CN113444803A - 宫颈癌预后标志微生物及其在制备宫颈癌预后预测诊断产品中的应用 - Google Patents

宫颈癌预后标志微生物及其在制备宫颈癌预后预测诊断产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施公开了一种宫颈癌预后标志微生物及其在制备宫颈癌预后预测诊断产品中的应用，所述宫颈癌预后标志微生物包括Dermabacter、Sulfurovum、Nostoc、Thermacetogenium和Alphavirus。本发明开发了所述5种宫颈癌预后标志微生物，并建立了预后评分系统；时间依赖性ROC曲线及多变量Cox回归分析显示本发明开发的5‑微生物预后评分系统对总生存率(OS)的判别能力明显优于其他临床因素(如年龄、分期、肿瘤大小)，且在5年的曲线下面积不劣于其在1或2年的面积，说明本预后评分系统对宫颈癌预后有独立且较持久的判别力。

Description

宫颈癌预后标志微生物及其在制备宫颈癌预后预测诊断产品 中的应用
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种宫颈癌预后标志微生物及其在制备宫颈癌预后预测诊断产品中的应用。
背景技术
宫颈癌的发病率及死亡率皆位于女性恶性肿瘤中的第四位，世界卫生组织2020年数据显示，全球每年大约有60.4万宫颈癌新发病例及34.2万死亡病例。尽管经过标准治疗后的宫颈癌平均5年生存率约45％，但复发或转移性宫颈的5年生存率仅15％。因此，提前对患者的预后及疗效进行预测，对预后可能差的患者提前予以有效干预，可能提高宫颈癌患者的5年总体生存率。
近年来，科学家发现肿瘤组织内存在多种细菌，有趣的是，这些细菌似乎具有肿瘤特异性——不同的肿瘤样本，细菌的种类也有不同。在良性乳腺组织微生物中出现的厌氧球菌、茎杆菌和链球菌，在乳腺癌组织微生物中不存在。肺癌患者与健康人之间微生物群的丰度、丰富度和多样性皆不同。宫颈癌的主要发病原因为高危型人乳头状HPV病毒持续感染，且90％的宫颈癌病理分型为鳞癌。2021年，Hermida LC等人报道了尽管大部分宫颈癌因HPV感染所致，但在宫颈癌组织中仍存在其他微生物与预后有关。
尽管宫颈癌组织内微生物可能与其预后有关，但目前尚无一组可对宫颈癌预后及治疗反应性进行预测的微生物群。因此，开发一组宫颈癌预后标志微生物相关的宫颈癌预后风险预测系统，用于评估预后和指导治疗，满足当前临床需求。
发明内容
本发明目的是提供一组宫颈癌预后标志微生物及其在制备宫颈癌预后预测诊断产品中的应用，可用以评估宫颈癌预后并可能指导其治疗方案的选择。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明实施例的第一方面，提供了一组宫颈癌预后标志微生物，所述宫颈癌预后标志微生物包括Dermabacter、Sulfurovum、Nostoc、Thermacetogenium和Alphavirus。
在本发明实施例的第二方面，提供了一种宫颈癌微生物标志物的丰度测定产品，包括检测所述5种预后相关微生物在宫颈癌组织中的DNA或mRNA丰度的产品。
进一步地，所述产品包括：宫颈癌预后标志微生物的探针和引物。
在上述技术方案中，该探针能够通过分子杂交与目标微生物序列结合产生杂交信号，该引物能够通过基于PCR的技术对目标微生物进行扩增。
本发明中的样本为宫颈癌患者的肿瘤组织，由肿瘤组织样本分离出mRNA或DNA，测定5种宫颈癌预后相关微生物的丰度，然后通过计算预后评分来预测病人的临床结果。上述5种宫颈癌相关微生物为Dermabacter,Sulfurovum,Nostoc,Thermacetogenium和Alphavirus。16S rRNA和23S rRNA作为内参对照。关于这些微生物的功能见表1。
在本发明实施例的第三方面，提供了一组所述的宫颈癌预后标志微生物、所述的宫颈癌微生物标志物的丰度测定产品在建立预测宫颈癌预后风险的模型中的应用。
在本发明实施例的第四方面，提供了一种预测宫颈癌预后风险预测系统，所述预测系统的计算公式如下：
Figure BDA0003162654940000021
所述微生物i包括权利要求1所述宫颈癌预后标志微生物：Dermabacter、Sulfurovum、Nostoc、Thermacetogenium和Alphavirus；
所述微生物i的丰度为所述宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度；
所述微生物i的系数为将所述宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度进行COX多因素回归分析后获得。
由于不同的样本，不同的检测手段所获得的DNA或mRNA丰度不同，因此所测得的微生物i的系数会有所不同。
进一步地，所述宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度的测定方法包括PCR、基因芯片、二代高通量测序、Panomics或Nanostring宏基因组测序中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明实施例的第五方面，提供了一种所述的预测系统在制备预测宫颈癌风险产品中的应用，所述预测系统的输入变量为所述的宫颈癌微生物标志物的DNA或mRNA丰度，即可获得宫颈癌风险的预测分值。
在本发明实施例的第六方面，提供了一种宫颈癌预后风险预测系统，所述系统包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
根据输入的宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度输入所述预测系统中，获得宫颈癌预后风险预测分值。
在本发明实施例的第七方面，提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时使用以下步骤：
将宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度输入如所述预测系统中，经过计算获得宫颈癌预后风险预测分值。
在本发明实施例的第八方面，提供了一种宫颈癌预后预测诊断产品，包括：
宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度测定产品；
和所述预测系统或所述的宫颈癌预后风险预测系统或所述的计算机可读存储介质。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明实施例提供的宫颈癌预后标志微生物及其在制备宫颈癌预后预测诊断产品中的应用，本发明选取迄今为止全面且无偏见的宫颈癌全基因组数据，采用了一种多步骤生物信息学策略，开发了一组5种与宫颈癌预后相关微生物。时间依赖性ROC曲线及多变量Cox回归分析显示本发明开发的5-微生物预后评分系统对总生存率(OS)的判别能力明显优于其他临床因素(如年龄、分期、肿瘤大小)，且在5年的曲线下面积不劣于其在1或2年的面积，说明本预后评分系统对宫颈癌预后有独立且较持久的判别力。此系统可用于辅助预测宫颈癌患者对治疗干预的反应，判断患者是否从化疗、放疗、靶向、免疫或其他治疗中获益，进行治疗方案选择，避免过度医疗，达成个体化医疗的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为筛选结果；其中图1A为TCGA中与OS相关微生物群的筛选；图1B-F宫颈癌微生物群中的代表微生物的Kaplan-Meier生存曲线举例；p值通过对比两组之间差别检定(log-rank test)而得到；
图2为与OS相关的宫颈癌微生物群采用向前逐步的COX回归方法筛选出5-微生物；其中图A为5-微生物在宫颈癌中的风险评估；图B为5-微生物组合的Kaplan-Meier生存曲线；图C为5-微生物组合的时间依赖ROC曲线；
图3为5-微生物组合在宫颈癌TCGA数据集中的COX多因素回归。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
本发明的技术方案的总体思路如下：
本发明利用TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中的宫颈癌患者临床信息和微生物的表达情况，通过生存分析，筛选出145种微生物与总生存期(Overall Survival，OS)有显著相关性；
采用典型判别分析法确定了5种微生物为一组宫颈癌预后相关的微生物标志物；
并在此基础上建立预后评分系统并验证其评估价值和准确性。
通过TCGA数据库，我们进一步验证了该5种微生物对宫颈鳞癌预后的判别能力独立于其他临床因素，并证明该预后评分系统的预后意义。
本说明书中使用的术语“探针”和“引物”表示寡核苷酸，优选为单链的脱氧核糖核苷酸，包括天然(naturally occurring)dNMP(dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)、变形核苷酸或非天然核苷酸，此外，还可以包含核糖核苷酸。
本发明中利用的探针和引物包含与靶核酸的目标位置互补的杂交核苷酸序列。术语“互补”的含义是指，在杂交条件下引物或探针与靶核酸序列选择性地进行杂交的充分互补，具有将实质上互补(substantially complementary)和完全互补(perfectlycomplementary)全部包括在内的含义，优选地为完全互补。本说明书中使用的术语“实质上互补的序列”不仅包括完全一致的序列，也包括在能够在特定靶序列上发挥引物作用且与作为比较对象的序列有部分不一致的序列。探针和引物的序列不需要具有与模板的一部分序列完全互补的序列，只要在能够与模板杂交从而发挥其固有作用的范围内具有充分的互补性即可。因此，本发明中的探针和引物不需要具有与作为模板的上述核苷酸序列完全互补的序列，只要在能够与模板杂交从而发挥其固有作用的范围内具有充分的互补性即可。引物和探针的设计为本领域技术人员所掌握的技能，例如可以利用引物设计用程序(例如：PRIMER 3程序)。
本发明中微生物DNA或mRNA丰度的测定可以利用本领域公知的方法进行，包括但不限于定量PCR、基因芯片、二代高通量测序、Panomics或Nanostring技术。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例、比对例及实验数据对本申请的一组宫颈癌预后标志微生物及其在制备宫颈癌预后预测诊断产品中的应用进行详细说明。
实施例1、宫颈癌预后标志微生物及其筛选方法
一、宫颈癌鳞癌样本中相关微生物的丰度对宫颈癌预后的影响
利用TCGA数据库中的248例宫颈癌鳞癌患者临床信息和相关微生物的丰度，采用R语言survival和surmier包，进一步评估了此1406种微生物的丰度对宫颈癌预后的影响；具体步骤包括：
1、分别寻找上述1406种微生物丰度的最佳截断值，根据其表达的最佳截断值分为高丰度和低丰度两组，使用Cox回归分析、Kaplan-Meier生存曲线和对数秩检验来评价这些微生物的高丰度或低丰度对总生存期(OS)的影响。
发现1406种微生物中有145种微生物的丰度与宫颈癌患者的总生存期之间存在显著关联(p值<0.01)；其中，110种微生物高丰度为预后的危险因素，35种微生物的高丰度为预后的保护因素(图1A)。图1B-F显示了5种微生物丰度对病人预后生存的影响。宫颈癌预后相关微生物标记物将从这145种微生物中筛选而来。最后，根据以上COX回归单因素分析产生的p值和HR对这些微生物进行排序(见表1)。
表1-与OS相关微生物对宫颈癌患者总生存期的影响
Figure BDA0003162654940000051
Figure BDA0003162654940000061
Figure BDA0003162654940000071
2、筛选宫颈癌预后的特征性微生物
在TCGA中的248例宫颈鳞癌患者微生物表达数据组成的数据集中，对145种与OS相关的微生物进行向前的逐步Cox回归分析，让模型自动纳入145种微生物中对生存预后有显著影响的微生物，最后进入该回归方程的5种微生物构成本发明的5-微生物预后标志物(图2A)。
最后筛选得到宫颈癌预后标志微生物，所述宫颈癌预后标志微生物包Dermabacter、Sulfurovum、Nostoc、Thermacetogenium和Alphavirus。
表2
Figure BDA0003162654940000072
Figure BDA0003162654940000081
实施例2、宫颈癌预后风险预测系统及其建立方法
1、宫颈癌预后风险预测系统
基于实施例1结果，我们开发了宫颈癌5-微生物预后评分系统。我们应用逐步的典型判别分析(canonical discriminant analysis)来识别能够以100％的准确性鉴别病人预后的微生物标记物，最后确定了一组由5种特定的宫颈癌预后微生物构成的评分系统，这些微生物包括：Dermabacter,Sulfurovum,Nostoc,Thermacetogenium和Alphavirus。各微生物的信息如表2所示。
上述宫颈癌预后评分系统用预测分值来计算患者的生存概率。评分系统被定义为通过Cox风险函数系数为基础的微生物丰度的线性组合。计算公式如下：
Figure BDA0003162654940000082
由于不同的样本，不同的检测手段所获得的DNA或mRNA丰度不同，因此所测得的微生物i的系数会有所不同。
在本发明实施例中，所述公式中微生物i的系数见表3所示，微生物i的丰度为宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度；
表3典型判别函数系数
标志微生物 系数i
Dermabacter 0.52451
Sulfurovum 0.51696
Nostoc -1.30693
Thermacetogenium -0.50574
Alphavirus -0.28423
2、每个患者的预后评分可以用来评估其总生存期和死亡风险。
(1)先根据样本的预后评分进行排序，并根据其得分通过X-tile法找出预后评分的最佳三分法的截断值，根据上下截断值将患者分为(预后)“好”、“中”、“差”三组。
预测分值的绝对值和分数划界可依不同的技术平台而不同，需要分别确定。
(2)对248例宫颈鳞癌的三组患者进行Kaplan-Meier分析和Log-Rank检验；同时进行COX回归分析，将“中”和“差”组分别与“好”组比较，计算危险比(hazard ratios,HR)，确定三组患者总生存期(overall survival，OS)的差异，从而进行分析。
具体地：
本发明实施例对248例宫颈鳞癌的患者根据其预后评分进行排序，并根据其得分通过X-tile法找出预后评分的最佳三分法的截断值，根据上下截断值将患者分为(预后)“好”、“中”、“差”三组。对248例宫颈鳞癌的三组患者进行Kaplan-Meier分析和Log-Rank检验；同时进行COX回归分析，将“中”和“差”组分别与“好”组比较，计算危险比(hazardratios,HR)，确定三组患者总生存期(overall survival，OS)的差异(图2B为5-微生物在248例患者中的Kaplan-Meier生存曲线)。图3森林图显示纳入肿瘤T分期、FIGO分期、年龄及是否放疗进行COX多因素分析，本发明5-微生物预后评分系统的“差”组及“中”组患者分别对比“好”组患者的危险比分别为27.12(95％CI 11.64-63.22，p<0.001)和3.54(95％CI1.73-7.21，p＝0.00051)。除此之外，根据该评分系统对患者进行评分后进行拟合1年、3年及5年的时间依赖性ROC曲线，如图2C所示，1年、3年及5年的曲线下面积皆为0.83，表明该评分系统的诊断效能较良好且在较长的时间内能保持该诊断效能。这些结果有力地验证了这组5-微生物标记物以及预后评分系统对不同预后患者的区分能力，可以很好地将预后良好或较差的患者进行区分。
3、本发明5-微生物预后评分系统与其他临床因素(如年龄、分期、肿瘤大小)对宫颈癌患者预后的评估效能对比
结果如图3所示，由图3可知，时间依赖性ROC曲线及多变量Cox回归分析显示本发明开发的5-微生物预后评分系统对总生存率(OS)的判别能力明显优于其他临床因素(如年龄、分期、肿瘤大小)，且在5年的曲线下面积不劣于其在1或2年的面积，说明本预后评分系统对宫颈癌预后有独立且较持久的判别力。
实施例3、宫颈癌预后风险预测系统
本发明实施例提供了一种宫颈癌预后风险预测系统，所述系统包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
根据输入的宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度输入实施例2所述预测系统中，获得宫颈癌预后风险预测分值。
实施例4、计算机可读存储介质
本发明实施例提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现实施例2方法和/或实施例3方法的步骤。
当然，本发明实施例所提供的一种包含计算机可执行指令的存储介质，其计算机可执行指令不限于如上所述的方法操作，还可以执行本发明任意实施例所提供的方法中的相关操作。
通过以上关于实施方式的描述，所属领域的技术人员可以清楚地了解到，本发明可借助软件及必需的通用硬件来实现，当然也可以通过硬件实现，但很多情况下前者是更佳的实施方式。基于这样的理解，本发明的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品可以存储在计算机可读存储介质中，如计算机的软盘、只读存储器(Read-Only Memory，ROM)、随机存取存储器(RandomAccess Memory，RAM)、闪存(FLASH)、硬盘或光盘等，包括若干指令用以使得一台电子设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行本发明各个实施例所述的方法。
值得注意的是，上述实施例中，所包括的各个单元和模块只是按照功能逻辑进行划分的，但并不局限于上述的划分，只要能够实现相应的功能即可；另外，各功能单元的具体名称也只是为了便于相互区分，并不用于限制本发明的保护范围。
应用例1、预测临床宫颈癌患者的预后效果
采集临床接收的宫颈癌患者的肿瘤组织并提取DNA或RNA，肿瘤组织可包括新鲜活检组织，术后组织，固定后的组织和石蜡包埋的组织。然后用本发明开发的试剂盒与相应的仪器定量检测预后评分系统5种微生物的丰度。将5种微生物的丰度分别输入本发明建立的预后评分公式：
Figure BDA0003162654940000101
在计算出患者的预测分值后，医生根据分数值来预测患者的预后情况，比如5年生存率。目前我们通过回顾性研究建立了模型，成功地在TCGA数据集进行了验证。通过计算数据集内所有患者的预后评分，并使用X-tile根据患者的评分对患者进行三分。使用Kaplan-Meier分析在“好”和“差”预后的患者群组之间的显着差异。我们发现，具有高预后评分的患者的OS显着短于评分低的患者(p<0.05)(图2B)。证实5-微生物预后评分系统可重复预测宫颈癌患者的预后。我们也计划实施前瞻性研究来进一步完善评分系统。
应用例2、预测临床仅1个中危因素的宫颈癌患者术后是否需要辅助放化疗
早期宫颈癌患者术后若有1个高危因素(淋巴结阳性、宫旁浸润、残端阳性)或2个中危因素(脉管癌栓、侵犯肌壁外1/2、肿瘤大于4cm)，指南推荐行术后辅助放化疗。然而，对于有1个中危因素的患者，指南不推荐行术后辅助放化疗。但是，该部分患者中，仍有部分患者易出现复发转移。由于并非所有术后1个中危因素的患者都可以从术后辅助放化疗中获益，那么为减少无效或过度治疗，降低医疗成本，有针对性的对部分术后1个中危因素的患者进行治疗，本发明通过以下方案实施来预测临床仅1个中危因素的宫颈癌患者术后是否需要辅助放化疗：对临床接收的宫颈癌患者采集肿瘤组织并提取DNA或RNA，肿瘤组织可包括新鲜活检组织，术后组织，固定后的组织和石蜡包埋的组织。然后用本发明开发的试剂盒与相应的仪器定量检测预后评分系统5-微生物的丰度。将5-微生物的丰度输入本发明建立的预后评分公式：
Figure BDA0003162654940000111
在计算出患者的预测分值后，医生根据分数值来考虑患者是否应接受术后辅助放化疗。对预测分值标示差预后的患者，可以建议医生对患者进行术后辅助放化疗。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种宫颈癌预后标志微生物，其特征在于，所述宫颈癌预后标志微生物包括Dermabacter、Sulfurovum、Nostoc、Thermacetogenium和Alphavirus。
2.一种宫颈癌微生物标志物的丰度测定产品，其特征在于，包括检测权利要求1所述5种预后相关微生物在宫颈癌组织中的DNA或mRNA丰度的产品。
3.根据权利要求2所述的宫颈癌微生物标志物的丰度测定产品，其特征在于，所述产品包括：宫颈癌预后标志微生物的探针和引物。
4.一种权利要求1所述的宫颈癌预后标志微生物、权利要求2-3所述的宫颈癌微生物标志物的丰度测定产品在建立预测宫颈癌预后风险预测系统以及制备宫颈癌预后预测诊断产品中的应用。
5.一种预测宫颈癌预后风险预测系统，其特征在于，所述预测系统的计算公式如下：
Figure FDA0003162654930000011
所述微生物i包括权利要求1所述宫颈癌预后标志微生物：Dermabacter、Sulfurovum、Nostoc、Thermacetogenium和Alphavirus；
所述微生物i的丰度为所述宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度；
所述微生物i的系数为将所述宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度进行COX多因素回归分析后获得。
6.根据权利要求5所述的一种预测宫颈癌预后风险预测系统，其特征在于，所述宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度的测定方法包括PCR、基因芯片、二代高通量测序、Panomics或Nanostring宏基因组测序中的任意一种或至少两种的组合。
7.一种权利要求5-6任一所述预测系统在制备预测宫颈癌风险产品中的应用，其特征在于，所述系统的输入变量为权利要求1所述的宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度，即可获得宫颈癌风险的预测分值。
8.一种宫颈癌预后风险预测系统，其特征在于，所述系统包括：
处理器和存储器，所述存储器耦接到所述处理器，所述存储器存储指令，当所述指令由所述处理器执行时使用以下步骤：
宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度输入如5-6任一所述预测系统中，获得宫颈癌预后风险预测分值。
9.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，所述计算机程序被处理器执行时使用以下步骤：
将宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度输入如5-6任一所述预测系统中，经过计算获得宫颈癌预后风险预测分值。
10.一种宫颈癌预后预测诊断产品，其特征在于，包括：
宫颈癌预后标志微生物的DNA或mRNA丰度测定产品；
和权利要求5-6任一所述预测系统或权利要求8所述的宫颈癌预后风险预测系统或权利要求9所述的计算机可读存储介质。
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