CN113388583A - 一种用于空间环境的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法及其微流控芯片和装置 - Google Patents

一种用于空间环境的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法及其微流控芯片和装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于空间环境的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法，在地基实验室中将细胞接种于原位细胞微流控芯片的细胞培养层中，冻存后待航天器发射入轨后进行复苏，步骤一装配原位细胞微流控芯片的芯片台上连接液路；步骤二调整微流控芯片温度，融化细胞冻存液；步骤三进行培养基灌流。本发明的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法，克服了传统技术仅能在无菌环境开展实验的缺点，可在非无菌环境下开展实验，而不会引起微生物污染，可降低空间实验室的建设成本；悬浮培养可提高细胞培养密度，同时微流控芯片的体积、质量小，适合于利用空间搭载任务有限资源开展高密度培养，可节约飞行搭载资源。

Description

一种用于空间环境的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法及 其微流控芯片和装置
技术领域
本发明属于空间医学工程以及生物技术研究领域，具体涉及一种在空间环境下应用片上原位细胞冻存与复苏的微流控芯片的细胞悬浮培养、复苏方法，及其微流控芯片，以及基于片上原位细胞冻存与复苏技术的自动化细胞复苏装置。使用该微流控芯片在一次完整空间搭载实验中的冻存、复苏和培养细胞的方法，本发明可应用于多种细胞。
背景技术
悬浮培养指的是一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统，是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。贴壁细胞也可通过微载体实现悬浮细胞培养，相比于贴壁细胞，悬浮细胞的培养、传代、换液等操作都十分简便，培养时只需将组织经分散、过滤、纯化和漂洗后，按一定密度接种于适宜培养液中，置于特定的培养条件下即可良好的生长。传代时也无需再分散，只需按比例稀释后即可继续培养。
在空间环境开展细胞研究的第一步是细胞复苏与接种。细胞复苏是指将冻存在液氮或者-80℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程，其核心是保持细胞活性，同时分离细胞与冻存液。在地基实验室中，细胞复苏通常采用快速融化的方法，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤，再使用离心的方法分离细胞和细胞冻存液。在天基实验室中，空间环境开展细胞培养实验的策略主要有两种，一种是在地基实验室将细胞复苏，并接种至细胞培养载荷中，待细胞贴壁后再发射入轨开展实验。目前我国的生命科学实验载荷常使用该策略，如实践十号和天舟一号等任务的细胞培养载荷。另一种是在天基实验室中直接复苏细胞，再使用离心机在轨模拟1G重力，待细胞贴壁后再在微重力环境下开启实验，在国际空间站上开展的部分实验采用的是这一策略，如使用国际空间站欧洲哥伦布实验舱中BioLab实验载荷的Experiment preparation unit开展的实验等。
然而，上述两种天基实验室中复苏细胞的方法均有一定局限性。天基实验室中直接复苏细胞存在航天员干预过多和实验误操作风险的问题。一方面，所有在轨复苏均需要较多航天员干预，并必须在无菌环境开展实验，而航天员资源和在轨无菌环境均为稀缺资源；另一方面，如果航天员实验操作失误则实验样本容易浪费。地基实验室接种后在轨实验的方法存在细胞活性维持难和实验窗口期短的问题。一方面，在部分发射任务中，由于载荷资源有限，从地面发射至在轨有一段时间无法控制细胞培养环境，因此对细胞状态有较大影响；另一方面，由于地面接种至在轨实验这段时间细胞一直处于生长期，即使使用特殊的技术也仅能一定程度延缓细胞生长，因此若在轨实验启动距离初接种时间过长，细胞活性可能大大降低；对于在空间站开展的实验而言，若所有实验载荷均需尽快入轨开展实验，则多个实验之间会有较多时间冲突；然而，货运飞船往返对接空间站的次数有限，因此如果所有实验均需要入轨后尽快开展实验，会导致大量实验堆积在空间站与货运飞船对接后的数日，这将大大降低空间实验室的利用率。
微流控芯片的结构可订制，通过定制特殊芯片结构解决空间环境中细胞复苏和接种的难题，实现自动化细胞复苏和悬浮培养。同时由于微流控芯片具有体积小、重量轻、功耗低、集成度高、自动化等优点，与空间细胞培养技术的需求高度匹配，基于微流控芯片发展细胞培养载荷技术现已经成为国内外重要发展方向。
发明内容
为了解决现有的在轨细胞复苏技术的缺陷，本发明结合微流控细胞培养技术、细胞冻存技术和细胞复苏技术，提供一种用于空间环境的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法及其微流控芯片和装置。本发明可用于多种细胞中空间环境下的复苏与培养，该技术成本低，操作简单，可有效解决细胞复苏的自动化问题。
本发明提供以下技术方案：
一种用于空间环境的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法，在地基实验室中将细胞接种于原位细胞微流控芯片的细胞培养层中，将所述原位细胞微流控芯片进行程序降温，待航天器发射入轨后进行复苏，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 将所述原位细胞微流控芯片从细胞冻存环境中取出，装入原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的芯片台上，连接所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的培养基储存器和废液储存器；
步骤二 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元，调整连接芯片台的微流控芯片加热制冷片的温度，融化培养腔室内的细胞冻存液；
步骤三 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元，控制培养基储存器液路上的流体驱动器将培养基推入培养基灌流层，将废液从培养基灌流层推入废液储存器。
进一步地，步骤三中，培养基在培养基灌流层连续灌流时间为8～12h，流速为50～1000μL/h。
进一步地，在步骤二中所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元，调整连接培养基储存器、废液储存器的加热制冷片，控制液体温度。
进一步地，细胞原位接种前先使细胞贴附于微载体表面，或将贴壁细胞包埋入微载体，用于培养贴壁细胞。
进一步地，还包括复苏后培养步骤：
步骤四 所述原位细胞微流控复苏、悬浮培养装置的电控单元，控制调整芯片台的微流控芯片加热制冷片的温度至细胞培养温度；电控单元控制培养基储存器液路上的流体驱动器，将培养基连续或间歇地推入培养基灌流层，旧的培养基推入废液储存器；电控单元接受传感器的信号，控制小型CO2气瓶和微型雾化器的开闭，来调整培养环境内CO2的含量和培养环境湿度。
进一步地，还包括复苏后冻存的步骤：
步骤五 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的试剂储存器保存有细胞冻存液，电控单元控制试剂储存器液路上的流体驱动器，将冻存液推入培养基灌流层，电控单元控制微型振荡器，震荡原位细胞微流控芯片；
步骤六 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元调整连接芯片台的微流控芯片加热制冷片的温度，以1～5℃/min的速度梯度降温至-20℃以下。
进一步地，还包括复苏后固定的步骤：
步骤五 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的试剂储存器保存有细胞固定液，电控单元控制试剂储存器液路上的流体驱动器，将冻存液推入培养基灌流层，电控单元控制微型振荡器震荡原位细胞微流控芯片；
步骤六 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元，调整连接芯片台的微流控芯片加热制冷片的温度，将样本保存于低温或常温。
一种原位细胞微流控芯片，由下至上依次包括芯片基底、培养腔室层、盖板，所述培养腔室层设有培养腔室、与培养腔室连通的若干微通道，在培养芯片盖板上设有接头，接头与微通道连通，所述盖板为软性材料；
培养腔室层通过多孔膜分成培养基灌流层和细胞培养层，细胞培养层通过微通道与接种接头连通，培养基灌流层通过微通道与灌流接头连通。
进一步地，所述盖板为聚二甲基硅氧烷PDMS、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET或聚氯乙烯PVC。
一种包含原位细胞微流控芯片的原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置，包括电控单元、所述原位细胞微流控芯片、液体储存与驱动单元，其中，所述原位细胞微流控芯片置于芯片台上，芯片台连接加热制冷片和微型振荡器；
液体存储与驱动单元的培养基储存器、试剂储存器、废液储存器分别与所述原位细胞微流控芯片通过管路连接，培养基储存器、废液储存器分别连接加热制冷片；
液体存储与驱动单元还包含若干流体驱动器，分别设置在试剂、培养基液路上；
电控单元设有微处理器，控制加热制冷片的温度，控制流体驱动器的通断及流体流速。
进一步地，还包括气体控制单元，在气体控制单元中设有小型CO2气瓶、CO2传感器、小型水箱、微型雾化器、湿度传感器，CO2传感器和湿度传感器收集微流控芯片温控单元内的CO2浓度和湿度，电控单元控制小型CO2气瓶和微型雾化器的开闭。
采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的芯片克服了传统技术仅能在无菌环境开展实验的缺点，可在非无菌环境下开展实验而不会引起微生物污染，极大简化了实验流程，降低了空间实验室建设成本；使用的芯片体积和质量均较小，同时悬浮培养可提高细胞培养密度，可节约搭载飞行的资源。
(2)可实现自动化细胞复苏、悬浮培养、冻存，在轨开展实验时航天员参与少，也避免航天员误操作导致的浪费；悬浮培养技术在空间环境中不依赖人造1G重力复苏细胞，降低了空间实验室建设和实验运行成本。
(3)本发明可有效延长空间细胞培养实验窗口期，避免大量实验堆积于航天器入轨后数日，提高了空间实验室的利用率；
(4)可以有效避免细胞长期储存后活性下降的问题，为高质量细胞实验提供实验平台。
(5)利用细胞悬浮培养技术，易于实现自动化的高密度细胞培养，充分利用有限的空间实验资源培养更多细胞，提高了空间实验室有限载荷体积的利用效率。
附图说明
图1是本发明原位细胞微流控芯片的结构示意图
图2是本发明原位细胞微流控芯片的爆炸图；
图3是本发明原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的结构示意图；
图4是微流控芯片片上原位复苏的显微镜观察结果图；
图5是CCK8检测细胞存活率的结果图。
其中：1、灌流接头，2、接种接头，3、盖板，4、细胞培养层，5、多孔膜，6、培养基灌流层，7、基底。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种用于空间环境的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法，在地基实验室中将细胞原位接种于原位细胞微流控芯片的细胞培养层中，再连接无菌管路及流路元件，将原位细胞微流控芯片进行程序降温，并保存于航天器的冻存环境(低于-70℃)，待航天器发射入轨后进行复苏，包括以下步骤：
步骤一 将原位细胞微流控芯片从冻存环境中取出，装入原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的芯片台上，将原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的培养基储存器、废液储存器与装置装配。
步骤二 原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元调整连接芯片台的微流控芯片加热制冷片的温度，融化培养腔室内的细胞冻存液；为了提高复苏存活率通常需要培养腔室内的细胞冻存液在60秒内迅速升温至37摄氏度，且融化冻存液过程中，最高温度不宜超过40℃，以避免细胞受损，调节温度的步骤也可提前进行。
步骤三 原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元控制培养基储存器液路上的流体驱动器，将培养基推入培养基灌流层，将废液从培养基灌流层推入废液储存器。
优选地，培养基在培养基灌流层连续灌流8～12h，流速为50～1000μL/h。这样通过灌流的方式去掉培养腔室中的冻存液，替换为新鲜培养基。细胞复苏后，可在芯片原位上进行细胞培养等后续实验。
由于本发明在地基实验室已经完成了细胞接种、冻存和微流控芯片无菌管路的连接，在运输和复苏过程中可无需依赖无菌环境，有效降低了空间实验室的建设成本，也能降低航天员误操作风险，同时微流控芯片相比于传统培养装置，具有体积小，质量小的优势，可进一步节约搭载飞行的资源。同时，由于冻存于微流控芯片中的细胞处于休眠状态，营养消耗小，可以有效避免细胞长期储存后活性下降的问题，因此实验窗口期长。
上述技术方法是悬浮培养的方法，适合培养悬浮细胞，为了培养贴壁细胞，优选地，在原位接种前使细胞贴附于微载体表面，或将贴壁细胞包埋入微载体，从而培养贴壁细胞。微载体可以是聚苯乙烯微载体、海藻酸钠微球、水凝胶微球。通过细胞悬浮培养，可实现高密度细胞培养，提高空间实验室有现在和体积的利用效率。
优选地，在步骤二中原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元调整连接培养基储存器、废液储存器的加热制冷片，控制液体温度。使得培养基储存器内的新鲜培养基可长期储存，也使废液储存器中的液体可在低温环境下储存，避免其内的蛋白质、外泌体等细胞产物降解，使废液可以满足返回地面后的后续分析需求。
以上技术及涉及到的微流控芯片均无需在微重力环境下使用人工1G重力工作，因此有效降低了空间实验室的建设成本。
实施例2
本发明的复苏方法，可以继续进行细胞培养。
步骤四 原位细胞微流控复苏、悬浮培养装置的电控单元控制连接芯片台的微流控芯片加热制冷片，使微流控芯片维持在合适细胞培养的温度，同时电控单元控制培养基储存器液路上的流体驱动器，将新鲜培养基连续或间歇地推入培养腔室，旧的培养基推入废液储存器；同时，电控单元通过气体控制单元内的传感器测定微流控芯片温控单元内的二氧化碳浓度和湿度，接受传感器的信号，并控制气体控制单元内小型二氧化碳气瓶和微型雾化器的开闭，控制培养环境内CO2的含量(0～10％)和培养环境湿度。气体控制模块控制培养环境内CO2的含量在5％±0.1％，培养环境相对湿度为70％；培养至指定的时间后，可保存培养的细胞样本。
优选的，还包括冻存的方法，步骤五原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元控制试剂储存器液路上的流体驱动器将冻存液(25％二甲亚砜DMSO+80％胎牛血清FBS)推入培养腔室，流速为1mL/min，灌流至原位细胞微流控芯片培养基灌流层内培养基被冻存液完全取代，再在微型振荡器的振荡下，混匀细胞培养层和培养基灌流层内的培养基。
加入冻存液的方法有两种，第一是将10％DMSO的冻存液连续灌流至培养基灌流层，同时辅以长时间震荡，促进冻存液向细胞培养层扩散，扩散完毕后冻存细胞；第二种是将20％或者更高浓度的DMSO冻存液一次性快速地灌流至培养基灌流层，同时辅以短时间的震荡，当两层腔室扩散完毕时，总体的DMSO体积分数约合10％，恰好满足细胞冻存对DMSO的需求。
步骤六 原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元调整连接芯片台的微流控芯片加热制冷片的温度，1-5℃/min的速度梯度降温至-20℃以下。将原位细胞微流控芯片及液路从装置内拆出，转移至细胞冻存环境保存，等待返回地面重新培养或开展后续分析。细胞冻存环境温度应低于-70℃。
优选地，还包括复苏后细胞固定的方法，步骤五原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元，控制试剂储存器液路上的流体驱动器将固定液(8％多聚甲醛溶液)推入培养腔室，流速为1mL/min，灌流至原位细胞微流控芯片培养基灌流层，其内培养基被固定液完全取代，再在微型振荡器的振荡下，混匀细胞培养层和培养基灌流层内的培养基。细胞固定液与细胞作用5-20分钟后，电控单元调整连接芯片台的微流控芯片加热制冷片的温度，拆除微流控芯片和流路，将样本保存于低温或常温，返回地面后，细胞可直接从细胞培养层吸出开展多种操作，包括细胞甩片、染色或免疫组化操作等。
实施例3
如图1、2所示，本发明提供了芯片基底7、培养腔室层、盖板3，培养腔室层设有培养腔室、与培养腔室连通的若干微通道，在培养芯片盖板上设有接头，接头与微通道连通，盖板为软性材料。
培养腔室层通过多孔膜5分成培养基灌流层6和细胞培养层4，细胞培养层通过微通道与接种接头2连通，培养基灌流层通过微通道与灌流接头1连通。
优选的，培养芯片盖板可为聚二甲基硅氧烷PDMS、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET、聚氯乙烯PVC。细胞冻存过程中，其内的体积变化大，因此使用软性材料可防止芯片在冻存过程中损坏泄漏。芯片能够适应细胞原位冻存、复苏的需求。
基底可为聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、玻璃或其他可使细胞贴附的材料，如需观测细胞则需选用透明材料，培养腔室层可选用聚甲基丙烯酸(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃材料。
芯片各层之间的固定可由环氧树脂灌封胶或聚甲基丙烯酸甲酯PMMA双面胶相互粘合，或者由热压键合封合，保障气密性。
实施例4
如图3所示，本发明提供了一种原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置，包括电控单元、原位细胞微流控芯片、液体储存与驱动单元，其中，原位细胞微流控芯片置于芯片台上，芯片台通过卡接等固定连接方法固定原位细胞微流控芯片。芯片台连接加热制冷片和微型振荡器，加热制冷片可为半导体加热制冷片，用于对培养腔室进行加热或降温处理，满足细胞复苏、悬浮培养、冻存的温度需求，微型振荡器可通过震荡，提升原位细胞微流控芯片细胞培养腔室的培养基灌流层与细胞培养层间物质的跨膜交换速度。
液体储存与驱动单元的试剂储存器、培养基储存器、废液储存器与原位细胞微流控芯片通过无菌管路连接，这样形成培养基储存器、培养腔室、废液储存器之间的液路连通，或者试剂储存器、培养腔室、废液储存器之间的液路连通。培养基储存器、废液储存器分别连接加热制冷片，保证培养基和废液的温度调控在所需温度。
在试剂液路和灌流液路上分别设有若干流体驱动器，驱动液体从培养腔室进入废液储存器。
电控单元设有微处理器，控制加热制冷片的温度，控制流体驱动器的通断。
实施例5
利用本发明的方法将人髓系白血病单核细胞THP-1在微流控芯片内的原位冻存与复苏。
复苏芯片内细胞，以100μL/h流速连续12小时向培养基灌流层灌流新鲜的RPMI-1640培养基，再使用显微镜观察细胞形态。图4为微流控芯片片上原位复苏的显微镜观察结果，结果见图4。复苏后，细胞边缘规则，形态正常，说明本发明的复苏的悬浮细胞生长状态正常，可用于后续生物学研究中。
从接种接头吸出芯片腔室内的细胞，混匀后，取100μL细胞液与10μL CCK8溶液混合，避光反应1h后测定450nm处吸光值。另设有对照组细胞使用传统细胞冻存管冻存细胞，复苏时将细胞加入10mL培养基，在1000rpm下离心5min，取出上清，使用等体积培养基重悬沉淀，再取100μL细胞液与10μL CCK8溶液混合，避光反应1h后测定450nm处吸光值。计算细胞存活率，结果如图5所示。
图5表明与传统方法相比，在微流控芯片内原位冻存与复苏的细胞中有至少70～80％细胞状态良好，考虑到细胞可以不断生长，因此细胞分裂后即可恢复冻存前的数量，同时若需以高细胞密度开展实验，仅需提高初始接种量即可达到与地面复苏手段相似的结果。说明本发明的复苏方法可复苏悬浮细胞，复苏效果良好，复苏的细胞可用于后续生物学研究中。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种用于空间环境的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法，在地基实验室中将细胞接种于原位细胞微流控芯片的细胞培养层中，将所述原位细胞微流控芯片进行程序降温，待航天器发射入轨后进行复苏，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 将所述原位细胞微流控芯片从细胞冻存环境中取出，装入原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的芯片台上，连接所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的培养基储存器和废液储存器；
步骤二 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元，调整连接芯片台的微流控芯片加热制冷片的温度，融化培养腔室内的细胞冻存液；
步骤三 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元，控制培养基储存器液路上的流体驱动器，将培养基推入培养基灌流层，将废液从培养基灌流层推入废液储存器。
2.根据权利要求1所述的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法，其特征在于，步骤三中，培养基在培养基灌流层连续灌流时间为8～12h，流速为50～1000μL/h。
3.根据权利要求1所述的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法，其特征在于，在步骤二中所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元调整连接培养基储存器、废液储存器的加热制冷片，控制液体温度。
4.根据权利要求1所示的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法，其特征在于，细胞原位接种前先使细胞贴附于微载体表面，或将贴壁细胞包埋入微载体，用于培养贴壁细胞。
5.根据权利要求1所述的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法，其特征在于，还包括复苏后培养步骤：
步骤四 所述原位细胞微流控复苏、悬浮培养装置的电控单元，调整芯片台的微流控芯片加热制冷片的温度至细胞培养温度，电控单元控制培养基储存器液路上的流体驱动器，将培养基连续或间歇地推入培养基灌流层，旧的培养基推入废液储存器；电控单元接受传感器的信号，控制小型CO2气瓶和微型雾化器的开闭，来调整培养环境内CO2的含量和培养环境湿度。
6.根据权利要求5所述的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法，其特征在于，还包括复苏后冻存的步骤：
步骤五 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的试剂储存器保存有细胞冻存液，电控单元控制试剂储存器液路上的流体驱动器，将冻存液推入培养基灌流层，电控单元控制微型振荡器震荡原位细胞微流控芯片；
步骤六 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元调整连接芯片台的微流控芯片加热制冷片的温度，以1～5℃/min的速度梯度降温至-20℃以下。
7.根据权利要求5所述的片上原位细胞复苏、悬浮培养的方法，其特征在于，还包括复苏后固定的步骤：
步骤五 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的试剂储存器保存有细胞固定液，电控单元控制试剂储存器液路上的流体驱动器，将冻存液推入培养基灌流层，电控单元控制微型振荡器震荡原位细胞微流控芯片；
步骤六 所述原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置的电控单元，调整连接芯片台的微流控芯片加热制冷片的温度，将样本保存于低温或常温。
8.一种根据权利要求1-6中任一项所述的原位细胞微流控芯片，其特征在于，由下至上依次包括芯片基底、培养腔室层、盖板，所述培养腔室层设有培养腔室、与培养腔室连通的若干微通道，在培养芯片盖板上设有接头，接头与微通道连通，所述盖板为软性材料；
培养腔室层通过多孔膜分成培养基灌流层和细胞培养层，细胞培养层通过微通道与接种接头连通，培养基灌流层通过微通道与灌流接头连通。
9.根据权利要求7所述的原位细胞微流控芯片，其特征在于，所述盖板为聚二甲基硅氧烷PDMS、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET或聚氯乙烯PVC。
10.一种包含权利要求7所述原位细胞微流控芯片的原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置，其特征在于，包括电控单元、所述原位细胞微流控芯片、液体储存与驱动单元，其中，所述原位细胞微流控芯片置于芯片台上，芯片台连接加热制冷片和微型振荡器；
液体存储与驱动单元的培养基储存器、试剂储存器、废液储存器分别与所述原位细胞微流控芯片通过管路连接，培养基储存器、废液储存器分别连接加热制冷片；
液体存储与驱动单元还包含若干流体驱动器，分别设置在试剂、培养基液路上；
电控单元设有微处理器，控制加热制冷片的温度，控制流体驱动器的通断及流体流速。
11.根据权利要求9所述的原位细胞微流控芯片复苏、悬浮培养装置，其特征在于，还包括气体控制单元，在气体控制单元中设有小型CO2气瓶、CO2传感器、小型水箱、微型雾化器、湿度传感器，CO2传感器和湿度传感器收集微流控芯片温控单元内的CO2浓度和湿度，电控单元控制小型CO2气瓶和微型雾化器的开闭。
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