CN113288520B - 一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨，可实现对临床大骨缺损的修复。使用光敏定向细胞技术构建定向细胞片，通过CT扫描骨缺损获取数据，编程后制备符合缺损的水凝胶，同时脱附转移定向细胞片，经生理盐水处理后形成3D形状形成个性化仿生骨膜；使用3D打印技术制备符合骨缺损区形状的新型硅酸钙生物陶瓷类支架，将仿生骨膜包裹组织工程骨支架植入缺损区进行骨修复。本发明能够有效地促进缺损区域血管浸润及新骨生成，利于恢复骨缺损患者的功能及美观。
Description
技术领域
本发明涉及一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨的制备方法。
背景技术
创伤、肿瘤或其他骨骼疾病引起的大骨缺损给临床治疗带来极大的挑战，据统计，我国每年被诊断为骨缺损的患者约有300万人，治疗主要以自体移植骨进行修复，自体骨移植是临床上骨组织缺损修复的金标准，但这种修复方法面临供区发病、功能修复和美观性无法兼顾等困境；修复大的节段性缺陷的骨替代支架也有许多局限性，例如不完全的血管吻合和浸润，成骨效率低以及新骨重塑缓慢。传统的组织工程学策略通常通过结合细胞、支架和生物活性因子构建组织工程骨，但较难实现大面积骨缺损中血管的充分浸润和新骨的快速重塑，目前组织工程骨的研究热点主要集中在不同材料，个性化修复及实现血管化等的方面，往往忽略了骨膜在骨缺损的修复和再生中的重要作用。
发明内容
本发明为克服上述现有技术所述的至少一种缺陷(不足)，
本发明的目的是提供一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨，包括生物陶瓷支架、仿生骨膜，所述仿生骨膜设于所述生物陶瓷支架上。其形状与骨缺损形状相符。
所述仿生骨膜的制备包括以下步骤：
S1.二氧化钛纳米点基板旋涂形成薄膜；
其中，由钛酸四丁酯、乙酰丙酮、去离子水、乙醇和聚乙烯吡咯烷酮为原材料配制旋涂前驱液，利用不同密度液相成分在旋涂过程中相对流动自组装形成薄膜；将旋涂后薄膜基板放置于马弗炉中，以8℃每分钟的速率使样本从室温上升至700℃并保持1h；
S2.紫外光通过光掩膜板的透光区照射到二氧化钛纳米点基板上；
具体而言，是使用波长为254nm紫外光通过光掩膜板照射到二氧化钛纳米点基板上,宽度及间隔相等，30～50m；
S3.基板上接种间充质干细胞，培养至汇合成定向膜片；
具体而言，基板上接种间充质干细胞是激活经UV照射材料表面的生物活性，使区域粘附性能增加；随后于基板上接种间充质干细胞，接种密度为每孔4*105/cm2～5*105/cm2，低糖DMEM培养基+10％FBS培养1-2周，培养至细胞呈成膜片；
S4.将基板放入反应池进行光处理投射；
具体而言，是用两个1毫米厚玻璃载玻片隔开1.5毫米厚硅橡胶垫片作为数字印刷反应池；印刷前体溶液由35wt％的甲基丙烯酸甲酯，15wt％的PEGDA，20wt％的3-磺酸丙基甲基丙烯酸钾盐和30wt％的蓝光引发剂溶液混合制成，避光保存；将基板放入反应池进行光处理投射后，将水凝胶与下面的基板分开，通过生理盐水处理后形成3D形状。
进一步的，所述仿生骨膜厚度覆盖于所述生物陶瓷支架上。
进一步的，所述仿生骨膜厚度为0.4-1.0mm。
进一步的，所述仿生骨膜厚度为0.5mm。
进一步的，非节段性骨缺损时，所述仿生骨膜覆盖在组织工程骨表面，具有一定的约束固位力。
进一步的，节段性骨缺损时，所述仿生骨膜完全包裹组织工程骨。
进一步的，仿生骨膜的制备方法，包括以下步骤：
进一步的，生物陶瓷支架的制备方法包括以下步骤：
S5.将生物陶瓷粉末与6％聚乙烯醇溶液以质量比为1.25:1(墨水的配比)混合；
S6.制备外形符合缺损范围，具有内部方形孔状结构的支架，孔径约为250-300μm。；
S7.打印。
更进一步的，打印完成后置于80℃下干燥过夜；在温度炉中以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃的目标温度，并保持3小时，然后自然冷却。
更进一步的，所述生物陶瓷粉末是的Ca90％Mg10％SiO3生物陶瓷粉末；所述生物陶瓷粉末需要在乙醇中研磨至粒径＜3μm。(Ca90％Mg10％SiO3指含10％镁取代的硅酸钙，即酸钙中10％的Ca被Mg取代)
与背景技术相比，本发明的有益效果是：
本发明构建了带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨，兼顾物理形貌、生物成分和操作性能的仿生骨膜克服了组织工程骨修复大骨缺损时血供不足、成骨效率低以及新骨重塑缓慢等问题。其中仿生骨膜通过光敏定向细胞技术在模拟天然骨膜结构的同时带入骨膜所需的细胞成分，数字化光处理打印技术打印出符合缺损范围的水凝胶，在解决以往骨膜可操作性差的问题的同时体现个性化的特点。组织工程骨--含镁改性多孔陶瓷支架含Mg，可增强骨缺损的再生能力，其制备方法3D打印技术可以提供个性化的组织工程骨，适应缺损区的空间范围，同时构建出多孔的结构，该结构可提高支架的成骨能力。将仿生骨膜与该组织工程骨联合应用于骨缺损修复具有更好的修复效果。
附图说明
图1为本发明带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨的制备工艺流程图。
图2为数字化光处理打印技术反应池示意图。其中1为印刷前体溶液；2为硅胶软垫；3为定向排列的干细胞片；4为TiO2纳米点基板；5为玻璃载玻片。
图3为仿生骨膜的扫描电镜图像。
图4为的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨的扫描电镜图像，A图可见方向孔状结构，B图为A图放大后的细微图像，可以看到打印出支架细微结构，放大比例见比例尺。
图5为带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨植入到兔颌骨缺损中，第12周时Masson染色切片图像。A为带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨组，B为单纯含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨组。NB：新骨(New Bone)。
图6为节段性骨缺损时的结构示意图。
图7为非节段性骨缺损时的结构示意图。10为仿生骨膜。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；对于本领域技术人员来说，某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。除特别注明外，本发明所用药品均为市售品。
一种制备带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨的方法，包括以下步骤：
(1)骨缺损CT扫描
使用CT获得骨缺损区的三维结构，导入mimics软件中获得数据信息，生成.stl文件；
(2)光敏定向细胞片构建波长为254nm紫外光(UV)通过平行图案的掩膜板照射到二氧化钛纳米点基板上，激活基板光照区表面生物活性提高其粘附能力，于基板接种骨髓间充质干细胞，培养至细胞完全汇合成膜片；
(3)水凝胶编程设计
B9Creator软件中导入.stl文件，控制基于数字微镜设备的商用投影仪进行编程，将带有细胞片的纳米点薄膜基板放入反应池加入光处理印刷前体溶液，根据编程进行光处理投射，经生理盐水处理后形成个性化骨膜。
(4)3D组织工程骨制备
使用3D打印陶瓷墨水打印设备(杭州普琳诺科技有限公司printnovo-3生物3D打印机)打印具有方形孔状结构的生物陶瓷支架(适宜的孔径和孔隙率(200-300μm)利于松质骨、血管内皮细胞长入，扩大接触面积以增加骨诱导效果)，置于80℃过夜，后经烧结完成制备。
作为具体实施例的改进，步骤(2)中掩膜板透光区宽度为与间隔相等，30-50μm。
作为具体实施例的改进，步骤(2)中二氧化钛纳米点基板制备以石英玻璃作为基板，配制悬涂前驱液，将玻片放于悬涂仪，抽成真空，Time设置40s，Speed为8KW，滴一滴液体开始悬涂，完成后取下玻片放入马弗炉，以8℃每分钟的速率使样本从室温上升至700℃并保持1h。悬涂前驱液的制备(以10mL为例)：于25mL烧杯中加入6mL无水乙醇，加入62μL乙酰丙酮+3μLddH2，缓慢连续加入680μL钛酸四丁酯，加入0.4g聚乙烯吡咯烷酮(上述过程使用磁力搅拌器搅拌)。转移液体至10mL容量瓶，用无水乙醇定容至10mL。
作为具体实施例的改进，步骤(2)中接种骨髓间充质干细胞，接种密度为每孔4*105/cm～5*105/cm2，低糖DMEM培养基+10％FBS培养1-2周。
作为具体实施例的改进，步骤(3)中印刷前体溶液(35wt％的甲基丙烯酸甲酯(GelMA)+15wt％的聚乙二醇(二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)+20wt％的3-磺酸丙基甲基丙烯酸钾盐(PSPMA)+30wt％的蓝光引发剂溶液)。
作为具体实施例的改进，步骤(3)中数字印刷反应池为两个的玻璃载玻片(1毫米厚)用硅橡胶垫片(1.5毫米厚)隔开构成。
作为具体实施例的改进，步骤(4)中生物陶瓷材料为Ca90％Mg10％SiO3，于乙醇中研磨至粒径＜5μm(粒径大小、配比浓度是为了配成墨水后打印更均质，避免过大粒径的颗粒堵塞喷头)。
作为具体实施例的改进，步骤(4)中生物陶瓷墨水配制中生物陶瓷：6％聚乙烯醇溶液质量比为1.25:1。
作为具体实施例的改进，步骤(4)中打印参数为喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。
作为具体实施例的改进，步骤(4)中烧结目标温度为1150℃，加热速率为2℃/分钟，维持在目标温度3小时。
仿生骨膜厚度为0.4-1.0mm，符合骨缺损CT扫描的范围和形状，覆盖于生物陶瓷支架上，例如针对胫骨节段性骨缺损，仿生骨膜可以实现完全包裹组织工程骨(图6)；针对颌骨部分骨缺损(非节段性，保留其余骨面)，仿生骨膜可以覆盖在组织工程骨表面(图7)，具有一定的约束固位力。本发明以数字化技术为基础制备个性化的仿生骨膜及含镁改性多孔生物陶瓷支架，该支架包含的镁离子相较于羟基磷灰石等材料具有更好的成骨能力；仿生骨膜的引入可提高目前单纯使用组织工程骨的修复能力，解决目前仿生骨膜研究中存在的无法融合天然骨膜结构与生物诱导能力、制备工艺复杂、缺乏适应性及可操作性等问题。
实施例
实施例1手术制作兔颌骨4mm×6mm×10mm缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为30μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以4*105/cm2的密度接种并培养骨髓间充质干细胞2周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入兔颌骨缺损区，仿生骨膜置于其表面。
实施例2手术制作兔颌骨4mm×6mm×10mm缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为30μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以5*105/cm2的密度接种并培养骨髓间充质干细胞1周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入兔颌骨缺损区，仿生骨膜置于其表面。
实施例3手术制作兔颌骨4mm×6mm×10mm缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为30μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以4*105/cm2的密度接种并培养脂肪间充质干细胞2周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入兔颌骨缺损区，仿生骨膜置于其表面。
实施例4手术制作兔颌骨4mm×6mm×10mm缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为30μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以5*105/cm2的密度接种并培养脂肪间充质干细胞1周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入兔颌骨缺损区，仿生骨膜置于其表面。
实施例5手术制作兔颌骨4mm×6mm×10mm缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为50μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以4*105/cm2的密度接种并培养骨髓间充质干细胞2周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入兔颌骨缺损区，仿生骨膜置于其表面。
实施例6手术制作兔颌骨4mm×6mm×10mm缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为50μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以5*105/cm2的密度接种并培养骨髓间充质干细胞1周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入兔颌骨缺损区，仿生骨膜置于其表面。
实施例7手术制作兔颌骨4mm×6mm×10mm缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为50μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以4*105/cm2的密度接种并培养脂肪间充质干细胞2周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入兔颌骨缺损区，仿生骨膜置于其表面。
实施例8手术制作兔颌骨4mm×6mm×10mm缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为50μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以5*105/cm2的密度接种并培养脂肪间充质干细胞1周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入兔颌骨缺损区，仿生骨膜置于其表面。
实施例9手术制作兔颌骨4mm×6mm×10mm缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过透明的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以5*105/cm2的密度接种并培养骨髓间充质干细胞1周，构建出非方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入兔颌骨缺损区，仿生骨膜置于其表面。
实施例10手术制作兔颌骨4mm×6mm×10mm缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过透明的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以4*105/cm2的密度接种并培养脂肪间充质干细胞2周，构建出非方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入股骨缺损区，仿生骨膜包裹支架。
实施例11手术制作大鼠股骨10mm截断骨缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为30μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以4*105/cm2的密度接种并培养骨髓间充质干细胞2周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入股骨缺损区，仿生骨膜包裹支架。
实施例12手术制作大鼠股骨10mm截断骨缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为30μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以5*105/cm2的密度接种并培养骨髓间充质干细胞1周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入股骨缺损区，仿生骨膜包裹支架。
实施例13手术制作大鼠股骨10mm截断骨缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为30μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以4*105/cm2的密度接种并培养脂肪间充质干细胞2周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入股骨缺损区，仿生骨膜包裹支架。
实施例14手术制作大鼠股骨10mm截断骨缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为30μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以5*105/cm2的密度接种并培养脂肪间充质干细胞1周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入股骨缺损区，仿生骨膜包裹支架。
实施例15手术制作大鼠股骨10mm截断骨缺损模型1，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为50μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以4*105/cm2的密度接种并培养骨髓间充质干细胞2周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入股骨缺损区，仿生骨膜包裹支架。
实施例16手术制作大鼠股骨10mm截断骨缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为50μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以5*105/cm2的密度接种并培养骨髓间充质干细胞1周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入股骨缺损区，仿生骨膜包裹支架。
实施例17手术制作大鼠股骨10mm截断骨缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为50μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以4*105/cm2的密度接种并培养脂肪间充质干细胞2周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入股骨缺损区，仿生骨膜包裹支架。
实施例18手术制作大鼠股骨10mm截断骨缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过宽度、间隙均为50μm的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以5*105/cm2的密度接种并培养脂肪间充质干细胞1周，构建出方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入股骨缺损区，仿生骨膜包裹支架。
实施例19手术制作大鼠股骨10mm截断骨缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过透明的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以5*105/cm2的密度接种并培养骨髓间充质干细胞1周，构建出非方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入股骨缺损区，仿生骨膜包裹支架。
实施例20手术制作大鼠股骨10mm截断骨缺损模型，CT扫描缺损区并引入mimics软件中生成.stl文件。使用紫外光经过透明的掩膜板照射二氧化钛基底板使其激活表面活性，以4*105/cm2的密度接种并培养脂肪间充质干细胞2周，构建出非方向性排列的细胞片；将stl文件导入B9Creator软件中，于反应池中编程控制光照时间照射水凝胶，并将细胞片脱附于水凝胶上，经生理盐水处理得到仿生骨膜。准备生物陶瓷墨水及3D打印设备，根据上述.stl文件确定缺损区所需支架三维结构，按预设程序打印：喷嘴直径为500微米，喷嘴的移动速度为8毫米/秒，相邻层之间的层厚为400μm，丝间距为1000μm。将获得的支架80℃干燥过夜，后以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃并保持3小时，获得组织工程骨支架。将支架置入股骨缺损区，仿生骨膜包裹支架。
Claims (8)
1.一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨，其特征在于，包括生物陶瓷支架、仿生骨膜，所述仿生骨膜设于所述生物陶瓷支架上；
所述仿生骨膜的制备包括以下步骤：
S1.二氧化钛纳米点基板旋涂形成薄膜；
其中，由钛酸四丁酯、乙酰丙酮、去离子水、乙醇和聚乙烯吡咯烷酮为原材料配制旋涂前驱液，利用不同密度液相成分在旋涂过程中相对流动自组装形成薄膜；将旋涂后薄膜基板放置于马弗炉中，以8℃每分钟的速率使样本从室温上升至700℃并保持1h；
S2.紫外光通过光掩膜板的透光区照射到二氧化钛纳米点基板上；
具体而言，是使用波长为254nm紫外光通过光掩膜板照射到二氧化钛纳米点基板上,宽度及间隔相等，30～50μ m ；
S3.基板上接种间充质干细胞，培养至汇合成定向膜片；
具体而言，基板上接种间充质干细胞是激活经UV照射材料表面的生物活性，使区域粘附性能增加；随后于基板上接种间充质干细胞，接种密度为每孔4*105/cm2～5*105/cm2，低糖DMEM培养基+10％FBS培养1-2周，培养至细胞呈成膜片；
S4.将基板放入反应池进行光处理投射；
具体而言，是用两个1毫米厚玻璃载玻片隔开1.5毫米厚硅橡胶垫片作为数字印刷反应池；印刷前体溶液由35wt％的甲基丙烯酸甲酯，15wt％的PEGDA，20wt％的3-磺酸丙基甲基丙烯酸钾盐和30wt％的蓝光引发剂溶液混合制成，避光保存；将基板放入反应池进行光处理投射后，将水凝胶与下面的基板分开，通过生理盐水处理后形成3D形状。
2.根据权利要求1所述的一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨，其特征在于，所述仿生骨膜厚度覆盖于所述生物陶瓷支架上。
3.根据权利要求1所述的一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨，其特征在于，所述仿生骨膜厚度为0.4-1.0mm。
4.根据权利要求1所述的一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨，其特征在于，所述仿生骨膜厚度为0.5mm。
5.根据权利要求1所述的一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨，其特征在于，非节段性骨缺损时，所述仿生骨膜覆盖在组织工程骨表面，具有一定的约束固位力。
6.根据权利要求1所述的一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨，其特征在于，节段性骨缺损时，所述仿生骨膜完全包裹组织工程骨。
7.根据权利要求1所述的一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨，其特征在于，所述生物陶瓷支架的制备包括以下步骤：
S5.将生物陶瓷粉末与6％聚乙烯醇溶液混合；
S6.制备外形符合缺损范围，具有内部方形孔状结构的支架，
S7.打印。
8.根据权利要求7所述的一种带仿生骨膜的含镁改性多孔生物陶瓷组织工程骨，其特征在于，打印完成后置于80℃下干燥过夜；在温度炉中以2℃/分钟的加热速率烧结至1150℃的目标温度，并保持3小时，然后自然冷却；所述生物陶瓷粉末是质量比为1.25:1的Ca90％Mg10％SiO3生物陶瓷粉末；所述生物陶瓷粉末需要在乙醇中研磨至粒径＜5μ m 。
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