CN113292675B

CN113292675B - GMA-羧甲基-β-环糊精单体、整体柱及手性药物分离方法

Info

Publication number: CN113292675B
Application number: CN202110599298.2A
Authority: CN
Inventors: 房琳琳; 张建斌; 孙慧君; 吴敬敬; 刘静
Original assignee: Dalian Medical University
Current assignee: Dalian Medical University
Priority date: 2021-05-31
Filing date: 2021-05-31
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2041-05-31
Also published as: CN113292675A

Abstract

本发明提供一种GMA‑羧甲基‑β‑环糊精单体、整体柱及手性药物分离方法，所述羧甲基‑β‑环糊精单体由羧甲基‑β‑环糊精、甲基丙烯酸缩水甘油酯、8‑二氮杂二环十一碳‑7‑烯和无水DMSO按照一定的重量制备而成，该整体柱能够实现对12种手性药物的基线分离，制备方法简单，且周期短。

Description

GMA-羧甲基-β-环糊精单体、整体柱及手性药物分离方法

技术领域

本发明属于手性药物分离技术领域，特别涉及一种GMA-羧甲基-β-环糊精单体、整体柱及手性药物分离方法。

背景技术

手性药物的分离一直是公众比较关心的话题，然而，仅根据药物的理化性质不能有效地区分对映体，因此需要一种更好的方法来有效地分离药物对映体。

毛细管电色谱(CEC)作为毛细管电泳(CE)和高效液相色谱(HPLC)的混合方法，在手性分离方面越来越引起人们的关注。其中，整体柱由于易制备、高渗透性、高稳定性和广泛的pH耐受性等而作为介质，并发展成为分离手性药物的有效工具。

环糊精(CD)是由葡萄糖基低聚糖形成的环状低聚糖，具有亲水性外表面和疏水性内表面。天然环糊精可分为α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)和γ-环糊精(γ-CD)，它们分别由6、7或8种无葡萄糖形成。β-CD是最广泛使用的手性选择剂，但其选择性有限，因此衍生出许多优良的手性选择衍生物，例如，磺丁醚-β-CD、羟丙基-β-CD、羧甲基--CD(CM-β-CD)。CM-β-CD可以保留β-CD的性质，与药物分子形成包合化合物，并具有很强的选择对映体的能力。因此羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱的发展得到了人们的关注。

但是，目前公开的羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱制备工艺复杂，分离效果差，如何简单、快速地制备出分离效率和稳定性高的羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱是目前急需解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种GMA-羧甲基-β-环糊精单体、整体柱及手性药物分离方法。

本发明其中一个技术方案提供一种GMA-羧甲基-β-环糊精单体，所述羧甲基-β-环糊精单体由如下成分制备而成：

进一步改进的方案中，所述无水DMSO的用量为120μL。

本发明另一个技术方案提供一种羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱，，所述整体柱内填充有GMA-羧甲基-β-环糊精单体。

本发明再一个技术方案提供一种羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

制备GMA-羧甲基-β-环糊精单体；

制备含有聚乙二醇作为致孔剂的均匀水解液；

将制备GMA-羧甲基-β-环糊精单体、溴代十六烷三甲胺和偶氮二异丁腈加入到均匀水解液中混匀，注入毛细管内，进行聚合反应。

进一步改进的方案中，制备制备GMA-羧甲基-β-环糊精单体的方法包括：将羧甲基-β-环糊精、甲基丙烯酸缩水甘油酯、8-二氮杂二环十一碳-7-烯和无水DMSO置于反应容器中，将反应容器置于水浴中持续搅拌，即得GMA-羧甲基-β-环糊精单体。

进一步改进的方案中，制备均匀水解液的方法包括搅拌含有乙酸、聚乙二醇、正硅酸甲酯和丙基三甲氧基硅烷的混合物，即得均匀水解液。

进一步改进的方案中，所述聚乙二醇的分子量为6000-20000。

本发明另一技术方案提供一种羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱在分离手性药物中的应用。

本发明另一技术方案提供一种利用羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱分离手性药物的方法，所述分离条件为：

色谱柱：羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱；

流动相：有机相乙腈：水相Tris-H₃PO₄＝1-30：70-90；

pH：4.5-6.5；

检测波长：220nm；

柱温：45℃；

分离电压：10-25kV。

本发明采用“一锅法”制备了羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱，其能够实现对12种手性药物的基线分离，制备方法简单，周期短。分离的12种药物对映体既包括酸性药物，也包括碱性药物，这表明羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱具有十分广泛的手性药物分离谱。

附图说明

图1为羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)的合成过程图；

图2为GMA-羧甲基-β-环糊精单体的合成过程图；

图3为羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱的合成过程图；

图4为核磁图谱，图中A表示β-CD在D₂O中的核磁图谱；B表示CM-β-CD在D₂O中的核磁图谱；C表示GMA-CM-β-CD在D₂O中的核磁图谱；

图5为红外光谱图；图中A为CM-β-CD的红外光谱图；B为GMA-CM-β-CD的的红外光谱图；

图6为羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱的扫描电镜图；图中A为扫描电镜微球体结构图像；B为内部分布图；C为双孔输送管道图；

图7为羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱制备条件的优化图：图中，A1为DMSO对保留时间的影响；A2为DMSO对分辨率(Rs)的影响；B1为AIBN对保留时间的影响；B2为AIBN对分辨率(Rs)的影响；C1为PEG分子量对保留时间的影响；C2为PEG分子量对分辨率(Rs)的影响；

图8为光学显微镜图；A1为DMSO的用量为120μL时的光学显微镜图；A2为DMSO的用量为100μL时的光学显微镜图；A3为DMSO的用量为140μL时的光学显微镜图；B2为AIBN的用量为0.5mg时的光学显微镜图；B3为AIB的用量为1.5mg时的光学显微镜图；C2为PEG的分子量为6000时的光学显微镜图；C3为PEG的分子量为20000时的光学显微镜图；

图9为扫描电镜图；A1为DMSO的用量为120μL时的扫描电镜图；A2为DMSO的用量为100μL时的扫描电镜图；A3为DMSO的用量为140μL时的扫描电镜图；B2为AIBN的用量为0.5mg时的扫描电镜图；B3为AIB的用量为1.5mg时的扫描电镜图；C2为PEG的分子量为6000时的扫描电镜图；C3为PEG的分子量为20000时的扫描电镜图；

图10为电渗流结果图；图中，A为pH对电渗流的影响，B为乙腈含量对电渗流的影响；

图11为12种手型药物的结构图；

图12为在分离中优化流动相pH值和乙腈的结果图；图中，A为流动相的pH对保留时间的影响；B为流动相的pH对12种药物的分辨率的影响；C为流动相中乙腈含量对保留时间的影响；D为流动相中乙腈的含量对12种药物分辨率的影响；

图13为12种手性药物的电色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1一种GMA-羧甲基-β-环糊精单体(GMA-CM-β-CD)

所述GMA-羧甲基-β-环糊精单体由如下成分制备而成：

制备方法包括如下步骤：

羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)的制备：将1gβ-环糊精加入50mL烧杯中，在50℃水浴条件下持续搅拌，并逐滴加入1％NaOH溶液；此后将1％的氯乙酸缓慢加入溶液中，搅拌乳白色的悬浮液直至澄清；在60℃水浴条件下继续搅拌4小时后，用稀盐酸调节溶液pH至7；继而在溶液中加入乙醇直至沉淀消失，静置；减压过滤后留下沉淀物，并置于恒温干燥箱中(60℃)干燥，即获得CM-β-CD，反应过程如图1所示；

将0.06g CM-β-CD、22mg甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、6mg 8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)和120μL无水DMSO置于反应容器中，并用橡胶塞密封；将反应容器置于100℃水浴中持续搅拌30分钟后，即得GMA-羧甲基-β-环糊精单体，反应过程如图2所示。

实施例2一种羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱的制备方法

所述制备方法包括如下步骤：

1)毛细管活化：使用氢氧化钠(1.0M，2h)、水(10min)、盐酸(1.0M，1h)、水(20min)、丙酮(10min)依次灌注毛细管，并用氮气气流干燥；

2)制备均匀水解液：在冰浴条件下，持续搅拌含有乙酸(0.01M，1.0mL)、聚乙二醇(PEG，10000mW，108mg)、正硅酸甲酯(TMOS，375μL)和丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS，85μL)的混合物2小时，获得均匀水解液；

3)制备GMA-羧甲基-β-环糊精单体：

将0.06g CM-β-CD、22mg甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、6mg 8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)和120μL无水DMSO置于反应容器中，并用橡胶塞密封；将反应容器置于100℃水浴中持续搅拌30分钟后，即得GMA-羧甲基-β-环糊精单体；

4)将20mgGMA-羧甲基-β-环糊精单体、20μL水、20μL DMF、2mg溴代十六烷三甲胺(CTAB)和1mg偶氮二异丁腈(AIBN)加入0.5mL的均匀水解液中，超声脱气3分钟并漩涡混匀；用注射泵将溶液泵入毛细管中，长约30厘米，两端用硅胶塞封闭；

5)将毛细管置于电热恒温干燥箱(40℃)19小时进行聚合反应，用甲醇冲洗管内未反应的多余物质后，制备羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱，合成过程如图3所示。

实施例3一种手性药物的分离方法

色谱柱：羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱；

流动相：有机相乙腈(ACN)：水相Tris-H₃PO₄(20mM)＝20:80；超声脱气，并用孔径为0.22μm的滤膜过滤；

pH：5.5；

检测波长：220nm；

柱温：45℃；

分离电压：15kV。

实验例1结构确认

利用¹H-NMR对β-CD、CM-β-CD和GMA-CM-β-CD进行分析，结果如图4中的A-C所示：与CM-β-CD的¹H-NMR谱相比，GMA-CM-β-CD在5.65～6.23ppm和1.72～2.12ppm均出现了新的信号，分别代表了亚甲基和甲基，表明甲基丙烯酸酯基团已成功取代CM-β-CD的羟基基团；通过CM-β-CD信号与取代基信号对应部位的比较，计算出GMA-CM-β-CD的平均取代度(ADS)为1.42。

采用傅里叶红外光谱对所制备的CM-β-CD和GMA-CM-β-CD单体进行分析，结果如图5所示：与CM-β-CD相比，GMA-CM-β-CD在1716.3cm^-1处出现了一个新的吸收峰，与C＝O的伸缩振动吸收峰有关；此外，在1619.5cm^-1处形成了C＝C伸缩振动产生的吸收峰，同时C＝C和C＝O形成了共轭结构，因此C＝C伸缩振动吸收峰的吸收向低波数方向移动且强度得以提高。上述结果表明，GMA-CM-β-CD已成功合成。

实验例2扫描电镜

将羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱切割成1cm长的样品，固定在铝棒上并喷涂铂，采用扫描电子显微镜(SEM)观察毛细管横截面。从图6可以看出，本申请所制备的羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱具有非晶态的硅聚体、均匀的双孔结构以及连续的微球结构。这种结构可以在不抑制流动相流动的情况下提供更大的分离表面积，即拥有优良的渗透率和高分离度。

实验例3羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱制备条件的优化

本申请使用不同含量的DMSO、AIBN及不同分子量的PEG，采用实施例2的制备方法获得多根羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱，并分别对氧氟沙星、阿托品、丙酸倍氯米松、舍康唑、盐酸舍曲林和盐酸异丙嗪6种药物进行手性分离并评价结果，结果如表1及图7-9所示。

表1羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱制备条件的优化结果

从表1中可以得出，当DMSO含量为120μL，AIBN含量为1.0mg且PEG的分子量为10000时，对6种手性药物具有非常好的分离度和渗透性。

如图7中的A1和A2所示，当DMSO含量为100μL时，所制备的羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱分离效果差，难以分离除阿托品、氧氟沙星以外的其他药物；在DMSO含量为140μL时，所制备的羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱也不能有效分离氧氟沙星、丙酸倍氯米松和舍他康唑；而当DMSO含量达到120μL时所制备的羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱可成功分离6种药物，并且维持较高的分离度。如图8和图9中的A1所示，DMSO含量在120μL时，可以使得聚合物与毛细管壁紧密贴合并均匀分布；合适剂量的DMSO可以使得整体柱形成均匀分布的空隙，形成双孔结构(大小孔隙)提高渗透性。如图8和图9中的A2和A3所示，DMSO含量过低或过高都会造成分布不均或孔隙结构层过疏或过致密，从而降低了对映体的分离度。

如图7中的B1和B2所示，当加入1mg AIBN参与反应时，所制备的羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱能较好地分离氧氟沙星、阿托品、舍他康唑和盐酸舍曲林。然而，当AIBN含量降至0.5mg时，由于该整体柱的聚合物分布不均，很难分离氧氟沙星和舍康唑；当AIBN含量增加到1.5mg时，所制备的羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱渗透性明显降低，盐酸舍曲林和舍康唑的分离性能很低，对氧氟沙星和阿托品的分离效果更差。如图8和图9的A1、B2和B3所示，当AIBN含量为1mg时，聚合物与毛细管内壁的结合更加紧密，聚合物孔径比例越合适，所聚合的微球越均匀。

如图7的C1和C2、图8和图9的A1、C2和C3所示，当PEG的分子量为10000时，所制备的羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱能够成功分离3种药物，并保证良好的分离度；然而，从图8和图9的C2和C3中可以看出，当PEG的分子量为6000或20000时，整体柱的内部结构渗透性较差或聚合物分布不均匀，不利于手性药物的分离。

实验例4电渗流实验

本申请针对羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱电渗透过程，考察流动相pH值等因素对电渗流的影响。

以DMSO作为模型化合物测定电渗流，结果如图10所示，从图10中的A可以得出，整体柱在pH值为4.5～6.5时电渗流随pH增加而增大；从图10中的B中可以得出，当ACN(％)在0～30％范围内变化时，电渗流与ACN含量呈线性关系，即当ACN(％)增加时，电渗透流量显著下降。

实验例5羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱的分离性能实验

本申请采用羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱分离12种手性药物，12种药物包括pKa在9至13之间的碱性药物：阿托品、倍他米松、乙酰甲胺磷、丙酸倍氯米松、咪唑乙醇、烯效唑、盐酸舍曲林、盐酸异丙嗪等；酸性药物(pKa＝4.0～6.8)：氧氟沙星、舍他康唑、维生素C和布洛芬；12种药物的结构如图11所示。

此外，考察了流动相的pH、ACN/H₂O、分离电压、缓冲液种类和浓度等对分离效果的影响，结果如下所示：

当流动相的pH＝2.5、pH＝3.0、pH＝3.5时，无法分离任何药物，当流动相的pH值超过7.0时，虽然保留时间缩短了，但降低了手性药物分子与CM-β-CD结合的能力，当pH控制在4.5～6.5之间时，可实现最好的分离。

如图12中的A和B所示，当pH从4.5增加到5.5时，大部分药物的停留时间都缩短了，而当pH继续增加到6.5时，药物的停留时间保持不变。在药物分离度方面，当pH＝5.5时，相较于其他条件，所有药物均可分离且保持较高分离度。

如图12中的C和D所示，当ACN浓度从0％提高到20％时，大部分手性药物分离的保留时间没有明显变化，当ACN浓度增加到30％时，流动相的电渗透迁移率显著增加，导致电渗流明显下降，保留时间显著延长；当ACN浓度为0％、10％和30％时，只能部分分离出5、7和6种药物；仅当ACN浓度增加到20％时，分离出的药物种类最多，且保持了高分离度。

本申请采用10～25kV的分离电压进行手性分离，当分离电压在15kv时达到峰值，随着分离电压的进一步升高，分离度逐渐降低。

当使用磷酸盐、醋酸盐作为流动相时，两种缓冲液离子强度都较大，导致实验过程中电流增加过高，基线波动大，且增加缓冲液浓度会增加流动相的黏度，降低电渗流量，从而增加药物对映体的保留时间。当流动相选择为pH＝5.5的Tris溶液，且浓度达到20mM时，药物分离效果最佳。

12种药物的手性分离结果见表2；阿托品、倍他米松、氧氟沙星、乙酰甲胺磷、丙酸倍氯米松、咪唑乙醇、舍他康唑、维生素C、烯效唑、盐酸舍曲林、盐酸异丙嗪、布洛芬的电色谱图如图13所示。

表2为12种药物在羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱上的分离结果

分离条件包括pH＝5.5，ACN/H₂O(20：80)，20mM Tris-H₃PO₄，15k V。

t₁是第一迁移对映体的时间；t₂是第二迁移对映体的时间；α是选择性因子；

μ_eff是对映体的有效迁移率(m²s^-1V^-1)，

其中I和L分别表示毛细管柱的有效长度和总长度；V是施加的电压；t₀是EOF标记的保留时间；R_s是分辨率；N₁是第一迁移对映体的理论板数；N₂是第二迁移对映体的理论板数。

实验例6重复性和稳定性实验

以咪唑乙醇作为模型药物，评估制备的的重现性和稳定性，结果图表3所示。

表3咪唑乙醇在整体柱上保留时间，分辨率和效率结果

分离条件：pH＝5.5，ACN/H₂O(20：80)，20mM Tris-H₃PO₄，15千伏。

从表3中可以看出，柱内、日间与柱间RDS分别为2.0～4.0％、2.2～4.3％和2.9～6.0％。因此，本申请所制备的羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱具有较高的重现性，且经过300次运行后羧甲基-β-环糊精有机硅杂化整体柱的分离性能无明显变化，说明该整体柱具有良好的稳定性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。