CN113419067A - 一种用于评估造血干细胞移植病人cmv感染后免疫状态的多肽组合物以及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一组用于评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态的多肽组合物，所述组合物包括如SEQ ID NO:1～383所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种检测试剂盒，包括以下试剂：试剂1、试剂2、试剂3、试剂4、试剂7和试剂8；所述试剂1包含了本发明的多肽组合物。本试剂盒覆盖了主要的CMV T细胞表位，使得在以CMV特异性CTL作为预测指标评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态的方法诊断更加灵敏，覆盖率高，不受HLA亚型限制。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种用于评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态的多肽组合物以及检测试剂盒。
背景技术
目前现有技术中的评估造血干细胞移植后病人巨细胞病毒 (Cytomegalovirus，CMV)感染免疫状态方法包括以下几种：1)基于高通量测序，同时检测T细胞免疫组库，通过计算TCR可变区的数量来对T细胞多样性进行定量，从而评价细胞免疫力。2)单纯分析人体外周血CD4+T细胞数量，由此对患者免疫重建做出评估。3)通过检测血清中抗原CMV-pp65、抗体 CMV-IgG和CMV-IgM或病毒核酸CMV-DNA的含量评估患者免疫状态。
但是，上述方法存在以下缺点：1)需测定T细胞免疫组库，费时费力费钱。且TCR可变区数量的高低并不等同于T细胞重建的好坏。CMV作为慢性病毒，其T细胞应答有一个重要的特征，就是病毒特异性记忆性CD8+T细胞持续扩增并长期保持较大数量，称之为“记忆膨胀”现象。这些特异性T细胞是趋向于优势表位克隆集中还是非优势表位也在后期扩张，还存在争论，故并不能单纯用T细胞多样性来判断患者的免疫力。2)用CD4数量来评价不够准确，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后CD4+T细胞恢复缓慢，CD4+初始T细胞重建至正常水平甚至需要20年以上的时间，其原因在于预处理、移植物抗宿主病 (GVHD)的发生及其防治可通过抑制胸腺输出功能或改变胸腺基质进而影响T 细胞的发育。3)血清CMV-IgG和IgM检测基本针对的是既往感染，且在免疫抑制状态下容易出现假阴性，使患者错失最佳治疗时机；现阶段应用广泛的 CMV-DNA检测，阳性阈值标准判别不一(500copies/mL，1000copies/mL)，且检测阴性不一定代表病人体内没有病毒复制，检测阳性也不一定代表是活病毒；CMV-pp65抗原检测适用性也非常有限，ELISA检测特异性高，但灵敏度低，检出率较DNA检测低。
目前临床上最常用的CMV诊断方法是检测CMV-DNA，但该方法存在种种限制性，例如，血浆PCR阴性不代表体内没有病毒；PCR阳性也不能说明体内有活病毒。且不同医疗机构的PCR检测限和诊断标准也不尽相同(500 copies/mL或1000copies/mL)。CMV从体内最终清除只能依靠机体自身的免疫功能，固有免疫和适应性免疫系统都对CMV病毒的复制起到监控和清除作用。研究表明，NK细胞，B细胞，CD4+T细胞和CD8+T细胞都参与了针对CMV 的免疫过程。T细胞(CD8+T和CD4+T细胞)介导的细胞免疫是机体针对CMV 感染最重要的免疫机制。如果利用CMV急性感染期间由CMV再激活引起的病毒特异性T细胞应答作为检测指标，寻找合适的阈值，既能当作移植预后的免疫重建指标，又可以作为移植后CMV感染的诊断指标。
虽然病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)在CMV 疾病诊断和治疗方面表现出巨大优势，但该方法在技术上还存在一定瓶颈，主要表现在不同人类淋巴细胞抗原(human lymphocyte antigen，HLA)背景病人的CMV抗原特异性CD8+T细胞针对的抗原多种多样，因此，如何针对不同HLA 背景的CMV感染病人，准确评价其细胞免疫力(含针对CMV的细胞免疫状态)，是本领域要解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一组评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态的多肽组合物以及检测试剂盒。本试剂盒覆盖了大部分CD4和 CD8表位，使得在以CMV特异性CTL作为预测指标评估造血干细胞移植病人 CMV感染后免疫状态的方法诊断更加灵敏，覆盖率高，不受HLA亚型限制。
本发明采用以下技术方案实现本发明的目的：
第一个方面本发明提供了一组用于评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态的多肽组合物，所述组合物包括如SEQ ID NO:1～383所示的氨基酸序列。该多肽组合物覆盖了大部分CD4和CD8表位，可用于刺激造血干细胞移植病人产生更丰富的CMV特异性CTL，避免由于不同HLA背景病人的CMV抗原特异性CD8+T细胞针对的不同抗原，而不能准确地评估病人的细胞免疫力。从而实现提高以CMV特异性CTL作为预测指标的评估病人的细胞免疫力的准确性。
第二个方面本发明提供了一种检测试剂盒，包括以下试剂：试剂1、试剂2、试剂3、试剂4、试剂7和试剂8；所述试剂1为本发明多肽组合物制备而成的多肽混合试剂，其浓度为0.26μM～1.04μM；试剂2包括死细胞染色试剂、 Anti-Human CD3-FITC、Anti-human CD4-APC-H7和Anti-human CD8-Percp-Cy5.5；试剂3为Anti-human IFN-γ-APC；试剂4为保存浓度为 1000U/mL的hIL-2；试剂7为蛋白质转运抑制剂；试剂8为细胞固定或破膜溶液试剂。
优选地，所述试剂1包含上述如SEQ ID NO:1～383所示的氨基酸序列；其浓度为0.26-1.04μM，使用时的终浓度为125-500nM。试剂1覆盖了CMV的表面抗原，可刺激PBMC获得更丰富的T细胞亚群，使得评估结果更加准确。
优选地，所述试剂2使用时死细胞染色试剂(LIVE/DEAD-V500)的稀释倍数为1:1000；Anti-human CD3-FITC的稀释倍数为1:50；Anti-human CD4-APC-H7 的稀释倍数为1:100；Anti-human CD8-Percp-Cy5.5的稀释倍数为1:100。试剂2 为抗体表面抗体组合物，不同的抗体带有不同的标签，便于识别产生的不同表面抗原的T细胞。
优选地，所述试剂3使用时Anti human-IFN-γ-APC的稀释倍数为1:100。试剂3为胞内抗体，用于检测T细胞释放的胞内因子。
优选地，所述试剂盒还包括C-RPMI溶液，所述C-RPMI溶液为含有质量浓度为10％的胎牛血清、1％的青霉素和1％的链霉素的RPMI 1640溶液。
第三个方面本发明提供了本发明多肽组合物在制备用于评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态的试剂盒中的应用。
第四个方面本发明提供了一种本发明所述的检测试剂盒在用于评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态中的应用。
本发明的有益效果为：本发明根据CMV的抗原蛋白构建了一系列交叠肽段，这些肽段覆盖了主要的CMV T细胞表位，能够刺激T细胞应答，解决了由于不同HLA背景的CMV感染病人不能准确评价其细胞免疫力的问题。本发明的试剂盒包含了本发明的抗原多肽组合，以及能够检测细胞免疫力的多种试剂，可准确的检测出PBMC经抗原多肽组合物刺激后产生的病毒特异性T细胞亚群及其释放的胞内因子，结合以CMV特异性CTL作为预测指标的计算公式以及阈值，可精准地评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态，进而指导病人的用药进程。
附图说明
图1为CMV病毒复制及IFN-γ+CD8+T细胞免疫应答规律数学模型示意图
图2为本发明预测模型ROC曲线分析以及确定阈值示意图
图3为CMV-DNA检测显示血浆DNA阴性病人检测到的IFN-γ+CD8+T 细胞达到阈值的示意图
图4为CMV-DNA检测显示血浆DNA阳性病人检测到的IFN-γ+CD8+T 细胞达到阈值的示意图
图5为CMV-DNA检测显示血浆DNA阴性病人检测到的IFN-γ+CD8+T 细胞未达到阈值的示意图
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例
1、材料和仪器
胎牛血清(Certified Fetal Bovine Serum，FBS)；Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液；淋巴细胞分离管(LeucosepTM tube)；RPMI 1640培养基、青霉素-链霉素溶液(Penicillin-Streptomycin)和DPBS缓冲液；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、佛波醇酯(phorbol myristate acetate，PMA)和人白细胞介素 -2(hIL-2)；Ionomycin Ca2+Salt；CMV病毒蛋白多肽；细胞计数板；96孔透明圆底微孔板(96-well Clear Round BottomTC-treated Microplate,Individually Wrapped,with Lid,Sterile)、96孔透明平底微孔板(96-well Clear Flat Bottom TC-treated Microplate,Individually Wrapped,withLid,Sterile)和5ml圆底聚苯乙烯试管(
5mLRound Bottom Polystyrene TestTube,with Snap Cap,Sterile)； Aqua死细胞染色试剂盒(LIVE/DEADTM Fixable AquaDead Cell Stain Kit)和70 μm细胞过滤器(
70μm Cell Strainer,White,Sterile,Individually Packaged；蛋白质转运抑制剂(Protein Transport Inhibitor,Containing Brefeldin A)、细胞固定/破膜溶液试剂盒(BD Cytofix/CytopermTMFixation/Permeabilization Solution Kit)、Mouse Anti humanCD3-FITC、Anti humanCD4-APC-H7、Anti human-CD8-Percp-Cy5.5、Anti human-TNF-a-PE-Cy7、Anti human-IFN-γ-APC。
大容量高速冷冻离心机(Eppendorf，5910R)；生物安全柜(ESCO，AC2-6S1)；二氧化碳细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，3111)；自动细胞计数仪 (COUNTSTAR，IC1000)；流式细胞仪(BD，Aria III)等。
2、前期准备
制备试剂1：构建CMV病毒蛋白多肽文库
选取AD169毒株的即刻早期蛋白IE-1、IE-2及磷酸化蛋白pp65，这些蛋白已被证明可覆盖大部分CMV T细胞免疫表位。按照蛋白序列，设计交叠肽文库 (每条多肽含有15个氨基酸，且多肽间有11个氨基酸的重叠)。此多肽文库共含有383条多肽，多肽用DMSO溶解，保存浓度为20mM，作为多肽母液，保存温度为-80℃。使用时，以含10％FBS、1％Penicillin-Streptomycin的RPMI 1640溶液(C-RPMI)将多肽DMSO母液稀释至浓度为0.26μM～1.04μM，此时将稀释好的383条多肽混合到一起，-20℃保存备用(试剂1)。所述多肽文库中的多肽序列如表1所示：
表1：多肽文库中的氨基酸序列(SEQ ID NO:1～383)
表面染色抗体试剂组合作为本发明的试剂2：包括活死细胞染色试剂、 Anti-Human CD3-FITC、Anti-human CD4 APC-H7、Anti-human CD8-Percp-Cy5.5。使用时，按括号内相应比例，稀释于含2％FBS的RPMI 1640溶液(每孔需50μl，现配现用)LIVE/DEAD-V500(1:1000)、Anti-human CD3 FITC(1:50)、Anti-human CD4 APC-H7(1:100)、Anti-humanCD8 Percp-Cy5.5(1:100)。本实施例中试剂2 中各试剂的信息如下表2：
表2
胞内抗体试剂作为本发明的试剂3：包括Anti-human IFN-γ-APC。使用时，按括号内比例，稀释于1×Perm Wash溶液(每孔需50μl，现配现用)，Anti-human IFN-γ-APC(1:100)。
试剂4：hIL-2(保存浓度1000U/mL，保存温度-20℃)现配现用；
试剂5：PMA(保存浓度100ng/mL，保存温度-20℃)；
试剂6：Innomycin Ca2+(保存浓度100μg/mL，保存温度-20℃)；
试剂7：蛋白质转运抑制剂(购自BD，商品名：GolgiPlugTM protein transportinhibitor containing brefeldin A)；
试剂8：细胞固定/破膜溶液试剂(购自BD商品名：Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization Solution Kit)。
2、实验方法
(1)将新鲜分离或复苏的外周血单个核细胞(PBMCs)重悬于1mL C-RPMI 溶液，台盼蓝染色，活细胞计数。调整细胞数为5×105cells，用100μL C-RPMI 溶液重悬，将细胞均匀铺于96孔透明圆底微孔板中，并分别设置阴性对照孔、阳性对照孔、检测孔。
(2)阴性对照孔、阳性对照孔、检测孔中试剂的添加信息如下表3、4：
表3
表4
| 阳性对照孔 | 保存浓度 | 终浓度 | ×1 |
| PM<u>A</u> | 100ng/mL | 50ng/mL | 50μL |
| Innomycin Ca<sup>2+</sup> | 100ng/mL | 2μg/mL | 2μL |
| hIL-2 | 1000U/mL | 40U/mL | 4μL |
| C-RPMI | 44μL | ||
| 总体积 | 100μL |
| 检测孔 | 保存浓度 | 终浓度 | ×1 |
| 试剂1 | 0.26-1.04μM | 125-500μM | 48μL |
| hIL-2 | 1000U/mL | 40U/mL | 4μL |
| C-RPMI | 48μL | ||
| 总体积 | 100μL |
上述试剂1中的浓度为范围值表示，在该浓度范围内试剂1均能实现本发明的技术效果。
(3)按照步骤(2)的实验设计每孔加入相应的试剂后，在各组中加入试剂7(2μL/mL)，然后轻轻晃动96孔透明圆底微孔板，随后将其转移至37℃， 5％CO2的细胞培养箱孵育16小时。
3、检测T细胞亚群及胞内因子释放
3.1检测T细胞亚群：PBMCs被刺激16小时后，将96孔圆底微孔板转移至离心机中，500×g，4℃离心，弃去上清液后重悬细胞于50μL表面抗体试剂 2中，4℃避光孵育30min。然后用含2％FBS的RPMI 1640溶液洗涤两次。
3.2检测T细胞胞内因子释放：对细胞进行表面染色固定及细胞胞膜破膜处理，每孔加入100μL BD固定/破膜液(试剂8)，4℃避光孵育20min。用1×Perm Wash溶液洗涤两次。然后500×g，4℃离心5min，弃去上清液后重悬细胞于试剂3中，4℃避光孵育30min后。用1×Perm Wash溶液洗涤两次。以200μL 含2％FBS的RPMI 1640溶液充分重悬细胞，并将细胞悬液经70μm滤网过滤后转移至5mL带盖流式管中。
3.3计算结果：BD FACS ARIA III上机检测，通过Flowjo软件对流式数据进行分析，以及进行CMV特异性CTL计算。计算方法如下：
IFN-γ+CD8+T细胞数(即CMV特异性CTL)＝106PBMC×淋巴细胞比例 (lymphocyte)×单细胞比例(single cell)×活细胞比例(LIVE/DEAD阴性) ×CD3+T细胞比例×CD8+T细胞比例(CD8阳性/CD4阴性)×IFN-g+CD8+T细胞比例。
结果判别：阳性孔有大量IFN-γ+CD8+T细胞(10％以上)，阴性孔应没有或有极少量IFN-g+CD8+T细胞(小于0.05％)，检测阈值为925个IFN-γ+CD8+T 细胞(每106PBMC)(检测孔减去阴性对照孔)，高于此阈值，表示病人安全，此处没有检测孔获得的IFN-γ+CD8+T细胞数。
将获得的检测结果数据和数学模型结合，建立allo-HSCT后90天内(CMV 急性感染期)CMV病毒复制及IFN-γ+CD8+T细胞免疫应答规律模型(图1)。已通过ROC曲线分析，与目前主流CMV病毒检测方法(qPCR)进行对比，并显示出优越性(图2)。
诊断标准为：当CMV-CTL低于925个/106PBMC时，CMV病毒血症风险较高；当CMV-CTL高于925个/106PBMC时，CMV病毒血症风险较低。
应用实例
采用本发明的试剂盒并结合本发明的模型针对21个患者不同HLA型(患者信息如下表5)以及不同CMV-DNA检测结果(阳性和阴性)的病人检测其免疫水平，并指导其后期是否使用抗病毒药物，结果如下：
如图3所示，CMV-DNA检测呈阴性，IFN-γ+CD8+T细胞数也达到或超过阈值(即925个IFN-γ+CD8+T细胞/每106PBMC)，表示其免疫力已达到病毒控制水平，针对这类病人可停止用药；如图4所示，CMV-DNA检测呈阳性，但IFN-γ+CD8+T细胞数达到或超过阈值，表示其免疫力已达到病毒控制水平，针对这类病人，即使停止抗病毒药物，病毒也会自行在2-9天内清除，因此，也可停止用药，同时应继续监测其免疫力；如图5所示，CMV-DNA检测阴性，但IFN-γ+CD8+T细胞数未达到阈值，表明其免疫力未达到病毒控制水平的病人，针对这部分病人应坚持用药，等待免疫力恢复，切不可因qPCR阴性结果而停止辅助性抗病毒药物，造成反复病毒血症，加大CMV疾病发生率。可见，本发明的试剂盒结合所述模型，依据阈值可以明确诊断，精确指导病人科学用药。
免疫抑制的allo-HSCT患者的CMV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的反应水平与CMV病毒复制水平呈负相关。本发明利用CMV急性感染期间CMV 再激活引起的病毒特异性T细胞应答作为检测指标，寻找合适的阈值，既能当作移植预后的免疫重建指标，又可以作为移植后CMV感染的诊断指标。本试剂盒通过抗原对细胞的刺激，分析IFN-γ+CD8+T淋巴细胞经抗原刺激后细胞因子释放情况，来评估移植后CMV感染病人的免疫能力。本发明试剂盒结合计算公式，诊断灵敏，覆盖率高，不受HLA亚型限制。此外，也可对病毒特异性T细胞进行体外扩增，适合在造血干细胞移植后引起的机会性感染疾病中应用，同时可向危害免疫系统的疾病或者旨在重建免疫系统的治疗效果评价方面推广。
表5：
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州医科大学
<120> 一种用于评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态的多肽组合物以及检
测试剂盒
<130> 5.25
<160> 383
<170> PatentIn version 3.3
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Leu Lys Lys Tyr Thr Gln Thr Glu Glu Lys Phe Thr Gly Ala Phe
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Thr Gln Thr Glu Glu Lys Phe Thr Gly Ala Phe Asn Met Met Gly
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Glu Lys Phe Thr Gly Ala Phe Asn Met Met Gly Gly Cys Leu Gln
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Gly Ala Phe Asn Met Met Gly Gly Cys Leu Gln Asn Ala Leu Asp
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Met Met Gly Gly Cys Leu Gln Asn Ala Leu Asp Ile Leu Asp Lys
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Cys Leu Gln Asn Ala Leu Asp Ile Leu Asp Lys Val His Glu Pro
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Ala Leu Asp Ile Leu Asp Lys Val His Glu Pro Phe Glu Glu Met
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Leu Asp Lys Val His Glu Pro Phe Glu Glu Met Lys Cys Ile Gly
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Cys Ile Gly Leu Thr Met Gln Ser Met Tyr Glu Asn Tyr Ile Val
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Thr Met Gln Ser Met Tyr Glu Asn Tyr Ile Val Pro Glu Asp Lys
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Thr Met Tyr Gly Gly Ile Ser Leu Leu Ser Glu Phe Cys Arg Val
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Cys Arg Val Leu Cys Cys Tyr Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met
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Cys Cys Tyr Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu Ala Lys Arg
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Ser Val Met Leu Ala Lys Arg Pro Leu Ile Thr Lys Pro Glu Val
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Ala Lys Arg Pro Leu Ile Thr Lys Pro Glu Val Ile Ser Val Met
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Leu Ile Thr Lys Pro Glu Val Ile Ser Val Met Lys Arg Arg Ile
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Pro Glu Val Ile Ser Val Met Lys Arg Arg Ile Glu Glu Ile Cys
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Ser Val Met Lys Arg Arg Ile Glu Glu Ile Cys Met Lys Val Phe
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Arg Arg Ile Glu Glu Ile Cys Met Lys Val Phe Ala Gln Tyr Ile
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Glu Ile Cys Met Lys Val Phe Ala Gln Tyr Ile Leu Gly Ala Asp
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Lys Val Phe Ala Gln Tyr Ile Leu Gly Ala Asp Pro Leu Arg Val
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Gly Ala Asp Pro Leu Arg Val Cys Ser Pro Ser Val Asp Asp Leu
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Leu Arg Val Cys Ser Pro Ser Val Asp Asp Leu Arg Ala Ile Ala
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Ser Pro Ser Val Asp Asp Leu Arg Ala Ile Ala Glu Glu Ser Asp
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Asp Asp Leu Arg Ala Ile Ala Glu Glu Ser Asp Glu Glu Glu Ala
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Ala Ile Ala Glu Glu Ser Asp Glu Glu Glu Ala Ile Val Ala Tyr
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Glu Ser Asp Glu Glu Glu Ala Ile Val Ala Tyr Thr Leu Ala Thr
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Val Ala Tyr Thr Leu Ala Thr Ala Gly Val Ser Ser Ser Asp Ser
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Leu Ala Thr Ala Gly Val Ser Ser Ser Asp Ser Leu Val Ser Pro
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Gly Val Ser Ser Ser Asp Ser Leu Val Ser Pro Pro Glu Ser Pro
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Ser Asp Ser Leu Val Ser Pro Pro Glu Ser Pro Val Pro Ala Thr
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Pro Ala Thr Ile Pro Leu Ser Ser Val Ile Val Ala Glu Asn Ser
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Pro Leu Ser Ser Val Ile Val Ala Glu Asn Ser Asp Gln Glu Glu
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Glu Glu Arg Glu Asp Thr Val Ser Val Lys Ser Glu Pro Val Ser
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Asp Thr Val Ser Val Lys Ser Glu Pro Val Ser Glu Ile Glu Glu
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Pro Val Ser Glu Ile Glu Glu Val Ala Pro Glu Glu Glu Glu Asp
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Gly Lys Ser Thr His Pro Met Val Thr Arg Ser Lys Ala Asp Gln
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Cys Asn Glu Asn Pro Glu Lys Asp Val Leu Ala Glu Leu Gly Asp
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Pro Glu Lys Asp Val Leu Ala Glu Leu Gly Asp Ile Leu Ala Gln
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Val Leu Ala Glu Leu Gly Asp Ile Leu Ala Gln Ala Val Asn His
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Leu Ala Gln Ala Val Asn His Ala Gly Ile Asp Ser Ser Ser Thr
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Val Asn His Ala Gly Ile Asp Ser Ser Ser Thr Gly Pro Thr Leu
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Gly Ile Asp Ser Ser Ser Thr Gly Pro Thr Leu Thr Thr His Ser
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Ser Ser Thr Gly Pro Thr Leu Thr Thr His Ser Cys Ser Val Ser
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Ser Val Ser Ser Ala Pro Leu Asn Lys Pro Thr Pro Thr Ser Val
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Lys Pro Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Asn Thr Pro Leu Pro
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Thr Ser Val Ala Val Thr Asn Thr Pro Leu Pro Gly Ala Ser Ala
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<213> 合成
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Val Thr Asn Thr Pro Leu Pro Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu Leu
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Pro Leu Pro Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu Leu Ser Pro Arg Lys
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Ala Ser Ala Thr Pro Glu Leu Ser Pro Arg Lys Lys Pro Arg Lys
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Pro Glu Leu Ser Pro Arg Lys Lys Pro Arg Lys Thr Thr Arg Pro
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Pro Arg Lys Lys Pro Arg Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val Ile
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Pro Arg Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val Ile Ile Lys Pro Pro
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Thr Arg Pro Phe Lys Val Ile Ile Lys Pro Pro Val Pro Pro Ala
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Lys Val Ile Ile Lys Pro Pro Val Pro Pro Ala Pro Ile Met Leu
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Pro Pro Ala Pro Ile Met Leu Pro Leu Ile Lys Gln Glu Asp Ile
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Ile Met Leu Pro Leu Ile Lys Gln Glu Asp Ile Lys Pro Glu Pro
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Glu Asp Ile Lys Pro Glu Pro Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg Asn
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Pro Glu Pro Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg Asn Lys Ile Ile Asp
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Tyr Arg Asn Lys Ile Ile Asp Thr Ala Gly Cys Ile Val Ile Ser
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Ile Ile Asp Thr Ala Gly Cys Ile Val Ile Ser Asp Ser Glu Glu
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Val Ile Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Gly Glu Glu Val Glu Thr
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Ser Glu Glu Glu Gln Gly Glu Glu Val Glu Thr Arg Gly Ala Thr
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Gly Ala Thr Ala Ser Ser Pro Ser Thr Gly Ser Gly Thr Pro Arg
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Ser Ser Pro Ser Thr Gly Ser Gly Thr Pro Arg Val Thr Ser Pro
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Thr Gly Ser Gly Thr Pro Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro Leu
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Thr Pro Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro Leu Ser Gln Met Asn
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Gln Met Asn His Pro Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro Asp
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Pro Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser
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Asp Pro Leu Gly Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser
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Gly Ala Ala Ser Ser Ser Leu Leu Ser Cys Gly His Gln Ser Ser
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Gly Ala Ser Thr Gly Pro Arg Lys Lys Lys Ser Lys Arg Ile Ser
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Met His Gln Val Leu Asp Glu Ala Ile Lys Ala Cys Lys Thr Met
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Val Lys Ala Ala Trp Ser Leu Lys Glu Leu His Thr His Gln Leu
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His Gln Leu Cys Pro Arg Ser Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile Ile
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Pro Arg Ser Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile Ile His Ala Ala Thr
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Ala Ala Thr Pro Val Asp Leu Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys Leu
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Val Asp Leu Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys Leu Pro Leu Met Gln
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Leu Cys Leu Pro Leu Met Gln Lys Phe Pro Lys Gln Val Met Val
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Leu Met Gln Lys Phe Pro Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe Ser
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Phe Pro Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe Ser Thr Asn Gln Gly
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Val Met Val Arg Ile Phe Ser Thr Asn Gln Gly Gly Phe Met Leu
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<213> 合成
<400> 234
Ile Phe Ser Thr Asn Gln Gly Gly Phe Met Leu Pro Ile Tyr Glu
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Asn Gln Gly Gly Phe Met Leu Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala Lys
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Phe Met Leu Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Val
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Ile Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Val Gly Gln Phe Glu
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Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Val Gly Gln Phe Glu Gln Pro Thr Glu
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<213> 合成
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Tyr Ala Val Gly Gln Phe Glu Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro Glu
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Gln Phe Glu Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro Glu Asp Leu Asp Thr
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Pro Thr Glu Thr Pro Pro Glu Asp Leu Asp Thr Leu Ser Leu Ala
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Pro Pro Glu Asp Leu Asp Thr Leu Ser Leu Ala Ile Glu Ala Ala
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Leu Asp Thr Leu Ser Leu Ala Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp Leu
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Ser Leu Ala Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp Leu Arg Asn Lys Ser
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Leu Ala Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp Leu Arg Asn Lys Ser Gln
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Gly Arg Arg Cys Pro Glu Met Ile Ser Val Leu Gly Pro Ile Ser
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Ser Val Leu Gly Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe
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Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp
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His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr Pro Val Leu
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Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr Pro Val Leu Pro His Glu Thr
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Gly Ile His Val Arg Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser
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Arg Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro
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Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro Asp Ser Thr Pro Cys His Arg Gly
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His Arg Gly Asp Asn Gln Leu Gln Val Gln His Thr Tyr Phe Thr
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Ser Ala Ala Glu Arg Lys His Arg His Leu Pro Val Ala Asp Ala
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Gly Lys Gln Met Trp Gln Ala Arg Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala
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Gly Leu Ala Trp Thr Arg Gln Gln Asn Gln Trp Lys Glu Pro Asp
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Thr Arg Gln Gln Asn Gln Trp Lys Glu Pro Asp Val Tyr Tyr Thr
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Ala Phe Val Phe Pro Thr Lys Asp Val Ala Leu Arg His Val Val
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Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe
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Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys
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Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu Phe Met His Val Thr Leu Gly
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Phe Met His Val Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr
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Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr Met Thr Arg Asn
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Thr Arg Asn Pro Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly
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Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu
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Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn
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Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys
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Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile
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Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ser His Ile Met Leu Asp Val Ala
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Gly Lys Ile Ser His Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His
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His Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly
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Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu Leu Cys Pro
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Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro
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His Phe Gly Leu Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile
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Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu
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Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu Met Asn Gly
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<213> 合成
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Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe
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<213> 合成
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Gly Asn Leu Leu Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln
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Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu
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Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr Val Glu Leu
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Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp
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Ile Arg Glu Thr Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala
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Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe
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Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp Ile Asp Leu
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Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg
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Phe Phe Phe Asp Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr
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<213> 合成
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Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro
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<213> 合成
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Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr Phe Thr Ser
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Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile
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Glu His Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu
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Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His
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<213> 合成
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Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His Thr Trp Asp Arg
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Tyr Arg His Thr Trp Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly
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<400> 342
Trp Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val
1 5 10 15
<210> 343
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 343
Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp Thr Ser Gly
1 5 10 15
<210> 344
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 344
Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp
1 5 10 15
<210> 345
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 345
Asp Asp Val Trp Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val
1 5 10 15
<210> 346
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 346
Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 347
Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys Thr Pro Arg
1 5 10 15
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<211> 15
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<213> 合成
<400> 348
Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly
1 5 10 15
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<213> 合成
<400> 349
Thr Glu Arg Lys Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala
1 5 10 15
<210> 350
<211> 15
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<400> 350
Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr
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<213> 合成
<400> 351
Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr Ser Ala Gly Arg
1 5 10 15
<210> 352
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<213> 合成
<400> 352
Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr Ser Ala Gly Arg Lys Arg Lys Ser
1 5 10 15
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<211> 15
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<213> 合成
<400> 353
Ala Ser Thr Ser Ala Gly Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala
1 5 10 15
<210> 354
<211> 15
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<213> 合成
<400> 354
Ala Gly Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr
1 5 10 15
<210> 355
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 355
Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr Ser Gly Val Met
1 5 10 15
<210> 356
<211> 15
<212> PRT
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<400> 356
Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr Ser Gly Val Met Thr Arg Gly Arg
1 5 10 15
<210> 357
<211> 15
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<213> 合成
<400> 357
Ala Cys Thr Ser Gly Val Met Thr Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu
1 5 10 15
<210> 358
<211> 15
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<213> 合成
<400> 358
Gly Val Met Thr Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala
1 5 10 15
<210> 359
<211> 15
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<213> 合成
<400> 359
Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala Pro Glu Glu Asp
1 5 10 15
<210> 360
<211> 15
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<213> 合成
<400> 360
Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala Pro Glu Glu Asp Thr Asp Glu Asp
1 5 10 15
<210> 361
<211> 15
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<213> 合成
<400> 361
Thr Val Ala Pro Glu Glu Asp Thr Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 362
Glu Glu Asp Thr Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu Ile His Asn Pro
1 5 10 15
<210> 363
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 363
Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu Ile His Asn Pro Ala Val Phe Thr
1 5 10 15
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<211> 15
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<213> 合成
<400> 364
Asp Asn Glu Ile His Asn Pro Ala Val Phe Thr Trp Pro Pro Trp
1 5 10 15
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<211> 15
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<400> 365
His Asn Pro Ala Val Phe Thr Trp Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile
1 5 10 15
<210> 366
<211> 15
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<213> 合成
<400> 366
Val Phe Thr Trp Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn
1 5 10 15
<210> 367
<211> 15
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<213> 合成
<400> 367
Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu Val Pro Met
1 5 10 15
<210> 368
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 368
Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5 10 15
<210> 369
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 369
Ala Arg Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn
1 5 10 15
<210> 370
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 370
Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln
1 5 10 15
<210> 371
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 371
Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu Phe Phe Trp
1 5 10 15
<210> 372
<211> 15
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<213> 合成
<400> 372
Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp
1 5 10 15
<210> 373
<211> 15
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<213> 合成
<400> 373
Lys Tyr Gln Glu Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile
1 5 10 15
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<213> 合成
<400> 374
Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 375
Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu Gly Val Trp
1 5 10 15
<210> 376
<211> 15
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<213> 合成
<400> 376
Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 377
Ala Glu Leu Glu Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala Gln Pro Lys Arg
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 378
Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala Gln Pro Lys Arg Arg Arg His Arg
1 5 10 15
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<211> 15
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<213> 合成
<400> 379
Pro Ala Ala Gln Pro Lys Arg Arg Arg His Arg Gln Asp Ala Leu
1 5 10 15
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<211> 15
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<213> 合成
<400> 380
Pro Lys Arg Arg Arg His Arg Gln Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys
1 5 10 15
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<211> 15
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<213> 合成
<400> 381
Arg His Arg Gln Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile Ala Ser Thr
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 382
Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile Ala Ser Thr Pro Lys Lys His
1 5 10 15
<210> 383
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成
<400> 383
Leu Pro Gly Pro Cys Ile Ala Ser Thr Pro Lys Lys His Arg Gly
1 5 10 15
Claims (8)
1.一组用于评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态的多肽组合物，其特征在于，所述组合物包括如SEQ ID NO:1～383所示的氨基酸序列。
2.一种检测试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：试剂1、试剂2、试剂3、试剂4、试剂7和试剂8；所述试剂1包含权利要求1所述的如SEQ ID NO:1～383所示的氨基酸序列，其浓度为0.26μM～1.04μM；试剂2包括死细胞染色试剂、Anti-Human CD3-FITC、Anti-human CD4-APC-H7和Anti-humanCD8-Percp-Cy5.5；试剂3为Anti-human IFN-γ-APC；试剂4为保存浓度为1000U/mL的hIL-2；试剂7为蛋白质转运抑制剂；试剂8为细胞固定和破膜溶液试剂。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1的浓度为0.26-1.04μM，使用时的终浓度为125-500nM。
4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂2使用时死细胞染色试剂的稀释倍数为1:1000；Anti human CD3-FITC的稀释倍数为1:50；Anti human CD4-APC-H7的稀释倍数为1:100；Anti human CD8-Percp-Cy5.5的稀释倍数为1:100。
5.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂3使用时Anti-human IFN-γ-APC的稀释倍数为1:100。
6.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括C-RPMI溶液，所述C-RPMI溶液为含有质量浓度为10％的胎牛血清、1％的青霉素和1％的链霉素的RPMI 1640溶液。
7.如权利要求1所述的多肽组合物在制备用于评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态的试剂盒中的应用。
8.如权利要求2所述的检测试剂盒在用于评估造血干细胞移植病人CMV感染后免疫状态中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202110574725.1A CN113419067A (zh) | 2021-05-26 | 2021-05-26 | 一种用于评估造血干细胞移植病人cmv感染后免疫状态的多肽组合物以及检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110574725.1A CN113419067A (zh) | 2021-05-26 | 2021-05-26 | 一种用于评估造血干细胞移植病人cmv感染后免疫状态的多肽组合物以及检测试剂盒 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| CN113419067A true CN113419067A (zh) | 2021-09-21 |
Family
ID=77712981
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110574725.1A Pending CN113419067A (zh) | 2021-05-26 | 2021-05-26 | 一种用于评估造血干细胞移植病人cmv感染后免疫状态的多肽组合物以及检测试剂盒 |
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- 2021-05-26 CN CN202110574725.1A patent/CN113419067A/zh active Pending
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