CN113423266A - 情绪障碍的啮齿动物模型 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及人类疾病的动物模型。更确切地说，本公开涉及情绪障碍，如单相抑郁症和焦虑症的啮齿动物模型。本文公开经遗传修饰的啮齿动物，其携带编码突变型人类GPR156蛋白的人源化G蛋白偶联受体156(GPR156)基因，所述蛋白在对应于全长野生型人类GPR156蛋白中的位置533的氨基酸位置处包含Asp。
Description
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技术领域
本公开涉及人类疾病的动物模型。更确切地说，本公开涉及情绪障碍，如单相抑郁症和焦虑症的啮齿动物模型。本文公开经遗传修饰的啮齿动物，其携带编码突变型人类GPR156蛋白的人源化G蛋白偶联受体156(GRP156)基因，所述蛋白在对应于全长野生型人类GPR156蛋白中的位置533的氨基酸位置处包含Asp。
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背景技术
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G蛋白偶联受体(GPCRs)是由7个螺旋跨膜域连同N端细胞外和C端细胞内域表征的细胞表面受体的大型超家族(Cherezov V等人,Science 318:1258-1265(2007))。GPCR表达于多种细胞类型中，且参与转导细胞外信号跨越细胞膜和进入细胞内部(Kobilka R,Biochim.Biophys.Acta 1768:794-807(2007))。2012年，诺贝尔化学奖授予了两位鉴别GPCR如何起作用的科学家(Clark R,Proc.Natl.Acad.Sci.USA110:5274-5275(2013))。
GPR156(G蛋白偶联受体156)是编码属于代谢型谷氨酸受体亚家族的GPCR的人类基因(Calver A等人,Brain Res.Mol.Brain Res.110:305-307(2003))。文献中用于引用GPR156的其它名称为GABABL(GABAB样或GABABL)和PGR28(Vassilatis D,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:4903-4908(2003))。在小鼠中，GPR156被称为Gpr156或Gababl。
发明内容
本文公开了经遗传修饰的啮齿动物，其适用作情绪障碍，例如单相抑郁症和焦虑症的动物模型。更确切地说，本文公开了在内源性啮齿动物Gpr156基因座处携带人源化Gpr156基因的经遗传修饰的啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，其中人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白或在对应于全长野生型人类GPR156蛋白中的位置533的氨基酸位置处包含Asp的突变型人类GPR156蛋白(在本文中也称为“E533D变异”)。本文还公开了用于制备经遗传修饰的啮齿动物的方法和靶向载体、育种方法和经遗传修饰的啮齿动物作为用于筛选和测试治疗剂的情绪障碍动物模型的用途。
在一个方面，本文公开经遗传修饰的啮齿动物，其基因组在内源性啮齿动物Gpr156基因座处包含人源化Gpr156基因，其中人源化Gpr156基因包含啮齿动物Gpr156核酸部分和人类GPR156核酸部分，且其中人源化Gpr156基因的表达受内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。啮齿动物Gpr156核酸部分和人类GPR156核酸部分各自可以是基因组DNA或cDNA。
在一些实施例中，啮齿动物中的人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白。
在一些实施例中，人源化GPR156基因中的人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的编码序列，其中编码序列包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子，且其中人类GPR156基因包含编码E533D变异的核苷酸。在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分进一步包含人类GPR156基因的5'非编码外显子序列或3'非编码外显子序列或其组合。人类GPR156基因的5'非编码外显子序列可包括例如任何5'非编码外显子，和/或人类GPR156基因的第一编码外显子的5'非编码部分。人类GPR156基因的3'非编码外显子序列可包括例如人类GPR156基因的3'UTR。在特定实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个外显子(即，包括3'UTR)，其中人类GPR156基因包含编码E533D变异的核苷酸。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的啮齿动物Gpr156核酸部分包含啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列或3'非编码外显子序列或其组合。在啮齿动物Gpr156基因为小鼠Gpr156基因的实施例中，5'非编码外显子序列可包括例如小鼠Gpr156基因的外显子1、外显子2(第一编码外显子)的5'非编码部分或其组合；且3'非编码外显子序列可包括例如小鼠Gpr156基因的外显子10(第9个和最后一个编码外显子)的3'UTR。在啮齿动物Gpr156基因为大鼠Gpr156基因的实施例中，5'非编码外显子序列可包括例如大鼠Gpr156基因的外显子1(也是第一编码外显子)的5'非编码部分；且3'非编码外显子序列可包括例如大鼠Gpr156基因的外显子9(也是最后一个编码外显子)的3'UTR。
在特定实施例中，人源化Gpr156基因包含啮齿动物Gpr156基因的'5非编码外显子序列，和人类GPR156基因的第一编码外显子至最后一个外显子中的ATG起始密码子，其中人类GPR156基因包含编码E533D变异的核苷酸；且在某些实施例中，此类人源化Gpr156基因进一步包含位于人类GPR156基因的最后一个外显子下游的啮齿动物Gpr156基因的3'非编码外显子序列。
在一些实施例中，提供人源化Gpr156基因中的啮齿动物Gpr156核酸部分的啮齿动物Gpr156基因为内源性啮齿动物Gpr156基因。
在一些实施例中，啮齿动物中的人源化Gpr156基因由将内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段替换为编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白的人类GPR156核酸而形成。人类GPR156核酸可以是基因组DNA或cDNA。
在一些实施例中，编码突变型人类GPR156蛋白的人类GPR156核酸包含编码序列(例如基因组或cDNA序列)，其包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子，其中人类GPR156基因包含编码E533D变异的核苷酸。在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分进一步包含人类GPR156基因的5'非编码外显子序列或3'非编码外显子序列或其组合。在一些实施例中，人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子的5'非编码序列或3'UTR或其组合。在特定实施例中，人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子至最后一个外显子(即，至3'UTR)中的ATG起始密码子，其中人类GPR156基因包含编码E533D变异的核苷酸。
在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段包含内源性啮齿动物Gpr156基因的ATG起始密码子(第一编码外显子中)至终止密码子(最后一个编码外显子中)。在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段进一步包含啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列或3'非编码外显子序列或其组合。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，其中突变型蛋白为814个氨基酸的全长GPR156蛋白。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:5中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:6中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6基本上一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码突变型人类GPR156蛋白，其为810个氨基酸的短同种型GPR156蛋白且包含E533D变异。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:7中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ IDNO:8中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8基本上一致的氨基酸序列。
在另外的实施例中，啮齿动物中的人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的编码序列(例如基因组或cDNA序列)，其中编码序列包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子。在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分进一步包含人类GPR156基因的5'非编码外显子序列或3'非编码外显子序列或其组合。在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的第一编码外显子的5'非编码序列或3'UTR或其组合。在特定实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个外显子(即，至3'UTR)。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的啮齿动物Gpr156核酸部分包含啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列或3'非编码外显子序列或其组合。在啮齿动物Gpr156基因为小鼠Gpr156基因的实施例中，人源化Gpr156中的啮齿动物Gpr156核酸部分可包含小鼠Gpr156基因的外显子1、外显子2中的5'非编码序列或外显子10的3'UTR，或其组合。
在特定实施例中，人源化Gpr156基因包含啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列，和人类GPR156基因的第一编码外显子至最后一个外显子中的ATG起始密码子；且在某些实施例中，此类人源化Gpr156基因进一步包含位于人类GPR156基因的最后一个外显子下游的啮齿动物Gpr156基因的3'非编码外显子序列。在啮齿动物Gpr156基因为小鼠Gpr156基因的实施例中，人源化Gpr156基因可包含小鼠Gpr156基因的外显子1、外显子2中的5'非编码序列或外显子10的3'UTR，或其组合，其中当存在时，小鼠Gpr156基因的外显子10的3'UTR位于人类GPR156基因的最后一个外显子下游。
在一些实施例中，提供人源化Gpr156基因中的啮齿动物Gpr156核酸部分的啮齿动物Gpr156基因为内源性啮齿动物Gpr156基因。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因由将内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段替换为编码野生型人类GPR156蛋白的人类GPR156核酸而形成。人类GPR156核酸可以是基因组DNA或cDNA。
在一些实施例中，编码野生型人类GPR156蛋白的人类GPR156核酸包含编码序列(例如基因组或cDNA序列)，其包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子。在一些实施例中，人类GPR156核酸进一步包含人类GPR156基因的5'和/或3'非编码外显子序列。在一些实施例中，人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的5'非编码序列或3'UTR或其组合。在特定实施例中，人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个外显子(即，至3'UTR)。
在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段包含内源性啮齿动物Gpr156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子。在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段进一步包含内源性啮齿动物Gpr156基因的5'和/或3'非编码外显子序列。在啮齿动物为小鼠的实施例中，被替换的小鼠基因组片段可包含内源性小鼠Gpr156基因的外显子1、外显子2中的5'非编码序列或外显子10的3'UTR，或其组合。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白，其中野生型蛋白为814个氨基酸的全长野生型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:1中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2基本上一致的氨基酸序列，且在位置533处包含Glu。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白，其为810个氨基酸的短同种型野生型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白包含SEQID NO:3中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:4中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4基本上一致的810个氨基酸的氨基酸序列，且在位置529处包含Glu。
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物对于人源化Gpr156基因是杂合的。在一些实施例中，本文公开的啮齿动物对于人源化Gpr156基因是纯合的。
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物不能表达内源性啮齿动物Gpr156蛋白。
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物为小鼠或大鼠。
在另一方面，本文公开分离的啮齿动物细胞或组织，其基因组在内源性啮齿动物Gpr156基因座处包含人源化Gpr156基因，其中人源化Gpr156基因包含啮齿动物Gpr156核酸部分和人类GPR156核酸部分，且其中人源化Gpr156基因的表达受内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。啮齿动物Gpr156核酸部分和人类GPR156核酸部分各自可以是基因组DNA或cDNA。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的编码序列，其中编码序列包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子，且其中人类GPR156基因包含编码E533D变异的核苷酸(在最后一个编码外显子中)。在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分进一步包含人类GPR156基因的5'和/或3'非编码外显子序列。在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的第一编码外显子的5'非编码序列或3'UTR或其组合。在特定实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的第一编码外显子至最后一个外显子(即，至3'UTR)中的ATG起始密码子，其中人类GPR156基因包含编码E533D变异的核苷酸。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因中的啮齿动物Gpr156核酸部分包含啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列或3'非编码外显子序列或其组合。在啮齿动物Gpr156基因为小鼠Gpr156基因的实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156中的啮齿动物Gpr156核酸部分可包含小鼠Gpr156基因的外显子1、外显子2中的5'非编码序列或外显子10的3'UTR，或其组合。
在特定实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因包含啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列，和人类GPR156基因的第一编码外显子至最后一个外显子中的ATG起始密码子，其中人类GPR156基因包含编码E533D变异的核苷酸；且在某些实施例中，此类人源化Gpr156基因进一步包含位于人类GPR156基因的最后一个外显子下游的啮齿动物Gpr156基因的3'非编码外显子序列。
在一些实施例中，提供分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因中的啮齿动物Gpr156核酸部分的啮齿动物Gpr156基因为内源性啮齿动物Gpr156基因。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因由将内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段替换为编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白的人类GPR156核酸而形成。人类GPR156核酸部分可以是基因组DNA或cDNA。
在一些实施例中，编码突变型人类GPR156蛋白的人类GPR156核酸包含编码序列(例如基因组或cDNA序列)，其包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子，其中人类GPR156基因包含编码E533D变异的核苷酸。在一些实施例中，人类GPR156核酸进一步包含人类GPR156基因的5'和/或3'非编码外显子序列。在一些实施例中，人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子的5'非编码部分或3'UTR或其组合。在特定实施例中，人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个外显子(即，包括3'UTR)，其中人类GPR156基因包含编码E533D变异的核苷酸。
在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段包含内源性啮齿动物Gpr156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子。在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段进一步包含内源性啮齿动物Gpr156基因的5'和/或3'非编码外显子序列。在啮齿动物细胞或组织为小鼠细胞或组织的实施例中，被替换的小鼠基因组片段可包含内源性小鼠Gpr156基因的外显子1、外显子2中的5'非编码序列或外显子10的3'UTR，或其组合。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，其中突变型蛋白为814个氨基酸的全长GPR156蛋白。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:5中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:6中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6基本上一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因编码突变型人类GPR156蛋白，其为810个氨基酸的短同种型GPR156蛋白且包含E533D变异。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:7中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:8中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8基本上一致的氨基酸序列。
在另外的实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的编码序列(例如基因组或cDNA序列)，其中编码序列包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子。在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分进一步包含人类GPR156基因的5'和/或3'非编码外显子序列。在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的第一编码外显子的5'非编码部分或3'UTR或其组合。在特定实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个外显子(即，包括3'UTR)。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因中的啮齿动物Gpr156核酸部分包含5'非编码外显子序列和/或3'非编码外显子序列。在啮齿动物细胞或组织为小鼠细胞或组织的实施例中，分离的小鼠细胞或组织中的人源化Gpr156基因中的啮齿动物Gpr156核酸部分可包含小鼠Gpr156基因的外显子1、外显子2中的5'非编码序列或外显子10的3'UTR，或其组合。
在特定实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因包含啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列，和人类GPR156基因的第一编码外显子至最后一个外显子中的ATG起始密码子；且在某些实施例中，此类人源化Gpr156基因进一步包含位于人类GPR156基因的最后一个外显子下游的啮齿动物Gpr156基因的3'非编码外显子序列。
在一些实施例中，提供分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因中的啮齿动物Gpr156核酸部分的啮齿动物Gpr156基因为内源性啮齿动物Gpr156基因。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因由将内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段替换为编码野生型人类GPR156蛋白的人类GPR156核酸而形成。人类GPR156核酸可以是基因组DNA或cDNA。
在一些实施例中，编码野生型人类GPR156蛋白的人类GPR156核酸包含编码序列(例如基因组或cDNA序列)，其包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子。在一些实施例中，人类GPR156核酸进一步包含人类GPR156基因的5'和/或3'非编码外显子序列。在一些实施例中，人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子的5'非编码部分或3'UTR或其组合。在特定实施例中，人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个外显子(即，包括3'UTR)。
在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段包含内源性啮齿动物Gpr156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白，其中野生型蛋白为814个氨基酸的全长野生型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:1中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2基本上一致的氨基酸序列，且在位置533处包含Glu。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织中的人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白，其为810个氨基酸的短同种型野生型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:4中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4基本上一致的810个氨基酸的氨基酸序列，且在位置529处包含Glu。
在一些实施例中，本文公开的分离的啮齿动物细胞或组织对于人源化Gpr156基因为杂合的。在一些实施例中，本文公开的分离的啮齿动物细胞或组织对于人源化Gpr156基因是纯合的。
在一些实施例中，本文公开的分离的啮齿动物细胞或组织不能表达内源性啮齿动物Gpr156蛋白。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞为啮齿动物胚胎干(ES)细胞。
在一些实施例中，分离的啮齿动物细胞或组织为小鼠细胞或组织，或大鼠细胞或组织。
在另一方面，本文公开制备经遗传修饰的啮齿动物的方法，该方法包含修饰啮齿动物基因组以使得经修饰的基因组在内源性啮齿动物Gpr156基因座处包含人源化Gpr156基因，其中人源化Gpr156基因包含啮齿动物Gpr156核酸部分和人类GPR156核酸部分，且其中人源化Gpr156基因的表达受内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制；以及获得包含经修饰的基因组的啮齿动物。啮齿动物Gpr156核酸部分和人类GPR156核酸部分各自可以是基因组DNA或cDNA。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白。
在一些实施例中，如下地修饰啮齿动物基因组：通过(a)将靶向载体引入至啮齿动物ES细胞中以获得修饰的啮齿动物ES细胞，其基因组包含人源化Gpr156基因；和(b)使用(a)的修饰的啮齿动物ES细胞来制备啮齿动物。
在一些实施例中，靶向载体包含整合至内源性啮齿动物Gpr156基因座中的人类GPR156核酸，由此在内源性啮齿动物Gpr156基因座处形成人源化Gpr156基因。人类GPR156核酸可以是基因组DNA或cDNA。
在一些实施例中，人类GPR156核酸包含编码序列(例如基因组或cDNA序列)，其包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子，其中人类GPR156基因包含编码Glu(野生型)或E533D变异(突变型)的核苷酸(在最后一个编码外显子中)。在一些实施例中，人类GPR156核酸进一步包含人类GPR156基因的5'和/或3'非编码外显子序列。在一些实施例中，人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子的5'非编码序列或3'UTR或其组合。在特定实施例中，人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个外显子(即，包括3'UTR)，其中人类GPR156基因包含编码Glu(野生型)或E533D变异(突变型)的核苷酸。
在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段包含内源性啮齿动物Gpr156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子。在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段进一步包含内源性啮齿动物Gpr156基因的5'和/或3'非编码外显子序列。在啮齿动物为小鼠的实施例中，被替换的小鼠基因组片段可包含内源性小鼠Gpr156基因的外显子1、外显子2中的5'非编码序列或外显子10的3'UTR，或其组合。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，其中突变型蛋白为814个氨基酸的全长GPR156蛋白。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:5中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:6中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6基本上一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码突变型人类GPR156蛋白，其为810个氨基酸的短同种型GPR156蛋白且包含E533D变异。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:7中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含SEQ IDNO:8中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8基本上一致的氨基酸序列。
在另外的实施例中，人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白，其中野生型蛋白为814个氨基酸的全长野生型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:1中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2基本上一致的氨基酸序列，且在位置533处包含Glu。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白，其为810个氨基酸的短同种型野生型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白包含SEQID NO:3中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白包含SEQ ID NO:4中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4基本上一致的810个氨基酸的氨基酸序列，且在位置529处包含Glu。
在一些实施例中，根据本发明方法制备的啮齿动物对于人源化Gpr156基因为杂合的。在一些实施例中，根据本发明方法制备的啮齿动物对于人源化Gpr156基因为纯合的。
在一些实施例中，根据本发明方法制备的啮齿动物不能表达内源性啮齿动物Gpr156蛋白。
在一些实施例中，根据本发明方法制备的啮齿动物为小鼠或大鼠。
在另一方面，本文公开靶向核酸载体，其包含待整合至内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156基因中的人类GPR156核酸，两侧是与啮齿动物Gpr156基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列，其中将人类GPR156核酸整合至啮齿动物Gpr156基因中使得将内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段替换为人类GPR156核酸，以形成人源化Gpr156基因，且其中人源化Gpr156基因的表达受内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。人类GPR156核酸(和人源化Gpr156基因)编码野生型人类GPR156蛋白或包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白。
在一些实施例中，靶向载体中的人类GPR156核酸包含编码序列(例如基因组或cDNA序列)，其包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子，其中人类GPR156基因包含在对应于全长野生型人类GPR156蛋白(例如SEQ ID NO:1或2)中的位置533的氨基酸位置处编码Glu(野生型)或Asp(突变型)的核苷酸。在一些实施例中，靶向载体中的人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个外显子。
在一些实施例中，靶向载体被设计成使得被替换的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段包含内源性啮齿动物Gpr156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子。在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段进一步包含内源性啮齿动物Gpr156基因的5'和/或3'非编码外显子序列。在啮齿动物为小鼠的实施例中，靶向载体被设计成使得被替换的小鼠基因组片段可包含内源性小鼠Gpr156基因的外显子1、外显子2中的5'非编码序列或外显子10的3'UTR，或其组合。
在一些实施例中，靶向载体经设计以将人类GPR156核酸整合至啮齿动物的基因组中，其中所述啮齿动物为小鼠或大鼠。
在另一方面，本文公开一种方法，其包含将基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因的第一啮齿动物与第二啮齿动物育种，产生基因组包含人源化Gpr156基因的后代啮齿动物，其中人源化Gpr156基因的表达受内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白。
在一些实施例中，第一啮齿动物和第二啮齿动物为小鼠。在一些实施例中，第一啮齿动物和第二啮齿动物为大鼠。
在另一方面，公开了一种后代啮齿动物，其基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因，其中所述后代啮齿动物通过包含将基因组包含人源化Gpr156基因的第一啮齿动物与第二啮齿动物育种的方法产生，其中人源化Gpr156基因的表达受内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白。
在一些实施例中，后代啮齿动物对于人源化Gpr156基因为杂合的。在一些实施例中，后代啮齿动物对于人源化Gpr156基因为纯合的。
在一些实施例中，后代啮齿动物为小鼠。在一些实施例中，后代啮齿动物为大鼠。
在一个方面，本文公开一种啮齿动物，其基因组包含经遗传修饰的Gpr156基因座，其中遗传修饰包含内源性啮齿动物Gpr156基因中的缺失，且任选地还包含报告基因的插入，其中报告基因可操作地连接于基因座处的内源性啮齿动物Gpr156启动子。
在一些实施例中，自第一编码外显子中的起始密码子之后的核苷酸开始至后续编码外显子(例如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九编码外显子)的基因组片段已缺失；且在一些此类实施例中，报告基因被插入且可操作地连接于内源性啮齿动物Gpr156基因的第一编码外显子中的起始密码子。在这些实施例中，报告基因的表达类似于未经修饰的内源性啮齿动物Gpr156基因的表达模式。
在一些实施例中，报告基因为LacZ，或编码选自由以下组成的群组的蛋白质的基因：荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、DsRed和MmGFP。
在一些实施例中，啮齿动物对于遗传修饰是纯合的。在一些实施例中，啮齿动物对于遗传修饰是杂合的。
在一些实施例中，啮齿动物为小鼠。在一些实施例中，啮齿动物为大鼠。
在另一方面，公开了情绪障碍，如单相抑郁症或焦虑症的啮齿动物模型。
在一些实施例中，情绪障碍的啮齿动物模型包含经遗传修饰的啮齿动物，其基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因，其中人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，且其中人源化Gpr156基因的表达手内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。啮齿动物对于人源化Gpr156基因可以是杂合或纯合的。
在一些实施例中，情绪障碍的啮齿动物模型进一步包含经遗传修饰的啮齿动物，其基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因，其中人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白，且其中人源化Gpr156基因的表达受内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。啮齿动物对于人源化Gpr156基因可以是杂合或纯合的。
在一些实施例中，情绪障碍的啮齿动物模型进一步包含经遗传修饰的啮齿动物，其基因组包含经遗传修饰的Gpr156基因座，其中遗传修饰包含内源性啮齿动物Gpr156基因中的缺失和任选地报告基因的插入，且其中报告基因可操作地连接于基因座处的内源性啮齿动物Gpr156启动子。啮齿动物对于遗传修饰可以是杂合或纯合的。
根据本公开，对于编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白的人源化Gpr156基因呈纯合，或对于内源性啮齿动物Gpr156基因中的缺失呈纯合的啮齿动物不能完成强迫游泳测试，而对照啮齿动物(对于编码野生型人类GPR156蛋白的人源化Gpr156基因呈纯合的啮齿动物，或未经遗传修饰或人源化的啮齿动物)能够进行强迫游泳测试。在用抗抑郁/抗焦虑药物治疗之后，E533D突变型啮齿动物或Gpr156缺失啮齿动物完成强迫游泳测试的能力得以改善。因此，对于编码E533D变体的人源化Gpr156基因呈纯合，或对于内源性啮齿动物Gpr156基因中的缺失呈纯合的啮齿动物不能完成强迫游泳测试可充当情绪障碍的特征或指示，且啮齿动物可用于筛选或测试用于治疗情绪障碍(如单相抑郁症和焦虑症)的治疗剂。
在另一方面，本文公开一种筛选或测试用于治疗单相抑郁症或焦虑症的治疗剂的方法，所述方法包含向本文公开的啮齿动物施用药剂，进行一个或多个分析(例如强迫游泳测试或弹珠掩埋测试)以确定药剂是否对啮齿动物在一个或多个分析中的表现有影响。当药剂对啮齿动物有治疗效果时，可将药剂鉴别为治疗候选物，所述治疗效果如通过例如减少、消除或防止强迫游泳测试中的损伤，或通过改善进行和完成强迫游泳测试的能力；或通过减少、消除或防止埋入的弹珠数目增加来评估。
附图说明
图1.顶部，内源性小鼠Gpr156基因座(编码区以条状线绘示)；中间，具有小鼠Gpr156外显子2(部分，自ATG之后的密码子开始)和外显子3-5缺失和LacZ编码序列插入的经遗传修饰的小鼠Gpr156基因座；以及底部，经遗传修饰的小鼠Gpr156基因座，所述基因座将来自小鼠Gpr156基因的外显子2中的ATG起始密码子至外显子10中的终止密码子的小鼠基因组片段替换为来自人类GPR156基因(野生型人类GPR156基因或编码E533D变体的突变型人类GPR156基因)的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子(也是最后一个外显子)中的终止密码子的人类基因组片段。此图中描绘的小鼠Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因的外显子(“Ex”)编号遵循小鼠外显子编号。
图2.游泳测试的总时间(以秒计)。对小鼠进行6分钟强迫游泳测试；并非所有小鼠都能执行任务。所述图展示不同测试Gpr156基因型的游泳测试的持续时间，从左到右，雄性Gpr156+/+、雄性Gpr156-/-、雄性GPR156hum/hum(对于野生型人类GPR156为纯合的)、雄性GPR156E533D/E533D、雌性Gpr156+/+、雌性Gpr156-/-、雌性GPR156hum/hum及雌性GPR156E533D/E533D。数据表示为每个动物组的平均值±SEM。
图3A.左图：在持续9周(每周6天，每天注射)每天用腹膜内注射的10mg/kg氟西汀进行治疗之前和之后，游泳测试的总时间(以秒计)。每3周对小鼠进行6分钟强迫游泳测试。所述图展示不同测试Gpr156基因型的游泳测试的平均·SEM持续时间：治疗的GPR156E533D /E533D小鼠、治疗的雄性GPR156hum/hum、治疗的雌性GPR156E533D/E533D、治疗的雌性GPR156hum/hum和未治疗的雌性GPR156E533D/E533D。氟西汀治疗改善了GPR156E533D/E533D小鼠的受损游泳表型。右图：对于腹膜内注射氟西汀之后3周、6周和9周测试的不同GPR156基因型，完成游泳测试的小鼠的百分比。尽管没有一只(0/13)GPR156E533D/E533D小鼠能够在9周氟西汀治疗之后首次进行游泳测试，但53％(7/13)的GPR156E533D/E533D小鼠完成了测试(第8只小鼠在350秒时未通过测试)。
图3B.图3A的实验中研究的个别GPR156E533D/E533D小鼠在9周内绘制的游泳测试表现，展示氟西汀治疗改善了GPR156E533D/E533D小鼠的受损游泳表型。在9周氟西汀治疗后，53％的小鼠完成了测试。另一方面，在未治疗组中，尽管一些小鼠改善了表现，但仅1/11只小鼠在9周时完成了游泳测试。
图3C-3D.丙咪嗪治疗改善了GPR156E533D/E533D小鼠的受损游泳表型。图3C：在丙咪嗪治疗之前，以及在每周6天(星期一至星期六)腹膜内注射15mg/kg丙咪嗪之后9周时测试的不同Gpr156基因型的游泳测试的总时间(以秒计)，雄性和雌性小鼠分开绘制。图3D：在用丙咪嗪治疗9周之前和之后测试的不同GPR156基因型的游泳测试的总时间(以秒计)，将各基因型的雄性和雌性小鼠组合。
图4.不同基因型的小鼠在10分钟内埋入的弹珠数目，从左到右：雄性Gpr156+/+、雄性Gpr156-/-、雄性GPR156hum/hum、雄性GPR156E533D/E533D、雌性Gpr156+/+、雌性Gpr156-/-、雌性GPR156hum/hum和雌性GPR156E533D/E533D。经遗传修饰且对于编码E533D变异的人源化GPR156基因呈纯合或对于小鼠Gpr156基因缺失呈纯合的雄性小鼠展示在10分钟内埋入的弹珠数目增加。数据表示为每个动物组的平均值±SEM。
具体实施方式
本文公开了经遗传修饰的啮齿动物，其适用作情绪障碍，例如单相抑郁症和焦虑症的动物模型。确切地说，本文公开了在内源性啮齿动物Gpr156基因座处携带人源化Gpr156基因的经遗传修饰的啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，其中人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白或在对应于全长野生型人类GPR156蛋白中的位置533的氨基酸位置处包含Asp的突变型人类GPR156蛋白(在本文中也称为“E533D变异”)。本文还公开了用于制备经遗传修饰的啮齿动物的方法和靶向载体、育种方法和经遗传修饰的啮齿动物作为用于筛选和测试治疗剂的情绪障碍动物模型的用途。
在以下章节中详细描述了本公开的各个方面。
GPR156
GPR156(G蛋白偶联受体156)编码属于C组G蛋白偶联受体家族的蛋白质，且与GABAB受体亚家族最密切相关(Calver A等人,Brain Res.Mol.Brain Res.110:305-307(2003))。预测GPR156蛋白含有七个跨膜域、N端细胞外域和C端胞内域，无信号肽(Calver等人,前述)。GPR156的C端序列含有推定的卷曲螺旋结构域二-亮氨酸和若干个RXR(R)ER保留基序，已显示其全部对于GABAB受体亚单位功能至关重要(Calver等人,前述)。另外，GPR156在中枢神经系统中的分布使人联想到其它已知GABAB亚单位(Calver等人,前述)。
人类GPR156基因(例如可在GenBank中以登录号NC_000003.12获得)位于染色体3上，在3q13与3q22之间，且长度为约120kb。已预测人类基因具有10个外显子，其中外显子2是第一编码外显子，尽管典型转录物似乎不包括预测转录物中存在的5'非编码外显子，且具有9个外显子，其中第一外显子也是第一编码外显子。同源小鼠基因(例如可在GenBank中以登录号NC_000082.6获得)位于染色体16上，且记录为具有10个外显子，其中外显子2是第一编码外显子。同源大鼠基因(例如可在GenBank中以登录号NC_005110.4获得)位于染色体11上，且记录为具有9个外显子，其中外显子1是第一编码外显子。编码全长或短同种型、野生型或E533D变异型人类GPR156蛋白的例示性人类基因组DNA序列阐述于SEQ ID NO:9-16中。例示性大鼠和小鼠转录物cDNA和蛋白质序列阐述于SEQ ID NO:25(NM_153295.1)、SEQID NO:26(NM_153394.2)、SEQ ID NO:27(NP_695207.1)和SEQ ID NO:28(NP_700443.2)中。
GPR156跨物种高度保守，其中小鼠和大鼠蛋白为87.5％一致，且其中小鼠和大鼠蛋白分别与人类蛋白69.3％和69.5％一致(Calver等人,前述)。
已报道了人类GPR156蛋白的两种野生型同种型。较长同种型在本文中也称为全长野生型人类GPR156蛋白，由814个氨基酸组成。由于12个核苷酸的框内缺失，较短同种型在对应于较长同种型的位置198至201的位置处含有4个氨基酸的缺失。对于各同种型，存在两个变体且在对应于较长同种型中的位置516，或对应于较短同种型中的位置512的氨基酸位置处具有谷氨酸或天冬氨酸。
在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白由如SEQ ID NO:1中所阐述的氨基酸序列表示。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白由如SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列表示。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2均由814个氨基酸组成且仅在位置516处不同，其中在此位置处，SEQ ID NO；1具有谷氨酸且SEQ ID NO:2具有天冬氨酸。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白可由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列表示。
在将给定氨基酸序列称为与参考序列“基本上一致”时，其包括其中给定氨基酸序列与参考序列至少98％一致、至少98.5％、至少99％一致或至少99.5％一致的实施例；例如，给定氨基酸序列与参考序列相差1、2、3、4或5个氨基酸，或相差不超过5、4、3、2或1个氨基酸。
在一些实施例中，短野生型人类GPR156蛋白同种型由如SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列表示。在一些实施例中，短野生型人类GPR156蛋白同种型由如SEQ ID NO:4中所阐述的氨基酸序列表示。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4均由810个氨基酸组成且仅在位置512处不同，其中在此位置处，SEQ ID NO；3具有谷氨酸且SEQ ID NO:4具有天冬氨酸。在一些实施例中，短野生型人类GPR156蛋白同种型可由与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所阐述的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列表示。
根据本公开的所有野生型人类GPR156蛋白(全长和短同种型蛋白)均在对应于全长野生型人类GPR156蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)中的位置533的位置处具有Glu残基。
如本文中所使用，当在给定多肽或核酸分子中的位置编号的情形下使用时，短语“对应于”或其语法变化形式是指当给定氨基酸或核酸分子与参考分子(例如其中本文的参考分子为全长野生型人类GPR156的多肽或核酸分子)相比时，指定参考多肽或核酸分子的编号。换句话说，给定聚合物中的氨基酸残基或核苷酸的位置是相对于参考分子，而不是由给定聚合物内的氨基酸残基或核苷酸的实际数字位置指示。例如，给定氨基酸序列可通过引入间隙而与参考序列比对，以优化两个序列之间的残基匹配。在这些情况下，尽管存在间隙，但给定氨基酸或核酸序列中的残基的编号相对于已与其比对的参考序列进行。
例如，短语“GPR156蛋白，其中所述蛋白在对应于SEQ ID NO:1的位置533的位置处包含谷氨酸”意指如果GPR156蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的序列比对，则GPR156蛋白在对应于SEQ ID NO:1的位置533的位置处具有谷氨酸。作为实例，对应于SEQ ID NO:1的位置533的SEQ ID NO:3的野生型GPR156蛋白的短同种型中的位置为位置529。
如上文所述，GPR156蛋白内对应于全长野生型人类GPR156蛋白的位置533的位置可通过在给定GPR156蛋白与全长野生型人类GPR156蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)之间进行序列比对而容易地鉴别。存在多种可用于进行序列比对以鉴别对应于SEQ ID NO:1或2中的位置533的氨基酸位置的计算算法。例如，通过使用NCBI BLAST算法(Altschul等人1997Nucleic Acids Res.25:3389-3402)或CLUSTALW软体(Sievers和Higgins 2014Methods Mol.Biol.1079:105-116.)，可进行序列比对。然而，序列也可以手动比对。
与单相抑郁症和焦虑症相关的人类GPR156中的改变/突变
美国公布申请2018/0030114 A1中报道了与受影响家庭成员的单相抑郁症的表型分离的人类GPR156基因中的罕见变体。更确切地说，已在US 2018/0030114 A1中将人类GPR156基因中的遗传改变鉴别为与受影响家庭成员的单相抑郁症的表型分离，所述遗传改变将对应于全长人类GPR156蛋白(例如SEQ ID NO:1或2)中的位置533的位置处的氨基酸自Glu变为Asp。此类蛋白在本文中也称为具有“E533D突变”或“E533D变异”的突变型人类GPR156蛋白。携带E533D变异的其它家庭成员已确诊患有焦虑症。因此，有人提出人类GPR156中的E533D变异指示对罹患情绪障碍(如单相抑郁症和焦虑症)的易感性增加。
根据本公开，啮齿动物中的内源性Gpr156基因座已经修饰(或人源化)以携带编码和表达包含E533D变异(即，在对应于全长野生型人类GPR156蛋白中的位置533的位置处包含Asp)的突变型人类GPR156蛋白的核酸。如本文中所展示，此类经遗传修饰的啮齿动物展现反映情绪障碍(如单相抑郁症和焦虑症)的特征，且因此可充当情绪障碍的啮齿动物模型。
包含人源化Gpr156基因的啮齿动物
本公开提供经遗传修饰的啮齿动物，其基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因，其中人源化Gpr156基因编码人类GPR156蛋白且受内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。
如本文所用的“人源化Gpr156基因”包括包含人类GPR156核酸部分和啮齿动物Gpr156核酸部分两者的Gpr156基因。例如，啮齿动物Gpr156基因可经修饰以使得啮齿动物Gpr156基因的一部分经人类GPR156核酸(例如人类GPR156基因的一部分)替换。在一些实施例中，内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因已经修饰以使得内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的一部分经人类GPR156核酸(例如人类GPR156基因的一部分)替换。
基因的“部分”在本文中可与基因的“片段”互换使用，其包括对基因的连续核苷酸序列部分的提及，包括例如5'调节区(例如启动子)、5'非编码外显子序列、3'非编码外显子序列、5'或3'非翻译区(UTR)、全部或部分外显子、全部或部分内含子、最后一个外显子下游的3'区或其组合。在一些实施例中，基因的一部分是指基因的编码区，例如包含基因的ATG起始密码子至终止密码子的核酸(基因组DNA或cDNA)。
“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”可包含任何长度的核苷酸的聚合形式，可包括RNA(例如mRNA)或DNA(例如基因组DNA或cDNA)，且可为单股、双股或多股的。因此，对“人类GPR156核酸”的提及可包括例如全部或部分人类GPR156基因的基因组和cDNA形式。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码为野生型人类GPR156蛋白的GPR156蛋白。
在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白为全长野生型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白由如SEQ ID NO:1中所阐述的氨基酸序列表示。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白由如SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列表示。在一些实施例中，全长野生型人类GPR156蛋白可由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列表示。
在一些实施例中，野生型人类GPR156蛋白为短同种型野生型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，短同种型野生型人类GPR156蛋白由如SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列表示。在一些实施例中，短同种型野生型人类GPR156蛋白由如SEQ ID NO:4中所阐述的氨基酸序列表示。在一些实施例中，短同种型野生型人类GPR156蛋白可由与SEQ ID NO:3或SEQID NO:4中所阐述的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列表示。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码814个氨基酸的全长GPR156蛋白，其中GPR156蛋白在对应于全长野生型人类GPR156蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)中的位置533的位置处包含Glu残基，且其中GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码810个氨基酸的短同种型GPR156蛋白，其中GPR156蛋白在对应于全长野生型人类GPR156蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)中的位置533的位置处包含Glu残基，且其中GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所阐述的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，即，在对应于全长野生型人类GPR156蛋白(例如SEQ ID NO:1或2)中的位置533的氨基酸位置处包含Asp的突变型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，相比于野生型人类GPR156蛋白，E533D变异为突变型人类GPR156蛋白中之唯一变异，在此情况下，突变型GPR156蛋白亦称为E533D变体。
在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白为全长人类GPR156蛋白。在一些实施例中，全长突变型人类GPR156蛋白由如SEQ ID NO:5中所阐述的氨基酸序列表示。在一些实施例中，全长突变型人类GPR156蛋白由如SEQ ID NO:6中所阐述的氨基酸序列表示。在一些实施例中，全长突变型人类GPR156蛋白可由与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所阐述的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列表示。
在一些实施例中，突变型人类GPR156蛋白为短同种型人类GPR156蛋白。在一些实施例中，短同种型突变型人类GPR156蛋白由如SEQ ID NO:7中所阐述的氨基酸序列表示。在一些实施例中，短同种型突变型人类GPR156蛋白由如SEQ ID NO:8中所阐述的氨基酸序列表示。在一些实施例中，短同种型突变型人类GPR156蛋白可由与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所阐述的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列表示。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码814个氨基酸的全长突变型GPR156蛋白，其中全长突变型GPR156蛋白包含E533D变异，且包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所阐述的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因编码810个氨基酸的短同种型突变型GPR156蛋白，其中GPR156蛋白包含E533D变异，且其中突变型GPR156蛋白包含与SEQ ID NO:7或SEQID NO:8中所阐述的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列。
如上所陈述，人源化Gpr156基因可包括人类GPR156核酸部分和啮齿动物Gpr156核酸部分。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含如上文所述的GPR156蛋白，例如野生型人类GPR156蛋白(全长或短同种型)或突变型人类GPR156蛋白(全长或短同种型)的编码序列。
在一些实施例中，编码序列呈基因组DNA的形式。在一些实施例中，编码序列呈cDNA的形式(即，无内含子序列)。适用于提供编码序列的核酸序列的实例阐述于SEQ IDNO:9-24中，其与蛋白质序列的对应性概括如下。
表1
在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分包含编码序列，其包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子(也是最后一个外显子)中的终止密码子。人类GPR156基因可以是最后一个编码外显子编码对应于全长野生型GPR156蛋白的位置533的氨基酸位置处的Glu的野生型基因，或最后一个编码外显子编码对应于全长野生型GPR156蛋白的位置533的氨基酸位置处的Asp的突变基因。
在一些实施例中，除了GPR156蛋白的编码序列以外，人源化Gpr156基因中的人类GPR156核酸部分进一步包含人类GPR156基因的5'非编码外显子序列(例如ATG起始上游的第一编码外显子的5'部分)、3'非编码外显子序列(例如终止密码子下游的最后一个外显子的3'部分，即，3'UTR)、最后一个外显子下游的核苷酸序列或其组合。
在本公开的人源化Gpr156基因中，人类GPR156核酸部分可操作地连接于啮齿动物Gpr156核酸部分。在一些实施例中，人源化Gpr156基因中的啮齿动物Gpr156核酸部分可包括啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列或3'非编码外显子序列或其组合。在啮齿动物Gpr156基因为小鼠Gpr156基因的实施例中，5'非编码外显子序列可包括例如小鼠Gpr156基因的外显子1、外显子2(第一编码外显子)的5'非编码部分或其组合；且3'非编码外显子序列可包括例如小鼠Gpr156基因的外显子10(第9个和最后一个编码外显子)的3'UTR。在啮齿动物Gpr156基因为大鼠Gpr156基因的实施例中，5'非编码外显子序列可包括例如大鼠Gpr156基因的外显子1(也是第一编码外显子)的5'非编码部分；且3'非编码外显子序列可包括例如大鼠Gpr156基因的外显子9(也是最后一个编码外显子和最后一个外显子)的3'UTR。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因包含人类GPR156基因的3'UTR。在一些实施例中，人源化Gpr156基因包含啮齿动物Gpr156基因的3'非编码外显子序列(例如3'UTR)。在一些实施例中，人源化Gpr156基因包含人类GPR156基因的3'UTR和啮齿动物Gpr156基因的3'UTR，其中啮齿动物3'UTR位于人类GPR156基因的3'UTR下游。
在一些特定实施例中，人源化Gpr156基因包含可操作地连接于人类GPR156核酸的啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列，所述核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个外显子(即，包括3'UTR)，接着是啮齿动物Gpr156基因的3'非编码外显子序列。在特定实施例中，人源化Gpr156基因包含可操作地连接于人类GPR156核酸的小鼠Gpr156基因的外显子1和外显子2(第一编码外显子)的5'非编码部分，所述核酸包含人类GPR156基因的ATG起始密码子至最后一个外显子(即，包括3'UTR)，接着是小鼠Gpr156基因的外显子10的3'UTR。
在一些实施例中，人源化Gpr156基因由将内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段替换为编码野生型人类GPR156蛋白或包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白的人类GPR156核酸而形成。人类GPR156核酸部分可以是基因组DNA或cDNA。
在一些实施例中，编码人类GPR156蛋白的人类GPR156核酸包含人类基因组片段，其包含人类GPR156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子，其中人类GPR156基因包含编码Glu残基(野生型)或E533D变异的核苷酸。在一些实施例中，人类GPR156核酸进一步包含人类GPR156基因的5'非编码外显子序列(例如第一编码外显子中的5'非编码序列)或3'非编码外显子序列(例如3'UTR)或其组合。在特定实施例中，人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的第一编码外显子的ATG起始密码子至最后一个外显子(即，包括3'UTR)。
在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段包含内源性啮齿动物Gpr156基因的第一编码外显子中的ATG起始密码子至最后一个编码外显子中的终止密码子。在一些实施例中，被替换的啮齿动物基因组片段进一步包含内源性啮齿动物Gpr156基因的5'和/或3'非编码外显子序列。在啮齿动物为小鼠的实施例中，被替换的小鼠基因组片段还可包含内源性小鼠Gpr156基因的外显子1、外显子2中的5'非编码序列或外显子10的3'UTR，或其组合。
在一些实施例中，包含内源性啮齿动物Gpr156基因座中的人源化Gpr156基因的本文公开的啮齿动物可对于人源化Gpr156基因为杂合或纯合的。
在一些实施例中，本文公开的啮齿动物不能表达内源性啮齿动物Gpr156蛋白。举例来说，提供一种啮齿动物，其中内源性啮齿动物Gpr156基因经人源化Gpr156基因破坏或缺失或修饰或替换。在一些实施例中，两个内源性啮齿动物Gpr156等位基因中的每一个中的基因组片段已经人类GPR156核酸替换，产生两个人源化Gpr156等位基因和不能表达内源性啮齿动物Gpr156蛋白的啮齿动物。在一些实施例中，一个内源性啮齿动物Gpr156等位基因的片段已经人类GPR156核酸替换，且另一个内源性啮齿动物Gpr156等位基因已经修饰以含有破坏或缺失，产生不能表达内源性啮齿动物Gpr156蛋白的啮齿动物。
本文还提供基因组包含经遗传修饰的Gpr156基因座的啮齿动物，其中所述遗传修饰包含内源性啮齿动物Gpr156基因中的缺失，且任选地还包含报告基因的插入，且其中报告基因可操作地连接于基因座处的内源性啮齿动物Gpr156启动子。啮齿动物对于遗传修饰可以是杂合或纯合的。
在一些实施例中，自紧接在第一编码外显子中的起始密码子之后的核苷酸开始至后续编码外显子(例如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九编码外显子)的基因组片段已缺失，且报告基因插入于紧接在内源性啮齿动物Gpr156基因的起始密码子下游。在这种联系中，预期报告基因的表达类似于未经修饰的内源性啮齿动物Gpr156基因的表达模式。
多种报告基因是所属领域中已知的并且适合用于本文中。在一些实施例中，报告基因为LacZ基因。在一些实施例中，报告基因为编码选自由以下组成的群组的蛋白质的基因：荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、DsRed和MmGFP。
对于本文所述的任何实施例，啮齿动物可包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。
在一些实施例中，啮齿动物为小鼠。在一些实施例中，啮齿动物为C57BL品系的小鼠，例如选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系。在其它实施例中，啮齿动物是129品系的小鼠，例如选自129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2的129品系(参见例如Festing等人(1999)，MammalianGenome 10:836；Auerbach等人(2000)，Biotechniques 29(5):1024-1028，1030，1032)。在一些实施例中，啮齿动物是其为前述129品系和前述C57BL/6品系的混合物的小鼠。在某些实施例中，小鼠是前述129品系的混合物(即杂种)、或前述C57BL品系的混合物、或C57BL品系和129品系的混合物。在某些实施例中，小鼠是C57BL/6品系与129品系的混合物。在具体实施例中，小鼠是VGF1品系，也称为F1H4，其为C57BL/6和129的杂种。在其它实施例中，小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在一些实施例中，小鼠是BALB品系和另一个前述品系的混合物。
在一些实施例中，啮齿动物为大鼠。在某些实施例中，大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和Dark Agouti。在其它实施例中，大鼠是选自以下的两个或更多个品系的混合物：Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti。
靶向载体、制备包含人源化Gpr156基因的啮齿动物的方法和育种方法
包含人源化Gpr156基因的啮齿动物可使用各种方法制备。在一些实施例中，构建携带人类GPR156核酸的靶向核酸构建体(即，靶向载体)。人类GPR156核酸可包括如上文所述的GPR156蛋白，例如野生型人类GPR156蛋白(全长或短同种型)或突变型人类GPR156蛋白(全长或短同种型)的编码序列。取决于大小(例如是否使用基因组DNA或cDNA)，人类GPR156核酸可直接从cDNA源克隆或以合成方式制备。或者，细菌人工染色体(BAC)库可提供人类GPR156核酸序列。
除了人类GPR156核酸以外，靶向载体可包括具有合适长度且与内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156基因序列同源的侧接核酸序列，以使得能够介导将人类GPR156核酸同源重组和整合至内源性啮齿动物Gpr156基因中，形成内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因。
在一些实施例中，靶向载体还包括可选标记基因(例如含有可选标记基因的自缺失盒，如全部以引用的方式并入本文中的美国专利第8,697,851号、第8,518,392号和第8,354,389号中所述)，其两侧可为位点特异性重组位点(例如loxP、Frt等)或包含所述重组位点。可选标记基因可置于与人类GPR156核酸相邻的靶向载体上，以允许容易地选择转染子。
在一些实施例中，携带人类GPR156核酸的靶向载体(如BAC载体)可通过例如电穿孔引入至啮齿动物胚胎干(ES)细胞中。本领域已经描述了小鼠ES细胞和大鼠ES细胞。参见，例如US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754和US 2008-0078000 A1(所有所述专利均以引用的方式并入本文)描述了小鼠ES细胞和用于制备经基因修饰的小鼠的
方法；并且US 2014/0235933 A1和US2014/0310828A1(所有所述专利均以引用的方式并入本文)描述了大鼠ES细胞和制备经基因修饰的大鼠的方法。
可选择具有整合于啮齿动物基因组中的人类GPR156核酸的ES细胞。选择之后，可修饰阳性ES克隆，例如，在必要时去除自缺失盒。接着将具有整合于基因组中的人类GPR156核酸序列的ES细胞用作供体ES细胞以通过使用
方法(参见例如US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754和US 2008-0078000 A1)，或US2014/0235933 A1和US 2014/0310828 A1中描述的方法注射至桑椹体前期胚胎(例如8细胞期胚胎)中。使包含供体ES细胞的胚胎温育直到胚泡期，然后植入代孕母体内，以产生完全源自供体ES细胞的F0啮齿动物。使用检测人类GPR156核酸序列或可选标记基因的存在的等位基因修饰(MOA)分析(Valenzuela等人，前述)，通过对从剪尾分离的DNA进行基因分型，可以鉴定出具有突变等位基因的啮齿动物幼崽。
本文进一步提供将如本文所述的经遗传修饰的啮齿动物与另一啮齿动物育种的方法，以及从此类育种获得的后代。
在一些实施例中，提供一种方法，其包含将如上文所述的第一经遗传修饰的啮齿动物(例如基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因的啮齿动物，其中人源化Gpr156基因的表达受内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制)与第二啮齿动物育种，产生基因组包含人源化Gpr156基因的后代啮齿动物。如上文所述，人源化Gpr156基因可编码野生型人类GPR156蛋白，或包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白。后代可具有从育种中所用的第二啮齿动物遗传的其它所需表型或基因修饰。在一些实施例中，后代啮齿动物对于人源化Gpr156基因为杂合的。在一些实施例中，后代啮齿动物对于人源化Gpr156基因为纯合的。
在一些实施例中，提供基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因的后代啮齿动物，其中后代啮齿动物通过包含将如上文所述的第一经遗传修饰的啮齿动物(例如基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因的啮齿动物，其中人源化Gpr156基因的表达受内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制)与第二啮齿动物育种的方法产生。在一些实施例中，后代啮齿动物对于人源化Gpr156基因为杂合的。在一些实施例中，后代啮齿动物对于人源化Gpr156基因为纯合的。
情绪障碍的啮齿动物模型
本文公开了情绪障碍(如单相抑郁症和焦虑症)的啮齿动物模型。
根据华盛顿(Washington D.C.)的美国精神病学会2013年公布的精神障碍诊断与统计手册-第五版(DSM-V)，单相抑郁症由组成：重度抑郁症、心境恶劣障碍、混合性抑郁症、抑郁情绪适应障碍和未另列出(NOS)的抑郁症。抑郁症的DSMIV准则为持续2周或更久的五种或更多种以下症状：i)几乎每天的大部分时间感觉到抑郁情绪；ii)对所有或几乎所有活动的兴趣或愉悦显著降低；ⅲ)显著体重减轻或食欲降低；iv)失眠或睡眠过度；v)精神运动性躁动或迟钝；vi)疲劳或能量损失；vii)无价值感或过度内疚感；viii)思考或集中的能力减弱或犹豫不决；以及ix)反复出现的死亡想法。心境恶劣障碍的DSMIV准则的特征是压倒性的慢性抑郁状态，表现为在大部分天数的大部分时间内的抑郁情绪，至少持续2年。罹患这种病症的人不会超过2个月不经历以下症状中的两种或更多种：i)食欲不振或暴饮暴食；ii)失眠或嗜睡；ⅲ)精力不足或疲劳；iv)低自尊；v)注意力不集中或难以做出决定；vi)绝望感。
焦虑症的生理症状包括但不限于肌肉紧张、心悸、出汗、头晕和呼吸急促。情绪症状包括但不限于不安、厄运即将来临的感觉、害怕死亡、害怕尴尬或羞辱以及害怕发生可怕的事情。
在一些实施例中，情绪障碍的啮齿动物模型包含经遗传修饰的啮齿动物，其基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因，其中人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，且其中人源化Gpr156基因的表达手内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。
在一些实施例中，情绪障碍的啮齿动物模型进一步包含经遗传修饰的啮齿动物，其基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因，其中人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白，且其中人源化Gpr156基因的表达受内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。此类啮齿动物已在本文中显示能够完成强迫游泳测试，与野生型啮齿动物(未经任何人源化)类似，且因此适用作待比较的额外对照啮齿动物。
在一些实施例中，情绪障碍的啮齿动物模型进一步包含经遗传修饰的啮齿动物，其基因组包含经遗传修饰的Gpr156基因座，其中遗传修饰包含内源性啮齿动物Gpr156基因中的缺失和任选地报告基因的插入，且其中报告基因可操作地连接于基因座处的内源性啮齿动物Gpr156启动子。啮齿动物对于遗传修饰可以是杂合或纯合的。对于内源性啮齿动物Gpr156基因中的缺失呈纯合的啮齿动物已在本文中显示不能够完成强迫游泳测试且在指定时间内埋入的弹珠的数量增加，且因此适用作待比较的额外对照啮齿动物。
在一些实施例中，在强迫游泳测试中评估经遗传修饰的啮齿动物。在强迫游泳测试的示例性实施例中，啮齿动物可放置于填充有水的容器或烧杯中，以确保即使啮齿动物的尾部也无法接触到容器的底部。水可以保持在室温下或30℃下。测试可持续约5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10分钟。在一些实施例中，测试持续约6分钟。如果啮齿动物不能进行测试(例如，在测试期结束之前不能保持漂浮)，则一旦其显示痛苦迹象，就将其从水中拉出。如本文所确定，对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因呈纯合或对于内源性啮齿动物Gpr156基因缺失呈纯合的啮齿动物不能进行强迫游泳测试是反映例如抑郁症或焦虑的情绪障碍的特征。野生型啮齿动物(表达内源性啮齿动物Gpr156)和对于人源化Gpr156基因(无E533D突变)呈纯合的经遗传修饰的啮齿动物在完成游泳测试方面没有困难，且可用作对照。在一些实施例中，可基于例如在不同时间点，或在治疗之前和之后评估个别啮齿动物来确定进行游泳测试的能力的提高。在一些实施例中，基于例如在不同时间点，或在治疗之前和之后评估具有相同遗传修饰的一组啮齿动物来确定进行游泳测试的能力的提高，且所述组中可成功进行测试的啮齿动物的百分比增加指示能力提高。可基于比较治疗的一组啮齿动物与具有相同基因型的分开的未治疗一组啮齿动物，或基于比较治疗之前的一组啮齿动物与治疗之后的相同的一组啮齿动物来确定进行游泳测试的能力的变化(例如增加或提高)。
本领域中使用强迫游泳测试(或Porsolt测试，Porsolt等人,Arch IntPharmacodyn Ther.229(2):327-336(1977))基于啮齿动物对不愉快的环境的反应来评估无助。无助是抑郁症的特征性特性。被放置在水中的啮齿动物(例如小鼠)通常会试图逃跑。然而，如果啮齿动物表现出抑郁行为，则啮齿动物将仅漂浮而不会试图逃跑，直到获救。习得性无助是最初由Seligman和同事在1970年代发现和探索的一种现象(Seligman,AnnuRev Med.23(1):407-412(1972))。此模型的主要吸引力之一是其源自抑郁症的认知观点，在这种观点中，事件被消极看待并被解释为无法控制，导致在处理这些事件时感到焦虑和无助。动物的习得性无助与人类的抑郁症之间有很多相似之处。例如，引起啮齿动物中观察到的抑郁症样行为的不可控应激事件类似地先于人类的一些临床抑郁症发作(Gold等人,NEng J Med.319(6):348-353(1988)；Lloyd,Arch Gen Psychiatry 37(5):541-548(1980))。此外，动物暴露于类似但可控的事件不会产生相关行为变化(Corum和Thurmond,Psychosom Med.39(6):436-43(1977)；Weiss等人,A model for neurochemical study ofdepression,M.Spiegelstein和A.Levy编,Elsevier,Amsterdam,1982,第195-223页)。如本领域中所述，Porsolt强迫游泳测试持续两天，其中第一天是训练日，且第二天是测试日。在训练试验期间，动物得知不可能从箱中逃脱。在测试日(第2天)，将动物置于水容器中五分钟。在第二天，动物所耗费的不动的时间量被测量为因变量。
本文中已显示对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因呈纯合的经遗传修饰的小鼠和对于小鼠Gpr156基因缺失呈纯合的经遗传修饰的小鼠不能进行对应于训练阶段的6分钟强迫游泳测试。小鼠最初能够游泳，但在试图找到逃生的几分钟后，其似乎在水中“惊慌失措”了。这些小鼠随后开始表现出异常行为，其特征是疯狂游泳、重复潜水和在水下旋转，且变得不能保持漂浮。如果不迅速从水中捞出，这些小鼠会被溺死。相比之下，野生型小鼠(表达内源性小鼠Gpr156)和对于人源化Gpr156基因(无突变)呈纯合的经遗传修饰的小鼠在完成6分钟游泳测试方面没有困难。
其它人尚未在文献中描述对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因呈纯合的经遗传修饰的小鼠或对于小鼠GPR156基因缺失呈纯合的经遗传修饰的小鼠所展示的独特行为。由于这些小鼠无法完成测试，本发明人无法测量习得性无助。但是，本发明人观察到对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因呈纯合的90％雌性和60％雄性经遗传修饰的小鼠未通过训练游泳阶段，而对于编码野生型人类GPR156蛋白的人源化Gpr156基因呈纯合的经遗传修饰的小鼠容易地完成了测试。类似地，对于小鼠Gpr156基因缺失呈纯合的90％雌性和53％雄性经遗传修饰的小鼠未通过训练游泳阶段，而其野生型同窝幼畜完成了测试。当游泳测试培训阶段在30℃而不是室温(～23℃)下加热的水中运行时或当使用更大且提供平台(逃脱选项)的水迷宫设备时，获得类似结果。
本文还显示对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因呈纯合的啮齿动物在用氟西汀(选择性血清素再吸收抑制剂)或丙咪嗪(去甲肾上腺素、乙酰胆碱、多巴胺和血清素再吸收抑制剂)治疗之后，其进行游泳测试的能力得以提高。对于用氟西汀(10mg/kg，腹膜内，每日)或丙咪嗪(15mg/kg，腹膜内，每日，第周六天)治疗9周之后的GPR156E533D/E533D小鼠，已观察到进行6分钟游泳测试的能力的提高。
在一些实施例中，在弹珠掩埋测试中评估经遗传修饰的啮齿动物。弹珠掩埋任务被用作强迫样行为和/或焦虑样行为的指标。具有OCD样症状的啮齿动物倾向于进行高度重复的行为(包括挖掘)，且高度焦虑的啮齿动物倾向于在新的环境中进行高度的挖掘。
在一些实施例中，可如下地进行弹珠掩埋测试。啮齿动物笼子可均匀地填充有玉米芯垫料，且弹珠均匀分布在垫料顶部。将每只啮齿动物放在笼子的中心，且进行约10分钟的测试。10分钟后，从笼子中取出动物并计数埋入至少三分之二的弹珠。
作为实例，本文中已显示对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因呈纯合或对于小鼠GPR156基因缺失呈纯合的经遗传修饰的雄性小鼠展现10分钟内埋入的弹珠数目增加的趋势(参见例如图4)。
本文公开的啮齿动物和模型允许更好地理解GPR156蛋白的功能和情绪障碍的发展。另外，此类啮齿动物可用于筛选、测试和开发用于治疗情绪障碍(如单相抑郁症或焦虑症)的治疗剂。
在一些实施例中，在本文中如下地确定治疗剂用于治疗单相抑郁症或焦虑症的作用：通过向本文公开的啮齿动物，例如携带编码E533D变体的人源化Gpr156基因的啮齿动物施用试剂，对啮齿动物进行一个或多个测试(例如强迫游泳测试或弹珠掩埋测试)，并确定候选治疗剂是否对啮齿动物在测试中的表现有任何影响，例如完成游泳测试的能力的任何提高，或弹珠掩埋测试中埋入的弹珠数目的任何减少。
可在本文公开的啮齿动物中测试的治疗剂包括市售抗抑郁剂和抗焦虑剂，以及开发用于治疗单相抑郁症和焦虑症的候选化合物。包括小分子化合物和核酸(例如基因疗法药物)两者。
在一些实施例中，抗抑郁剂为选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)。SSRI的适合实例包括但不限于西它普兰(Citalopram)
依地普兰(Escitalopram)
帕罗西汀(Paroxetine)
氟西汀(Fluoxetine)
氟伏沙明(Fluvoxamine)
和舍曲林(Sertraline)
在一些实施例中，抗抑郁剂为血清素-去甲肾上腺素再吸收抑制剂(SNRI)。SNRI的适合实例包括但不限于去甲文拉法辛(Desvenlafaxine)
度洛西汀(Duloxetine)
左旋体米那普仑(Levomilnacipran)
米那普仑(Milnacipran)
托芬那森(Tofenacen)
和文拉法辛(Venlafaxine)
在一些实施例中，抗抑郁剂为去甲肾上腺素再吸收抑制剂(NRI)。NRI的适合实例包括但不限于瑞波西汀(Reboxetine)
维洛沙嗪(Viloxazine)
和阿托西汀(Atomoxetine)(Strattera)。
在一些实施例中，抗抑郁剂为锂。
在一些实施例中，抗抑郁剂为血清素调节剂和刺激剂(SMS)。SMS的适合实例包括但不限于维拉唑酮(Vilazodone)
和沃替西汀(Vortioxetine)
在一些实施例中，抗抑郁剂为血清素拮抗剂和再吸收抑制剂(SARI)。SARI的适合实例包括但不限于依托哌酮(Etoperidone)
奈法唑酮(Nefazodone)
和曲唑酮(Trazodone)
在一些实施例中，抗抑郁剂为三环抗抑郁剂(TCA)。TCA的适合实例包括但不限于阿米替林(Amitriptyline)
氧阿米替林(Amitriptylinoxide)
氯米帕明(Clomipramine)
地昔帕明(Desipramine)
二苯西平(Dibenzepin)
二甲他林(Dimetacrine)
度硫平(Dosulepin)
多塞平(Doxepin)
丙咪嗪(Imipramine)
洛夫帕明(Lofepramine)
美利曲辛(Melitracen)
硝沙西平(Nitroxazepine)
去甲替林(Nortriptyline)
诺昔替林(Noxiptiline)
哌泊非嗪(Pipofezine)
普罗替林(Protriptyline)
和曲米帕明(Trimipramine)
。还包括布替林(Butriptyline)
地美替林(demexiptiline)
氧米帕明(Imipraminoxide)
伊普吲哚(iprindole)
美他帕明(metapramine)
丙吡西平(propizepine)
和奎纽帕明(quinupramine)
还包括奥匹哌醇(Opipramol)
和噻奈普汀(Tianeptine)
在一些实施例中，抗抑郁剂为四环抗抑郁剂(TeCA)。TeCA的适合实例包括但不限于阿莫沙平(Amoxapine)
麦普替林(Maprotiline)
米安色林(Mianserin)
米氮平(Mirtazapine)
和司普替林(Setiptiline)
在一些实施例中，抗抑郁剂为单胺氧化酶抑制剂(MAOI)。MAOI的适合实例包括但不限于异丙烟肼(Iproniazid)
异卡波肼(Isocarboxazid)
苯乙肼(Phenelzine)
司来吉兰(Selegiline)
强内心百乐明(Tranylcypromine)
美曲吲哚(Metralindole)
吗氯贝胺(Moclobemide)
吡吲哚(Pirlindole)
和托洛沙酮(Toloxatone)
其它的包括例如苯莫辛(benmoxin)
卡罗沙酮(Caroxazone)
异丙氯肼(iproclozide)
美巴那肼(mebanazine)
尼亚拉胺(nialamide)
奥他莫辛(octamoxin)
苯异丙肼(pheniprazine)
苯氧丙肼(phenoxypropazine)
匹戊肼(pivhydrazine)
沙夫肼(safrazine)
依普贝胺(Eprobemide)
和米那卜林(minaprine)
在一些实施例中，抗抑郁剂为非典型抗精神病药。非典型抗精神病药的适合实例包括但不限于氨磺必利(Amisulpride)
鲁拉西酮(Lurasidone)
和喹硫平(Quetiapine)
在一些实施例中，抗抑郁剂为阿戈美拉汀(Agomelatine)
二苯美伦(Bifemelane)
安非他酮(Bupropion)
氯胺酮(Ketamine)
坦度螺酮(Tandospirone)
或替尼沙秦(Teniloxazine)
在一些实施例中，抗焦虑剂为苯并二氮呯，包括但不限于阿普唑仑(Alprazolam)
溴西泮(Bromazepam)
氯二氮环氧化物(Chlordiazepoxide)
氯硝西泮(Clonazepam)
氯氮平酸盐(Clorazepate)
安定(Diazepam)
弗拉西泮(Flurazepam)
劳拉西泮(Lorazepam)
奥沙西泮(Oxazepam)
替马西泮(Temazepam)
三唑仑(Triazolam)
和托非索泮(Tofisopam)
在一些实施例中，抗焦虑剂为氨基甲酸酯，包括但不限于美普巴(meprobamate)
在一些实施例中，抗焦虑剂为抗组织胺，包括但不限于羟嗪(Hydroxyzine)
氯芬尼拉明(Chlorpheniramine)(Chlor-
)和苯海拉明(diphenhydramine)
在一些实施例中，抗焦虑剂为氮杂螺酮(azapirone)，包括但不限于布司必隆(Buspirone)
和坦度螺酮(Tandospirone)
在一些实施例中，抗焦虑剂为SSRI、SNRI、TCA、TeCA或MAOI，如本文所述。
在一些实施例中，抗焦虑剂为美比卡(Mebicar)
法博替唑(Fabomotizole)
塞兰克(Selank)、布罗曼坦(Bromantane)、埃莫西平(Emoxypine)、普瑞巴林(Pregabalin)、异戊酸薄荷酯(Menthyl isovalerate)或异戊酸薄荷酯(Menthyl isovalerate)
向啮齿动物施用抗抑郁剂或抗焦虑剂可通过任何适合途径，包括但不限于肠胃外、静脉内、经口、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌肉内。施用也可以通过连续输注、局部施用、从植入物(凝胶、膜等)持续释放和/或静脉内注射来进行。
可持续适当的时间段，例如3、4、5、6、7、8、9或10周或更久(如果需要)向啮齿动物给药。
本说明书通过下述实例进一步示出，所述实例不应以任何方式解释为限制性的。所有引用的参考文献(包括如本申请自始至终引用的文献引用、授权专利和公开的专利申请)的内容在此明确地以引用的方式并入。
实例
实例1.经遗传修饰的小鼠的产生。
Gpr156靶向构建体如下设计。对于小鼠Gpr156的敲除，含有小鼠Gpr156基因组序列的细菌人工染色体(BAC)经修饰以使得含有新霉素抗性基因的带有loxP序列的(floxed)lacZ报告基因盒在人类UBC(泛素)启动子控制下替换紧接在起始ATG密码子之后的Gpr156外显子2(或编码外显子1，即，第一编码外显子)至外显子5末端(或编码外显子4)。盒被克隆以使得lacZ编码序列与起始ATG密码子同框。将此构建体电穿孔至100％C57Bl/6NTac小鼠胚胎干细胞中。为了使Gpr156基因座人源化，将小鼠ATG至终止基因组序列替换为人类GPR156 ATG至超出3'非翻译区末端100bp。此人类GPR156 DNA编码在位置516处具有Glu(E)的长同种型(814个氨基酸)。紧接在人源化之后，将自缺失新霉素抗性盒置于Gpr156基因座的3'端处。此靶向构建体接着通过在人类GPR156编码外显子9中添加单一A至T碱基对取代进一步修饰，以产生E533D人类突变，且嘌呤霉素抗性盒替换新霉素型式。将这些构建体电穿孔至50％C57Bl/6NTac/50％129SvEvTac小鼠胚胎干细胞系中。通过TAQMAN分析鉴别来自所有电穿孔的成功靶向克隆。Gpr156-/+、Gpr156humIn/+和Gpr156humIn G533D/+小鼠使用
方法(Valenzuela 2003Nat Biotech PMID:12730667；Poueymirou 2007NatBiotech PMID:17187059)产生且按需要回交至C57Bl/6NTac。
实例2.通过报告基因评估Gpr156的表达
使用包含内源性小鼠Gpr156基因缺失和报告基因插入的经遗传修饰的小鼠，其中报告基因可操作地连接于内源性小鼠Gpr156基因座处的内源性小鼠Gpr156启动子，本发明人能够确认Gpr156在成年小鼠的脑中的表达，在嗅球、海马区、缰核、后屈束和丘中具有显著表达。脑的这些区域与人类和动物抑郁症模型中的抑郁症和焦虑相关。在缰核中检测到最强表达；患有抑郁症的患者的内侧和外侧缰核展示体积减小。对人类的功能成像研究强调了外侧缰核被阴性结果选择性激活(Shepard等人,Schiz Bull.32:417-421(2006)，Ullsperger和von Cramon,J Neurosci.23:4308-4314(2003))。另外，啮齿动物和人类中累积的证据表明外侧缰核在若干严重抑郁症模型中活动过度，其中活动增加与暴露于不同种类的应激源有关(Li等人,Nature 470:535-539(2011)，Mirrione等人,Front.Hum.Neurosci.8:29(2014)，Morris等人,NeuroImage 10:163-172(1999)，Shumake等人,Brain Res.963:274-281(2003)，Wirtshafter等人,Brain Res.633:21-26(1994))。在治疗抑郁症中，也成功测试了将缰核作为深部脑刺激的新靶标(Sartorius等人,Biol.Psychiatry 67:e9-e11(2010))。
实例3.用于评估经遗传修饰的啮齿动物的方法
动物
所有程序均按照雷杰纳荣制药公司机构动物护理及使用委员会(RegeneronPharmaceuticals Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准的方案进行。所有小鼠均以12小时开关灯循环(7am至7pm)饲养，可自由获取水和食物。
弹珠掩埋任务
弹珠掩埋任务被用作强迫样行为和/或焦虑样行为的指标。当将小鼠置于新笼子中时，常见的反应是挖掘行为增加。此测试用于评估药物对小鼠掩埋弹珠的自然和重复行为的影响，所述行为通过具有抗强迫特性的药物减少(Njung'e和Handley,Br JPharmacol.104:105-112(1991b)，Thomas等人,Psychopharmacol.204:361-373(2009))。
Tecniplast小鼠笼(39×19×16cm)均匀地填充有5cm玉米芯垫料。24颗透明玻璃弹珠(15cm直径)以4×6网格图案均匀分布在垫料顶部。将每只小鼠放在笼子的中心，且进行10分钟的测试。10分钟后，从笼子中取出动物并计数埋入至少三分之二的弹珠的数目。
强迫游泳测试
将小鼠置于填充有4升23-25℃自来水的5升透明塑料烧杯(25×18cm直径)中，以确保即使小鼠的尾部也无法接触到烧瓶的底部。使用ANY-mazeTM视频跟踪系统(StoeltingCo.)同时记录四只动物。记录数据6分钟。烧瓶由3面白色塑料隔板(40cm高×25cm宽)隔开。记录游泳测试6分钟。记录被设置为当烧瓶中有运动时自动开始，以便记录的时间对于每只小鼠是特定的。如果小鼠不能进行测试，则一旦其显示痛苦迹象，就将其从水中拉出。
6分钟的记录被分成三个时间段(0-100秒、101-200秒和最后158秒)，以便更好地采样随时间变化的行为。
FST分析的主要数据点为游泳时间、移动时间、不移动时间、速度、行进距离、游泳区饲养、移动事件和不移动事件。不动被定义为总体质量的60％不动2秒。此参数允许后腿和脚的小幅运动以保持平衡和或踩水，而不会被视为主动游泳。
平衡木
平衡木(Maze Engineers)用于评估协调和感觉神经平衡。小鼠被训练在一条1米长、6mm宽的横木上行走，横木的一端有一个开放的平台，且终点是一个开放的黑盒子。横木被抬高到布制吊床上方，以捕捉到从横木上滑落的任何小鼠。在训练阶段期间，老鼠首先被放置在末端盒子旁边，然后逐渐远离它，直到老鼠可以在横木上行走。接着运行了三个后续1分钟试验，在两次运行之间休息30秒。将小鼠放在面向终点的开放平台前面，并根据滑倒次数和到达终点所用的时间进行评分。
旋杆测试
通过来自IITC Life Science系列8的加速旋杆来评估运动协调和平衡。将小鼠置于悬挂在笼底上方的水平定向旋转圆柱体上3分钟。旋转的圆柱体足够低，不会伤害动物，但足够高以避免跌倒。给定动物在这个旋转杆上停留的时间长度是衡量其平衡、协调、身体状况和运动计划的量度。首先训练动物停留在以逐渐更高的速度(最大速度15rpm，3次试验)旋转的旋杆(直径3.5cm，宽9cm)上。第二天，每只小鼠以高达15rpm的速度放置在旋杆上进行3次连续试验(试验之间30分钟)，每次试验180秒。记录跌落的等待时间或如果动物没有跌落，则指定高达180的评分。分析中使用每只小鼠的3个试验的中值评分。
Catwalk
为了评估脚步和步态变化，使用基于CatWalkTM XT(Noldus)视频的自动自由行走步态分析系统对小鼠进行了评估，所述系统允许对多达35个步态参数(从足迹大小到运动动力学)进行定量评估。此系统允许动物以与人类临床步态测试类似的方式以优选速度自愿移动。动物被放置在跑道的起点，开放的一端在其前方。小鼠自发地跑到跑道的末端以试图逃出。对每只小鼠进行评估，直到其成功地在步道跑了三次，并且小鼠必须在5秒内穿过走道的记录区域才能对跑动进行计数。装置由以下者组成：一个130cm长的硬化玻璃平台，带有可调节通道以限制直线运动、红色顶灯、连接到玻璃平台的绿色LED灯以及安装在平台下方的高速彩色相机。附接至设备的绿色LED灯将光发射到玻璃板上，并且这种光只会在啮齿动物爪子接触玻璃的地方折射，使高速数码相机能够实时捕捉啮齿动物爪子的精确位置。头顶的红灯为记录身体轮廓创造了对比。视觉数据被数字化并传输到连接的计算机，其中CatWalkTM XT软件可用于通过爪印之间的距离、时间和强度差异对静态和动态步态运动学进行半自动标记和分析。然后将步态数据导出用于数据存储和后续分析。
相机进行记录，且系统软件测量足迹。关于爪位异常来分析足迹。
旷场
旷场是一个空旷的相对较大、明亮的矩形形状场地，在其中测量动物的活动。所述评估反映了新的环境探索、一般的运动活动，并且可以为啮齿动物的焦虑相关行为提供初步筛选。将小鼠置于旷场设备(Kinder scientific；16"W×16"L×15"H室)中且对其评分60分钟。所述室被设置为两个区域；一个中心区域网格(6"×6")和一个外部区域网格(16"×16")且动物运动由32条红外光束收集。进入中心区域的探索行为减少与焦虑表型相关。计算小鼠穿过网格线(即从一个网格移动到另一个网格)的次数，以及饲养次数、不动时间和梳理事件的次数。在Kinder Scientific设备中，这些事件通过计算机软件和旷场周围的红外光束自动计数。
尾部扭转
尾部扭转是一种简单的方法，可用于筛选可能的前庭功能障碍。将小鼠放在平坦表面上，并且抓住小鼠的中尾扭转尾部，以使小鼠转向它的背部。如果动物难以使自身翻正恢复，这可能指示前庭缺陷。
翻正反射
翻正反射是一种评估运动协调和前庭功能障碍的简单分析法。将小鼠仰卧放在平坦的表面上。测量了翻正自身所用的时间(最多30秒)。
钢丝悬挂测试
钢丝悬挂是测量后爪或前爪握力的替代测试。脚滑或无法悬挂可指示存在缺陷。使用了一个悬挂在离桌面至少12英寸的带有蓝色垫子的钢丝笼顶部。允许小鼠用其后爪或前爪抓住钢丝笼顶部，并在60秒的间隔内测量小鼠抓住杆的总时间。每只小鼠测量三个60秒间隔。记录掉落的等待时间。
实例3.在各种行为分析中评估小鼠
强迫游泳测试
在6分钟强迫游泳测试中评估小鼠；并非所有小鼠都能执行任务。图2展示不同测试GPR156/Gpr156基因型的游泳测试的持续时间。数据表示为每个动物组的平均值±SEM。
数据展示对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因呈纯合的经遗传修饰的小鼠和对于小鼠Gpr156基因缺失呈纯合的经遗传修饰的小鼠表现出不能执行强迫游泳测试。小鼠最初能够游泳，但在试图找到逃生的几分钟后，其似乎在水中“惊慌失措”了。这些小鼠随后开始表现出异常行为，其特征是疯狂游泳、重复潜水和在水下旋转，且变得不能保持漂浮。如果不迅速从水中捞出，这些小鼠会被溺死。相比之下，野生型小鼠(表达内源性小鼠Gpr156)和对于人源化Gpr156基因(无突变)呈纯合的经遗传修饰的小鼠在完成6分钟游泳测试方面没有困难。
其它人尚未在文献中描述对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因呈纯合的经遗传修饰的小鼠或对于小鼠Gpr156基因缺失呈纯合的经遗传修饰的小鼠所展示的独特行为。由于这些小鼠无法完成测试，本发明人无法测量习得性无助。但是，本发明人观察到对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因呈纯合的85％雌性和90％雄性经遗传修饰的小鼠未通过训练游泳阶段，而对于编码野生型人类GPR156蛋白的人源化Gpr156基因呈纯合的经遗传修饰的啮齿动物容易地完成了测试。类似地，对于小鼠Gpr156基因缺失呈纯合的90％雌性和53％雄性经遗传修饰的小鼠未通过训练游泳阶段，而其野生型同窝幼畜完成了测试。当游泳测试培训阶段在30℃而不是室温(～23℃)下加热的水中运行时或当使用更大且提供平台(逃脱选项)的水迷宫设备时，获得类似结果。强迫游泳测试的观察结果表明E533D点突变导致GPR156蛋白功能缺陷或丧失。
还评估了小鼠的协调、平衡和运动功能、其一般运动活动以及其在旋杆、步道、平衡木、旷场、翻正反射、悬尾反射和钢丝悬挂测试中的前庭功能。对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因或野生型人源化Gpr156基因呈纯合的经遗传修饰的小鼠未展现任何严重的平衡缺陷，以及协调或运动缺陷和/或前庭功能障碍，如下表2中所概述。
为了研究不能进行游泳测试是否可能是焦虑的特征，每日用腹膜内注射的氟西汀(一种选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI，10mg/kg))来治疗小鼠，持续4周。在持续4周每日用腹膜内注射的10mg/kg氟西汀治疗之前和之后，每周对小鼠进行6分钟强迫游泳测试。记录每日用氟西汀治疗之前和之后的游泳测试的总时间(以秒计)。如图3A中所示，在初始强迫游泳测试中(基线，在治疗之前)，测试的对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因呈纯合的小鼠中没有一只能够进行6分钟游泳测试。在用氟西汀治疗4周之后，62.5％的雄性(8只小鼠中的5只)和50％的雌性(10只中的5只)能够成功地进行6分钟游泳测试。也并行地运行一组未治疗的雌性GPR156E533D作为对照，在4周之后，仅20％(5只中的1只)雌性完成了游泳测试。数据表示为每个动物组的平均值±SEM。
为了测试氟西汀是否可逆转受损的游泳测试表型，持续9周每周6天每天用10mg/kg氟西汀(i.p)治疗GPR156hum/hum和GPR156E533D/E533D小鼠。与GPR156-/-小鼠类似，GPR156E533D /E533D小鼠展示游泳测试中的损伤，其中约85％的雌性和90％的雄性未能完成6分钟游泳测试。因此，对小鼠进行游泳测试(基线)且从研究中排除能够进行6分钟游泳测试的动物。接着将剩余的小鼠分成2组，用氟西汀治疗和未治疗。如图3B中所示，尽管没有一只(0/13)GPR156E533D小鼠能够首次进行游泳测试，但在用氟西汀治疗9周之后，61％(8/13)的小鼠完成了测试。相比之下，在未治疗组中，尽管一些小鼠改善了表现，但仅1/11只小鼠在9周时完成了游泳测试(参见图3C；还参见图3B)。
用另一抗抑郁药物丙咪嗪(Tofranil)治疗也改善了GPR156E533D/E533D中受损的游泳表型。丙咪嗪是一种抑制去甲肾上腺素、乙酰胆碱、多巴胺和血清素再吸收的三环抗抑郁剂。对于此研究，对小鼠进行游泳测试(基线)且从研究中排除能够进行6分钟游泳测试的动物。持续9周每周6天每天用15mg/kg丙咪嗪(i.p)治疗小鼠。如图3D中所示，用丙咪嗪治疗也诱使GPR156E533D/E533D小鼠表现改善，以完成游泳测试。
另外在弹珠掩埋测试中评估小鼠。如图4中所示，对于编码E533D变异的人源化Gpr156基因呈纯合或对于小鼠Gpr156基因缺失呈纯合的经遗传修饰的雄性小鼠展现10分钟内埋入的弹珠数目增加的趋势。数据表示为每个动物组的平均值±SEM。
表2
Claims (79)
1.一种经遗传修饰的啮齿动物，其基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化G蛋白偶联受体156(GPR156)基因，其中所述人源化Gpr156基因包含啮齿动物Gpr156核酸部分和人类GPR156核酸部分，其中所述人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白或在对应于全长野生型人类GPR156蛋白中的位置533的氨基酸位置处包含Asp的突变型人类GPR156蛋白(E533D变异)，且其中所述人源化Gpr156基因的表达受所述内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。
2.根据权利要求1所述的啮齿动物，其中所述人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白。
3.根据权利要求2所述的啮齿动物，其中所述人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的ATG起始密码子至终止密码子，其中所述人类GPR156基因包含编码所述E533D变异的核苷酸。
4.根据权利要求3所述的啮齿动物，其中所述人类GPR156核酸部分进一步包含所述人类GPR156基因的3'UTR。
5.根据权利要求3或4所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物Gpr156核酸部分包含啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列。
6.根据权利要求5所述的啮齿动物，其中所述人源化Gpr156基因进一步包含啮齿动物Gpr156基因的3'非编码外显子序列。
7.根据权利要求2所述的啮齿动物，其中所述人源化Gpr156基因是由将所述内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段替换为所述人类GPR156核酸部分而形成。
8.根据权利要求7所述的啮齿动物，其中所述人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的ATG起始密码子至终止密码子，其中所述人类GPR156基因包含编码所述E533D变异的核苷酸。
9.根据权利要求8所述的啮齿动物，其中所述人类GPR156核酸部分包含人类基因组片段，其包含所述人类GPR156基因的所述ATG起始密码子至最后一个外显子。
10.根据权利要求7所述的啮齿动物，其中被替换的所述内源性啮齿动物Gpr156基因的所述啮齿动物基因组片段包含所述内源性啮齿动物Gpr156基因的所述ATG起始密码子至所述终止密码子。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的啮齿动物，其中包含E533D变异的所述突变型人类GPR156蛋白包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的啮齿动物，其中所述人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白。
13.根据权利要求12所述的啮齿动物，其中所述人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的所述ATG起始密码子至所述终止密码子。
14.根据权利要求13所述的啮齿动物，其中所述人类GPR156核酸部分进一步包含所述人类GPR156基因的3'UTR。
15.根据权利要求13或14所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物Gpr156核酸部分包含啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列。
16.根据权利要求15所述的啮齿动物，其中所述人源化Gpr156基因进一步包含啮齿动物Gpr156基因的3'非编码外显子序列。
17.根据权利要求12所述的啮齿动物，其中所述人源化Gpr156基因是由将所述内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段替换为所述人类GPR156核酸部分而形成。
18.根据权利要求17所述的啮齿动物，其中所述人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的所述ATG起始密码子至所述终止密码子。
19.根据权利要求18所述的啮齿动物，其中所述人类GPR156核酸部分包含人类基因组片段，其包含所述人类GPR156基因的所述ATG起始密码子至最后一个外显子。
20.根据权利要求17所述的啮齿动物，其中被替换的所述内源性啮齿动物Gpr156基因的所述啮齿动物基因组片段包含所述内源性啮齿动物Gpr156基因的所述ATG起始密码子至所述终止密码子。
21.根据权利要求12至20中任一项所述的啮齿动物，其中所述野生型人类GPR156蛋白包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所述的氨基酸序列。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述人源化Gpr156基因为杂合的。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述人源化Gpr156基因为纯合的。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物不能表达内源性啮齿动物Gpr156蛋白。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物为小鼠或大鼠。
26.一种分离的啮齿动物细胞或组织，其基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因，其中所述人源化Gpr156基因包含啮齿动物Gpr156核酸部分和人类GPR156核酸部分，其中所述人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白或包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，且其中所述人源化Gpr156基因的表达受所述内源性啮齿动物Gpr156基因座处的所述啮齿动物Gpr156启动子控制。
27.根据权利要求26所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的ATG起始密码子至终止密码子，其中所述人类GPR156基因包含在编码对应于全长野生型人类GRP156蛋白中的位置533的位置处编码的Glu或Asp的核苷酸。
28.根据权利要求27所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述人类GPR156核酸部分进一步包含所述人类GPR156基因的3'UTR。
29.根据权利要求27或28所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述啮齿动物Gpr156核酸部分包含啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列。
30.根据权利要求29所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述人源化Gpr156基因进一步包含啮齿动物Gpr156基因的3'非编码外显子序列。
31.根据权利要求26所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述人源化Gpr156基因是由将所述内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段替换为所述人类GPR156核酸部分而形成。
32.根据权利要求31所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述人类GPR156核酸部分包含人类GPR156基因的ATG起始密码子至终止密码子，其中所述人类GPR156基因包含在编码对应于全长野生型人类GRP156蛋白中的位置533的位置处编码的Glu或Asp的核苷酸。
33.根据权利要求32所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述人类GPR156核酸部分包含人类基因组片段，其所述人类基因组片段包含所述人类GPR156基因的所述ATG起始密码子至最后一个外显子。
34.根据权利要求31所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中被替换的所述内源性啮齿动物Gpr156基因的所述啮齿动物基因组片段包含所述内源性啮齿动物Gpr156基因的所述ATG起始密码子至所述终止密码子。
35.根据权利要求26至34中任一项所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述人源化Gpr156基因编码包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，其中所述突变型人类GPR156蛋白包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列。
36.根据权利要求26至34中任一项所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白，其中所述野生型人类GPR156蛋白包含如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所述的氨基酸序列。
37.根据权利要求26至36中任一项所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述分离的啮齿动物细胞或组织对于所述人源化Gpr156基因为杂合的。
38.根据权利要求26至36中任一项所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述分离的啮齿动物细胞或组织对于所述人源化Gpr156基因为纯合的。
39.根据权利要求26至38中任一项所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述啮齿动物细胞或组织不能表达内源性啮齿动物Gpr156蛋白。
40.根据权利要求26至39中任一项所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述啮齿动物细胞为啮齿动物胚胎干(ES)细胞。
41.根据权利要求26至40中任一项所述的分离的啮齿动物细胞或组织，其中所述啮齿动物细胞或组织为小鼠细胞或组织，或大鼠细胞或组织。
42.一种制备经遗传修饰的啮齿动物的方法，其包含：
修饰啮齿动物基因组以使得所述经修饰的基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因，其中所述人源化Gpr156基因包含啮齿动物Gpr156核酸部分和人类GPR156核酸部分，其中所述人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白或包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，且其中所述人源化Gpr156基因的表达受所述内源性啮齿动物Gpr156基因座处的所述啮齿动物Gpr156启动子控制；和
获得包含所述经修饰的基因组的经遗传修饰的啮齿动物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述啮齿动物基因组是通过包含以下的方法修饰：
(a)将靶向载体引入至啮齿动物ES细胞中，其中所述靶向载体包含待整合至内源性啮齿动物Gpr156基因座中的人类GPR156核酸部分，由此在内源性啮齿动物Gpr156基因座处形成人源化Gpr156基因；
(b)获得经遗传修饰的啮齿动物ES细胞，其基因组包含所述人源化Gpr156基因；和
(c)使用(b)的所述经遗传修饰的啮齿动物ES细胞制备啮齿动物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述人类GPR156核酸部分包含人类基因组片段，所述人类基因组片段其包含人类GPR156基因的ATG起始密码子至终止密码子，其中所述人类GPR156基因包含编码在对应于全长野生型人类GRP156蛋白中的位置533的氨基酸位置处的编码Glu或Asp的核苷酸。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述人类GPR156核酸部分进一步包含所述人类GPR156基因的3'UTR。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述啮齿动物Gpr156核酸部分包含所述内源性啮齿动物Gpr156基因的5'非编码外显子序列。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述人源化Gpr156基因进一步包含啮齿动物Gpr156基因的3'非编码外显子序列。
48.根据权利要求43所述的方法，其中所述人源化Gpr156基因是由将所述内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段替换为所述人类GPR156核酸部分而形成。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述人类GPR156核酸部分包含人类基因组片段，其包含人类GPR156基因的ATG起始密码子至终止密码子，其中所述人类GPR156基因包含编码在对应于全长野生型人类GRP156蛋白中的位置533的氨基酸位置处的编码Glu或Asp的核苷酸。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述人类基因组片段包含所述人类GPR156基因的ATG起始密码子至最后一个外显子。
51.根据权利要求48所述的方法，其中被替换的所述内源性啮齿动物Gpr156基因的所述啮齿动物基因组片段包含所述内源性啮齿动物Gpr156基因的所述ATG起始密码子至所述终止密码子。
52.根据权利要求42至51中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对于所述人源化Gpr156基因为杂合的。
53.根据权利要求42至51中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物对于所述人源化Gpr156基因为纯合的。
54.根据权利要求42至53中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物不能表达内源性啮齿动物Gpr156蛋白。
55.根据权利要求42至54中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物为小鼠或大鼠。
56.一种靶向载体，其包含
人类GPR156核酸，其待整合至内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156基因中的人类[g1]GPR156[/g1]核酸，两侧是由与所述啮齿动物Gpr156基因座处的核苷酸序列同源的5'核苷酸序列和3'核苷酸序列侧接，
其中将所述人类GPR156核酸整合至所述啮齿动物Gpr156基因中使得引起将所述内源性啮齿动物Gpr156基因座处的内源性啮齿动物Gpr156基因的啮齿动物基因组片段替换为所述人类GPR156核酸，以形成人源化Gpr156基因，
其中所述人类GPR156核酸编码野生型人类GPR156蛋白或包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，且
其中所述人源化Gpr156基因的表达受所述内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。
57.根据权利要求56所述的靶向载体，其中所述人类GPR156核酸包含人类GPR156基因的ATG起始密码子至终止密码子，其中所述人类GPR156基因包含在编码对应于全长野生型人类GRP156蛋白中的位置533的氨基酸位置处编码的Glu或Asp的核苷酸。
58.根据权利要求47所述的靶向载体，其中所述人类GPR156核酸包含所述人类GPR156基因的ATG起始密码子至最后一个外显子。
59.根据权利要求58所述的靶向载体，其中被替换的所述内源性啮齿动物Gpr156基因的所述啮齿动物基因组片段包含所述内源性啮齿动物Gpr156基因的所述ATG起始密码子至所述终止密码子。
60.根据权利要求56至59中任一项所述的靶向载体，其中所述啮齿动物为小鼠或大鼠。
61.一种方法，其包含将基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因的第一啮齿动物与第二啮齿动物育种，产生基因组包含人源化Gpr156基因的后代小鼠，其中所述人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白或包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，且其中所述人源化Gpr156基因的表达受所述内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述第一啮齿动物和所述第二啮齿动物为小鼠，或所述第一啮齿动物和所述第二啮齿动物为大鼠。
63.一种后代啮齿动物，其基因组包含内源性啮齿动物Gpr156基因座处的人源化Gpr156基因的后代啮齿动物，其中所述后代啮齿动物是通过包含将基因组包含所述人源化Gpr156基因的第一啮齿动物与第二啮齿动物育种的方法产生，其中所述人源化Gpr156基因编码野生型人类GPR156蛋白或包含E533D变异的突变型人类GPR156蛋白，且其中所述人源化Gpr156基因的表达受所述内源性啮齿动物Gpr156基因座处的啮齿动物Gpr156启动子控制。
64.根据权利要求63所述的后代啮齿动物，其中所述后代啮齿动物对于所述人源化Gpr156基因为杂合的。
65.根据权利要求63所述的后代啮齿动物，其中所述后代啮齿动物对于所述人源化Gpr156基因为纯合的。
66.根据权利要求63至65中任一项所述的后代啮齿动物，其中所述后代啮齿动物为小鼠或大鼠。
67.一种啮齿动物，其基因组包含经遗传修饰的Gpr156基因座，其中所述遗传修饰包含内源性啮齿动物Gpr156基因中的缺失和任选地的报告基因的插入，其中所述报告基因可操作地连接于所述基因座处的所述内源性啮齿动物Gpr156启动子。
68.根据权利要求67所述的啮齿动物，其中自起始密码子之后的核苷酸开始且延续至后续编码外显子的基因组片段已缺失，且其中所述报告基因可操作地连接于所述内源性啮齿动物Gpr156基因的所述起始密码子。
69.根据权利要求67或68所述的啮齿动物，其中所述报告基因为LacZ，或编码选自由以下组成的群组的蛋白质的基因：荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、DsRed和MmGFP。
70.根据权利要求68至69中任一项所述的啮齿动物，其中所述报告基因的表达类似于内源性啮齿动物Gpr156基因的表达模式。
71.根据权利要求67至70中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述遗传修饰为纯合的。
72.根据权利要求67至70中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物对于所述遗传修饰为杂合的。
73.根据权利要求67至72中任一项所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物为大鼠或小鼠。
74.一种测试用于治疗单相抑郁症或焦虑症的药剂的作用的方法，其包含
向根据权利要求2至11或22至25中任一项所述的啮齿动物施用所述药剂；
对所述啮齿动物进行测试以评估所述啮齿动物的指示单相抑郁症或所述焦虑症的行为，和
确定所述药剂是否对所述啮齿动物的所述行为有任何影响。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述测试为强迫游泳测试。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述测试为弹珠掩埋测试。
77.一种情绪障碍的啮齿动物模型，其包含根据权利要求2至11或22至25中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物。
78.根据权利要求77所述的啮齿动物模型，其进一步包含根据权利要求12至21或22至25中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物。
79.根据权利要求77或78所述的啮齿动物模型，其进一步包含根据权利要求67至73中任一项所述的经遗传修饰的啮齿动物。
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