试者，优选是对于受试者的消化系统不可用。这可以通过，例如结合或吸附玉米赤霉烯酮的试剂实现。一般而言，玉米赤霉烯酮中和试剂可以是任何合适类型的试剂，其可选自一种或多种多肽、一种或多种微生物和一种或多种玉米赤霉烯酮-结合试剂。
玉米赤霉烯酮还可以是能够转化玉米赤霉烯酮或其衍生物或类似物的α/β-水解酶。本领域技术人员已知各种α/β-水解酶，其特别描述于Lenfant等，(2013)‘ESTHER,thedatabase of theα/β-hydrolase fold superfamily of proteins:tools to explorediversity of functions’Nucleic Acids Research,Volume41,Issue D1,D423–D429和Mindrebo等，(2016)‘Unveiling the functional diversity of the Alpha-Betahydrolase fold in plants’Curr Opin Struct Biol.233–246中。简言之，所有的α/β-水解酶均具有称为α/β-折叠(alpha/beta-折叠)的特定折叠的特征。该种α/β-折叠是许多系统起源和催化功能差别很大的水解酶所共有的。每种酶的核心是α/β-结构(而非桶)，其含有由α-螺旋(aA-aF)连接的8条β-链(b1-b8)(Ollis等，(1992)‘The alpha/beta hydrolasefold‘Protein Eng.5(3):197-211)。因此，如本文所述的α/β-水解酶可包含α/β-折叠。优选地，如本文所述的α/β-水解酶包含排列成中央β-折叠的8条β链(b1-b8)组成的α/β-水解酶核心结构域，并另外包含6个交叉的α-螺旋(aA-aF)。
在Kourist等，(2010)‘The alpha/beta-hydrolase fold 3DM database(ABHDB)as a tool for protein engineering.’Chembiochem.11(12):1635-43)中特别描述了α/β-水解酶不同类别的成员以及它们的结构特征。
作为酶，通常将α/β-水解酶描述为负责酯键和肽键的水解。然而，α/β-水解酶还参与碳-碳键的断裂，脱羧反应和杂芳环的无辅助因子的双氧化。因此，α/β-水解酶可以包括该超家族的催化成员(酶)。非限制性实例为水解酶(乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、双烯内酯水解酶、脂肪酶、角质酶、硫酯酶、丝氨酸羧肽酶、脯氨酸亚氨基肽酶、脯氨酸寡肽酶、环氧化物水解酶)以及需要HCN、H2O2或O2而非H2O的活化以用于反应机制的酶(卤代烷烃脱卤素酶、卤代过氧化物酶、羟基腈裂解酶)。非催化成员可包括神经连接蛋白、谷蛋白(glutactin)、神经趋化因子(neurotactin)、甲状腺球蛋白的C-末端结构域、卵黄蛋白、CCG1-相互作用-因子-B和二肽氨基肽酶VI。
ESTHER数据库收集并注释了与该超家族的基因和蛋白质序列相关的公开信息。因此，本领域技术人员还可自ESTHER(http://bioweb.supagro.inra.fr/ESTHER/general？what＝index)(α/β-水解酶折叠超家族蛋白的数据库)获得α/β-水解酶。
如本文所用的α/β-水解酶可包含SEQ ID NO:45的序列或与SEQ ID NO:45的序列具有60％或更高序列同一性的序列。因此，包含该序列的任何α/β-水解酶均包含在术语α/β-水解酶中。
另外地或可选地，如本文所用的α/β-水解酶还可包含SEQ ID NO:46的序列或与SEQ ID NO:46的序列具有60％或更高序列同一性的序列。因此，包含该序列的任何α/β-水解酶均包含在术语α/β-水解酶中。
另外地或可选地，如本文所用的α/β-水解酶还可包含SEQ ID NO:47、48或49的序列或与SEQ ID NO:47、48或49的序列具有60％或更高序列同一性的序列。因此，包含该序列的任何α/β-水解酶均包含在术语α/β-水解酶中。
另外地或可选地，如本文所用的α/β-水解酶还可包含SEQ ID NO:50的序列或与SEQ ID NO:50的序列具有60％或更高序列同一性的序列。因此，包含该序列的任何α/β-水解酶均包含在术语α/β-水解酶中。
例如，α/β-水解酶可包含与SEQ ID NO:45的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的序列。可选地或另外地，α/β-水解酶可包含与SEQ ID NO:46的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的序列。可选地或另外地，α/β-水解酶可包含与SEQ ID NO:47、48和/或49的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的序列。可选地或另外地，α/β-水解酶可包含与SEQ ID NO:50的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的序列。
SEQ ID NOs:45-50的序列示于下表。
Figure BDA0003197690610000151
Figure BDA0003197690610000161
Figure BDA0003197690610000171
在两条或更多条多肽序列(比如SEQ ID NO:45-50)的上下文中的术语“同一的”或“同一性百分比”指当在比较窗口上或在测量的指定区域上采用本领域已知的序列比较算法或通过手动比对和目视检查进行最大对应性的比较和比对时，两条或更多条序列或子序列相同或具有相同的特定百分比的氨基酸(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)。将具有例如80％至95％或更高的序列同一性的序列认为基本上是同一的。本领域技术人员将知道如何使用例如基于如本领域已知的CLUSTALW计算机程序(ThompsonNucl.Acids Res.2(1994),4673-4680)或FASTDB(Brutlag Comp.App.Biosci.6(1990),237-245)的那些来测定序列间/中的同一性百分比。
本领域技术人员还可用的是BLAST和BLAST 2.6算法(Altschul Nucl.AcidsRes.25(1977),3389-3402)。用于氨基酸序列的BLASTP程序使用默认的字长(W)6，期望阈值10和两条链都进行比较。此外，还可使用BLOSUM62评分矩阵(HenikoffProc.Natl.Acad.Sci.,USA,89,(1989),10915；Henikoff和Henikoff(1992)‘Amino acidsubstitution matrices from protein blocks.‘Proc Natl Acad Sci U S A.1992Nov15；89(22):10915-9)。
例如，可以将代表基本局部比对搜索工具的BLAST2.6(Altschul,Nucl.AcidsRes.25(1997),3389-3402；Altschul,J.Mol.Evol.36(1993),290-300；Altschul,J.Mol.Biol.215(1990),403-410)用于搜索局部序列比对。
玉米赤霉烯酮中和试剂还可以是如Qi L等，Food Addit Contam Part A ChemAnal Control Expo Risk Assess.2016Nov；33(11):1700-1710中所述的臭氧。玉米赤霉烯酮中和试剂还可以是一种微生物，比如如Kosawang C等，Fungal Biol.2014Apr；118(4):364-73所述的粉红黏帚霉(Clonostachys rosea)，或如Arunrussamee Sangsila等，FoodControl,Volume 62,April 2016,Pages187-192所述的戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)，或酵母菌株，比如如Schatzmayr等，Mycot.Res.2003 19:124-128所述的解毒毛孢酵母MTV(Trichosporon mycotoxinivorans MTV)。此外，如Zinedine A等，Food ChemToxicol.2007Jan；45(1):1-18或Ji C等，Animal Nutrition Volume 2,Issue 3,2016,Pages 127-133描述了其它的玉米赤霉烯酮中和试剂。
如上所述，玉米赤霉烯酮中和试剂还可以通过如结合和/或吸附降低玉米赤霉烯酮的生物利用度。此类试剂的实例包括考来烯胺、二乙烯基苯-苯乙烯、膨润土、富含蒙脱石的粘土、沸石、有机粘土、活性炭、酵母或酵母细胞壁衍生产品。
玉米赤霉烯酮中和方法可包括、但不限于使玉米赤霉烯酮中和试剂与饲料接触的方法。该方法还可包括热处理或超声波处理。
由于缺乏合适的方法来允许测定所应用的霉菌毒素中和试剂或霉菌毒素中和方法是否达到了预期的效果，因此对霉菌毒素中和试剂或霉菌毒素中和方法的功效和/或效率的评估提出了相当大的挑战。因此，本发明的方法还可用于评估方法或(测试)化合物中和ZEN的能力的目的。换言之，本发明的方法可用于评估方法或化合物中和ZEN的能力。此类化合物可以选自一种或多种多肽、一种或多种微生物和一种或多种玉米赤霉烯酮-结合试剂，所述一种或多种微生物包括活的、死亡的、冻干的、自溶性和/或休眠的微生物，所述一种或多种玉米赤霉烯酮-结合试剂包括有机和/或无机玉米赤霉烯酮-结合试剂。通过使用本发明的方法，可以以特别快速的方式实现对ZEN中和试剂或ZEN中和方法的功效和/或效率的评估。
在已经从受试者获得样品的情况下，本发明的方法由此可以包括在从受试者获得测试样品之前的用与玉米赤霉烯酮和测试化合物接触的饲料饲喂受试者的步骤(a3)。在这种情况下，所述方法可进一步包括使饲料与玉米赤霉烯酮接触、使饲料与测试化合物接触、和/或使玉米赤霉烯酮与测试化合物接触的步骤。一般而言，这些步骤可以以任何顺序实施。因此，所述方法可包括在步骤(a3)之前的如下步骤：(a1)使饲料与玉米赤霉烯酮接触；和(a2)使与玉米赤霉烯酮接触的饲料与测试化合物接触；或(a1’)使饲料与测试化合物接触，和(a2’)使与测试化合物接触的饲料与玉米赤霉烯酮接触；或(a1”)使玉米赤霉烯酮与测试化合物接触，和(a2”)使与测试化合物接触的玉米赤霉烯酮与饲料接触。
在一些情况下(其可能是测试样品为细胞培养物的情况)，该样品可已与玉米赤霉烯酮和测试化合物直接接触。在此类方法中使用的对照样品可以是阴性对照样品或阳性对照样品。在该上下文中使用的阴性对照样品是指已经与玉米赤霉烯酮和任选地不中和玉米赤霉烯酮的化合物接触的样品。在该上下文中使用的阳性对照样品是指已经与玉米赤霉烯酮和中和玉米赤霉烯酮的化合物接触的样品，或未与玉米赤霉烯酮接触的样品。在此类方法中，测试样品与阳性对照样品之间表达水平不存在偏差或表达水平的非显著的偏差可以指示测试化合物中和玉米赤霉烯酮的能力。可选地或任选地，测试样品与阴性对照样品之间存在表达水平的(优选显著的)偏差可以指示测试化合物中和玉米赤霉烯酮的能力。在此类方法中，样品可以是非从受试者获得的样本。
为了避免时间、劳动和成本密集的动物试验，优选地在培养的细胞中进行研究实验。因此，测试样品、阳性对照样品和/或阴性对照样品可以是细胞培养物。作为说明性实例，细胞培养物可包含MCF-7、T47D、SUM159、HeLa或Ishikawa。此外，可以使诸如如猪颗粒细胞的原代细胞包含在细胞培养物中。通过提供一种如本文所述的方法，其中测试样品、诸如阳性对照样品或阴性对照样品的对照样品为细胞培养物，可以以特别有效的方式获得如方法或化合物中和ZEN的能力的有价值的数据。
本发明还涉及根据本发明所述的至少一种miRNA用于检测测试样品中玉米赤霉烯酮影响的用途。所述至少一种miRNA可选自ssc-miR-1、ssc-miR-125a、ssc-miR-125b、ssc-miR-127、ssc-miR-129a、ssc-miR-133a-5p、ssc-miR-135、ssc-miR-136、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-146b、ssc-miR-181c、ssc-miR-182、ssc-miR-183、ssc-miR-187、ssc-miR-195、ssc-miR-204、ssc-miR-206、ssc-miR-22-3p、ssc-miR-22-5p、ssc-miR-335、ssc-miR-34a、ssc-miR-369、ssc-miR-378、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-486、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-493-5p、ssc-miR-497、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-708-3p、ssc-miR-758、ssc-miR-7135-3p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-301a-5p、put-miR-300。优选地，根据本发明所述的至少一种miRNA可选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-129a-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-182、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-183、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-7135-3p、ssc-miR-204、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-187、ssc-miR-335、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-497。所述用途可以在本发明的任何方法中使用。此类用途可以用于以下目的：检测受试者的玉米赤霉烯酮暴露，评估测试化合物或方法中和玉米赤霉烯酮的能力，或选择用于采用玉米赤霉烯酮中和试剂或玉米赤霉烯酮中和方法处理的食品。通过将如本文所述的至少一种miRNA用于检测测试样品中玉米赤霉烯酮影响，可以以尤其高的可靠性和特异性检测ZEN影响。
为了允许快速反应(比如如在ZEN暴露的情况下提供对抗试剂)，需要测试结果的快速可用性(availability)。例如，如果用集成系统测定测试样品中至少一种miRNA的表达水平并将表达水平与参照值进行比较，就可以实现上述目标。因此，本发明的方法可以是计算机执行的方法，这些方法可以通过用于实施这些方法的装置来实施。
因此，本发明还涉及一种数据处理系统，包括被配置为执行包括以下步骤的方法的处理器：将在自受试者获得的测试样品中测定的根据本发明所述的至少一种miRNA的表达水平与参照值进行比较。需要输入关于至少一种miRNA的表达水平。该信息将经由一种能够确定此类信息的装置传送至数据处理系统，如通过一些传输介质，比如通过电线或电缆，通过光纤或经由电磁辐射。此类装置可以整合在数据处理系统中或与其相连接。还可以将关于至少一种miRNA的表达水平的信息经由通过用户界面的输入传送至数据处理系统。如果参照值对应于自未暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中所述miRNA的表达水平，则测试样品与参照值之间miRNA的表达水平的(显著)偏差可以指示玉米赤霉烯酮影响(比如玉米赤霉烯酮暴露)。在此类情况下，所述方法可包括如果测定到偏差，则指示受试者的玉米赤霉烯酮暴露。可选地，如果参照值对应于在自已暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中测定的表达水平，则测试样品的值与参照值之间的无偏差可以指示玉米赤霉烯酮影响，比如玉米赤霉烯酮暴露。在此类情况下，所述方法可包括如果测定到无偏差或无显著的偏差，则指示受试者的玉米赤霉烯酮暴露。在本上下文中“无偏差”还可涵盖非显著的偏差，或(不典型的)低偏差。所述至少一种miRNA可选自ssc-miR-1、ssc-miR-125a、ssc-miR-125b、ssc-miR-127、ssc-miR-129a、ssc-miR-133a-5p、ssc-miR-135、ssc-miR-136、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-146b、ssc-miR-181c、ssc-miR-182、ssc-miR-183、ssc-miR-187、ssc-miR-195、ssc-miR-204、ssc-miR-206、ssc-miR-22-3p、ssc-miR-22-5p、ssc-miR-335、ssc-miR-34a、ssc-miR-369、ssc-miR-378、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-486、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-493-5p、ssc-miR-497、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-708-3p、ssc-miR-758、ssc-miR-7135-3p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-301a-5p、put-miR-300。优选地，根据本发明所述的至少一种miRNA可选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-129a-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-182、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-183、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-7135-3p、ssc-miR-204、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-187、ssc-miR-335、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-497。
理想地，数据处理系统与能够确定测试样品中根据本发明所述的至少一种miRNA的表达水平的装置连接，或整合于其中。所述装置可以为数据处理系统提供与所述至少一种miRNA的表达水平有关的信息。此类装置可以例如为测序装置，比如定量实时测序装置。测序装置是本领域技术人员已知的并为如通过Illumina、Pacific Biosciences、OxfordNanopore Technologies等商购可获得的。特别有用的是便携式测序装置，比如MinION测序(Oxford Nanopore Technologies)。能够确定根据本发明所述的至少一种miRNA的表达水平的装置还可以是微阵列读数器。
因此，本发明还涉及能够确定根据本发明所述的至少一种miRNA的水平的测序装置，包括本发明的数据处理系统。所述至少一种miRNA可选自ssc-miR-1、ssc-miR-125a、ssc-miR-125b、ssc-miR-127、ssc-miR-129a、ssc-miR-133a-5p、ssc-miR-135、ssc-miR-136、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-146b、ssc-miR-181c、ssc-miR-182、ssc-miR-183、ssc-miR-187、ssc-miR-195、ssc-miR-204、ssc-miR-206、ssc-miR-22-3p、ssc-miR-22-5p、ssc-miR-335、ssc-miR-34a、ssc-miR-369、ssc-miR-378、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-486、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-493-5p、ssc-miR-497、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-708-3p、ssc-miR-758、ssc-miR-7135-3p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-301a-5p、put-miR-300。优选地，根据本发明所述的至少一种miRNA可选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-129a-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-182、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-183、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-7135-3p、ssc-miR-204、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-187、ssc-miR-335、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-497。
本发明还涉及一种计算机程序，包括使本文所述的数据处理系统或本文所述的测序装置执行以下步骤的指令：(a)将在自受试者获得的测试样品中测定的根据本发明所述的至少一种miRNA的表达水平与参照值进行比较；和(b)如果测定到偏差，则指示受试者的玉米赤霉烯酮暴露，其中所述参照值对应于在自未暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中测定的表达水平；或如果测定到无偏差，则指示受试者的玉米赤霉烯酮暴露，其中所述参照值对应于在自已暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中测定的表达水平。当将计算机程序加载到数据处理系统中并由其执行时，数据处理系统变成了用于执行本文所述的方法的设备。
计算机程序可以是可从计算机可用或计算机可读介质访问的计算机程序产品，该计算机可用或计算机可读介质提供供计算机或任何指令执行系统使用或与其结合使用的程序代码。因此，本发明还涉及一种其上存储了本文公开的计算机程序的计算机可读介质。计算机可用或计算机可读介质可以是可包含存储、通信、传播或传输程序以供指令执行系统、设备或装置使用或与其结合使用的任何设备。所述介质可以是电子、磁、光、电磁、红外线、半导体或纸系统(或设备或装置)或传播介质。所述介质可以是任何合适的有形介质，比如磁盘、CD、DVD、BD、硬盘驱动器、记忆棒、存储卡或任何其他计算机可读存储介质。
为了实现ZEN暴露的特别具有成本效益且快速的检测，提供一种用于实施本发明意义上的检测ZEN影响的方法的试剂盒，该试剂盒包含针对本发明的至少一种miRNA的特异性结合试剂，其中所述特异性结合试剂包含在固体支持物上或缀合至固体支持物。所述至少一种miRNA可选自ssc-miR-1、ssc-miR-125a、ssc-miR-125b、ssc-miR-127、ssc-miR-129a、ssc-miR-133a-5p、ssc-miR-135、ssc-miR-136、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-146b、ssc-miR-181c、ssc-miR-182、ssc-miR-183、ssc-miR-187、ssc-miR-195、ssc-miR-204、ssc-miR-206、ssc-miR-22-3p、ssc-miR-22-5p、ssc-miR-335、ssc-miR-34a、ssc-miR-369、ssc-miR-378、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-486、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-493-5p、ssc-miR-497、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-708-3p、ssc-miR-758、ssc-miR-7135-3p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-301a-5p、put-miR-300。优选地，根据本发明所述的至少一种miRNA可选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-129a-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-182、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-183、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-7135-3p、ssc-miR-204、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-187、ssc-miR-335、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-497。所述试剂盒可包含针对至少一种miRNA的未标记的特异性结合配偶体和标记的特异性结合配偶体。优选地，未标记的特异性结合配偶体缀合至固体支持物。所述试剂盒可包含针对不大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26种miRNA的特异性结合配偶体。在一些应用中，所述试剂盒可包含针对不大于24、48、96或384种miRNA的特异性结合配偶体。所述试剂盒可包含针对不大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26种根据本发明的方法所述的miRNA的特异性结合配偶体。所述试剂盒可仅包含针对根据本发明的方法所述的miRNA的特异性结合配偶体。
此类试剂盒可用于横向流动测试。横向流动装置的示意图如图8所示。所述试剂盒可包含横向流动装置(LFD)，其包含载体(固体支持物)，所述载体(固体支持物)包含至少两个区域，即缀合垫和测试区。所述缀合垫包含针对根据本发明所述的至少一种miRNA的标记的结合试剂，其可以固定在溶剂(如包含靶分子的溶剂)中并可在该溶剂中被转运至测试区。所述测试区包含未标记的结合试剂，该结合试剂也能够结合靶分子。由此，被来自缀合垫的标记的试剂结合的靶标(至少一种miRNA)也就被固定在测试区。可选的另外的对照区可包含另一固定的结合试剂，其能够结合来自缀合垫的未被保留在测试区的标记的结合试剂。横向流动装置的实例描述在Koczula和Gallotta.Essays Biochem.2016Jun 30；60(1):111-20或Krska和Molinelli.Anal Bioanal Chem.2009Jan；393(1):67-71中。
另外，可以通过ELISA，如Sandwich-ELISA进行免疫化学检测。因此，所述试剂盒可包含靶标miRNA的(优选未标记的)特异性结合试剂，所述特异性结合试剂可以固定在固体支持物或已固定在固体支持物上。可以将测试样品添加至该支持物上。另外，可以添加针对靶标miRNA的标记的结合试剂。然后，miRNA结合的标记可用于miRNA的定量。
所述特异性结合试剂可以例如为核酸、抗体、抗体的抗原结合片段或具有抗体样性质的蛋白质样分子。当将标记的和未标记的特异性结合配偶体均用在试剂盒中时，优选地两种结合配偶体可同时结合靶标miRNA。例如，若一个特异性结合配偶体可以结合(如杂交)靶标miRNA的一部分，而另一个特异性结合配偶体可以结合(如杂交)靶标miRNA的另一部分，那么则上述情况可以实现。
所述试剂盒可进一步包含用于检测与特异性结合试剂结合的miRNA的手段，所述特异性结合试剂比如本文所述的未标记的特异性结合试剂，优选地，所述特异性结合试剂缀合至固体支持物。此类手段可包括缀合至可检测标记的探针。例如，此类手段可以是如本文所述的标记的特异性结合试剂。一般而言，此类“可检测标记”可以是任何合适的化学物质或酶，它们在化学、物理、光学或酶促反应中直接或间接产生可检测的化合物或信号。例如，可以将荧光或放射性标记用于产生作为可检测信号的荧光或X-射线。可以将染料用于产生光信号。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶是催化显色反应产物形成的酶标记(同时也是光标记)的实例。优选地，标记不会负面影响该标记所缀合的结合配偶体的特性。优选的可检测标记为光学可检测标记，比如生色团或荧光标记。
本发明的特征还在于以下项目：
项目1、一种用于检测玉米赤霉烯酮影响的方法，包括：(c)测定测试样品中至少一种miRNA的表达水平，所述至少一种miRNA选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-129a-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-182、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-183、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-7135-3p、ssc-miR-204、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-187、ssc-miR-335、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-497；和(d)将所述表达水平与参照值进行比较。
项目2、根据项目1所述的方法，其中所述参照值对应于对照样品中所述至少一种miRNA的表达水平。
项目3、根据项目1或2所述的方法，其中所述玉米赤霉烯酮影响为玉米赤霉烯酮暴露。
项目4、根据前述项目中任一项所述的方法，其中自受试者获得所述测试样品。
项目5、根据前述项目中任一项所述的方法，其中与参照值的表达水平的偏差指示玉米赤霉烯酮暴露。
项目6、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述偏差包含根据项目1所述的miRNA中的至少一种的表达水平的升高和/或降低。
项目7、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述偏差包含根据项目1所述的miRNA中的至少两种的表达水平的至少一个比率的升高和/或降低。
项目8、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述偏差是统计学显著的。
项目9、根据前述项目中任一项所述的方法，其中自已暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得所述对照样品或所述对照样品为多个样品的平均值，其中自未暴露于玉米赤霉烯酮的一个或多个受试者获得所述多个样品。
项目10、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述样品为血液样品或组织样品。
项目11、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述样品为血清样品。
项目12、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-129a-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-182、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-183和ssc-miR-140-3p。
项目13、根据项目11或12所述的方法，其中所述至少一种miRNA包含选自ssc-miR-542-3p和ssc-miR-1、ssc-miR-542-3p和ssc-miR-493-3p、ssc-miR-135和ssc-miR-432-5p以及ssc-miR-455-5p和ssc-miR-493-3p的两种miRNA。
项目14、根据项目11至13中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA的表达水平包含两种miRNA之间的表达水平的至少一个比率，所述两种miRNA选自ssc-miR-542-3p和ssc-miR-1、ssc-miR-542-3p和ssc-miR-493-3p、ssc-miR-135和ssc-miR-432-5p以及ssc-miR-455-5p和ssc-miR-493-3p。
项目15、根据项目14所述的方法，其中所述两种miRNA之间的表达水平的至少一个比率选自ssc-miR-542-3p和ssc-miR-1、ssc-miR-542-3p和ssc-miR-493-3p、ssc-miR-135和ssc-miR-432-5p以及ssc-miR-455-5p和ssc-miR-493-3p之间的比率。
项目16、根据项目1至10中任一项所述的方法，其中所述样品为子宫组织样品。
项目17、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-7135-3p、ssc-miR-204、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-187、ssc-miR-335、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p和ssc-miR-497。
项目18、根据项目16或17所述的方法，其中所述至少一种miRNA包含miR-542-3p和miR-1。
项目19、根据项目18所述的方法，其中至少一种miRNA的表达水平包含miR-542-3p和miR-1之间的表达水平的比率。
项目20、根据项目4至19中任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
项目21、根据项目4至20中任一项所述的方法，其中所述受试者为猪(Sus)属的。
项目22、根据项目21所述的方法，其中所述受试者为野猪(Sus scrofa)种的。
项目23、根据前述项目中任一项所述的方法，进一步包括(e)提供与玉米赤霉烯酮影响有关的信息。
项目24、根据前述项目中任一项所述的方法，进一步包括(b)提供测试样品。
项目25、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法用于诊断。
项目26、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法用于玉米赤霉烯酮暴露的诊断。
项目27、根据项目1至24中任一项所述的方法，其中所述方法不用于诊断。
项目28、根据项目4至24和27中任一项所述的方法，其中所述方法用于饲料或食品中玉米赤霉烯酮的检测。
项目29、根据项目28所述的方法，其中所述方法包括在自所述受试者获得测试样品之前，(a)用怀疑含有玉米赤霉烯酮的饲料饲喂所述受试者。
项目30、根据项目4至24和27至29中任一项所述的方法，其中所述方法用于选择用于与玉米赤霉烯酮中和试剂接触或用于应用玉米赤霉烯酮中和方法的饲料。
项目31、根据项目29或30所述的方法，包括(a)在自所述受试者获得测试样品之前，用怀疑含有玉米赤霉烯酮的饲料饲喂所述受试者；和/或(f)如果所述测试样品和对照样品之间至少一种miRNA的表达水平的偏差指示玉米赤霉烯酮暴露，则选择所述饲料以用于与玉米赤霉烯酮中和试剂接触或以用于应用玉米赤霉烯酮中和方法。
项目32、根据项目30或31所述的方法，其中所述玉米赤霉烯酮中和试剂选自一种或多种多肽、一种或多种微生物和一种或多种玉米赤霉烯酮-结合试剂。
项目33、根据项目30至32中任一项所述的方法，进一步包括提供玉米赤霉烯酮中和试剂。
项目34、根据项目30至33中任一项所述的方法，进一步包括使通过所述方法选择的饲料或食品与玉米赤霉烯酮中和试剂接触，或对所述饲料应用玉米赤霉烯酮中和方法。
项目35、根据项目4至22和25至27中任一项所述的方法，其中所述方法用于评估方法或测试化合物中和玉米赤霉烯酮的能力。
项目36、根据项目35所述的方法，其中所述测试化合物选自一种或多种多肽、一种或多种微生物和一种或多种玉米赤霉烯酮-结合试剂。
项目37、根据项目35或36所述的方法，其中所述方法包括在自受试者获得测试样品之前，(a3)用与玉米赤霉烯酮和测试化合物接触的饲料饲喂受试者。
项目38、根据项目37所述的方法，其中所述方法包括在(a3)之前的如下步骤：(a1)使饲料与玉米赤霉烯酮接触；和(a2)使与玉米赤霉烯酮接触的饲料与测试化合物接触；或(a1’)使饲料与测试化合物接触，和(a2’)使与测试化合物接触的饲料与玉米赤霉烯酮接触；或(a1”)使玉米赤霉烯酮与测试化合物接触，和(a2”)使与测试化合物接触的玉米赤霉烯酮与饲料接触。
项目39、根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述方法用于评估方法或测试化合物中和玉米赤霉烯酮的能力。
项目40、根据项目39所述的方法，其中所述测试化合物选自一种或多种多肽、一种或多种微生物和一种或多种玉米赤霉烯酮-结合试剂。
项目41、根据项目39或40所述的方法，其中所述测试样品已与玉米赤霉烯酮和测试化合物接触。
项目42、根据项目39至41中任一项所述的方法，其中所述对照样品为阴性对照样品或阳性对照样品。
项目43、根据项目42所述的方法，其中测试样品与阳性对照样品之间不存在表达水平的偏差，或测试样品与阴性对照样品之间存在表达水平的偏差指示测试化合物中和玉米赤霉烯酮的能力。
项目44、根据项目40至43中任一项所述的方法，其中所述测试样品、对照样品、阳性对照样品或阴性对照样品为细胞培养物。
项目45、根据项目30至44中任一项所述的方法，其中中和通过降解进行。
项目46、根据项目30至44中任一项所述的方法，其中中和通过结和进行。
项目47、至少一种miRNA用于检测测试样品中玉米赤霉烯酮影响的用途，所述至少一种miRNA选自miR-1、miR-181c、miR-206、miR-503、miR-542-3p、miR-135、miR-135a-5p、miR-129a-3p、miR-142-3p、miR-432-5p、miR-455-5p、miR-182、miR-493-3p、miR-455-3p、miR-183、miR-140-3p、miR-7135-3p、miR-204、miR-143-5p、miR-187、miR-335、miR-424-5p、miR-450a、miR-450b-5p、miR-450c-5p、miR-497。
项目48、根据项目47所述的用途，其中所述用途用于检测受试者的玉米赤霉烯酮暴露。
项目49、一种数据处理系统，包括被配置为执行包括以下步骤的方法的处理器：(a)将在自受试者获得的测试样品中测定的至少一种miRNA的表达水平与参照值进行比较，所述至少一种miRNA选自miR-1、miR-181c、miR-206、miR-503、miR-542-3p、miR-135、miR-135a-5p、miR-129a-3p、miR-142-3p、miR-432-5p、miR-455-5p、miR-182、miR-493-3p、miR-455-3p、miR-183、miR-140-3p、miR-7135-3p、miR-204、miR-143-5p、miR-187、miR-335、miR-424-5p、miR-450a、miR-450b-5p、miR-450c-5p和miR-497；和(b)如果测定到偏差，则指示受试者的玉米赤霉烯酮暴露，其中所述参照值对应于在自未暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中测定的表达水平；或如果测定到无偏差，则指示受试者的玉米赤霉烯酮暴露，其中所述参照值对应于在自已暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中测定的表达水平。
项目50、一种能够测定至少一种miRNA的水平的测序装置，所述至少一种miRNA选自miR-1、miR-181c、miR-206、miR-503、miR-542-3p、miR-135、miR-135a-5p、miR-129a-3p、miR-142-3p、miR-432-5p、miR-455-5p、miR-182、miR-493-3p、miR-455-3p、miR-183、miR-140-3p、miR-7135-3p、miR-204、miR-143-5p、miR-187、miR-335、miR-424-5p、miR-450a、miR-450b-5p、miR-450c-5p和miR-497，所述装置包括项目49所述的数据处理系统。
项目51、一种计算机程序，包括使项目49所述的数据处理系统或项目50所述的测序装置执行以下步骤的指令：(b)将在自受试者获得的样品中测定的至少一种miRNA的表达水平与参照值进行比较，所述至少一种miRNA选自miR-1、miR-181c、miR-206、miR-503、miR-542-3p、miR-135、miR-135a-5p、miR-129a-3p、miR-142-3p、miR-432-5p、miR-455-5p、miR-182、miR-493-3p、miR-455-3p、miR-183、miR-140-3p、miR-7135-3p、miR-204、miR-143-5p、miR-187、miR-335、miR-424-5p、miR-450a、miR-450b-5p、miR-450c-5p和miR-497；和(c)如果测定到偏差，则指示受试者的玉米赤霉烯酮暴露，其中所述参照值对应于在自未暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中测定的表达水平；或如果测定到无偏差，则指示受试者的玉米赤霉烯酮暴露，其中所述参照值对应于在自已暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中测定的表达水平。
项目52、一种计算机可读介质，其具有储存于其上的项目51所述的计算机程序。
项目53、一种用于实施项目1至38中任一项所述的方法的试剂盒，包含针对至少一种miRNA的特异性结合试剂，所述至少一种miRNA选自miR-1、miR-181c、miR-206、miR-503、miR-542-3p、miR-135、miR-135a-5p、miR-129a-3p、miR-142-3p、miR-432-5p、miR-455-5p、miR-182、miR-493-3p、miR-455-3p、miR-183、miR-140-3p、miR-7135-3p、miR-204、miR-143-5p、miR-187、miR-335、miR-424-5p、miR-450a、miR-450b-5p、miR-450c-5p和miR-497，所述特异性结合试剂包含在固体支持物中或缀合至固体支持物。
项目54、根据项目53所述的试剂盒，其中所述特异性结合试剂为核酸、抗体、抗体的抗原结合片段或具有抗体样性质的蛋白质样分子。
项目55、根据项目53或54所述的试剂盒，进一步包含用于检测与特异性结合试剂结合的miRNA。
项目56、根据项目55所述的试剂盒，其中用于检测与特异性结合试剂结合的miRNA的手段包括与可检测标记结合的探针。
项目57、根据项目56所述的试剂盒，其中所述可检测标记为光学可检测标记。
***
需要指出的是，除非上下文另有明确指示，本文所用单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”包括所提及的复数，反之亦然。因此，例如，提及的“一种miRNA”或“一种方法”分别包括一种或多种这样的miRNA或方法，提及的“所述方法”包括本领域普通技术人员已知的可修饰或置换的等效步骤和方法。类似地，例如，提及的“miRNAs”包括“一种miRNA”。
除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”将被理解为是指该系列中的每一个元素。本领域技术人员将认识到或采用常规实验能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等价方案。本发明旨在涵盖这种等价方案。
术语“大于”包括具体数字。例如，“大于20”表示≥20。
本说明书及权利要求或项目中，除非上下文有其它要求，词语“包括/包含(comprise)”以及变形词语诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为意指包括陈述的整数(或步骤)或者整数(或步骤)的集合。并不排除任何其它的整数(或步骤)或者整数(或步骤)的集合。当本文使用时，术语“包括/包含(comprising)”能够用术语“含有(containing)”、“由...组成(composed of)”、“包括/包含(including)”、“具有(having)”或“携带(carrying)”替代。
如本文所用的术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指在给定值或范围的20％内，优选地10％内，和更优选地5％内。然而，其还包括具体数目，如，约20包括20。
当本文使用时，“由…组成”排除了未在权利要求要素中规定的任何要素、步骤或成分。当本文使用时，“本质上由…组成”并不排除实质上不影响权利要求的基本特征和新特征的材料或步骤。
本文的每一个实例中，术语“包括/包含”、“本质上由…组成”和“由…组成”中任意一个可被其它两个术语中的任意一个替代。不能将术语相互替换的可能性理解为这些术语必然是同义的。
应当理解，本发明不限于本文所描述的特定方法、操作程序、材料、试剂和物质等并由此可以改变。本文所用的术语仅用于描述具体的实施方案的目的，并不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
贯穿本说明书的文本所引用的所有出版物(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商的规格、说明等)，均以其全文并入本文。本文无任何内容将被解释为承认发明无权由于在先发明而早于这样的公开内容。就通过引入并入的材料与本说明书矛盾或不一致来说，本说明书将优先于任何这样的材料。
附图说明
为了进一步阐明本发明的所有方面，以下借助附图和实施例描述本发明。其中：
图1示出了随实验的时间进程四个处理组的动物(n＝6)的平均外阴表面积。
图2示出了在ZEN-暴露的仔猪的子宫样品中差异表达的miRNA的数量(具有调整的p值≤0.07)。
图3A和3B示出了ZEN暴露后，在至少一个ZEN组中显著受影响的(即具有FDR p调整值≤0.07)的子宫组织中野猪(S.scrofa)-特异性miRNA的倍数改变值。这种倍数改变值可以是正向或负向的，即与对照样品相比上调或下调。
图3C-3E示出了未显著受影响的(即具有FDR p调整值>0.07)子宫组织中野猪(S.scrofa)-特异性miRNA的倍数改变值。这种倍数改变值可以是正向或负向的，即与对照样品相比上调或下调。
图4示出了在子宫组织中ZEN暴露后推测和预测显著增加或降低(FDR p调整值≤0.07)的miRNA的log2-转换的倍数改变和表达水平(测定为每百万标签数(Tags PerMillion),TPM)。
图5示出了第6天和第28天基于靶向qPCR的血清分析的结果，比较了Ctrl和ZEN高组。仅考虑了在各处理组的至少四个个体中具有可量化水平的miRNA。
图6示出了来自基于靶向qPCR的血清分析的miRNA的倍数改变值。这种倍数改变值可以是正向或负向的，即与对照样品相比上调或下调。
图7示出了来自全部三个ZEN组的基于靶向qPCR的血清分析的miRNA比率的倍数改变值，以及ZEN组vs对照的组合值(即ZEN vs无ZEN)。当至少一个样品日的曲线下面积(AUC)值为≥0.7时，则认为比率是合适的。这种倍数改变值可以是正向或负向的，即与对照样品相比上调或下调。
图8示出了横向流动装置的示意图。
具体实施方式
实施例1：动物和研究设计
从当地生产商处获得断奶的雌性仔猪(母猪：兰德瑞斯猪x大白猪，公猪：皮特兰；30+/-2日龄)并对其单独标记。在受控环境条件下将仔猪圈养在板条地板围栏中。在7天的适应期后，根据体重和外阴尺寸选择24只雌性仔猪，并分配到四组中的一组(6只动物/组)。仔猪接受空白饲料(阴性对照；Ctrl)或饲喂被三种递增浓度的ZEN污染的饲料(ZEN低：0.17mg/kg饮食；ZEN中：1.5mg/kg饮食；ZEN高：4.6mg/kg饮食)。在28天的实验期间中，每个处理组都可以自由获取饮水和分配的饮食。每天观察猪并每周称重。
饮食在BIOMIN AN(Herzogenburg,Austria)生产，并根据仔猪的能量和氨基酸需求配制。制备了四种不同的批次，一种对照批次和三种人工污染了ZEN(Fermentek LTD，Israel；纯度>99.2％)的批次。通过制备麦芽糊精预混物来实现ZEN在饮食中的均匀分布，该预混物含有适量的ZEN，并以0.9％(w/w)的掺入率添加到基础饲料中。通过HPLC-MS(Romer Labs GmbH)验证和确认最终ZEN浓度。
每周(第0、6、14、21和28天)通过颅腔静脉的点刺(
Figure BDA0003197690610000335
EDTA,KabeLabortechnik GmbH,Nümbrecht-Elsenroth,Deutschland)从个体动物收集血液。离心后(1500x g,20min)，将血清样品保存在-80℃下以用于随后的分析。定期用卡尺测量外阴长度和宽度，以确定饮食ZEN的影响。如先前所报道的(Jiang等，2011.Journal of animalscience,89,3008-3015)，按照外阴长度×外阴宽度来计算外阴面积。在实验期间每只仔猪进行8次测量。
在实验饮食中膳食暴露28天后，通过肌肉内注射氯胺酮(0.1mL/kg体重(b.w.)
Figure BDA0003197690610000332
Vétoquinol GmbH,Ravensburg,Germany)和阿扎哌隆(0.03mL/kg b.w.；
Figure BDA0003197690610000333
Janssen-Cilag,Neuss,Germany)对猪进行麻醉。随后，通过心内注射
Figure BDA0003197690610000334
(Intervet,Unterschleiβheim,Germany；0.1ml/kg b.w.)对动物实施安乐死。收集整个生殖道，称重并检查任何临床症状。切取小块子宫体和空肠中段，放入1ml RNAlater中，4℃下保存过夜。第二天，将所有的组织样品转移到-80℃下长期保存，直至处理以进行转录组学分析。
结果：对ZEN的暴露使外阴表面以剂量和时间依赖性方式增加(参见图1)。具体地，ZEN中组和ZEN高组的仔猪分别在暴露13天和6天后显示出外阴表面的显著增加。在第26天，与对照组相比，ZEN中组外阴表面的增加为+90％，ZEN高组外阴表面的增加为+230％。类似地，在ZEN高组的仔猪中，整个生殖道(包括阴道、子宫、输卵管、卵巢)的重量显著增加。以相对于个体体重来表示生殖道的重量([生殖道(g)/体重(kg)]*100)，计算的平均值(±SD)如下：在对照、ZEN低、ZEN中和ZEN高组中分别为51.8±20.6、55.8±17.2、121.4±43.4和353.4±110.6。在ZEN高和对照组之间观察到显著性差异(p值<0.001)。与浓度无关，ZEN暴露对仔猪的体重没有影响。
实施例2：组织中miRNA分析
miRNA提取和文库制备：将总共18只动物用于组织中的miRNA谱的研究：6只来自Ctrl，4只来自ZEN低，4只来自ZEN中，以及4只来自ZEN高。将大约30mg来自子宫或空肠的组织通过珠打步骤破坏，并使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)根据制造商的说明提取和纯化总RNA，所述总RNA包括大约18个核苷酸以上的RNA。首先在Nanodrop(TermoScientifc NanoDrop 2000,USA)估算RNA的浓度，并在RIN测量期间再次采用Agilent2100Bioanalyzer(Agilent Technologies,Germany)以确定RNA质量。采用NEBNextMultiplex SmallRNA Library preparation set for Illumina(New England Biolabs)将总共1μg的总RNA用于构建小RNA测序文库。将衔接子连接的总RNA反转录为cDNA，该cDNA用作采用Illumina's SR引物和Index引物1-18的PCR扩增(15个循环)的模板。将带条形码的(Barcoded)DNA文库采用QIAQuick PCR纯化程序(Qiagen,Hilden,Germany)纯化并采用DNA 1000高敏感芯片(Agilent Technologies,Germany)定量。以等摩尔(50nM)浓度合并纯化的样品。采用凝胶纯化进行尺寸选择以选择18到50个核苷酸之间的插入尺寸。在NextSeq500测序仪器上，根据制造商的说明对最终的多重(multiplexed)(n＝18)文库进行测序。使用bcl2fastq软件(Illumina inc.)对原始数据进行解重(de-multiplexed)并对每个样品生成FASTQ文件。采用FastQC线上工具(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)检查FASTQ数据。
RNA测序(RNA-Seq)生物信息学分析：对总读数(reads)采用Cutadapt进行衔接子修剪并采用FastQC工具进行质量过滤(Q-Score>30)。采用bowtie2将经修剪并质量过滤的读数与miRBase release 21(www.mirbase.org；Kozomora和Griffiths-Jones.2014.Nucleid Acids Research,42,D68-D73)中的参照miRNA序列进行比对。然后，将读数映射到野猪(Sus scrofa)基因组组装Sscrofa10.2以及Ensembl小非编码RNA参照数据库。将读数相对于每个文库的总读数计数标准化，以生成每百万标签数(TPM)值。Clustvis用于无监督聚类分析。EdgeR(Robinson等，2010.Bioinformatics,26,139-140)用于基于TPM值的差异表达分析。采用Benjamini-Hochberg错误发现率(FDR)将获得的p值针对多重检验进行调整。将调整后p值≤0.07看做是显著的。
RNA-Seq验证：采用实时聚合酶链反应，也称为定量聚合酶链反应(qPCR)，来验证子宫RNA-Seq中得到的一些结果。从用于测序分析的相同总RNA样品开始，采用50ng总RNA，在反转录(RT)反应中采用Universal cDNA Synthesis Kit II(Exiqon,Denmark)合成cDNA。根据制造商建议使用反应条件。为了监测RT效率和具有抑制活性的杂质的存在，将合成的RNA spike-in(cel-miR-39-3p)添加到RT反应中。PCR扩增在Roche LC480 II仪器(Roche,Germany)中以96-孔板模式并采用EXiLENT SYBR Green mastermix(Exiqon,Denmark)进行，其中设置如下：95℃达10min，95℃达10s和60℃达60s的45个循环，然后是熔解曲线分析。为了计算定量循环值(Cq-值)，使用了二阶导数法。通过从针对该样品计算的Cq平均值中减去个体miRNA Cq值，将Cq-值相对于每个样品中的平均Cq-值标准化(全局平均标准化)。
结果：小RNA测序显示，在来自miRBase的目前已知的总计461种猪成熟miRNA中，子宫样品中存在224种猪种(ssc)中已知的miRNA(具有每百万标签数>1)。其中，ZEN暴露后，16种(ZEN中)和74种(ZEN高)miRNA被显著影响。图2给出了不同处理组中上调和下调miRNA的数量的概述。在ZEN中组中，与对照组(图3A和3B)相比，受显著影响的物种特异性miRNA的倍数改变达到了-3.4(ssc-miRNA-187)至+3.9(ssc-miRNA-542-3p)。在ZEN高组中，效果更加明显，其中倍数改变达到-4.1(ssc-miRNA-204)至+12.6(ssc-miRNA-542-3p)。总之，在ZEN中和ZEN高组中，14种miRNAs(ssc-miR-1、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-181c、ssc-miR-187、ssc-miR-206、ssc-miR-335、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-497、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-7135-3p)通常会受到影响。ZEN暴露导致13种推测或预测的miRNA的显著表达偏差(图4)。其中，在ZEN中和ZEN高组中，put-miR-300受显著影响。为了验证下一代RNA测序结果，通过qPCR成功地对所有组的子宫样本中的ssc-miR-542-3p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-503、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-181c进行了定量。
实施例3：血清样品中的miRNA分析
miRNA提取和qPCR分析：与小-RNA-Seq分析不同，将所有来自饲喂试验的动物均用于血清中miRNA谱的研究(6只每组；总共24只)。采用miRNeasy Mini Kit(Qiagen,Germany)从血清样品中分离RNA。将血清样品在冰上解冻，并以12000x g离心5分钟以清除任何细胞碎片。对于每个样品，将200μL血清与1000μL Qiazol和1μL合成的spike-in(Exiqon,Denmark)混合。室温温育10分钟后，在裂解液中加入200μL氯仿，在4℃下以12,000x g冷却离心15分钟。将体积为650μL的上部水相与7μL糖原(50mg/mL)混合以促进沉淀。将样品转移至miRNeasy mini柱，并将RNA用750μL乙醇沉淀，然后用RPE和RWT缓冲液洗涤。将RNA用30μL无核酸酶水洗脱，并在-80℃下保存直至一步分析。从总RNA样品开始，使用Universal cDNASynthesis Kit II(Exiqon,Denmark)合成cDNA。根据制造商的建议选择反应条件。每10μL反转录(RT)反应总共使用2μL纯化的总RNA。为了监测RT效率和具有抑制活性的杂质的存在，将合成的RNA spike-in(cel-miR-39-3p)添加到RT反应中。PCR扩增在Roche LC480 II仪器(Roche,Germany)中采用定制的Pick&Mix板(Exiqon,Denmark)以384-孔板模式并采用EXiLENT SYBR Green mastermix(Exiqon,Denmark)进行，其中设置如下：95℃达10min，95℃达10s和60℃达60s的45个循环，然后是熔解曲线分析。为了计算定量循环值(Cq-值)，使用了本领域技术人员已知的二阶导数法。通过从针对该样品计算的Cq平均值中减去个体miRNA Cq值，将Cq-值相对于每个样品中的平均Cq-值标准化(全局平均标准化)。选择用于靶向分析的miRNA，它们在子宫样品中对ZEN处理的应答及其相关性示于表1中。
表1：选择用于靶向分析的miRNA
Figure BDA0003197690610000361
Figure BDA0003197690610000371
Figure BDA0003197690610000381
Figure BDA0003197690610000391
Figure BDA0003197690610000401
结果：在ZEN暴露6天和28天后收集的血清样品上实施ssc-miR-1、ssc-miR-125a、ssc-miR-125b、ssc-miR-127、ssc-miR-129a、ssc-miR-133a-5p、ssc-miR-135、ssc-miR-136、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-146b、ssc-miR-181c、ssc-miR-182、ssc-miR-183、ssc-miR-187、ssc-miR-195、ssc-miR-204、ssc-miR-206、ssc-miR-22-3p、ssc-miR-22-5p、ssc-miR-335、ssc-miR-34a、ssc-miR-369、ssc-miR-378、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-486、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-493-5p、ssc-miR-497、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-708-3p、ssc-miR-758、ssc-miR-7135-3p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-301a-5p、put-miR-300的靶向分析。对于ssc-miR-135、ssc-miR-187、ssc-miR-195、ssc-miR-497，采用为人直系同源序列设计的引物通过qPCR进行扩增。然而，这四种miRNA的猪和人序列之间的序列同一性是100％。由于读数计数太低而从数据集中删除了几个miRNA(ssc-miR-143-5p、ssc-miR-187、ssc-miR-493-5p、ssc-miR-708-3p、ssc-miR-7135-3p、ssc-miR-135b-5p、hsa-miR-301a-5p、put-miR-300)后，重点放在Ctrl组和ZEN高组之间可量化的miRNA水平的比较上。ZEN暴露后，3种(第6天)和5种(第28天)miRNA显示出上调或下调(未调整p-值≤0.1)。上调的miRNA包括ssc-miR-140-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-455-5p和ssc-miR-542-3p，而下调的miRNA包括ssc-miR-1、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-181c和ssc-miR-182。图5给出了ZEN暴露后血清miRNA水平的log2-转换倍数改变的详情。除了前述miRNA，ZEN对六种miRNA即ssc-miR-129a、ssc-miR-135、ssc-miR-206、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-493-3p和ssc-miR-503的log2-转换倍数改变具有很大的影响(≤-0.8或≥0.8)。为了进一步探索ZEN的全局影响而不考虑浓度如何，对所有组和所有miRNA的数据(倍数改变)进行了主成分分析(PCA)。这允许检测在所有处理中均不是恒定的miRNA。由此发现了一些已经报道受影响的miRNA，但也发现一些新的miRNA，比如ssc-miR-183。从得到的数据得出结论，基于考虑相对倍数改变和绝对表达水平的显著的上调或下调和相关表达模式，将ssc-miR-1、ssc-miR-129a、hsa-miR-135a-3p、ssc-140-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-181c、ssc-miR-182、ssc-miR-183、ssc-206、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-503和ssc-miR-542-3p识别为作为用于ZEN影响的基于机制的生物标志物的合适miRNA。
实施例4：组织和血清中miRNA水平的相关性
为了比较子宫(NGS读数计数)和血清(qPCR dCq值)获得的miRNA结果，进行了相关性分析。为此，对NGS读数计数进行log2-转换并计算残差(与平均值的差)并用于相关性。两种miRNA显示出组织和血清表达水平相关联的趋势：ssc-miR-455-5p(样品尺寸：17；相关系数r＝0.4045；显著性水平P＝0.1073；r的95％置信区间：-0.09449至0.7411)和ssc-miR-542-3p(样品尺寸：17；相关系数r＝0.4244；显著性水平P＝0.0895；r的95％置信区间：-0.07066至0.7517)。
实施例5：miRNA比率和接受者操作特性(ROC)分析
建立被识别为在血清样品中受ZEN暴露影响的选定miRNA之间的比率，并随后使其经受ROC(接受者操作特性)方法，ROC是一种用于生物标志物评估的经过验证的通用方法(Grund和Sabin.2010.Current Opinion in HIV and AIDS,5,473-479)。由此，识别了能够对未暴露于ZEN(Ctrl)的猪和暴露于ZEN(ZEN低、ZEN中、ZEN高)的猪加以区分的合适的比率：ssc-miR-135/ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p/ssc-miR-493-3p、ssc-miR-542-3p/ssc-miR-1和ssc-miR-542-3p/ssc-miR-493-3p(图6)。
除了实施例3中描述的15种血清miRNA之外(这15种血清miRNA被识别为作为用于ZEN影响的基于机制的生物标志物的合适miRNA)，发现miRNA比率ssc-miR-135/ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p/ssc-miR-493-3p、ssc-miR-542-3p/ssc-miR-1和ssc-miR-542-3p/ssc-miR-493-3p是能够检测ZEN影响的非常可靠的且非常显著的生物标志物。
本文示例性地描述的发明可以适于在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元件、一种或多种限制的情况下实施。此外，本文采用的术语和表述用作描述性的术语而非限制，并且无意使用排除所示和所述特征的任何等同物或其部分的此类术语和表述，而是应该认识到，各种修改形式都可在要求保护的发明的范围内。因而，应该理解，尽管本发明通过示例性实施方案和任选的特征进行了具体公开，本领域技术人员可能进行本文其中实施的发明的修改和变化，并且此类修改和变化认为是在本发明的范围内。
本发明在本文中已经作了广泛且概括性的描述。落入上位公开内容中的每一个较窄类别和亚类分组也构成本发明的部分。这包括本发明的上位性描述，条件是或者否定性限制是从类属中去除了任何主题内容，无论排除的材料是否在本文中具体描述。
其它实施方案在权利要求之内。此外，在所述发明的特征或方面按照马库什组进行描述的情况下，本领域技术人员应认识到本发明也由此按照马库什组的任何单个成员或成员的亚组进行描述。
序列表
<110> 艾尔柏股份公司
<120> 生物标志物
<130> LC21310008P
<150> EP18210684.9
<151> 2018-12-06
<160> 50
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 1
uggaauguaa agaaguaugu a 21
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 2
ucccugagac ccuuuaaccu gug 23
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 3
ucccugagac ccuaacuugu ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 4
ucggauccgu cugagcuugg cu 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 5
aagcccuuac cccaaaaagc au 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 6
agcugguaaa auggaaccaa au 22
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 7
uauggcuuuu uauuccuaug uga 23
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 8
acuccauuug uuuugaugau gga 23
<210> 9
<211> 23
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 9
uaccacaggg uagaaccacg gac 23
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 10
uguaguguuu ccuacuuuau gg 22
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 11
ggugcagugc ugcaucucug g 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 12
ugagaacuga auuccauagg c 21
<210> 13
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 13
aacauucaac cugucgguga gu 22
<210> 14
<211> 24
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 14
uuuggcaaug guagaacuca cacu 24
<210> 15
<211> 23
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 15
uauggcacug guagaauuca cug 23
<210> 16
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 16
ucgugucuug uguugcagcc gg 22
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 17
uagcagcaca gaaauauugg c 21
<210> 18
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 18
uucccuuugu cauccuaugc cu 22
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 19
uggaauguaa ggaagugugu ga 22
<210> 20
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 20
aagcugccag uugaagaacu gu 22
<210> 21
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 21
aguucuucag uggcaagcuu ua 22
<210> 22
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 22
ucaagagcaa uaacgaaaaa ug 22
<210> 23
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 23
uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<400> 24
aauaauacau gguugaucuu u 21
<210> 25
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 25
acuggacuug gagucagaag gc 22
<210> 26
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 26
cagcagcaau ucauguuuug aa 22
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 27
ucuuggagua ggucauuggg u 21
<210> 28
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 28
uuuugcgaug uguuccuaau au 22
<210> 29
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 29
uuuugcaaua uguuccugaa ua 22
<210> 30
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 30
uuuugcgaug uguuccuaau ac 22
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 31
gcaguccaug ggcauauaca c 21
<210> 32
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 32
uaugugccuu uggacuacau cg 22
<210> 33
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 33
uccuguacug agcugccccg ag 22
<210> 34
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 34
ugaaggucua cugugugcca gg 22
<210> 35
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 35
uuguacaugg uaggcuuuca uu 22
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 36
cagcagcaca cugugguuug u 21
<210> 37
<211> 23
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 37
uagcagcggg aacaguacug cag 23
<210> 38
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 38
ugugacagau ugauaacuga aa 22
<210> 39
<211> 23
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 39
caacuagacu gugagcuucu aga 23
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 40
uuugugaccu gguccacuaa c 21
<210> 41
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 41
aucugucugu gucucugagc ag 22
<210> 42
<211> 23
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 42
uauggcuuuu cauuccuaug uga 23
<210> 43
<211> 22
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 43
gcucugacuu uauugcacua cu 22
<210> 44
<211> 24
<212> RNA
<213> 野猪(Sus scrofa)
<220>
<223> 微小RNA
<400> 44
uugcaggaac uugugagucu ccua 24
<210> 45
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α/β水解酶结构域
<400> 45
Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu
20 25 30
Ala Gly Asp Pro Asp Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr
35 40 45
Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ser Glu His
50 55 60
Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp
65 70 75 80
Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg
85 90 95
Phe Ile Ala Leu Val Val Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly
115 120 125
Gln Leu Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu
130 135 140
Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val
145 150 155 160
Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp
165 170 175
Trp Glu Gly Phe Cys Arg Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala
180 185 190
Arg Ser Phe Val Ala Asp Gly Ile Pro Gln His Leu Gln Glu Tyr Asp
195 200 205
Pro Glu Trp Ala Arg Val Phe Tyr Glu Gly Thr Val Gly Leu Ser Cys
210 215 220
Pro His Glu Arg Met Leu Gly Gln Val Lys Thr Pro Val Leu Leu Thr
225 230 235 240
His His Met Arg Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala
245 250 255
Leu Ser Asp Glu Gln Ala Leu Arg Ala Arg Arg Leu Met Asp Ser Ala
260 265 270
Gly Val Thr Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met
275 280 285
His Gln Ser Ala Pro Ala Arg Tyr Val Glu Ile Phe Thr Arg Trp Ala
290 295 300
Ala Ala Leu Ala Pro
305
<210> 46
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α/β水解酶结构域
<400> 46
Met Ala Asp Pro Ala Gln Arg Asp Val Tyr Val Pro His Ala Tyr Pro
1 5 10 15
Glu Lys Gln Ala Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu Ala
20 25 30
Gly Glu Pro Asp Met Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr Gly
35 40 45
Ser Trp Trp Gly Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu Asn Phe
50 55 60
His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp Ala
65 70 75 80
Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg Phe
85 90 95
Ile Ala Leu Val Val Lys Arg Pro Val Ile Val Ala Gly Asn Ser Ser
100 105 110
Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly Gln
115 120 125
Val Arg Gly Ala Leu Cys Glu Asp Ala Pro Phe Phe Ala Ser Glu Leu
130 135 140
Val Thr Thr Cys Gly His Ser Ile Arg Gln Ala Ala Gly Pro Met Phe
145 150 155 160
Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp Trp
165 170 175
Thr Gly Tyr Cys Arg Ala Ala Asp Ala Ser Ser Ser Pro Met Ala Arg
180 185 190
Tyr Phe Val Ala Asp Glu Ile Pro Gln His Met Arg Glu Tyr Asp Pro
195 200 205
Glu Trp Ala Arg Ala Phe Trp Glu Gly Thr Val Ala Leu His Cys Pro
210 215 220
His Glu Gln Leu Leu Thr Gln Val Lys Thr Pro Val Leu Leu Thr His
225 230 235 240
His Met Arg Asp Ile Asp Pro Asp Thr Gly His Leu Val Gly Ala Leu
245 250 255
Ser Asp Glu Gln Ala Ala Arg Ala Arg Leu Leu Met Glu Ser Ala Gly
260 265 270
Val Lys Val Asp Tyr Ala Ser Val Pro Asp Ala Leu His Met Met His
275 280 285
Gln Phe Asp Pro Pro Arg Tyr Val Glu Ile Phe Thr Gln Trp Ala Ala
290 295 300
Thr Leu Ala Ala
305
<210> 47
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α/β水解酶结构域
<400> 47
Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu
20 25 30
Ala Gly Asp Pro Gly Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr
35 40 45
Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu His
50 55 60
Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp
65 70 75 80
Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg
85 90 95
Phe Ile Ala Leu Val Val Arg Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly
115 120 125
Gln Ile Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu
130 135 140
Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val
145 150 155 160
Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp
165 170 175
Trp Glu Gly Phe Arg Ser Ala Ala Asp Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala
180 185 190
Arg Ser Phe Val Ala Asp Thr Ile Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp
195 200 205
Pro Glu Trp Ala Arg Ala Phe Tyr Glu Gly Thr Val Gly Leu Asn Cys
210 215 220
Pro His Glu Arg Met Leu Asn Arg Val Asn Thr Pro Val Leu Leu Thr
225 230 235 240
His His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala
245 250 255
Leu Ser Asp Glu Gln Ala Ala Gln Val Arg Arg Leu Met Glu Ser Ala
260 265 270
Gly Val Lys Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met
275 280 285
His Gln Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Leu Thr Pro Trp Thr
290 295 300
Ala Ala Leu Ala Pro
305
<210> 48
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α/β水解酶结构域
<400> 48
Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu
20 25 30
Ala Gly Asp Pro Asp Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr
35 40 45
Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu His
50 55 60
Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp
65 70 75 80
Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg
85 90 95
Phe Ile Ala Leu Val Val Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly
115 120 125
Gln Leu Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu
130 135 140
Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val
145 150 155 160
Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Ser Asp
165 170 175
Trp Glu Gly Phe Cys Arg Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala
180 185 190
Arg Ser Phe Val Ala Asp Gly Ile Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp
195 200 205
Pro Glu Trp Ala Arg Ala Phe His Glu Gly Thr Val Gly Leu Asn Cys
210 215 220
Pro His Glu Arg Met Leu Gly Arg Val Asn Thr Pro Val Leu Leu Thr
225 230 235 240
His His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala
245 250 255
Leu Ser Asp Glu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Leu Met Glu Ser Ala
260 265 270
Gly Val Arg Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met
275 280 285
His Gln Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Phe Thr Arg Trp Ala
290 295 300
Ala Ala Leu Ala Pro
305
<210> 49
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α/β水解酶结构域
<400> 49
Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu
20 25 30
Ala Gly Asp Pro Gly Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr
35 40 45
Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu His
50 55 60
Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp
65 70 75 80
Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg
85 90 95
Phe Met Ala Leu Val Val Arg Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly
115 120 125
Gln Ile Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu
130 135 140
Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val
145 150 155 160
Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp
165 170 175
Trp Glu Gly Phe Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala
180 185 190
Arg Ser Phe Val Ala Asp Thr Ile Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp
195 200 205
Pro Glu Trp Ala Arg Ala Phe Tyr Glu Gly Thr Val Gly Leu Asn Cys
210 215 220
Pro His Glu Arg Met Leu Asn Arg Val Asn Thr Pro Val Leu Leu Thr
225 230 235 240
His His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala
245 250 255
Leu Ser Asp Glu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Arg Leu Met Glu Ser Ala
260 265 270
Gly Val Lys Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met
275 280 285
His Gln Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Leu Thr Pro Trp Ala
290 295 300
Ala Ala Leu Ala Pro
305
<210> 50
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α/β水解酶结构域
<400> 50
Met Ala Glu Glu Gly Thr Arg Ser Glu Ala Ala Asp Ala Ala Thr Gln
1 5 10 15
Ala Arg Gln Leu Pro Asp Ser Arg Asn Ile Phe Val Ser His Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Arg Gln Val Asp Leu Gly Glu Val Val Met Asn Phe Ala Glu
35 40 45
Ala Gly Ser Pro Asp Asn Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Glu Gln Thr
50 55 60
Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Pro Val Met Gly Leu Leu Ala Glu Asn
65 70 75 80
Phe His Val Phe Ala Val Asp Ile Arg Gly Gln Gly Arg Ser Thr Trp
85 90 95
Thr Pro Arg Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg
100 105 110
Phe Ile Ala Leu Val Ile Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ala Met Pro Gly
130 135 140
Gln Ile Arg Ala Ala Leu Cys Glu Asp Ala Pro Phe Phe Ala Ser Glu
145 150 155 160
Leu Val Pro Ala Tyr Gly His Ser Val Leu Gln Ala Ala Gly Pro Ala
165 170 175
Phe Glu Leu Tyr Arg Asp Phe Leu Gly Asp Gln Trp Ser Ile Gly Asp
180 185 190
Trp Lys Gly Phe Val Glu Ala Ala Lys Ala Ser Pro Ala Lys Ala Met
195 200 205
Gln Leu Phe Pro Thr Pro Asp Glu Ala Pro Gln Asn Leu Lys Glu Tyr
210 215 220
Asp Pro Glu Trp Gly Arg Ala Phe Phe Glu Gly Thr Val Ala Leu His
225 230 235 240
Cys Pro His Asp Arg Met Leu Ser Gln Val Lys Thr Pro Ile Leu Ile
245 250 255
Thr His His Ala Arg Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Glu Leu Leu Gly
260 265 270
Ala Leu Ser Asp Leu Gln Ala Glu His Ala Gln Asp Ile Ile Arg Ser
275 280 285
Ala Gly Val Arg Val Asp Tyr Gln Ser His Pro Asp Ala Leu His Met
290 295 300
Met His Leu Phe Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Leu Thr Ser Trp
305 310 315 320
Ser Ala Thr Leu Pro Ala Asn Asp
325

Claims (15)

1.一种用于检测玉米赤霉烯酮影响的方法，包括：
(c)测定测试样品中至少一种miRNA的表达水平，所述至少一种miRNA选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-129a-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-182、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-183、ssc-miR-140-3p、ssc-miR-7135-3p、ssc-miR-204、ssc-miR-143-5p、ssc-miR-187、ssc-miR-335、ssc-miR-424-5p、ssc-miR-450a、ssc-miR-450b-5p、ssc-miR-450c-5p、ssc-miR-497；和
(d)将所述表达水平与参照值进行比较。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述参照值对应于对照样品中所述至少一种miRNA的表达水平。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种miRNA选自ssc-miR-1、ssc-miR-181c、ssc-miR-206、ssc-miR-503、ssc-miR-542-3p、ssc-miR-135、ssc-miR-129a-3p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-432-5p、ssc-miR-455-5p、ssc-miR-182、ssc-miR-493-3p、ssc-miR-455-3p、ssc-miR-183和ssc-miR-140-3p。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一种miRNA的表达水平包含两种miRNA之间的表达水平的至少一个比率，所述两种miRNA选自ssc-miR-542-3p和ssc-miR-1、ssc-miR-542-3p和ssc-miR-493-3p、ssc-miR-135和ssc-miR-432-5p以及ssc-miR-455-5p和ssc-miR-493-3p。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中自受试者获得所述测试样品，其中优选地，所述受试者为优选猪(Sus)属、优选野猪(Sus scrofa)种的哺乳动物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括
(b)提供所述测试样品；和/或
(e)提供与玉米赤霉烯酮影响有关的信息。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法用于，优选地玉米赤霉烯酮暴露的诊断。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法用于饲料或食品中玉米赤霉烯酮的检测，其中优选地，所述方法用于选择用于与玉米赤霉烯酮中和试剂接触或用于应用玉米赤霉烯酮中和方法的饲料。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，包括
(a)在自所述受试者获得所述测试样品之前，用怀疑含有玉米赤霉烯酮的饲料饲喂所述受试者；和/或
(f)如果所述测试样品和对照样品之间所述至少一种miRNA的表达水平的偏差指示玉米赤霉烯酮暴露，则选择所述饲料以用于与玉米赤霉烯酮中和试剂接触或以用于应用玉米赤霉烯酮中和方法。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法用于评估方法或测试化合物中和玉米赤霉烯酮的能力。
11.至少一种miRNA用于检测测试样品中玉米赤霉烯酮影响的用途，所述至少一种miRNA选自miR-1、miR-181c、miR-206、miR-503、miR-542-3p、miR-135、miR-135a-5p、miR-129a-3p、miR-142-3p、miR-432-5p、miR-455-5p、miR-182、miR-493-3p、miR-455-3p、miR-183、miR-140-3p、miR-7135-3p、miR-204、miR-143-5p、miR-187、miR-335、miR-424-5p、miR-450a、miR-450b-5p、miR-450c-5p、miR-497。
12.一种数据处理系统，包括被配置为执行包括以下步骤的方法的处理器
(a)将在自受试者获得的测试样品中测定的至少一种miRNA的表达水平与参照值进行比较，所述至少一种miRNA选自miR-1、miR-181c、miR-206、miR-503、miR-542-3p、miR-135、miR-135a-5p、miR-129a-3p、miR-142-3p、miR-432-5p、miR-455-5p、miR-182、miR-493-3p、miR-455-3p、miR-183、miR-140-3p、miR-7135-3p、miR-204、miR-143-5p、miR-187、miR-335、miR-424-5p、miR-450a、miR-450b-5p、miR-450c-5p和miR-497；和
(b)如果测定到偏差，则指示所述受试者的玉米赤霉烯酮暴露，其中所述参照值对应于在自未暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中测定的表达水平；或如果测定到无偏差，则指示所述受试者的玉米赤霉烯酮暴露，其中所述参照值对应于在自已暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中测定的表达水平。
13.一种能够测定至少一种miRNA的水平的测序装置，所述至少一种miRNA选自miR-1、miR-181c、miR-206、miR-503、miR-542-3p、miR-135、miR-135a-5p、miR-129a-3p、miR-142-3p、miR-432-5p、miR-455-5p、miR-182、miR-493-3p、miR-455-3p、miR-183、miR-140-3p、miR-7135-3p、miR-204、miR-143-5p、miR-187、miR-335、miR-424-5p、miR-450a、miR-450b-5p、miR-450c-5p和miR-497，所述装置包括权利要求12所述的数据处理系统。
14.一种计算机程序，包括使权利要求12所述的数据处理系统或权利要求13所述的测序装置执行以下步骤的指令
(b)将在自受试者获得的样品中测定的至少一种miRNA的表达水平与参照值进行比较，所述至少一种miRNA选自miR-1、miR-181c、miR-206、miR-503、miR-542-3p、miR-135、miR-135a-5p、miR-129a-3p、miR-142-3p、miR-432-5p、miR-455-5p、miR-182、miR-493-3p、miR-455-3p、miR-183、miR-140-3p、miR-7135-3p、miR-204、miR-143-5p、miR-187、miR-335、miR-424-5p、miR-450a、miR-450b-5p、miR-450c-5p和miR-497；和
(c)如果测定到偏差，则指示所述受试者的玉米赤霉烯酮暴露，其中所述参照值对应于在自未暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中测定的表达水平；或如果测定到无偏差，则指示所述受试者的玉米赤霉烯酮暴露，其中所述参照值对应于在自已暴露于玉米赤霉烯酮的受试者获得的对照样品中测定的表达水平；或
具有存储于其上的所述计算机程序的计算机可读介质。
15.一种用于实施权利要求1至10中任一项所述的方法的试剂盒，包含针对至少一种miRNA的特异性结合试剂，所述至少一种miRNA选自miR-1、miR-181c、miR-206、miR-503、miR-542-3p、miR-135、miR-135a-5p、miR-129a-3p、miR-142-3p、miR-432-5p、miR-455-5p、miR-182、miR-493-3p、miR-455-3p、miR-183、miR-140-3p、miR-7135-3p、miR-204、miR-143-5p、miR-187、miR-335、miR-424-5p、miR-450a、miR-450b-5p、miR-450c-5p和miR-497，其中所述特异性结合试剂包含在固体支持物中或缀合至固体支持物。
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