CN113466113B - 一种流式荧光光斑位置分布的测量方法 - Google Patents

一种流式荧光光斑位置分布的测量方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，包括以下步骤：S1：将流式荧光分析仪原来摆放光电倍增管的位置摆放具有多通道输出的硅光电倍增管，涉及流式荧光技术领域。该流式荧光光斑位置分布的测量方法，硅光电倍增管采用二维像素结构，经过对16通道输出的信号进行处理可以得到光斑中心的2维坐标位置XY以及光斑的扩散程度D，通过对三个处理信号可以指导荧光收集透镜的位置调整，将光束形态调节到最佳位置，该测量方法只需观察3个处理过的信号即可，只需一个示波器既可观测信号，大大降低调整难度及信号分析处理的复杂度。

Description

一种流式荧光光斑位置分布的测量方法
技术领域
本发明涉及流式荧光技术领域，具体为一种流式荧光光斑位置分布的测量方法。
背景技术
流式荧光技术是基于编码微球和流式技术的一种临床应用型的高通量发光检测技术，又被称为液态芯片、悬浮阵列等。该项技术是继生物芯片技术、化学发光技术之后的新一代高通量分子诊断技术平台，是临床诊断领域及生命科学研究中的一大热点。
流式荧光分析仪的原理是将激光入射到鞘流池后，微球颗粒产生荧光通过荧光收集透镜入射到光电倍增管进行接收，将光信号转换为电信号，需要通过调节收集荧光透镜的位置来调节入射到光电倍增管的光束形态使得光束到达最佳接收心态，但是荧光光强是极微弱的肉眼不可见的，同时微球是高速流过鞘流池的，所以荧光信号是高速的并且微弱的，对于这类高速且微弱的光无法采用CCD的成像器件进行采集，因此流式荧光分析仪的收集荧光调节存在调节困难，调节指标无法定量的问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，解决了荧光光强是极微弱的肉眼不可见的，同时微球是高速流过鞘流池的，所以荧光信号是高速的并且微弱的，对于这类高速且微弱的光无法采用CCD的成像器件进行采集，因此流式荧光分析仪的收集荧光调节存在调节困难，调节指标无法定量的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，包括以下步骤：
S1：将流式荧光分析仪原来摆放光电倍增管的位置摆放具有多通道输出的硅光电倍增管；
S2：激光器经过透镜产生特定激光入射到鞘流池，激光与流过鞘流池中染有荧光染料的微球相遇，荧光染料受激产生荧光，荧光被侧边的收集透镜收集，经过滤光片过滤后入射到硅光电倍增管，光电倍增产生电信号，通过电路采集电信号传送到电脑分析荧光成分；
S3：S1中所述硅光电倍增管包括SIPM传感芯片，SIPM传感芯片4行4列结构的多通道输出为16个电流信号I(1..16)，根据其结构设计出以下三个计算公式：
通过计算出光斑中心的2维坐标位置XY以及光斑的扩散程度D，X等于检测器左边一半通道(1、2、5、6、9、10、13、14)的光强总和减去检测器右边一半通道(3、4、7、8、11、12、15、16)的光强总和除于全部的通道光强总和，可以得到归一化数值范围-1到+1，当X输出趋近于0的时候，说明光斑中心在X轴的中间，同理Y等于检测器上边一半通道(1、2、3、4、5、6、7、8)的光强总和减去检测器下边一半通道(9、10、11、12、13、14、15、16)的光强总和除于全部的通道光强总和，可以得到归一化数值范围-1到+1，当Y输出趋近于0的时候，说明光斑中心在Y轴的中间，D值等于检测器中心4个通道(6、7、10、11)的光强总和减去检测器外圈通道(1、2、3、4、5、8、9、12、13、14、15、16)的总和除于全部的通道光强总和，可以得到归一化数值范围-1到+1，D值的大小是表征光斑大小的，当D值变小的时候说明光斑的尺寸在变大。
优选的，所述SIPM传感芯片输出为16个信号，通过电路设计将16个通道的电流信号转换为电压信号，采用运放加减法电路对16个电压进行运算实现3个公式信号输出。
优选的，所述流式荧光分析仪包括
基板；
第一激光器，所述第一激光器固定安装于所述基板的表面；
扩束透镜及安装座，所述扩束透镜及安装座固定安装于所述基板的表面；
第一聚焦镜及安装座，所述第一聚焦镜及安装座固定安装于所述基板的表面；
第二聚焦镜及安装座，所述第二聚焦镜及安装座固定安装于所述基板的表面；
第一二项色镜及安装座，所述第一二项色镜及安装座固定安装于所述基板的表面；
光电倍增管，所述光电倍增管固定安装于所述基板的表面；
鞘流池及安装座，所述鞘流池及安装座固定安装于所述基板的表面；
光电二极管及安装座，所述光电二极管及安装座固定安装于所述基板的表面；
收集透镜及安装座，所述收集透镜及安装座固定安装于所述基板的表面；
第一硅光电倍增管安装座，所述第一硅光电倍增管安装座固定安装于所述基板的表面；
第二硅光电倍增管安装座，所述第二硅光电倍增管安装座固定安装于所述基板的表面；
硅光电倍增管，所述硅光电倍增管固定安装于所述基板的表面；
第二激光器，所述第二激光器固定安装于所述基板的表面；
第二二项色镜及安装座，所述第二二项色镜及安装座固定安装于所述基板的表面。
优选的，所述硅光电倍增管包括高压温补电源、温度SIPM传感芯片、SIPM传感芯片和高速跨阻放大器。
优选的，所述高压温补电源分别与温度SIPM传感芯片和SIPM传感芯片电性连接，所述SIPM传感芯片与高速跨阻放大器电性连接。
优选的，所述第一激光器、扩束透镜及安装座和第一聚焦镜及安装座相适配。
优选的，所述光电二极管及安装座和收集透镜及安装座相适配。
优选的，所述硅光电倍增管与第二激光器相适配。
(三)有益效果
本发明具有以下有益效果：
该流式荧光光斑位置分布的测量方法，通过将原来摆放光电倍增管的位置摆放具有多通道输出的硅光电倍增管，硅光电倍增管是一种弱光感应的光电转换器件，其特点体积小、增益高、响应快，适合测量荧光信号，多通道输出硅光电倍增管采用二维像素结构，经过对16通道输出的信号进行处理可以得到光斑中心的2维坐标位置XY以及光斑的扩散程度D，通过对三个处理处理信号可以指导荧光收集透镜的位置调整，将光束形态调节到最佳位置，该测量方法只需观察3个处理过的信号即可，只需一个示波器既可观测信号，大大降低调整难度及信号分析处理的复杂度。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
图1为本发明流式荧光技术原理图；
图2为本发明SIPM传感芯片原理图；
图3为本发明光电倍增管的结构示意图；
图4为本发明流式荧光分析仪结构示意图；
图5为本发明光电倍增管的系统原理图。
图中，1-基板、2-第一激光器、3-扩束透镜及安装座、4-第一聚焦镜及安装座、5-第二聚焦镜及安装座、6-第一二项色镜及安装座、7-光电倍增管、8-鞘流池及安装座、9-光电二极管及安装座、10-收集透镜及安装座、11-第一硅光电倍增管安装座、12-第二硅光电倍增管安装座、13-硅光电倍增管、131-高压温补电源、132-温度传感器、133-SIPM传感芯片、134-高速跨阻放大器、14-第二激光器、15-第二二项色镜及安装座。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“开孔”、“上”、“下”、“厚度”、“顶”、“中”、“长度”、“内”、“四周”等指示方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的组件或元件必须具有特定的方位，以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
请参阅图1-5，本发明实施例提供一种技术方案：一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，包括以下步骤：
S1：将流式荧光分析仪原来摆放光电倍增管的位置摆放具有多通道输出的硅光电倍增管；
S2：激光器经过透镜产生特定激光入射到鞘流池，激光与流过鞘流池中染有荧光染料的微球相遇，荧光染料受激产生荧光，荧光被侧边的收集透镜收集，经过滤光片过滤后入射到硅光电倍增管，光电倍增产生电信号，通过电路采集电信号传送到电脑分析荧光成分；
S3：S1中所述硅光电倍增管包括SIPM传感芯片，SIPM传感芯片4行4列结构的多通道输出为16个电流信号I(1..16)，根据其结构可以设计出以下三个计算公式：
通过计算出光斑中心的2维坐标位置XY以及光斑的扩散程度D，X等于检测器左边一半通道(1、2、5、6、9、10、13、14)的光强总和减去检测器右边一半通道(3、4、7、8、11、12、15、16)的光强总和除于全部的通道光强总和，可以得到归一化数值范围-1到+1，当X输出趋近于0的时候，说明光斑中心在X轴的中间，同理Y等于检测器上边一半通道(1、2、3、4、5、6、7、8)的光强总和减去检测器下边一半通道(9、10、11、12、13、14、15、16)的光强总和除于全部的通道光强总和，可以得到归一化数值范围-1到+1，当Y输出趋近于0的时候，说明光斑中心在Y轴的中间，D值等于检测器中心4个通道(6、7、10、11)的光强总和减去检测器外圈通道(1、2、3、4、5、8、9、12、13、14、15、16)的总和除于全部的通道光强总和，可以得到归一化数值范围-1到+1，D值的大小是表征光斑大小的，当D值变小的时候说明光斑的尺寸在变大。
可以解决流式荧光分析仪生产调试过程中光斑调教对准困难的问题，为调教荧光光斑提供一个可定量的调试指标。
优选的，所述SIPM传感芯片输出为16个信号，通过电路设计将16个通道的电流信号转换为电压信号，采用运放加减法电路对16个电压进行运算实现3个公式信号输出。
所述流式荧光分析仪包括
基板1；
第一激光器2，所述第一激光器2固定安装于所述基板1的表面；
扩束透镜及安装座3，所述扩束透镜及安装座3固定安装于所述基板1的表面；
第一聚焦镜及安装座4，所述第一聚焦镜及安装座4固定安装于所述基板1的表面；
第二聚焦镜及安装座5，所述第二聚焦镜及安装座5固定安装于所述基板1的表面；
第一二项色镜及安装座6，所述第一二项色镜及安装座6固定安装于所述基板1的表面；
光电倍增管7，所述光电倍增管7固定安装于所述基板1的表面；
鞘流池及安装座8，所述鞘流池及安装座8固定安装于所述基板1的表面；
光电二极管及安装座9，所述光电二极管及安装座9固定安装于所述基板1的表面；
收集透镜及安装座10，所述收集透镜及安装座10固定安装于所述基板1的表面；
第一硅光电倍增管安装座11，所述第一硅光电倍增管安装座11固定安装于所述基板1的表面；
第二硅光电倍增管安装座12，所述第二硅光电倍增管安装座12固定安装于所述基板1的表面；
硅光电倍增管13，所述硅光电倍增管13固定安装于所述基板1的表面；
第二激光器14，所述第二激光器14固定安装于所述基板1的表面；
第二二项色镜及安装座15，所述第二二项色镜及安装座15固定安装于所述基板1的表面。
流式荧原理：激光器经过透镜产生特定激光入射到鞘流池，激光与流过鞘流池中染有荧光染料的微球相遇，荧光染料受激产生荧光，荧光被侧边的收集透镜收集，经过滤光片过滤后入射到光电倍增管，光电倍增产生电信号，通过电路采集电信号传送到电脑分析荧光成分。
硅光电倍增管由工作在盖革模式下的APD(G-APD)微元阵列组成当光子入射硅光电倍增管时，由于雪崩效应，这些微元迅速雪崩导通，并在电场的加速下形成电流。由于雪崩效应的放大作用，硅光电倍增管的增益通常能达到10^5～10^6，与光电倍增管相当；雪崩效应是指硅光电倍增管的反向偏压大于其击穿电压的工作状态。如果加到PN结两端的反向偏压能够使PN结的耗尽层内产生足够强的电场，则在耗尽层内产生的载流子就会在电场的作用下获得足够大的动能，这样载流子便有一定的概率能与其它的硅原子发生碰撞电离，并产生新的电子-空穴对，这样的过程不断地持续下去，就会使载流子的数目急剧增加，这一过程称为雪崩倍增过程。
雪崩倍增过程一旦开始，就会一直持续下去。通常的做法是加入一个与雪崩光电二极管相串联的淬灭电阻进行分压来实现降低耗尽层内的电场强度的目的，流过淬灭电阻的电流会在淬灭电阻两端产生电压降，从而导致二极管内PN结两端的电压也会随之急剧降低，进而导致耗尽层内电场强度迅速减弱，达到停止雪崩的作用，这个过程叫做淬灭。
完成淬灭之后，淬灭电阻两端的电压降消失，PN结两端的电压又达到外加偏压的水平，雪崩光电二极管恢复到对光敏感的状态，准备接收下一个光子，并重复以上过程。
所述硅光电倍增管13包括高压温补电源131、温度传感器132、SIPM传感芯片133和高速跨阻放大器134。
所述高压温补电源131分别与温度传感器132和SIPM传感芯片133电性连接，所述SIPM传感芯片133与高速跨阻放大器134电性连接。
所述第一激光器2、扩束透镜及安装座3和第一聚焦镜及安装座4相适配。
所述光电二极管及安装座9和收集透镜及安装座10相适配。
所述硅光电倍增管13与第二激光器14相适配。
工作过程温度传感器测量SiPM传感芯片133当前的温度给温度传感器132，温度传感器132根据温度信号调整电压输出，保证SiPM传感芯片133具有在不同工作温度下的稳定增益，SiPM传感芯片133输出光电流经高速跨阻放大器变成电压信号供后面电路采集信号。
测试验证：采用二十八项两维分类编码微球，对硅光电倍增管进行测试，发现未补偿前数据X维度的探测器响应存在非线性，造成右上角的微球分辨偏移无法落在对应圈内，就无法识别编码微球造成数据失效或错误，实验数据变通过非线性补偿算法将硅光电倍增管获得的原始数据经过非线性补偿计算，得到的新值满足系统要求的线性范围，可以替换光电倍增管，硅光电倍增管的应用，使得原来使用价格昂贵工艺复杂的真空光电倍增管得到替代，大大降低了系统成本。经过误差补偿使传感器的缺陷得到弥补，从而在流式荧光应用中发挥极大作用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (8)

1.一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：将流式荧光分析仪原来摆放光电倍增管的位置摆放具有多通道输出的硅光电倍增管；
S2：激光器经过透镜产生特定激光入射到鞘流池，激光与流过鞘流池中染有荧光染料的微球相遇，荧光染料受激产生荧光，荧光被侧边的收集透镜收集，经过滤光片过滤后入射到硅光电倍增管，光电倍增产生电信号，通过电路采集电信号传送到电脑分析荧光成分；
S3：S1中所述硅光电倍增管包括SIPM传感芯片，SIPM传感芯片4行4列结构的多通道输出为16个电流信号I(1..16)，根据其结构设计出以下三个计算公式：
通过计算出光斑中心的2维坐标位置XY以及光斑的扩散程度D，X等于检测器左边一半通道(1、2、5、6、9、10、13、14)的光强总和减去检测器右边一半通道(3、4、7、8、11、12、15、16)的光强总和除于全部的通道光强总和，可以得到归一化数值范围-1到+1，当X输出趋近于0的时候，说明光斑中心在X轴的中间，同理Y等于检测器上边一半通道(1、2、3、4、5、6、7、8)的光强总和减去检测器下边一半通道(9、10、11、12、13、14、15、16)的光强总和除于全部的通道光强总和，可以得到归一化数值范围-1到+1，当Y输出趋近于0的时候，说明光斑中心在Y轴的中间，D值等于检测器中心4个通道(6、7、10、11)的光强总和减去检测器外圈通道(1、2、3、4、5、8、9、12、13、14、15、16)的总和除于全部的通道光强总和，可以得到归一化数值范围-1到+1，D值的大小是表征光斑大小的，当D值变小的时候说明光斑的尺寸在变大。
2.根据权利要求1所述的一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，其特征在于：所述SIPM传感芯片输出为16个信号，通过电路设计将16个通道的电流信号转换为电压信号，采用运放加减法电路对16个电压进行运算实现3个公式信号输出。
3.根据权利要求1所述的一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，其特征在于：所述流式荧光分析仪包括
基板；
第一激光器，所述第一激光器固定安装于所述基板的表面；
扩束透镜及安装座，所述扩束透镜及安装座固定安装于所述基板的表面；
第一聚焦镜及安装座，所述第一聚焦镜及安装座固定安装于所述基板的表面；
第二聚焦镜及安装座，所述第二聚焦镜及安装座固定安装于所述基板的表面；
第一二项色镜及安装座，所述第一二项色镜及安装座固定安装于所述基板的表面；
光电倍增管，所述光电倍增管固定安装于所述基板的表面；
鞘流池及安装座，所述鞘流池及安装座固定安装于所述基板的表面；
光电二极管及安装座，所述光电二极管及安装座固定安装于所述基板的表面；
收集透镜及安装座，所述收集透镜及安装座固定安装于所述基板的表面；
第一硅光电倍增管安装座，所述第一硅光电倍增管安装座固定安装于所述基板的表面；
第二硅光电倍增管安装座，所述第二硅光电倍增管安装座固定安装于所述基板的表面；
硅光电倍增管，所述硅光电倍增管固定安装于所述基板的表面；
第二激光器，所述第二激光器固定安装于所述基板的表面；
第二二项色镜及安装座，所述第二二项色镜及安装座固定安装于所述基板的表面。
4.根据权利要求3所述的一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，其特征在于：所述硅光电倍增管包括高压温补电源、温度SIPM传感芯片、SIPM传感芯片和高速跨阻放大器。
5.根据权利要求4所述的一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，其特征在于：所述高压温补电源分别与温度SIPM传感芯片和SIPM传感芯片电性连接，所述SIPM传感芯片与高速跨阻放大器电性连接。
6.根据权利要求3所述的一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，其特征在于：所述第一激光器、扩束透镜及安装座和第一聚焦镜及安装座相适配。
7.根据权利要求3所述的一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，其特征在于：所述光电二极管及安装座和收集透镜及安装座相适配。
8.根据权利要求3所述的一种流式荧光光斑位置分布的测量方法，其特征在于：所述硅光电倍增管与第二激光器相适配。
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