CN113454208A - 用于免疫抑制的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了能够特异性抑制针对供体同种异体抗原或自身抗原的免疫反应的调节性T细胞(Treg)、其组合物及其产生方法。任选地，这些Treg用于包括自然杀伤(NK)细胞的群体中。还描述了使用这些Treg或Treg和NK细胞的混合群的相关方法，包括用于促进移植受者的同种异体移植物接受性和治疗受试者的自身免疫性障碍的方法。这些Treg或Treg和NK细胞的混合群源自受试者的血细胞，并且可以减少或替代广效免疫抑制剂的使用。

Description

用于免疫抑制的组合物和方法

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且该序列表特此通过引用以其全文并入。所述ASCII副本创建于2019年12月12日，名称为51329-002WO2_Sequence_Listing_12.12.19_ST25，并且大小为3,714字节。

背景技术

肾移植是目前终末期肾病(ESKD)患者的首选治疗方法。根据美国肾脏数据系统年度报告，超过660,000名美国人正在接受ESKD治疗。在这些患者中，468,000人是透析患者，超过193,000人进行了功能性肾移植。每年有超过89,000名ESKD患者死亡，美国每年用于治疗肾衰竭的医疗保险支出大约为310亿美元，约占所有医疗保险费用的7％。截至2016年，美国目前有超过100,000名患者在等待肾移植。个人首次移植的中值等待时间为3.6年，等待时间可能因健康状况、相容性和器官的可用性而异。2017年，美国进行了大约20,000例肾移植，其中三分之二来自已故供体，三分之一来自活体供体。

近年来尽管短期移植存活率有所改善，但长期移植存活率没有显著变化。目前，器官移植患者接受广谱免疫抑制剂以防止对捐赠器官的排斥。然而，这些免疫抑制剂使移植受者容易受到严重感染，特别是因为移植受者长期坚持使用免疫抑制剂药物方案。由于免疫抑制剂治疗而导致感染和癌症的发展是移植受者的一个重大问题。因此，需要替代治疗来促进移植耐受和防止排斥，从而消除与当前免疫抑制药物(包括影响同种异体移植物存活的那些)相关的毒性。

发明内容

本文所述的发明尤其提供了源自对(i)移植供体同种异体抗原或(ii)自身抗原具有特异性的患者的调节性T细胞(Treg)。本发明还提供了用于抑制针对同种异体抗原或自身抗原的免疫反应的方法，以及用于促进同种异体移植物接受性和用于治疗或防止移植排斥或自身免疫性障碍的方法。Treg还可用于Treg和NK细胞的混合群中。

在一方面，本发明提供了一种分离的调节性T细胞(Treg)，其包括特异性结合以下的T细胞受体(TCR)：(i)同种异体抗原，它是人类白细胞抗原(HLA)分子或其片段，并且不由存在于Treg基因组中的核苷酸序列编码，或(ii)导致自身免疫性障碍的自身抗原或其片段。

在特定的实施例中，TCR特异性结合HLA分子。在一些实施例中，TCR特异性结合高变区(HVR)，例如HLA分子的β-链HVR。在一些实施例中，HLA分子是HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、HLA-A、HLA-B或HLA-C分子或其片段。在特定的实施例中，HLA分子是HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP分子或其片段。在某些实施例中，HLA-DR分子是HLA-DR1、HLA-DR2、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR5、HLA-DR6、HLA-DR7、HLA-DR8、HLA-DR9、HLA-DR10、HLA-DR11、HLA-DR12、HLA-DR13、HLA-DR14、HLA-DR15、HLA-DR16、HLA-DR17、HLA-DR18、HLA-DR51、HLA-DR52或HLA-DR53分子，或如本文所述或本领域已知的任何其他HLA-DR血清型。在一些实施例中，TCR特异性结合的HLA分子或其片段由存在于器官或组织供体的基因组中的核苷酸序列编码。

在一些实施例中，Treg能够抑制针对同种异体抗原或自身抗原的T效应细胞(Teff)反应。在另外的实施例中，Treg能够抑制对直接同种异体识别、半直接同种异体识别和/或间接同种异体识别的Teff增殖反应。

在一些实施例中，Treg包括激活腺苷能信号传导途径。

在一些实施例中，Treg表达一种或多种选自由CD4、CD25、CD39、CD73、FOXP3、GITR、CLTA4、ICOS、GARP、LAP、PD-1、CCR6和CXCR3组成的组的标志物。

在另一方面，本发明的特征在于分离的Treg，其包括特异性结合以下的TCR：(i)同种异体抗原，它是HLA分子或其片段，并且不由存在于Treg基因组中的核苷酸序列编码，或(ii)导致自身免疫性障碍的自身抗原或其片段；其中Treg已通过如下方法产生，该方法包括(a)使包含从受者受试者获得的T细胞的免疫细胞群与HLA分子或自身抗原的片段和自体抗原呈递细胞(APC)接触；和(b)在足以形成包含多个Treg的扩增的T细胞系的时间和条件下扩增步骤(a)的免疫细胞群；以及任选地(c)从免疫细胞群中纯化Treg。在一些实施例中，(a)的免疫细胞群还包含自然杀伤(NK)细胞，并且如果进行步骤(c)，则步骤(c)包括从免疫细胞群中纯化Treg和NK细胞，从而产生Treg和NK细胞的混合群。

在另一方面，本发明的特征在于细胞混合群，其包括如前述方面中任一个所述的Treg和NK细胞。

在另一方面，本发明的特征在于组合物，其包含如前述实施例中任一项所述的Treg。

在另一方面，本发明的特征在于组合物，其包含如前述方面所述的Treg和NK细胞的混合群。

在另一方面，本发明的特征在于抑制受试者的免疫反应的方法，该方法包括向受试者施用如前述方面中任一个所述的Treg、Treg和NK细胞的混合群、或药物组合物。在一些实施例中，免疫反应是针对同种异体抗原或自身抗原的Teff反应。

在另一方面，本发明的特征在于治疗或防止移植排斥的方法或治疗受试者的自身免疫性障碍的方法，该方法包括向受试者施用如前述方面中任一个所述的Treg、Treg和NK细胞的混合群、或组合物。

在一些实施例中，受试者患有自身免疫性障碍(例如，自闭症、自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、狼疮(lupus)、局灶节段性肾小球肾炎(focal segmental glomerulonephritis)或膜性肾病(membranousnephropathy))。

在一些实施例中，受试者是器官或组织移植受者。在如前述方面中任一个所述的一些实施例中，TCR特异性结合的HLA分子或其片段由存在于器官或组织供体的基因组中的核苷酸序列编码。在另外的实施例中，该方法进一步包括减少施用于受试者的免疫抑制剂的剂量(例如，减少10％、减少20％、减少30％、减少40％、减少50％、减少60％、减少70％、减少80％、减少90％、或减少100％)。优选地，免疫抑制剂的剂量减少至多50％(例如，减少10％、减少20％、减少30％、减少40％或减少50％)。

在一些实施例中，器官是肾脏、肝脏、心脏、肺、胰腺、肠、胃、睾丸、阴茎、胸腺或面部、手或腿血管复合同种异体移植物。在一些实施例中，组织包括骨、肌腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经组织、骨髓、朗格汉斯胰岛、干细胞、血液或血管。

在另一方面，本发明的特征在于用于产生如前述方面中任一个所述的Treg的方法，该方法包括(a)使包含从受者受试者获得的T细胞的免疫细胞群与HLA分子或自身抗原的片段和自体抗原呈递细胞(APC)接触；和(b)在足以形成包含多个Treg的扩增的T细胞系的时间和条件下扩增步骤(a)的免疫细胞群；以及任选地(c)从免疫细胞群中纯化Treg。

在一些实施例中，该方法包括重复步骤(a)和(b)超过一次。在一些实施例中，该方法包括重复步骤(a)和(b)超过三次，例如四次或五次。在另外的实施例中，步骤(a)大约每七至十天进行一次。

在一些实施例中，自体APC是外周血单核细胞(PBMC)、树突细胞、巨噬细胞或B细胞。在某些实施例中，自体APC是PBMC。在一些实施例中，对PBMC进行辐照。

在一些实施例中，包含T细胞的免疫细胞群是PBMC群、幼稚

T细胞群或纯化Treg群。在特定的实施例中，免疫细胞群是PBMC群。在另外的实施例中，步骤(a)进一步包括使受者受试者PBMC与IL-2接触。在一些实施例中，IL-2的浓度为约50IU/ml至约200IU/ml，例如约100IU/ml。在其他实施例中，HLA分子或自身抗原的片段的浓度为约25μg/ml至约200μg/ml，例如约50μg/ml。在一些实施例中，HLA分子的片段是纯化的肽或肽混合物。在一些实施例中，免疫细胞群包括NK细胞。在一些实施例中，步骤(c)包括从免疫细胞群中纯化Treg和NK细胞，从而产生Treg和NK细胞的混合群。

在另一方面，本发明的特征在于组合物，其包含：(a)如前述方面中任一个所述的Treg；和(b)HLA分子或自身抗原的片段。

在一些实施例中，组合物还包括IL-2。在一些实施例中，IL-2的浓度为约50IU/ml至约200IU/ml，例如约100IU/ml。在一些实施例中，HLA分子或自身抗原的片段的浓度为约25μg/ml至约200μg/ml，例如约50μg/ml。在一些实施例中，HLA分子或自身抗原的片段是纯化的肽或肽混合物。在一些实施例中，组合物还包括NK细胞。

定义

为方便起见，以下提供了说明书、实例和所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或从上下文中暗示，以下术语和短语包括以下提供的含义。提供这些定义是为了帮助描述特定的实施例，而不是为了限制所要求保护的技术，因为该技术的范围仅由权利要求限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语均具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如果本领域术语的用法与其在本文提供的定义之间存在明显差异，则以说明书中提供的定义为准。

免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在以下文献中找到：The MerckManual of Diagnosis and Therapy[默克诊疗手册],第19版,由默沙东公司(MerckSharp&Dohme Corp.)出版,2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编辑),The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine[分子细胞生物学和分子医学百科全书],由布莱克威尔科学公司(Blackwell Science Ltd.)出版,1999-2012(ISBN 9783527600908)；和Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference[分子生物学和生物技术：综合案头参考],由VCH出版公司(VCH Publishers,Inc.)出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann[维尔纳·鲁特曼免疫学],由爱思唯尔公司(Elsevier)出版,2006；Janeway’s Immunobiology[简氏免疫生物学],Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编辑),泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis Limited),2014(ISBN0815345305,9780815345305)；Lewin's Genes XI[Lewin的基因XI],由琼斯和巴特利特出版社(Jones&Bartlett Publishers)出版,2014(ISBN-1449659055)；Michael RichardGreen和Joseph Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆:实验室手册],第4版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港,纽约,美国(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology[分子生物学的基本方法],爱思唯尔科学出版公司(Elsevier Science Publishing,Inc.),纽约,美国(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA[酶学实验室方法：DNA],Jon Lorsch(编辑)爱思唯尔公司(Elsevier),2013(ISBN0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)[分子生物学现代方法(CPMB)],Frederick M.Ausubel(编辑),约翰威利父子公司(John Wiley and Sons),2014(ISBN 047150338X,9780471503385)；Current Protocols in Protein Science(CPPS)[蛋白质科学现代方法(CPPS)],John E.Coligan(编辑),约翰威利父子公司(JohnWiley and Sons,Inc.),2005；以及Current Protocols in Immunology(CPI)[免疫学现代方法(CPI)](John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strobe(编辑)约翰威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.),2003(ISBN0471142735,9780471142737)，将这些文献的内容均通过引用以其全文并入本文。

如本文所用的术语“约”在提及可测量值如量或浓度时，意在涵盖指定值的±10％、±5％、±1％、±0.5％或±0.1％的变化以及指定值。例如，“约X”，其中X是可测量值，意在包括X以及X的±10％、±5％、±1％、±0.5％或±0.1％的变化。本文提供的可测量值的范围可以包括其中的任何其他范围和/或单个值。

如本文所用，术语“施用”是指向受试者施用组合物(例如，分离的Treg、其药物组合物、任何另外的治疗剂和/或包括另外的治疗剂的任何药物组合物)。对动物受试者(例如，对人)的施用可以通过任何合适的途径。例如，施用可以是支气管(包括通过支气管滴注)、经颊、肠内、肠胃外、皮间、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌肉内、鼻内、腹膜内、鞘内、瘤内、静脉内、心室内、粘膜、经鼻、口服、直肠、皮下、舌下、外用、气管(包括通过气管内滴注)、透皮、阴道或玻璃体施用。施用可以是全身的或局部的。

如本文所用，“同种异体的”是指源自或获得自同一物种的不同受试者(例如，与移植受者来自同一物种的受试者)的细胞、组织、器官、核酸(例如，DNA)、或多肽(例如，蛋白质)、或其他分子。“同种异体抗原(alloantigen)”是指出现在同一物种的一些但不是所有成员中的抗原。

术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指展示在其表面与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原(例如，外来抗原)的细胞(例如，免疫系统细胞，如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞或巨噬细胞))。在一些实施例中，APC可以是专职APC(例如，表达II类MHC分子的细胞，包括B细胞、树突细胞或巨噬细胞)。在其他实施例中，APC可以是非专职APC(例如，表达I类MHC分子的细胞，如成纤维细胞、神经胶质细胞或内皮细胞)。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。

如本文所用，“自身抗原(autoantigen)”或“自体抗原(self-antigen)”是通常在受试者体内发现的任何物质，其在异常情况下不再被该受试者的淋巴细胞或抗体识别为受试者自身的一部分，并因此受到免疫系统攻击，就好像它是外来物质一样。自身抗原可以是天然存在的分子，例如通常由受试者自身产生和使用的蛋白质，引发可能导致受试者的自身免疫性疾病或障碍的免疫反应。

如本文所用，“自身免疫性疾病”或“自身免疫性障碍”的特征在于一个人的免疫系统无法区分外来细胞和健康细胞。这导致一个人的免疫系统针对一个人的健康细胞进行程序性细胞死亡。

如本文所用，术语“自体的”是指源自或获得自同一受试者或患者的细胞、组织、器官、核酸(例如，DNA)或多肽(例如，蛋白质)。

如本文所用，术语“片段”是指小于参考蛋白质的氨基酸序列的100％(例如，99％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的参考长度序列)，但包括例如5、6、7、8、9、10、15个或更多个氨基酸。片段可以具有足够的长度，以保持参考蛋白质的所需功能。

如本文所用，“免疫反应”是指生物体的免疫系统对物质做出的反应，该物质包括但不限于外来蛋白或自身蛋白。三种一般类型的“免疫反应”包括粘膜反应、体液反应和细胞免疫反应。免疫反应可包括以下中的至少一种：抗体产生、炎症、产生免疫、产生对抗原的超敏反应、抗原特异性淋巴细胞对抗原的反应、以及移植(transplant或graft)排斥。

“免疫抑制剂”(“immunosuppressant”或“immunosuppressive agent”)是防止、延迟发生针对宿主中的外来细胞(特别是移植细胞)的免疫反应或降低该免疫反应的强度的任何药剂。免疫抑制剂的实例包括但不限于环孢菌素、环磷酰胺、泼尼松、地塞米松、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、麦考酚酯、沙利度胺、FK-506、全身性类固醇、以及范围广泛的抗体、受体激动剂、受体拮抗剂、和本领域技术人员已知的其他此类药剂。

如本文所用，术语“分离的”是指与至少一种其他产品、化合物或组合物分开的产品、化合物或组合物，该产品、化合物或组合物在其天然存在的状态下(无论是在自然界中还是合成地制成)都与该至少一种其他产品、化合物或组合物相关联。

如本文所用，术语“主要组织相容性复合物”和“MHC”是指特定的基因簇，其中许多基因编码参与抗原呈递的进化相关细胞表面蛋白，这些蛋白质是组织相容性最重要的决定因素之一。MHC分子在本领域中也被称为主要组织相容性抗原。I类MHC或MHC-I功能主要是向CD8⁺T淋巴细胞呈递抗原。II类MHC或MHC-II功能主要是向CD4⁺T淋巴细胞呈递抗原。I类MHC分子是MHC中编码的重链(也称为α链)和β2-微球蛋白(β2M)的异源二聚体。重链的细胞外区域折叠成三个结构域(α1、α2和α3)，而β2M构成第四个结构域。I类MHC分子的肽结合位点主要由α1和α2结构域构成，它们形成结合抗原肽的凹槽。II类MHC分子也是异源二聚体，但不包括β2M，而是包括α链和β链，两者都在MHC中编码。II类MHCα链是包括细胞外α1和α2结构域的跨膜蛋白，而β链是包括细胞外β1和β2结构域的跨膜蛋白。α1和β1结构域形成II类MHC分子的肽结合位点。有关MHC及其功能的回顾，请参见，例如Janeway’s Immunobiology[简氏免疫生物学]，同上。

在人类中，MHC基因被称为“人类白细胞抗原”或“HLA”基因。例如，人类有三个I类MHCα-链基因，称为HLA-A、HLA-B和HLA-C，以及三对II类MHCα-和β-链基因，称为HLA-DR，HLA-DP和HLA-DQ。HLA-DR簇可能包含一个额外的β-链基因，其产物可以与DRα链配对。

如本文所用，术语“器官”是指作为整体专门用于执行特定身体功能的身体组织结构。在本文描述的发明的含义内，移植的器官包括，例如但不限于，心脏、肾脏、肝脏、肺、膀胱、输尿管、胃、肠(例如小肠和大肠)、皮肤、舌头、食道、内分泌腺(例如，胰腺、肾上腺、唾液腺、甲状腺、脑垂体等)、骨髓、脾脏、胸腺、淋巴结、肌腱、韧带、肌肉、子宫、阴道、卵巢、输卵管、阴茎、睾丸、角膜、晶状体、视网膜、中耳、外耳、耳蜗、虹膜和静脉。用于移植的器官还可以包括血管复合同种异体移植物，例如面部、手或腿。

术语“外周血单核细胞”或“PBMC”是指具有圆形核的任何血细胞，例如淋巴细胞、单核细胞或树突细胞。

如本文所用，术语“药物组合物”是指含有治疗剂的混合物，任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体组合，以施用于受试者(如哺乳动物，例如人)，从而防止、治疗或控制影响或可能影响受试者的特定疾病或病症。药物组合物可包括本文所述的分离的Treg。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指适合与受试者如哺乳动物(例如人)的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应和/或与合理的收益/风险比相称的其他问题并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用，术语“Treg和NK细胞的混合群”是指已用同种异体抗原或自身抗原刺激并根据本文所述的程序扩增的Treg和NK细胞的混合物。细胞可以以Treg细胞与NK细胞的比例为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:10、1:20、1:50、1:100、100:1、50:1、20:1、10:1、6:1、5:1、4:1、3:1或2:1存在。在优选的实施例中，细胞以Treg细胞与NK细胞的比例为6:1至2:1存在。如本文所述，Treg和NK细胞的混合群包括最少量的其他细胞类型，例如小于群体的2％(或1％或更小，或3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％)。

术语“防止”(preventing和prevention)是指将药剂或组合物施用至易患特定不良病症、障碍或疾病的临床无症状个体，并因此涉及防止疾病的至少一种体征或症状的发生。如本文所用，除非另有说明，否则术语“症状”包括体征和症状。

如本文所用，术语“排斥”或“移植排斥”是指器官移植受者的免疫反应引起针对移植器官、细胞或组织(无论是天然的还是生物人工的，如再细胞化组织)的反应的一个或多个过程，该一个或多个过程足以损害或破坏器官的正常功能。免疫系统反应可以涉及特异性(抗体和T细胞依赖性)机制或非特异性(吞噬、补体依赖性等)机制，或两者兼而有之。在一个实例中，肾移植的排斥或接受可以通过血液中的肌酐水平来测量，其中肌酐水平≥1.6mg/dl表示慢性排斥，而肌酐水平≤1.6mg/dl表示稳定的肾功能。

如本文所用，术语“特异性结合(specific binding和specifically binds)”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的物理相互作用，其中第一实体以比结合到非靶标的第三实体更高的特异性和亲和力结合到第二靶标实体。在一些实施例中，特异性结合可指第一实体对第二靶标实体的亲和力，该亲和力在相同条件下与对非靶标的第三实体的亲和力相比为至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更高。对给定靶标具有特异性的试剂是在所使用的测定条件下表现出对该靶标的特异性结合的试剂。非限制性实例包括抗体或配体，其识别并结合同源结合配偶体(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白质。

如本文所用，术语“受试者”是指可以向其施用根据本发明的组合物的任何生物体，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括任何动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、非人灵长类动物和人)。优选地，受试者是人。受试者可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将在未来接受治疗，或者是在针对特定疾病或病症受过训练的专业人员的照料下的人或动物。受试者可以是患者(例如，移植受者)。

如本文所用，“抑制”功能或活性是在与除感兴趣的条件或参数之外的其他相同条件相比，或者可替代地与另一条件(例如，受试者的免疫反应)相比时，降低功能或活性。“免疫抑制”作用或反应通常是指由APC产生或表达细胞因子或其他分子，以减少、遏制或防止免疫反应。当APC对识别由该APC呈递的抗原的免疫细胞产生免疫抑制作用时，该免疫抑制作用被称为对所呈递的抗原具有特异性。

如本文所用，术语“T细胞”是指在细胞介导的免疫中起核心作用的一类淋巴细胞。通过细胞表面上存在T细胞受体(TCR)，可以将T细胞与其他淋巴细胞(如B细胞和自然杀伤细胞)区分开来。T细胞不呈递抗原，并依赖其他淋巴细胞(例如，自然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞)来协助抗原呈递。存在几个T细胞亚组(例如，辅助性T细胞、记忆性T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤性T细胞、γδT细胞和粘膜相关的恒定T细胞)，每个都具有不同的功能。

如本文所用，术语“调节性T细胞”和“Treg”是指免疫抑制性T细胞的亚群，其通常表征为表达标志物CD4、FOXP3和CD25。Treg调节免疫系统，维持对自体抗原的耐受，防止自身免疫性疾病，并且还抑制抗肿瘤免疫反应。

“组织”是指具有相似形态和功能的一组细胞。在本文描述的发明的含义内，能够移植的组织包括但不限于骨、肌腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经组织、骨髓、朗格汉斯胰岛、干细胞、血液、血管、软骨、韧带、神经和中耳。

如本文所用，术语“移植”是指已从一个受试者的起源部位转移到相同或不同受试者的接受部位的器官、器官的一部分、组织、工程化组织或细胞。例如，在同种异体移植物移植程序中，移植的起源部位在供体个体中，而接受部位在另一个受者个体中。

如本文所用，“移植供体”是从中取出器官、器官的一部分、组织、工程化组织或细胞以移植到受者中的哺乳动物。“移植受者”是指接受取自供体的器官、器官的一部分、组织、工程化组织或细胞的哺乳动物。

如本文所用，术语“治疗”(treat、treatment、treating)或“改善”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、遏制、减缓或停止与疾病或障碍相关的病症(例如，移植排斥或GHVD)的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病症、疾病或障碍的至少一种副作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。可替代地，如果疾病的进展减慢或停止，则治疗是有效的。也就是说，治疗不只包括症状或标志物的改善，而且还包括与在没有治疗的情况下预期的情况相比，使症状的进展或恶化停止或至少减缓。有益的或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状、减弱疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、有所缓和(无论是部分缓和还是完全缓和)、和/或降低死亡率，无论是可检测的还是不可检测的。术语“治疗”疾病还包括使疾病的症状或副作用缓解(包括姑息治疗)。

本发明提供了许多优点。例如，本发明提供了一种促进同种异体移植物接受性的免疫疗法，其具有减少或消除对免疫抑制药物治疗的需要的潜力。该疗法可以针对每位患者进行个体化处理，并且不需要供体组织，因此适用于接受过已故或活体供体移植的受试者。可以在移植后的任何时间开始疗法，并且该疗法是一种适用于任何类型的实体器官移植的方法。此外，本发明适用于抑制对间接、半直接和/或直接同种异体抗原识别的免疫反应。本发明还可用于提供针对急性和慢性移植排斥两者的保护。此外，本发明可用于治疗自身免疫性障碍，例如通过用自身抗原刺激Treg。

本发明的另一个特征是它在本质上并不具有广泛的免疫抑制性，而是通过调节机体自身的免疫反应来促进同种异体移植物接受性。由于对病原体的整体反应干扰较低，同种异体抗原特异性方法或自身抗原特异性方法在策略上更安全，并因此与对第三方抗原的低感染耐受相关。

本发明的其他特征和优点将从其优选实施例的以下描述中以及从权利要求中显而易见。

附图说明

图1A-1D是一系列显示了来自移植受者的CD4⁺和CD4⁺CD25^-T细胞响应供体特异性同种异体抗原的增殖的图。细胞增殖是通过复制指数来测量的，复制指数是所有细胞在被细胞增殖染料染色后经历的平均分裂次数。

图2是显示用供体特异性抗原刺激Treg前和刺激Treg后的CD4⁺T细胞增殖的图。在Treg接受一次、两次或三次刺激后测量增殖。

图3是一系列显示了无论受试者接受的免疫抑制药物方案的不同组合如何，Treg的抑制能力的图。

图4是显示特异性HLA-DR同种异体肽之间Treg抑制能力差异的图。没有观察到显著差异。

图5A-5F是一系列显示了在转孔膜(transwell membrane)存在(接触依赖性)和不存在(非接触依赖性)的情况下Treg的抑制能力的图。图5A是一系列显示了受试者035中的接触依赖性免疫抑制的图。图5B是一系列显示了受试者008中的接触依赖性免疫抑制的图。图5C是一系列显示了用Treg和T细胞克隆10E9、1G11、10H9和10B5进行的接触依赖性免疫抑制的图。图5D是一系列显示了受试者022中的接触依赖性免疫抑制的图。图5E是一系列显示了受试者002中的接触依赖性免疫抑制的图。图5F是一系列显示了受试者036中的接触依赖性免疫抑制的图，该受试者具有两个HLA错配(HLA-DR1和HLA-DR15)。Treg3-3次刺激后的T系；Treg4-4次刺激后的T系；Treg5-5次刺激后的T系。

图6是一系列显示了Treg响应直接同种异体识别和间接同种异体识别的抑制作用的图。

图7A-7C是一系列显示了Treg在自体和第三方响应者中响应供体特异性同种异体刺激(allostimulation)的抑制作用的图。图7A是一系列显示了用来自受试者038的Treg进行的受试者038(HLA-DR4错配)、011(HLA-DR4错配)和023(HLA-DR15错配)中的免疫反应的图。图7B是一系列显示了用来自受试者002的Treg进行的受试者002(HLA-DR1错配)、035(HLA-DR1错配)和037(HLA-DR4错配)中的免疫反应的图。图7C是一系列显示了用来自受试者004的Treg进行的受试者004(HLA-DR1错配)、023(HLA-DR15错配)和011(HLA-DR4错配)中的免疫反应的图。据观察，Treg抑制了特异性针对供体同种异体抗原的免疫反应。

图8A-8C是一系列显示了Treg的旁观抑制作用的图。在图8A中，受试者036具有HLA-DR1和HLA-DR15错配。在图8B中，受试者004具有HLA-DR1和HLA-DR15错配。在图8C中，受试者022具有HLA-15和HLA-17错配。观察到Treg在具有超过一个HLA错配的受试者中表现出旁观免疫抑制作用。

图9是一系列显示了抗IL-10抗体对Treg免疫抑制活性的作用的图。观察到抗IL-10抗体对Treg的抑制活性没有作用。

图10是一系列显示了A2A受体拮抗剂伊曲茶碱对Treg免疫抑制活性的作用的图。伊曲茶碱被证明可以消除Treg的抑制活性。

图11是一系列显示了伊曲茶碱对受试者016、018、037和037中Treg的免疫抑制活性的作用的图。

图12A-12H是一系列显示了如通过流式细胞术针对从受试者023、035、046和052产生的Treg所分析的，与特征性Treg表型相关的表型标志物的图。CD4⁺T细胞上调CD25和Foxp3，同时下调CD127。CD4⁺T细胞还上调GITR、CTLA4、ICOS、GARP、LAP、PD-1、CD39、CD73、CD45RA、CXCR3和CCR6。

具体实施方式

本文披露了使用对一种或多种供体同种异体抗原具有特异性的患者调节性T细胞(Treg)进行的针对移植患者的个体化免疫疗法。Treg能够抑制对供体同种异体抗原的T效应细胞(Teff)免疫反应，从而促进同种异体移植物的接受性，而无需免疫抑制剂。这种使用患者产生的Treg进行的方法允许在不需要供体组织的情况下进行个体化疗法。此外，该方法提供了在治疗自身免疫性障碍中针对自身抗原具有特异性的Treg的产生和使用。Treg的使用避免了非特异性免疫抑制，从而保护患者免受免疫抑制治疗导致的感染风险。此外，本文所述的Treg还可用于包含Treg和自然杀伤细胞(NK细胞)的群体中。

Treg是免疫系统的重要组成部分，充当免疫反应的“专业”抑制剂。它们在维持同种异体移植物功能方面的重要性已在多个体外和体内模型中得到证明(参见，例如Duran-Struuck等人,Transplantation[移植]101(2):274-283,2017；Lam等人,Transplantation[移植]101(10):2277-2287,2017)。根据经典的表型描述，Treg是CD4⁺细胞，其组成型表达高水平的白介素(IL)-2受体α-链CD25以及转录因子Foxp3，Foxp3被认为是用于发展和维持调节功能的重要组成部分(参见，例如Vaikunthanathan等人,Clin.Exp.Immunol.[临床和实验免疫学]189(2):197-210,2017)。另一种表面标志物CD127与Foxp3表达呈负相关，并且可用于鉴定Treg(参见，例如Liu等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]203(7):1701-11,2006)。Treg在疗法中用于诱导对同种异体移植物的耐受或作为免疫调节的潜在用途已引起人们对增加Treg数量的兴趣，包括通过抗原特异性方式或非特异性方式开发不同的扩增方案。在抗原特异性扩增中，Treg通常通过由供体B细胞或树突细胞呈递同种异体抗原的直接方法，或通过使用自身树突细胞进行间接呈递而暴露于同种异体抗原(参见，例如Veerapathran等人,Blood[血液]118(20):5671-80,2011)。供体同种异体抗原特异性Treg已被证明比非特异性多克隆Treg有效五到十倍(参见，例如Vaikunthanathan等人,Clin.Exp.Immunol.[临床和实验免疫学]189(2):197-210,2017)。

分离的Treg和NK细胞

本发明的分离的Treg和NK细胞源自受试者(例如，移植受者或患有自身免疫性障碍的受试者)的T细胞和NK细胞。可用于本发明的T细胞和NK细胞包括获得自受试者的自体T细胞和NK细胞(例如，人T细胞和NK细胞)，这些细胞在离体修饰和扩增后随后将向该受试者施用。T细胞和NK细胞通常从外周血中获得，外周血通过例如静脉穿刺或通过植入的端口或导管进行抽取而从受试者中收集。任选地，可以通过包括白细胞去除术在内的过程获得血液，其中从受试者的血液中获得白细胞，而将其他血液成分返回给受试者。可以使用本领域已知的方法处理血液或白细胞去除术产品(新鲜的或冷冻保存的)以富集T细胞。因此，例如，可以进行密度梯度离心(使用例如Ficoll)和/或逆流离心淘析以富集单核细胞(包括T细胞)。可以进一步进行使用例如IL-2的T细胞刺激步骤以刺激T细胞并耗尽其他细胞。然后可以对富集的T细胞制剂的T细胞进行离体修饰。

在一些实施例中，本文所述的Treg和NK细胞对供体同种异体抗原具有特异性并且能够抑制针对特定同种异体抗原的免疫反应。例如，供体同种异体抗原可以是存在于移植供体中但不存在于移植受者中的MHC分子。特别地，Treg和NK细胞对其具有特异性的供体同种异体抗原可以是存在于移植供体中但不存在于移植受者中的人类白细胞抗原(HLA)。当移植供体和受者具有不同的HLA时，这称为HLA错配。移植受者与供体可能具有超过一个HLA错配。本文所述的Treg和NK细胞对移植受者中的HLA错配具有特异性。

例如，Treg和NK细胞可以对HLA-DR蛋白具有特异性，例如HLA-DR1、HLA-DR2、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR5、HLA-DR6、HLA-DR7、HLA-DR8、HLA-DR9、HLA-DR10、HLA-DR11、HLA-DR12、HLA-DR13、HLA-DR14、HLA-DR15、HLA-DR16、HLA-DR17、HLA-DR18、HLA-DR51、HLA-DR52、或HLA-DR53蛋白，或本领域已知的任何其他HLA-DR血清型。在另一个实例中，Treg和NK细胞可以对HLA-DQ蛋白具有特异性，例如HLA-DQ2、HLA-DQ3、HLA-DQ4、HLA-DQ5、HLA-DQ6、HLA-DQ7、HLA-DQ8、或HLA-DQ9肽，或本领域已知的任何其他HLA-DQ血清型。在另一个实例中，Treg和NK细胞可以对HLA-DP蛋白具有特异性，例如HLA-DPw1、HLA-DPw2、HLA-DPw3、HLA-DPw4、HLA-DPw5、或HLA-DPw6蛋白，或本领域已知的任何其他HLA-DP血清型。在另一个实例中，Treg和NK细胞可以对HLA-A肽具有特异性，例如HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、HLA-A10、HLA-A11、HLA-A19、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A28、HLA-A29、HLA-A30、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A36、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69、HLA-A74、或HLA-A80蛋白，或本领域已知的任何其他HLA-A血清型。在另一个实例中，Treg和NK细胞可以对HLA-B蛋白具有特异性，例如HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、HLA-B22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-B41、HLA-B42、HLA-B44、HLA-B45、HLA-B46、HLA-B47、HLA-B48、HLA-B49、HLA-B50、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B53、HLA-B54、HLA-B55、HLA-B56、HLA-B57、HLA-B58、HLA-B59、HLA-B60、HLA-B61、HLA-B62、HLA-B63、HLA-B64、HLA-B65、HLA-B67、HLA-B70、HLA-B71、HLA-B72、HLA-B73、HLA-B75、HLA-B76、HLA-B77、HLA-B78、HLA-B81、HLA-B*82、或HLA-B*83蛋白，或本领域已知的任何其他HLA-B血清型。在另一个实例中，Treg和NK细胞可以对HLA-C蛋白具有特异性，例如HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7、HLA-Cw8、HLA-Cw9、HLA-Cw10、或HLA-Cw11蛋白，或本领域已知的任何其他HLA-C血清型。

在另一个实例中，本文所述的Treg和NK细胞对导致自身免疫性障碍的自身抗原具有特异性。自身抗原可以是例如导致类风湿性关节炎、狼疮或膜性肾病的自身抗原。自身抗原也可以是例如导致自闭症或自闭症谱系障碍的自身抗原。

在前述实例中的任一个中，Treg和NK细胞可以对全长HLA肽或自身抗原具有特异性。可替代地，Treg和NK细胞可以对HLA肽的片段(例如，HLA肽的β-链片段)或自身抗原的片段具有特异性。特别地，Treg和NK细胞可以抑制针对前述HLA肽或自身抗原或其片段中的任一者的Teff免疫反应。

通过本文描述的方法产生的Treg的特征可在于存在或不存在一种或多种另外的分子标志物，其可以通过本领域已知的标准方法(例如，流式细胞术)容易地评估。通过本文描述的方法产生的Treg可以表达一种或多种选自CD4、CD25、Foxp3、GITR、CTLA4、ICOS、GARP、LAP、PD-1、CD39、CD73、CD45RA、CXCR3和CCR6的标志物。此外，Treg可下调或缺乏CD127的表达。例如，Treg可具有CD4⁺CD25⁺CD127^-表型。Treg也可具有CD4⁺CD25⁺CD39⁺表型。在另一个实例中，Treg可具有CD4⁺CD25⁺CD73⁺表型。在前述实例的任一个中，Treg还可表达一种或多种选自GITR、CTLA4、ICOS、GARP、LAP、PD-1、CD39、CD73、CD45RA、CXCR3和CCR6的标志物。NK细胞的特征还在于存在或不存在一种或多种另外的分子标志物，如CD56或CD16。

产生Treg和NK细胞的方法

产生Treg和NK细胞

本发明的Treg通常由免疫细胞群(例如，从受试者获得的PBMC)产生，该免疫细胞群包含源自受试者(例如，移植受者或患有自身免疫性疾病或障碍的受试者)的T细胞。任选地，免疫细胞群还包括NK细胞。通常，用于离体刺激T细胞的方法是本领域已知的。对于本文描述的方法，通过使细胞与HLA分子(如HLA肽)或自身抗原的片段(例如β-链片段)和自体APC(例如PBMC、树突细胞、巨噬细胞或B细胞)接触来刺激T细胞。免疫细胞群可以是PBMC群、幼稚T细胞群或源自受试者(例如，移植受者或患有自身免疫性疾病或障碍的受试者)的分离的Treg群，并且任选地包括NK细胞。例如，免疫细胞群可以与以下浓度的HLA肽或自身抗原接触：约25μg/ml至约200μg/ml，例如约25μg/ml至约150μg/ml、约25μg/ml至约100μg/ml、约25μg/ml至约75μg/ml、约25μg/ml至约50μg/ml、约30μg/ml至约200μg/ml、约30μg/ml至约150μg/ml、约30μg/ml至约100μg/ml、约30μg/ml至约75μg/ml、约40μg/ml至约200μg/ml、约40μg/ml至约150μg/ml、约40μg/ml至约100μg/ml、约40μg/ml至约75μg/ml、约50μg/ml至约200μg/ml、约50μg/ml至约150μg/ml、约50μg/ml至约100μg/ml、或约50μg/ml至约75μg/ml。在一个特定的实例中，HLA肽或自身抗原的浓度为50μg/ml。

为了扩增T细胞系，可以在IL-2存在的情况下刺激免疫细胞群。用于该方法的IL-2的浓度可为例如约50IU/ml至约200IU/ml，例如约50IU/ml至约150IU/ml、约50IU/ml至约100IU/ml、约70IU/ml至约200IU/ml、约70IU/ml至约150IU/ml、约100IU/ml至约200IU/ml、约100IU/ml至约150IU/ml、或约150IU/ml至约200IU/ml。在一个特定的实例中，IL-2的浓度为100IU/ml。

免疫细胞群可以在IL-2存在下用HLA肽或自身抗原和自体APC刺激一次。在其他情况下，细胞被刺激超过一次，例如两次、三次、四次或五次。每次刺激之间的时间间隔是例如七到十天之间，例如七天、八天、九天或十天。

本文描述的用于提供Treg的方法可以在T细胞群或包括Treg和NK细胞两者的免疫细胞群上进行。在一些实施例中，随后从T细胞群或从免疫细胞群中纯化Treg。在另外的实施例中，从免疫细胞群中纯化Treg和NK细胞的混合群。用于分离Treg和NK细胞的方法是本领域已知的。例如，可以使用许多市售的分离试剂盒(实验室规模分离)以及FACS细胞分选仪(GMP分离)从混合群中纯化Treg。在本文所述的标准制剂中，Treg被纯化并且这种纯化通常包括NK细胞。

HLA分子

如上所述，可用于治疗或防止移植排斥或促进同种异体移植物接受性的Treg对存在于器官或组织移植供体中但不存在于受者中的同种异体抗原(例如HLA蛋白)具有特异性。在供体中发现但在受者中未发现的HLA蛋白称为HLA蛋白错配。这些识别错配的HLA蛋白的Treg可以通过使Treg与一个或多个HLA肽片段接触来产生，这些片段可以是重叠的或不重叠的。此类HLA肽片段是从存在于供体HLA蛋白中但不存在于受者HLA蛋白中的错配的HLA蛋白序列部分产生的。例如，HLA肽可以基于例如任何已知HLA血清型(例如，上述任何HLA血清型)或其片段的β-链序列的高变区的序列合成。在一些实施例中，HLA肽片段是从如下UniProt登录号的HLA-DRB序列产生的：P04229、P01912、P13760、P13761、Q30134、Q9TQE0、Q30167、P20039、Q95IE3、Q5Y7A7、Q9GIY3、P01911、或Q29974。HLA片段可以是约10-100、15-50或18-22个氨基酸长的肽。表1提供了已知HLA基因型及其相应血清型的表格。

表1.HLA I类和II类基因型和血清型

除了上面列出的那些之外，任何其他HLA蛋白及其肽片段也可用于制备本文描述的发明的Treg。肽可以通过本领域技术人员已知的方法(例如固相合成)容易地合成，或者它们可以通过多种商业来源合成或从多种商业来源获得。一种或多种对应于HLA蛋白的HLA肽片段可用于刺激如本文所述的Treg。示例性HLA-DR肽片段序列可见于Vella等人,Transplantation[移植].27；64(6):795-800,1997中，将其通过引用以其全文并入本文。

在一个工作实例中，鉴定了至少一个HLA-DR蛋白错配，其中在移植供体中发现了HLA-DR蛋白，但在受者中未发现。合成了一组基于一种或多种错配的HLA-DR蛋白的HLA-DR肽片段，其中这些肽对于供体的错配的HLA-DR蛋白而言是独特的，并且不与受者的HLA-DR蛋白重叠。这些肽片段是基于错配的HLA-DR蛋白的β-链高变区合成的，并且可以例如对应于以下序列：

表2.示例性β-链HLA-DR肽片段序列

虽然表2中的序列是作为可用于本发明的肽片段的实例提供的，但其他肽片段可根据本文所述的程序合成。表2中提供的肽片段不应被解释为限制可用于产生如本文所述的Treg的程序的HLA肽片段序列的范围。

示例性抑制机制

已经描述了几种有助于Treg功能的非接触依赖性和接触依赖性机制，它们通常同时工作。不受理论的束缚，本文所述的Treg可通过下文所述的一种或多种机制抑制免疫反应。

已描述的非接触依赖性机制包括抗炎细胞因子的产生(例如，IL-10、IL-35和TGF-β)(参见，例如Maloy等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]197(1):111-9,2003)以及miRNA的转移，其可以通过外泌体沉默T细胞中的特定基因，从而防止增殖以及细胞因子的产生(参见，例如Okoye等人,Immunity[免疫]41(1):89-103,2014)。

接触依赖性机制包括但不限于CTLA-4与其配体B7.1和B7.2在APC上的相互作用，导致防止T细胞激活的负信号(参见，例如Vasu等人,J.Immunol.[免疫学杂志]173(4):2866-76,2004和DiPaolo等人,J.Immunol.[免疫学杂志]179(7):4685-93,2007)；细胞表面LAG-3表达，其结合II类MHC分子并防止APC的成熟和激活效应T细胞的能力；膜结合活性TGFβ-1在Treg群上的表达(参见，例如Savage等人,J.Immunol.[免疫学杂志]181(3):2220-6,2008)；经由CTLA-4和程序性细胞死亡1(PD-1)的接合诱导细胞凋亡(参见，例如Francisco等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]206(13):3015-29,2009)；颗粒酶A/B表达(参见，例如Grossman等人,Blood[血液]104(9):2840-8,2004)；IL-2剥夺(参见，例如Pandiyan等人,Nat.Immunol.[自然免疫学]8(12):1353-62,2007)；以及通过破坏腺苷能代谢途径。

人Treg通过腺苷能途径的抑制涉及将ATP依次转化为AMP和腺苷，腺苷结合效应T细胞上的A2a受体。这通过细胞质cAMP的升高激活免疫抑制环，导致促炎细胞因子的产生和增殖减少(参见，例如Mandapathil等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]285(10):7176-86,2010)。

药物组合物

可将本文所述的Treg掺入用于施用于受试者(例如接受器官、组织或细胞移植的人患者，或患有自身免疫性障碍的患者)的媒介物中。可以使用本领域已知的方法制备含有Treg细胞的药物组合物。此外，药物组合物可包括Treg和NK细胞的混合群。此类组合物可使用如本领域技术人员确定合适的多种药学上可接受的载体来制备(参见，例如Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacology[雷明顿：药理学的科学与实践]第22版,Allen,L.编辑(2013)；Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems[药物剂型和药物递送系统],第7版,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams and Wilkins)(2004)；Kibbe等人,Handbook ofPharmaceutical Excipients[药物赋形剂手册],第3版,医药出版社(PharmaceuticalPress)(2000))。可以使用多种药学上可接受的载体，包括媒介物、助剂和稀释剂。此外，还可以使用多种药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等。非限制性示例性载体包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。

治疗方法和用途

本文所述的Treg(任选地在包括NK细胞的群体中)可用于抑制免疫反应以促进接受器官或组织移植的患者的同种异体移植物接受性，或用于治疗或防止移植排斥。器官可以是可移植的任何器官，包括但不限于心脏、肾脏、肝脏、肺、膀胱、输尿管、胃、肠(例如小肠或大肠))、皮肤、舌头、食道、内分泌腺(例如，胰腺、肾上腺、唾液腺、甲状腺、脑垂体等)、骨髓、脾脏、胸腺、淋巴结、肌腱、韧带、肌肉、子宫、阴道、卵巢、输卵管、睾丸、阴茎、角膜、晶状体、视网膜、中耳、外耳、耳蜗、虹膜和静脉。可以移植的器官还包括血管复合同种异体移植物，例如面部、手或腿。组织可以是可移植的任何组织，包括但不限于骨、骨髓、朗格汉斯胰岛、干细胞、血液、血管、神经组织、软骨、肌腱、韧带、角膜、心脏瓣膜、神经和/或静脉、中耳、培养组织(例如，可以作为器官或组织发挥作用的分化细胞)、和/或3D工程化组织。细胞可以是可移植的任何细胞(例如，干细胞(例如，造血干细胞))。

目前有多种公认的方案来促进移植受者对供体器官或组织的耐受。通常，这些方案包括施用免疫抑制剂以防止受者对移植器官或组织的排斥。在一个实例中，对于与供体匹配的移植受者HLA，该方案包括施用环磷酰胺、胸腺辐照和抗胸腺细胞球蛋白。在另一个实例中，对于与供体错配的移植受者HLA，该方案包括施用环磷酰胺、抗CD2抗体、胸腺和骨髓辐照，并且可以使用或不使用利妥昔单抗。在另一个实例中，对于与供体匹配的移植受者HLA，该方案涉及施用环磷酰胺、氟达拉滨和CD34+细胞。用于促进同种异体移植物接受性的其他方法是本领域技术人员已知的。

除了用于促进同种异体移植物接受性的任何公认的方案之外或替代用于促进同种异体移植物接受性的任何公认的方案，还可以施用Treg或Treg和NK细胞的混合群。在某些情况下，在施用Treg后减少免疫抑制剂的施用。在施用Treg或Treg和NK细胞的混合群后，免疫抑制剂的剂量可减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实例中，在用Treg或Treg和NK细胞的混合群治疗后，免疫抑制剂的剂量减少约50％。在另一个实例中，在施用Treg或Treg和NK细胞的混合群后停止施用免疫抑制剂。

本发明的Treg或Treg和NK细胞的混合群也可用于治疗自身免疫性障碍，如自闭症、自闭症谱系障碍、类风湿性关节炎、狼疮、局灶节段性肾小球肾炎和膜性肾病。自身免疫性疾病或障碍的另外的非限制性实例包括但不限于炎性关节炎、1型糖尿病、多发性硬化症、牛皮癣、炎性肠病和血管炎、过敏性炎症(如过敏性哮喘、特应性皮炎、接触性超敏反应)、格雷夫斯病(Graves’disease)(甲状腺功能亢进)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)(甲状腺功能减退)、乳糜泻、克罗恩病(Crohn’s disease)和溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、原发性胆汁性硬化/肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、雷诺现象(Raynaud’s phenomenon)、硬皮病、干燥综合征(Sjogren’ssyndrome)、古德帕斯特综合征(Goodpasture’s syndrome)、韦格纳肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)、风湿性多肌痛、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、慢性疲劳综合征(CFS)、自身免疫性阿狄森氏病(autoimmune Addison’s Disease)、强直性脊柱炎、急性播散性脑脊髓炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、眼阵挛性肌阵挛综合征、视神经炎、奥德氏甲状腺炎(Ord’s thyroiditis)、天疱疮、恶性贫血、犬多发性关节炎、赖特综合征(Reiter’s syndrome)、高安氏大动脉炎(Takayasu’s arteritis)、温热性自身免疫性溶血性贫血(warm autoimmune hemolytic anemia)、和纤维肌痛(FM)。

组合疗法

本文所述的Treg或Treg和NK细胞的混合群可与其他已知的药剂和疗法组合使用。如本文所用，“组合”施用是指在受试者患有障碍(例如疾病或病症)的过程中向该受试者递送两种(或更多种)不同治疗，例如，在该受试者被诊断患有该障碍之后且该障碍已经被治愈或消除或因其他原因停止治疗之前递送该两种或更多种治疗。在一些实施例中，当第二治疗的递送开始时，第一治疗的递送仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这有时在本文中被称为“同时递送(simultaneous delivery)”或“并行递送(concurrent delivery)”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施例中，由于组合施用，治疗更有效。例如，与不存在第一治疗的条件下施用第二治疗所观察到的结果相比，第二治疗更有效，例如使用更少的第二治疗观察到等效的作用，或者第二治疗将症状减少更大的程度，或者观察到对第一治疗而言类似的情况。在一些实施例中，递送使得症状或与障碍相关的其他参数的减少大于在没有另一种治疗的情况下递送的一种治疗所观察到的结果。这两种治疗的作用可以是部分相加的、完全相加的、或大于相加的。该递送可以使得所递送的第一治疗的作用在递送第二治疗时仍然可检测。本文所述的Treg或Treg和NK细胞的混合群以及至少一种另外的治疗剂可以同时、在相同或分开的组合物中、或依次施用。对于依次施用，可以首先施用Treg或Treg和NK细胞的混合群，然后可以施用另外的药剂。可替代地，施用顺序可以颠倒，并且可以首先施用另外的药剂，然后可以施用Treg或Treg和NK细胞的混合群。Treg或Treg和NK细胞的混合群细胞疗法和/或其他治疗剂、程序或方式可以在活动性障碍期间或在缓和期或活动度较低的疾病期间施用。Treg或Treg和NK细胞的混合群细胞疗法可以在另一种治疗前、与治疗并行、治疗后、或障碍的缓和期间施用。

当组合施用时，本文所述的Treg或Treg和NK细胞的混合群以及另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部可以以与单独使用的每种药剂(例如作为单一疗法)的量或剂量相比更高、更低或相同的量或剂量施用。在某些实施例中，Treg或Treg和NK细胞的混合群、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的施用量或剂量与单独使用的每种药剂的量或剂量相比更低(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施例中，产生期望效果(例如，治疗癌症)的Treg或Treg和NK细胞的混合群、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的量或剂量与实现相同治疗效果所需的单独每种药剂的量或剂量相比更低(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。

例如，一种或多种另外的治疗剂可以包括通常用于器官或组织移植的一种或多种免疫抑制剂。一种或多种免疫抑制剂可以是移植后立即给予以防止急性排斥的药剂(例如，甲基强的松龙、抗胸腺细胞丙种球蛋白(atgam)、胸腺球蛋白、巴利昔单抗或阿仑单抗)或用于维持的一种或多种免疫抑制剂(例如，泼尼松、钙调神经蛋白抑制剂(例如，环孢菌素或他克莫司)、吗替麦考酚酯、硫唑嘌呤、西罗莫司或依维莫司)。器官移植后给予的其他免疫抑制剂包括CTLA-4融合蛋白(例如，贝拉西普或阿巴西普)、皮质类固醇(例如，甲基强的松龙、地塞米松或泼尼松龙)、细胞毒性免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、巯嘌呤、或甲氨蝶呤)、免疫抑制剂抗体(例如，抗胸腺细胞球蛋白、巴利昔单抗或英夫利昔单抗)、西罗莫司衍生物(例如，依维莫司或西罗莫司)、和抗增殖剂(例如，吗替麦考酚酯、麦考酚酸钠或硫唑嘌呤)。适用于本文描述的发明的用途的另外的免疫抑制剂是本领域技术人员已知的，并且本发明在此方面不受限制。

此外，鉴于本文所述的结果，从肾移植患者产生的供体肽驱动的T细胞系的抑制活性涉及腺苷能途径。鉴于这些结果，另外的组合疗法涉及将Treg输注与另外的治疗相结合，这些另外的治疗是例如腺苷受体激动剂(例如，瑞加德松)或在移植物中增加CD39表达(例如，通过施用免疫调节治疗，如干扰素β、芬戈莫德、阿仑单抗和皮质激素)以实现移植耐受。

施用途径

可以通过标准方法将有效量的、本文描述的用于治疗或防止疾病或障碍(例如，移植排斥或自身免疫性障碍)或用于促进同种异体移植物接受性的治疗剂(例如，对供体同种异体抗原或自身抗原具有特异性的Treg或Treg和NK细胞的混合群)施用于受试者。例如，药剂可以通过多种不同途径中的任一种施用，包括例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮内、皮下、经皮注射、口服、透皮(外用)、经动脉、瘤内、结内、髓内或经粘膜施用。在一些实施例中，可以将药剂(例如，对供体同种异体抗原或自身抗原具有特异性的Treg或Treg和NK细胞的混合群)直接施用(例如，通过注射或输注)到移植器官或组织中。在一个实施例中，将本文所述的组合物施用到体腔或体液(例如，腹水、胸膜液、腹膜液或脑脊液)中。例如，可以将治疗剂(例如，对供体同种异体抗原或自身抗原具有特异性的Treg或Treg和NK细胞的混合群)通过注射或输注施用，例如，肌肉内、皮下、腹膜内或静脉内施用。在任何给定情况下最合适的施用途径将取决于施用的特定药剂，患者，所治疗的特定疾病或病症，药物配制品方法，施用方法(例如，施用时间和施用途径)，患者的年龄、体重、性别，所治疗疾病的严重程度，患者的饮食和患者的排泄率。可以例如以粘性形式封装或注射药剂(例如，对供体同种异体抗原或自身抗原具有特异性的Treg或Treg和NK细胞的混合群)，用于递送到选定位点。药剂可以以能够将该药剂递送至选定位点的基质形式提供。基质可以提供药剂的缓慢释放，并为细胞浸润提供适当的呈递和合适的环境。基质可以由目前用于其他植入医疗应用的材料形成。基质材料的选择基于以下中的任何一项或多项：生物相容性、生物可降解性、机械性能、以及外观和界面性能。一个实例是胶原基质。

可以将治疗剂(例如，对供体同种异体抗原或自身抗原具有特异性的Treg或Treg和NK细胞的混合群)掺入适合施用于受试者(例如人)的药物组合物中。这样的组合物通常包括药剂和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是已知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则此类介质可用于本文所述。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。

给药

如本文所用，术语“单位剂型”是指适合一次施用的剂量。举例来说，单位剂型可以是布置在递送装置(例如，注射器或静脉内滴注袋)中的一定量的治疗剂。例如，单位剂型以单次施用方式施用。在另一个实例中，可以同时施用超过一种单位剂型。

在一些实施例中，将Treg或Treg和NK细胞的混合群作为单一疗法施用，即，针对该病症的另一种治疗不并行施用于受试者。Treg或Treg和NK细胞的混合群组合物可以一次施用于患者。如果需要，Treg细胞组合物也可以多次施用。Treg或Treg和NK细胞的混合群可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术进行施用(参见，例如Rosenberg等人,New EnglandJournal of Medicine[新英格兰医学杂志]319:1676(1988))。

对患者施用的上述治疗的剂量将随着所治疗病症的确切性质和治疗受者而变化。可根据本领域接受的实践进行针对人施用的剂量的缩放(scaling)。

在一些实施例中，需要单次治疗方案。在其他实施例中，可以进行一个或多个后续剂量或治疗方案的施用。例如，在每两周治疗一次持续三个月后，可以每月重复治疗一次，持续六个月或一年或更长时间。在一些实施例中，在初始治疗之后不施用另外的治疗。

如本文所述的组合物的剂量可由医师确定并根据需要进行调整以适应观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常会对受试者进行监测，以确定治疗何时提供治疗益处，并确定是否施用另外的细胞、停止治疗、恢复治疗或对治疗方案进行其他更改。剂量不应大到引起不良副作用，如细胞因子释放综合征。通常，剂量将随着患者的年龄、病症和性别而变化并且可由本领域技术人员确定。在任何并发症的情况下，剂量也可以由个体医师进行调整。

疗效

可以由熟练的临床医生确定用Treg或Treg和NK细胞的混合群进行治疗(例如，在治疗移植排斥或自身免疫性障碍，或促进同种异体移植物接受性方面)的疗效。然而，在以下条件下治疗被认为是“有效治疗”(如本文所使用的术语)：本文描述的病症的一种或多种体征或症状以有益的方式改变，其他临床上可接受的症状得到改善或甚至减轻，或者在根据本文所述的方法治疗后诱导了例如至少10％的期望的反应。例如，可以通过测量标志物、指标、症状和/或根据本文所述的方法治疗的病症的发生率或任何其他适当的可测量参数来评估疗效。根据本文所述的方法进行的治疗可将病症的标志物或症状的水平降低例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。

疗效也可以通过住院评估的个体未恶化或需要医疗干预(即疾病的进展停止)来测量。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。

治疗包括对个体疾病的任何治疗，并且包括：(1)遏制疾病，例如防止症状(例如疼痛或炎症)恶化；或(2)减轻疾病的严重程度，例如引起症状消退。用于治疗疾病的有效量是指当施用于有此需要的受试者时，足以导致对该疾病进行有效治疗(如本文所定义的该术语)的量。可以通过评估病症或期望的反应的物理指标来确定药剂的疗效。通过测量此类参数中的任何一个或参数的任何组合来监测施用和/或治疗的疗效完全在本领域技术人员的能力范围内。可以在本文所述病症的动物模型中评估给定方法的疗效。在使用实验动物模型时，当观察到标志物的统计学显著变化时可证明治疗的疗效。

移植排斥的示例性非限制性症状包括血清肌酐升高、eGFR(估计的肾小球滤过率)降低、流感样症状、发烧、尿排出量减少、体重增加、疼痛和疲劳。

自身免疫性疾病或障碍的示例性非限制性症状包括疲劳、关节疼痛和肿胀、皮肤问题、腹痛或消化问题、反复发烧、蛋白尿和腺体肿胀。

所有此类修改都旨在包括在所附权利要求的范围内。

在以下编号的段落中进一步描述了本发明：

1.一种分离的调节性T细胞(Treg)，其包含特异性结合以下的T细胞受体(TCR)：

(i)同种异体抗原，它是人类白细胞抗原(HLA)分子或其片段，并且不由存在于该Treg的基因组中的核苷酸序列编码，或

(ii)导致自身免疫性障碍的自身抗原或其片段。

2.如段落1所述的Treg，其中该TCR特异性结合该HLA分子。

3.如段落2所述的Treg，其中该TCR特异性结合该HLA分子的高变区(HVR)。

4.如段落3所述的Treg，其中该TCR特异性结合该HLA分子的β-链HVR。

5.如段落2-4中任一段所述的Treg，其中该HLA分子是HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、HLA-A、HLA-B或HLA-C分子或其片段。

6.如段落5所述的Treg，其中该HLA分子是HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP分子或其片段。

7.如段落6所述的Treg，其中该HLA-DR分子是HLA-DR1、HLA-DR2、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR5、HLA-DR6、HLA-DR7、HLA-DR8、HLA-DR9、HLA-DR10、HLA-DR11、HLA-DR12、HLA-DR13、HLA-DR14、HLA-DR15、HLA-DR16、HLA-DR17、HLA-DR18、HLA-DR51、HLA-DR52或HLA-DR53分子或其片段。

8.如段落1-7中任一段所述的Treg，其中该Treg能够抑制针对该同种异体抗原或该自身抗原的T效应细胞(Teff)反应。

9.如段落8所述的Treg，其中该Treg能够抑制对直接同种异体识别、半直接同种异体识别和/或间接同种异体识别的Teff增殖反应。

10.如段落8或9所述的Treg，其中该Treg能够激活腺苷能信号传导途径。

11.如段落1-10中任一段所述的Treg，其中该Treg表达一种或多种选自由CD4、CD25、CD39、CD73、FOXP3、GITR、CLTA4、ICOS、GARP、LAP、PD-1、CCR6和CXCR3组成的组的标志物。

12.如段落2-11中任一段所述的Treg，其中TCR特异性结合的HLA分子或其片段由存在于器官或组织供体的基因组中的核苷酸序列编码。

13.一种分离的Treg，其包含特异性结合以下的TCR：

(i)同种异体抗原，它是HLA分子或其片段，并且不由存在于该Treg的基因组中的核苷酸序列编码，或

(ii)导致自身免疫性障碍的自身抗原或其片段；

其中该Treg已通过如下方法产生，该方法包括：

(a)使包含从受者受试者获得的T细胞的免疫细胞群与该HLA分子或自身抗原的片段和自体抗原呈递细胞(APC)接触；和

(b)在足以形成包含多个这些Treg的扩增的T细胞系的时间和条件下扩增步骤(a)的免疫细胞群；以及任选地

(c)从该免疫细胞群中纯化这些Treg。

14.如段落13所述的Treg，其中(a)的免疫细胞群还包含自然杀伤(NK)细胞，并且如果进行步骤(c)，则步骤(c)包括从该免疫细胞群中纯化这些Treg和NK细胞，从而产生Treg和NK细胞的混合群。

15.一种细胞混合群，其包含如段落1-12中任一段所述的Treg和NK细胞。

16.一种组合物，其包含如段落1-14中任一段所述的Treg。

17.一种组合物，其包含如段落15所述的细胞混合群。

18.一种抑制受试者的免疫反应的方法，该方法包括向该受试者施用如段落1-14中任一段所述的Treg、如段落15所述的细胞混合群、或如段落16或17所述的药物组合物。

19.如段落18所述的方法，其中该免疫反应是针对该同种异体抗原或该自身抗原的Teff反应。

20.一种治疗或防止移植排斥的方法或一种治疗受试者的自身免疫性障碍的方法，该方法包括向该受试者施用如段落1-14中任一段所述的Treg、如段落15所述的细胞混合群、或如段落16或17所述的组合物。

21.如段落18或19所述的方法，其中该受试者患有自身免疫性障碍。

22.如段落18-20中任一段所述的方法，其中该受试者是器官或组织移植受者。

23.如段落18-20或22中任一段所述的方法，其中TCR特异性结合的HLA分子或其片段由存在于器官或组织供体的基因组中的核苷酸序列编码。

24.如段落18-20、22或23中任一段所述的方法，其中该方法进一步包括减少施用于该受试者的免疫抑制剂的剂量。

25.如段落18-20或22-24中任一段所述的方法，其中该器官是肾脏、肝脏、心脏、肺、胰腺、肠、胃、睾丸、阴茎、胸腺或面部、手或腿血管复合同种异体移植物。

26.如段落18-20或22-24中任一段所述的方法，其中该组织包括骨、肌腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经组织、骨髓、朗格汉斯胰岛、干细胞、血液或血管。

27.如段落20或21所述的方法，其中该自身免疫性障碍是自闭症、自闭症谱系障碍、类风湿性关节炎、狼疮、局灶节段性肾小球肾炎或膜性肾病。

28.一种用于产生如段落1-12中任一段所述的Treg的方法，该方法包括：

(a)使包含从受者受试者获得的T细胞的免疫细胞群与该HLA分子或自身抗原的片段和自体APC接触；和

(b)在足以形成包含多个这些Treg的扩增的T细胞系的时间和条件下扩增步骤(a)的免疫细胞群；以及任选地

(c)从该免疫细胞群中纯化这些Treg。

29.如段落28所述的方法，其中该方法包括重复步骤(a)和(b)超过三次。

30.如段落28或29所述的方法，其中该方法包括重复步骤(a)和(b)四次或五次。

31.如段落28-30中任一段所述的方法，其中步骤(a)大约每七至十天进行一次。

32.如段落28-31中任一段所述的方法，其中这些自体APC是外周血单核细胞(PMBC)、树突细胞、巨噬细胞或B细胞。

33.如段落32所述的方法，其中这些自体APC是PBMC。

34.如段落33所述的方法，其中对这些PBMC进行辐照。

35.如段落28-34中任一段所述的方法，其中包含T细胞的免疫细胞群是PMBC群、幼稚T细胞群或纯化Treg群。

36.如段落35所述的方法，其中该免疫细胞群是PBMC群。

37.如段落36所述的方法，其中步骤(a)进一步包括使该PBMC群与IL-2接触。

38.如段落37所述的方法，其中IL-2的浓度为约50IU/ml至约200IU/ml。

39.如段落38所述的方法，其中IL-2的浓度为约100IU/ml。

40.如段落28-39中任一段所述的方法，其中HLA分子或自身抗原的片段的浓度为约25μg/ml至约200μg/ml。

41.如段落40所述的方法，其中HLA分子或自身抗原的片段的浓度为约50μg/ml。

42.如段落28-41中任一段所述的方法，其中HLA分子或自身抗原的片段是纯化的肽或肽混合物。

43.如段落28-42中任一段所述的方法，其中该免疫细胞群包含NK细胞。

44.如段落28-43中任一段所述的方法，其中步骤(c)包括从该免疫细胞群中纯化这些Treg和NK细胞，从而产生Treg和NK细胞的混合群。

45.一种组合物，其包含：

(a)如段落1-14中任一段所述的Treg；和

(b)该HLA分子或自身抗原的片段。

46.如段落45所述的组合物，其中该组合物还包含IL-2。

47.如段落46所述的组合物，其中IL-2的浓度为约50IU/ml至约200IU/ml。

48.如段落47所述的组合物，其中IL-2的浓度为约100IU/ml。

49.如段落45-48中任一段所述的组合物，其中HLA分子或自身抗原的片段的浓度为约25μg/ml至约200μg/ml。

50.如段落49所述的组合物，其中HLA分子或自身抗原的片段的浓度为约50μg/ml。

51.如段落45-50中任一段所述的组合物，其中HLA分子或自身抗原的片段是纯化的肽或肽混合物。

52.如段落45-51中任一段所述的组合物，其还包含NK细胞。

本披露的实施例的描述并非旨在是穷举性的或旨在将本披露限制于所披露的精确形式。虽然本文出于说明的目的描述了本披露的具体实施例和实例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本披露的范围内各种等效修改是可能的。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但替代实施例可以以不同的顺序执行功能，或者可以基本上并行执行功能。本文提供的本披露的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施例可以进行组合以提供另外的实施例。如有必要，本披露的多个方面可被修改，以采用上述参考文献和应用的组成、功能和概念来提供本披露的又另外的实施例。此外，出于生物功能等效性的考虑，可以在不影响生物或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白质结构进行一些改变。可以根据详细描述对本披露进行这些和其他改变。

本文描述的技术通过以下实例进一步说明，这些实例绝不应被解释为进行进一步的限制。

实例

以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，鉴于本文提供的描述，可以实践各种其他实施例。

实例1.研究患者

总共45名肾移植受者(与供体存在一个或多个HLA-DR错配)被纳入研究。除了接受依维莫司或贝拉西普代替他克莫司的三例患者之外，其他患者接受了包括他克莫司在内的双重或三重免疫抑制疗法。在获得知情同意书后，在移植后的多次访视中获取血液样品，并从十七名患者中产生了十九种T细胞系。地方机构伦理委员会批准了研究方案。

实例2.HLA-DR特异性T细胞系的产生

肽的合成

合成了一组长度为18-22个氨基酸的非重叠肽，对应于HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*1501、HLA-DRB1*0301和HLA-DRB1*0401的全长β-链高变区(

利特莫尔，英国)，如先前报道的(Tsaur等人,Kidney Int.[国际肾脏]79(9):1005-12,2011)。

T细胞系的产生

在移植后的多次访视中收集肾移植受者的外周血样品，并使用LYMPHOPREP^TM(干细胞技术公司(Stemcell Technologies))通过密度梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。然后将细胞离体扩增或冷冻在LN2中以备将来使用。

将PBMC(10x10⁶)在IMMUNOCULT^TM无血清培养基(干细胞技术公司)中培养，该培养基含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、100μg/mL L-谷氨酰胺、5mmol/L HEPES、1％非必需氨基酸、以及1mmol/L丙酮酸钠(吉博科公司(Gibco))和2-巯基乙醇。在IL-2(10μg/mL)存在的情况下，将PBMC以7-10天的间隔用错配的源自供体的HLA-DR同种异体肽(50μg/mL)和自体辐照的(10-15Gy)PBMC作为抗原呈递细胞(APC)重复刺激，如在Tsaur等人,KidneyInt.[国际肾脏]79(9):1005-12(2011)中所描述的。将所有T细胞系在37℃下在湿润的5％CO₂培养箱中培养，并在四到五个刺激周期后收获。扩增的细胞的免疫调节性功能通过抑制测定进行评估，并显示能够抑制响应相同供体抗原的CD4⁺T细胞增殖(图2)。

实例3.增殖和抑制测定

将1x10⁶个羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色的PBMC用作响应者，并用供体错配的HLA-DR同种异体肽和自体辐照的PBMC作为APC(2x10⁶)在96孔U底板中在湿润的5％CO₂培养箱中刺激72h。通过稀释CFSE来评估增殖。在抑制测定中，在存在或不存在T细胞系的情况下，以范围为1:2至1:16的PBMC:T细胞系的比率培养受刺激的PBMC。

对于非接触依赖性抑制测定，使用转孔板代替96孔U底板。涉及对抑制进行遏制的实验包括添加伊曲茶碱(20μg/mL)或抗IL-10(10μg/mL)和抗TGF-β(10μg/mL)中和抗体。所有测定均一式三份进行。

实例4.流式细胞分析

针对各种T细胞标志物进行了T细胞系的免疫表型分析，这些标志物具有荧光团缀合的人抗CD3、抗CD4、抗CD25、抗CD127、抗CD39和抗CD73

。使用Canto II细胞仪(BD

)获取数据并使用

进行分析。进行表型分析的门控策略(gating strategy)包括活PBMC群的初始门控，随后是CD3⁺CD4⁺群。CD25、CD127、CD39和CD73的表达水平表示为CD3⁺CD4⁺群的％。

T细胞增殖和抑制通过响应者细胞的CFSE染料稀释来确定。CFSE分布的分析在

增殖平台上进行，并且数据由复制指数(RI)表示。RI仅确定响应者细胞的倍数扩增(Roederer,Cytometry A.[细胞术A]79(2):95-101(2011))，并且定义为所有细胞在被细胞增殖染料染色后经历的平均分裂次数。根据增殖和抑制值计算抑制百分比。

实例5.统计分析

结果表示为平均值±s.d。适当时使用学生t检验比较患者的特征、表型和功能数据。每个实验条件重复三次。p<0.05被认为是显著的。

实例6.来自移植受者的CD4+CD25-T细胞响应供体特异性同种异体抗原的增殖反应

CD4⁺CD25⁺细胞从肾移植受者的PBMC中耗尽。将CD4⁺CD25^-细胞(即Treg耗尽的T细胞池)和CD4⁺细胞用供体同种异体抗原刺激。使用染料稀释法在流式细胞仪中测量增殖。

T细胞池中Treg的耗尽导致对同种异体抗原的Teff反应增强。此反应因受者而异(图1A-1D)。

实例7.产生的T细胞系的免疫抑制活性

人口统计学和临床特征

该研究包括总共45名肾移植受者(具有一个或多个供体DR错配)。从17名受试者的外周血单核细胞(PBMC)中创建并离体扩增了总共19个单个T细胞系。这17名受试者的人口统计数据呈现于下表3中。

表3.产生T细胞系的患者的人口统计数据

HLA—人类淋巴细胞抗原；C1—第一次采血；将针对年龄、HLA错配、血清肌酐以及移植日期与C1之间的时间的值表示为平均值±(s.d.)。

总共有82.35％的患者接受了胸腺球蛋白作为诱导疗法。在维持免疫抑制治疗方面，共有十四名患者(82.3％)接受他克莫司治疗，其中十名患者接受与吗替麦考酚酯(MMF)或麦考酚酸(MPA)和类固醇组合治疗。一名患者接受了依维莫司与MMF治疗，而另外两名患者接受了贝拉西普和类固醇治疗，这两名患者中的一名也接受了MMF治疗，另一名患者则接受了硫唑嘌呤治疗。所有患者都具有稳定的肾功能，尽管其中四人之前曾因急性排斥而接受过治疗。

T细胞系的产生和形态表征

T细胞系是通过用供体特异性HLA-DR同种异体肽(HLA-DR1、HLA-DR4、HLA-DR15或HLA-DR17)重复刺激(4-5次)来自肾移植受者的PBMC产生的，如实例2中所述。分析产生的每种T细胞系的细胞表面标志物以定义离体扩增的细胞。据观察，离体扩增的系中有20％-50％的细胞是CD3⁺CD4⁺T细胞。所产生的CD3⁺CD4⁺T细胞中的一些还上调CD25的表达，同时下调CD127的表达。此外，观察到CD3⁺CD4⁺T细胞一致表达CD39和CD73。表4显示了来自每种离体扩增的T细胞系的CD4⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺CD125^-、CD4⁺CD39⁺和CD4⁺CD73⁺细胞的百分比。四种代表性T细胞系的流式细胞术数据呈现在图12A-12H中。

在所有离体扩增的T细胞系中，CD4⁺T细胞亚组表达了一种调节性表型(CD25⁺CD127^-CD39⁺和CD25⁺CD127^-CD73⁺)。表达CD4⁺CD39⁺和CD4⁺CD73⁺的细胞百分比从20％到60％不等。进一步观察到，CD39和CD73不在相同的CD4⁺T细胞群上共表达。

表4.产生的T细胞系的表型分析

T细胞系的功能表征

接下来通过评估离体扩增的T细胞系遏制抗原特异性和非特异性T细胞增殖的免疫抑制功能来确定它们的功能表征。观察到所有19种T细胞系都能够遏制供体抗原特异性T细胞增殖。表5呈现了受者PBMC对供体特异性HLA-DR同种异体肽的增殖反应和T细胞系的免疫抑制能力。从17名移植受者中产生的所有离体扩增的T细胞系均表现出抑制能力，而与受试者接受的免疫抑制药物方案的不同组合无关(表5，图3)。T细胞系不抑制非特异性T细胞增殖。

使用复制指数呈现下表5中显示的数据，复制指数定义为所有细胞在被细胞增殖染料染色后经历的平均分裂次数。根据增殖和抑制值计算抑制百分比(Roederer,Cytometry A.[细胞术A]79(2):95-101(2011))。

表5.PBMC的增殖反应和T细胞系的抑制能力

Rep index-复制指数；Fk-他克莫司；MMF-吗替麦考酚酯；MPA-麦考酚酸；

Aza-硫唑嘌呤；HLA-人类淋巴细胞抗原

在特定的HLA-DR同种异体肽和抑制百分比之间没有观察到显著差异(图4)。同样，既没有在产生的T细胞系中CD4⁺CD25⁺CD127^-细胞百分比与抑制百分比之间观察到相关性，也没有在抑制百分比与这些患者的肾功能之间观察到相关性。还分析了接受或未接受急性排斥治疗的移植患者之间T细胞系中CD4⁺CD25⁺CD127^-细胞百分比与抑制百分比的差异。同样，没有观察到统计学上显著的差异。

实例8.接触依赖性免疫抑制

为了进一步了解抑制机制，如实例3中所述使用经典的抑制测定转孔系统。据观察，当被半透膜隔开时，T细胞系失去了抑制供体抗原特异性T细胞增殖的能力，这表明T细胞系介导的抑制依赖于细胞-细胞接触(图5A-5F)。

实例9.响应直接和间接同种异体识别的抑制能力

将来自肾移植受者的CD4⁺T细胞通过供体细胞(直接同种异体识别)或加载有供体抗原的自体APC(间接同种异体识别)刺激，并通过染料稀释法测量增殖/抑制。离体扩增的免疫调节性T细胞系有效地抑制了CD4⁺T细胞对直接和间接同种异体识别两者的增殖反应(图6)。这在同种异体移植物受者中是期望的，从而提供针对急性和慢性排斥两者的保护。

实例10.Treg的抗原特异性

使用标准抑制测定法确定离体扩增的T细胞系的抗原特异性抑制。通过染料稀释法测量来自肾移植受者和第三方响应者的CD4⁺T细胞对供体抗原的增殖反应。

据观察，T细胞系选择性地抑制针对特定供体同种异体抗原的T细胞增殖免疫反应，并且Treg对第三方响应者对不同供体抗原的增殖反应没有影响。如图7A所示，受试者038和023与其各自的供体具有不同的HLA-DR错配(分别为HLA-DR4错配和HLA-DR15错配)。从受试者038扩增的T系抑制了所述受试者针对供体同种异体抗原的免疫反应，但不抑制受试者023中针对不同同种异体抗原的第三方免疫反应。另一方面，受试者038和011具有相同的HLA-DR错配。从受试者038扩增的T系显示了部分抑制在不同受试者中针对相同抗原的T响应者激活的能力。在图7B中，受试者002和035具有相同的HLA-DR错配(HLA-DR1)，而受试者037具有不同的HLA错配(HLA-DR4)。在图7C中，受试者004、023和011都具有不同的HLA错配(分别为HLA-DR1、-DR15和-DR4)。

实例11.旁观抑制作用

旁观抑制是在与其供体具有超过一个HLA错配的受试者中确定的。针对每个错配分别扩增抗原特异性T细胞系。每个T细胞系的旁观抑制作用使用标准抑制测定法进行确定，其中抗原刺激由相同或不同的供体肽提供。

尽管T细胞通常对特定抗原具有特异性，但在这种情况下显示，Treg能够抑制对与其具有特异性的抗原共表达的抗原的免疫反应，这证明了连锁(旁观)抑制的一个实例。

例如，在图8A中，受试者036具有两个HLA错配，HLA-DR1和HLA-DR15。如前两张图所示，针对HLA-DR1的Treg和针对HLA-DR15的Treg显示出针对呈递其各自抗原的APC的免疫抑制作用。在底部的两张图中，两种Treg系均也能够抑制针对呈递共表达的同种异体抗原的APC的免疫反应。HLA-DR1 Treg抑制针对HLA-DR1和HLA-DR15两者的免疫反应；类似地，HLA-DR15 Treg抑制针对HLA-DR1和HLA-DR15两者的免疫反应。对于具有HLA-DR1和HLA-DR15错配的受试者004以及对于具有HLA-DR15和HLA-DR17错配的受试者022，也分别在图8B和图8C中证明了这种作用。

实例12.免疫抑制机制

如上所述检测到产生的T细胞系中CD39和CD73两者的表达的上调。之前已表明，CD39和CD73两者均与小鼠Treg的免疫抑制机制有关，其中从CD39/CD73介导的细胞外ATP降解为AMP产生ATP衍生的腺苷可增加Treg中的细胞内环AMP(cAMP)水平。这通过间隙连接(gap junction)转移到T效应细胞，导致诱导型cAMP早期阻遏因子(ICER)的上调，进而遏制活化T细胞核因子(NFAT)和IL-2转录(Deaglio等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]204(6):1257-65,2007；Klein等人,Front.Immunol.[免疫学前沿]7:315,2016)。

为了确定产生的T细胞系的免疫抑制机制是否涉及类似于小鼠Treg的腺苷能途径的激活，在存在或不存在A2A受体(A2Ar)拮抗剂的情况下进行了标准抑制测定。使用A2Ar拮抗剂伊曲茶碱遏制腺苷能途径导致抑制的消除和抗原特异性T细胞增殖的增加(图10)。这表明T细胞系的调节性功能是通过CD39和CD73的上调介导的，这导致腺苷的产生和腺苷能途径的激活。此外，检测到T细胞系上表面PD-1表达的上调，这是另一种与腺苷能信号传导途径的激活相关的细胞表面标志物(图11)。

为了确定IL-10是否有助于T细胞系的抑制机制，在标准抑制测定中使用了中和IL-10单克隆抗体。在存在或不存在中和IL-10单克隆抗体的情况下，离体扩增的T细胞系对抗原特异性T细胞增殖的抑制没有变化(图9)。此外，TGF-β中和抗体也对T细胞系的免疫抑制能力没有任何影响。此前先前有报道称，高浓度的IL-10和TGF-β中和抗体均可以消除Treg介导的抑制。然而，在标准抑制测定中，在存在IL-10和TGF-β中和抗体两者的情况下，没有观察到T细胞系介导的抑制发生变化。

其他实施例

尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实例的方式对上述发明进行了一些详细的描述，但是这些描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的披露内容均通过引用以其全文明确并入。

序列表

<110> 布里格姆及妇女医院股份有限公司（The Brigham and Women's Hospital,Inc.）

<120> 用于免疫抑制的组合物和方法

<130> 51329-002WO2

<150> US 62/778,538

<151> 2018-12-12

<160> 15

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Arg Phe Leu Trp Gln Leu Lys Phe Glu Cys His Phe Phe Asn Gly Thr

1 5 10 15

Thr Glu Arg Val Arg

20

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Thr Glu Arg Val Arg Leu Leu Glu Arg Cys Ile Tyr Asn Gln Glu Glu

1 5 10 15

Ser Val Arg Phe Asp

20

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp

1 5 10 15

Ala Glu Tyr Trp Asn

20

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu Gln Arg Arg Ala Ala Val Asp Thr Tyr

1 5 10 15

Cys Arg

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

His Asn Tyr Gly Val Gly Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Gly Asp Thr Arg Pro Arg Phe Leu Trp Gln Pro Lys Arg Glu Cys His

1 5 10 15

Phe Phe Asn Gly

20

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Glu Arg Val Arg Phe Leu Asp Arg Tyr Phe Tyr Asn Gln Glu Glu Ser

1 5 10 15

Val Arg Phe

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro

1 5 10 15

Asp Ala Glu Tyr

20

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu Gln Ala Arg Ala Ala Val Asp

1 5 10 15

Thr Tyr Cys Arg

20

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

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1 5 10

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Arg Phe Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Glu Cys His Phe Phe Asn Gly Thr

1 5 10 15

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

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Glu Arg Val Arg Tyr Leu Asp Arg Tyr Phe His Asn Gln Glu Glu Asn

1 5 10 15

Val Arg Phe Asp

20

<210> 13

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro

1 5 10 15

Asp Ala Glu Tyr

20

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<211> 18

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu Gln Lys Arg Gly Arg Val Asp Asn Tyr

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Cys Arg

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

His Asn Tyr Gly Val Val Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg

1 5 10

Claims (52)

1.一种分离的调节性T细胞Treg，其包含特异性结合以下的T细胞受体TCR：

(i)同种异体抗原，它是人类白细胞抗原HLA分子或其片段，并且不由存在于该Treg的基因组中的核苷酸序列编码，或

(ii)导致自身免疫性障碍的自身抗原或其片段。

2.如权利要求1所述的Treg，其中该TCR特异性结合该HLA分子。

3.如权利要求2所述的Treg，其中该TCR特异性结合该HLA分子的高变区HVR。

4.如权利要求3所述的Treg，其中该TCR特异性结合该HLA分子的β-链HVR。

5.如权利要求2所述的Treg，其中该HLA分子是HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、HLA-A、HLA-B或HLA-C分子或其片段。

6.如权利要求5所述的Treg，其中该HLA分子是HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP分子或其片段。

7.如权利要求6所述的Treg，其中该HLA-DR分子是HLA-DR1、HLA-DR2、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR5、HLA-DR6、HLA-DR7、HLA-DR8、HLA-DR9、HLA-DR10、HLA-DR11、HLA-DR12、HLA-DR13、HLA-DR14、HLA-DR15、HLA-DR16、HLA-DR17、HLA-DR18、HLA-DR51、HLA-DR52或HLA-DR53分子或其片段。

8.如权利要求1所述的Treg，其中该Treg能够抑制针对该同种异体抗原或该自身抗原的T效应细胞Teff反应。

9.如权利要求8所述的Treg，其中该Treg能够抑制对直接同种异体识别、半直接同种异体识别和/或间接同种异体识别的Teff增殖反应。

10.如权利要求8所述的Treg，其中该Treg能够激活腺苷能信号传导途径。

11.如权利要求1所述的Treg，其中该Treg表达一种或多种选自由CD4、CD25、CD39、CD73、FOXP3、GITR、CLTA4、ICOS、GARP、LAP、PD-1、CCR6和CXCR3组成的组的标志物。

12.如权利要求2所述的Treg，其中该TCR特异性结合的HLA分子或其片段由存在于器官或组织供体的基因组中的核苷酸序列编码。

13.一种分离的Treg，其包含特异性结合以下的TCR：

(i)同种异体抗原，它是HLA分子或其片段，并且不由存在于该Treg的基因组中的核苷酸序列编码，或

(ii)导致自身免疫性障碍的自身抗原或其片段；

其中该Treg已通过如下方法产生，该方法包括：

(a)使包含从受者受试者获得的T细胞的免疫细胞群与该HLA分子或自身抗原的片段和自体抗原呈递细胞APC接触；和

(b)在足以形成包含多个这些Treg的扩增的T细胞系的时间和条件下扩增步骤(a)的免疫细胞群；以及任选地

(c)从该免疫细胞群中纯化这些Treg。

14.如权利要求13所述的Treg，其中(a)的免疫细胞群还包含自然杀伤NK细胞，并且如果进行步骤(c)，则步骤(c)包括从该免疫细胞群中纯化这些Treg和NK细胞，从而产生Treg和NK细胞的混合群。

15.一种细胞混合群，其包含如权利要求1所述的Treg和NK细胞。

16.一种组合物，其包含如权利要求1所述的Treg。

17.一种组合物，其包含含有如权利要求1所述的Treg和NK细胞的细胞混合群。

18.一种抑制受试者的免疫反应的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求16或17所述的药物组合物。

19.如权利要求18所述的方法，其中该免疫反应是针对该同种异体抗原或该自身抗原的Teff反应。

20.一种治疗或防止移植排斥的方法或一种治疗受试者的自身免疫性障碍的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求16或17所述的组合物。

21.如权利要求18所述的方法，其中该受试者患有自身免疫性障碍。

22.如权利要求18所述的方法，其中该受试者是器官或组织移植受者。

23.如权利要求18所述的方法，其中该TCR特异性结合的HLA分子或其片段由存在于器官或组织供体的基因组中的核苷酸序列编码。

24.如权利要求18所述的方法，其中该方法进一步包括减少施用于该受试者的免疫抑制剂的剂量。

25.如权利要求18所述的方法，其中该器官是肾脏、肝脏、心脏、肺、胰腺、肠、胃、睾丸、阴茎、胸腺或面部、手或腿血管复合同种异体移植物。

26.如权利要求18所述的方法，其中该组织包括骨、肌腱、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经组织、骨髓、朗格汉斯胰岛、干细胞、血液或血管。

27.如权利要求20所述的方法，其中该自身免疫性障碍是自闭症、自闭症谱系障碍、类风湿性关节炎、狼疮、局灶节段性肾小球肾炎或膜性肾病。

28.一种用于产生如权利要求1所述的Treg的方法，该方法包括：

(a)使包含从受者受试者获得的T细胞的免疫细胞群与该HLA分子或自身抗原的片段和自体APC接触；和

(b)在足以形成包含多个这些Treg的扩增的T细胞系的时间和条件下扩增步骤(a)的免疫细胞群；以及任选地

(c)从该免疫细胞群中纯化这些Treg。

29.如权利要求28所述的方法，其中该方法包括重复步骤(a)和(b)超过三次。

30.如权利要求28所述的方法，其中该方法包括重复步骤(a)和(b)四次或五次。

31.如权利要求28所述的方法，其中步骤(a)大约每七至十天进行一次。

32.如权利要求28所述的方法，其中这些自体APC是外周血单核细胞PMBC、树突细胞、巨噬细胞或B细胞。

33.如权利要求32所述的方法，其中这些自体APC是PBMC。

34.如权利要求33所述的方法，其中对这些PBMC进行辐照。

35.如权利要求28所述的方法，其中包含T细胞的免疫细胞群是PMBC群、幼稚T细胞群或纯化Treg群。

36.如权利要求35所述的方法，其中该免疫细胞群是PBMC群。

37.如权利要求36所述的方法，其中步骤(a)进一步包括使该PBMC群与IL-2接触。

38.如权利要求37所述的方法，其中IL-2的浓度为约50IU/ml至约200IU/ml。

39.如权利要求38所述的方法，其中IL-2的浓度为约100IU/ml。

40.如权利要求28所述的方法，其中该HLA分子或自身抗原的片段的浓度为约25μg/ml至约200μg/ml。

41.如权利要求40所述的方法，其中该HLA分子或自身抗原的片段的浓度为约50μg/ml。

42.如权利要求28所述的方法，其中该HLA分子或自身抗原的片段是纯化的肽或肽混合物。

43.如权利要求28所述的方法，其中该免疫细胞群包含NK细胞。

44.如权利要求28所述的方法，其中步骤(c)包括从该免疫细胞群中纯化这些Treg和NK细胞，从而产生Treg和NK细胞的混合群。

45.一种组合物，其包含：

(a)如权利要求1所述的Treg；和

(b)该HLA分子或自身抗原的片段。

46.如权利要求45所述的组合物，其中该组合物还包含IL-2。

47.如权利要求46所述的组合物，其中IL-2的浓度为约50IU/ml至约200IU/ml。

48.如权利要求47所述的组合物，其中IL-2的浓度为约100IU/ml。

49.如权利要求45所述的组合物，其中该HLA分子或自身抗原的片段的浓度为约25μg/ml至约200μg/ml。

50.如权利要求49所述的组合物，其中该HLA分子或自身抗原的片段的浓度为约50μg/ml。

51.如权利要求45所述的组合物，其中该HLA分子或自身抗原的片段是纯化的肽或肽混合物。

52.如权利要求45所述的组合物，其进一步包含NK细胞。

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