CN113278193B - 藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113278193B CN113278193B CN202110741695.9A CN202110741695A CN113278193B CN 113278193 B CN113278193 B CN 113278193B CN 202110741695 A CN202110741695 A CN 202110741695A CN 113278193 B CN113278193 B CN 113278193B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- casein
- phycocyanin
- starch
- microgel
- porous starch
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000005018 casein Substances 0.000 title claims abstract description 120
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 title claims abstract description 103
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 title claims abstract description 103
- 239000008107 starch Substances 0.000 title claims abstract description 103
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 72
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims abstract description 72
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 12
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 11
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 claims description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 claims description 3
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 claims description 3
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 claims description 3
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 14
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 63
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 63
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 37
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 4
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000001157 Fourier transform infrared spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 231100000215 acute (single dose) toxicity testing Toxicity 0.000 description 2
- 238000011047 acute toxicity test Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000001055 blue pigment Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J9/00—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof
- C08J9/36—After-treatment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0045—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent agent being a peptide or protein used for imaging or diagnosis in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
- A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
- A61K49/0073—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form semi-solid, gel, hydrogel, ointment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2303/00—Characterised by the use of starch, amylose or amylopectin or of their derivatives or degradation products
- C08J2303/02—Starch; Degradation products thereof, e.g. dextrin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2489/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明属于材料和荧光成像技术领域，涉及一种藻蓝蛋白‑酪蛋白/多孔淀粉微凝胶及其制备方法和应用；1)制备酪蛋白/多孔淀粉微凝胶；2)在避光条件下，将藻蓝蛋白粉末溶解于酪蛋白/多孔淀粉微凝胶中，搅拌均匀，得到产物藻蓝蛋白‑酪蛋白/多孔淀粉微凝胶；产物中藻蓝蛋白的浓度为0.40～0.60mg/mL；溶解温度20～25℃；搅拌时间1～2h。本发明采用多孔淀粉和酪蛋白作为原料，制备得到微凝胶，进一步在微凝胶上负载藻蓝蛋白，合成原理和过程简单，具有负载率高、缓释效果优良、荧光性能好、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于材料和荧光成像技术领域，涉及一种藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
荧光蛋白—藻蓝蛋白(PC)是FDA在美国批准的唯一天然蓝色颜料。在欧盟，藻蓝蛋白已被列为有色食品原料，在食品中的使用没有含量限制。然而，由于藻蓝蛋白的稳定性较差，该蛋白质在高温环境下易于失活和降解，在食品中使用时容易褪色，这使得PC的价值无法得到充分利用。
微凝胶是一种内部交联的微观三维网络，由分散在合适溶剂中的交联聚合物分子组成。它们可以均匀地分散在溶剂中并溶胀。因此，它被广泛用作药物、营养、代谢产物和基因传递，可以显著改善药代动力学特性和靶向药物的生物分布。
通常，对于微凝胶在生物医学，组织工程和食品结构中的许多应用，生物降解性和生物相容性是非常重要的问题。因此，与传统化学材料相比，由天然大分子制备的微凝胶具有显著优势。另外，微凝胶与负载的生物活性物质之间的相互作用较弱，因此可以长时间维持药物的生物活性。然而，这些生物大分子载体仍然存在诸如低负载等问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶及其制备方法和应用，采用多孔淀粉和酪蛋白作为原料，制备得到微凝胶基体，在基体上负载藻蓝蛋白，得到高负载率且可用于荧光成像的微凝胶；本发明合成原理和过程简单，具有负载率高、缓释效果优良、荧光性能好、成本低等优点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的制备方法包括以下步骤：
1)制备酪蛋白/多孔淀粉微凝胶，备用；
2)在避光条件下，将藻蓝蛋白粉末溶解于酪蛋白/多孔淀粉微凝胶中，搅拌均匀，得到产物藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶。
进一步的，所述步骤2)，产物中藻蓝蛋白浓度为0.40～0.60mg/mL；溶解温度20～25℃；搅拌时间1～2h。
进一步的，所述步骤1)中酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的制备过程是：
1.1)将淀粉溶于水形成淀粉悬浮液；
1.2)向淀粉悬浮液中加入复合酶，再加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH为5.8～6.0，经复合酶水解反应、分离后，将得到的沉淀物经洗涤、干燥、破碎和筛分，得到多孔淀粉；
1.3)将上述得到的多孔淀粉与酪蛋白混合，调节pH为6.8～7.2，经加热、均质，得到酪蛋白/多孔淀粉微凝胶。
进一步的，所述步骤1.2)中，淀粉悬浮液与复合酶液的体积比为9～11:1～2；所述淀粉悬浮液浓度为8～12mg/mL；所述复合酶液的酶活力比为糖化酶：α-淀粉酶＝3000:2000～2400IU/mL；水解温度55～60℃；水解时间10～14h。
进一步的，所述淀粉为糯米淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉或马铃薯淀粉。
进一步的，所述步骤1.3)中，多孔淀粉与酪蛋白的质量比为6:3～6:5；加热温度25～35℃，加热时间10～15min；均质压力为80～100MPa。
一种藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的制备方法所制备的藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶。
一种藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶在荧光成像中的应用。
进一步的，所述藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶中藻蓝蛋白浓度为0.40～0.60mg/mL。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用酪蛋白和多孔淀粉两种大分子成分，制备得到酪蛋白/多孔淀粉微凝胶，进一步负载藻蓝蛋白得到产物藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶，合成工艺简单，成本低，易于推广，且制备的产物，缓释效果优良、荧光性能好。
2、本发明将淀粉在复合酶催化作用下水解形成多孔淀粉，然后多孔淀粉与酪蛋白混合，利用大分子间的静电相互作用力，得到酪蛋白/多孔淀粉微凝胶，由于水解后的多孔淀粉具有三维蜂窝状多孔结构，充分利用多孔淀粉的比表面积特性即其优异的吸附性能，用于功能性成分的递送，提高藻蓝蛋白的负载率。
附图说明
图1为藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶合成和应用模型图；
图2为原料糯米淀粉、多孔淀粉、酪蛋白、均质的酪蛋白以及酪蛋白/多孔淀粉微凝胶在不同放大倍数下的SEM；
图3为多孔淀粉和酪蛋白反应过程反应机理示意图；
图4A合成过程中微凝胶圆二色光谱的变化；
图4B不同pH值对微凝胶圆二色光谱的影响；
图4C微凝胶在合成过程中傅里叶变换红外光谱的变化；
图4D不同pH值对微凝胶红外光谱的影响。
图5A为是藻蓝蛋白负载前后酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的荧光强度的变化；
图5B为不同淀粉原料制成的PC-casein/PS MGs的体外缓释曲线比较；
图5C为casein/PS MGs和PC-casein/PS MGs对斑马鱼的急性毒性试验；
图5D为不同Cu2+浓度的藻蓝蛋白溶液的荧光强度；
图6为casein/PS MGs、藻蓝蛋白、PC-casein/PS MGs、含Cu2+的PC-casein/PS MGs在不同明场下和荧光场下对斑马鱼体内荧光成像结果图。
具体实施方式
现结合附图以及实施例对本发明做详细的说明。
参见图1，本发明提供的藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶，利用复合酶水解制备得到的多孔淀粉，与酪蛋白在适当条件下通过静电相互作用结合，得到高负载率的酪蛋白/多孔淀粉微凝胶(简称casein/PS MGs)；然后在避光条件下将藻蓝蛋白PC溶解在制备的酪蛋白/多孔淀粉微凝胶中，并在室温下得到藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶(简称PC-casein/PS MGs)。本发明提供的制备过程简单、条件温和；原料易得、成本低，易于推广实现。
以具体的实施例对本发明提供的制备方法进行说明。
实施例1
本实施例提供的藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶PC-casein/PS MGs的制备过程包括以下步骤：
1)制备酪蛋白/多孔淀粉微凝胶
1.1)多孔淀粉的制备
将糯米淀粉与水混合，得到浓度10mg/mL的淀粉悬浮液；
1.2)向浓度10mg/mL的10mL淀粉悬浮液中加入1.5mL酶活力比为(糖化酶：α-淀粉酶＝3000:2000IU/mL的复合酶液，水解温度60℃、水解时间12h，同时加入缓冲液(柠檬酸-柠檬酸钠)调节pH 6.0，最终制得水解率为40％的糯米多孔淀粉混合液，得到沉淀物；将沉淀物用蒸馏水充分洗涤，在40℃下真空干燥，压碎并筛分，得到多孔淀粉；
本实施例中，通过缓冲液(柠檬酸-柠檬酸钠)调节pH至复合酶水解所需的适当pH；
1.3)酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的制备
按照质量比6:4分别称取多孔淀粉和酪蛋白，并均配制成浓度为0.5mg/mL的溶液；并将溶液混合后，调节混合溶液的pH为7.0，并于30℃下水浴加热15min，100MPa下高压均质3次，即可得到乳白色体系均一的酪蛋白/多孔淀粉微凝胶，简称casein/PS MGs；
2)藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的制备
将粉末状的藻蓝蛋白PC溶于步骤2)制备好的casein/PS MGs中，在室温(温度25℃)避光、搅拌1h，得到产物藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶；本实施例中，PC与casein/PS MGs的质量体积比要保证最终得到的产物中PC终浓度为0.5mg/mL。
实施例2～实施例6
实施例2～实施例6提供的制备方法与实施例1相同，不同的是各个步骤中的反应条件参数不同，具体参见表1。
表1实施例2～实施例6各反应条件参数
以上是本发明的几组实施例，本发明的原材料也可用下述进行替换。
本发明提供的实施例1～实施例6中，淀粉还可用甘薯淀粉，玉米淀粉或马铃薯淀粉替换；淀粉悬浮液与复合酶液的体积比为9～11:1～2内的任意值；淀粉悬浮液浓度为8～12mg/mL之间；复合酶液的酶活力比为糖化酶：α-淀粉酶＝3000:2000～2400IU/mL之间；水解温度55～60℃之间；水解时间10～14h之间。多孔淀粉与酪蛋白的质量比在6:3～6:5之间；加热温度在25～35℃范围内，加热时间在10～15min之间；均质压力为80～100MPa之间。在此条件下，均能合成得到PC-casein/PS MGs。
进一步的，为了说明本发明制备的PC-casein/PS MGs的特征和性能优越性，进行表征试验。
试验1原料的SEM
选取原料糯米淀粉、多孔淀粉、酪蛋白、均质的酪蛋白以及实施例1制备的酪蛋白/多孔淀粉微凝胶，采用环境扫描电子显微镜(Quanta 200，FEI公司)，检测条件：喷金处理后高真空模式下进行形貌表征，得到各原料不同放大倍数下的SEM图谱，结果如图2所示。
其中：图2A为糯米淀粉在5μm下的SEM图谱；图2B为糯米淀粉在1μm下的SEM图谱；图2C为多孔淀粉在1μm下的SEM图谱；图2D为酪蛋白在15μm下的SEM图谱；图2E为均质的酪蛋白在5μm下的SEM图谱；图2F为酪蛋白/多孔淀粉在5μm下的SEM图谱。
从图2的各个图谱中，可以看出，通过复合酶解成功得到蜂窝状的多孔结构，均质使得酪蛋白的粒度减小，且凝胶中淀粉受到高速剪切和挤压后变成棒状结构且表面变光滑，对本发明最终材料的高吸附性能具有明显的提升效果。
试验2
通过对去稳定剂、反应温度、质量比以及不同pH的考察，对多孔淀粉和酪蛋白之间作用机理进行验证。
(1)稳定剂
试验过程是在添加不同的化学试剂情况下，通过测定凝胶粒径及浊度的变化探索PS和casein间的结合作用力。分别在NGs中加入如下试剂：0.05mol/L NaCl、0.05mol/LUrea、0.5％SDS(0.05mol/L NaCl可屏蔽体系静电相互作用力；0.05mol/L Urea可破坏多糖蛋白等高分子之间的氢键相互作用，是一种氢键开裂剂；0.5％SDS可破坏高分子间的疏水相互作用)，磁力搅拌30min后静止，测定体系粒径、PDI以及浊度变化；试验结果如图3A和图3B所示。图3A为去稳定剂对微凝胶粒径和PDI的影响，图3B为去稳定剂对微凝胶浊度影响。
从图3A和图3B得到：酪蛋白-PS微凝胶的形成主要依赖于分子间的静电相互作用和疏水相互作用，其中静电相互作用起主导作用。
(2)反应温度和摩尔比
试验组1：步骤1.2)的温度30℃；同时多孔淀粉与酪蛋白的质量比为0:1、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1；
试验组2：步骤1.2)的温度50℃；同时多孔淀粉与酪蛋白的质量比为0:1、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1；
试验过程是：试验组和对照组的得到的酪蛋白/多孔淀粉微凝胶(casein/PSMGs)，采用荧光分光光度计(F-7000，日本日立公司)，激发波长为280nm，狭缝宽度均为10nm，光谱条件下得到扫描范围：300～450nm对应的荧光光谱，如图3C(试验组，温度30℃)和图3D(对比组，温度50℃)所示。
从图3C和图3D得到结论：PS与酪蛋白相互作用过程是自发的，且是放热和熵驱动的过程，静电相互作用是主要的结合作用力。此外，表明也存在一定的疏水相互作用。
在图3C和图3D上分别选取激发波长在280nm时，不同质量分数对应的荧光强度变化值，然后得到双对数图，如图3E所示。双对数是摩尔浓度和荧光强度变化值(F0-F/F)做对数得到的，其中F0为多孔淀粉与酪蛋白的质量比是0:1时得到的荧光强度；F为加入不同浓度的淀粉后酪蛋白的荧光强度。
从图3E得到结论：多孔淀粉与酪蛋白在30℃和50℃的结合位点分别接近1.469和1.584。表明实验浓度下多孔淀粉与酪蛋白的比例约为(6:4，m/m)，且受温度影响较小。并且PS-酪蛋白相互作用常数的Ka为106L/mol，远大于104L/mol，说明casein/PS MGs之间存在很强的结合力，有力证明本发明最终材料的易于结合和微凝胶合成工艺简单易行。
(4)圆二色谱和红外表征
1)试验过程：对酪蛋白、均质的酪蛋白和实施例1得到的酪蛋白/多孔淀粉微凝胶，采用圆二色光谱仪(Chirascan，英国应用光物理公司)，检测条件：扫描速度50nm/min，狭缝宽度1nm，响应时间1s，扫描3次，分辨率为0.1nm，1mm石英样品池，记录190～260nm范围内酪蛋白CD图谱，参见图4A；
再采用傅里叶红外光谱仪(Tensor27，德国布鲁克)，检测条件：以空气为背景，扫描范围为2000-1000cm-1，分辨率4cm-1，分别得到傅里叶变换红外光谱的变化，参见图4C；
2)试验过程：酪蛋白与多孔淀粉在混合时，调节pH分别为4.0、7.0、10.0，其余与实施例1的反应条件参数相同，分别得到3组酪蛋白/多孔淀粉微凝胶；采用圆二色光谱仪(Chirascan，英国应用光物理公司)，检测条件：扫描速度50nm/min，狭缝宽度1nm，响应时间1s，扫描3次，分辨率为0.1nm，1mm石英样品池，记录190～260nm范围内酪蛋白CD图谱，得到3组微凝胶的圆二色光谱的变化趋势，参见图4B；
调节pH分别为4.0、7.0、10.0，其余与实施例1的反应条件参数相同，分别得到3组酪蛋白/多孔淀粉微凝胶。再采用傅里叶红外光谱仪(Tensor27，德国布鲁克)，检测条件：以空气为背景，扫描范围为2000-1000cm-1，分辨率4cm-1，分别得到傅里叶变换红外光谱的变化，参见图4D。
从图4A～4D得到的结论是：均质化使酪蛋白分子更有序、更紧密，酪蛋白分子更稳定；多孔淀粉的加入对酪蛋白的球形结构有一定的保护作用，提高了其结构稳定性和有序性；此外，当调节pH为7.0时，与pH 4.0、10.0相比，α-螺旋含量大大增加，无规卷曲含量大大降低，体系更加有序和稳定。
试验3
(1)藻蓝蛋白PC、casein-PS MGs以及PC-casein/PS MGs的荧光变化
分别对藻蓝蛋白PC、实施例1制备的casein-PS MGs以及实施例1制备的PC-casein/PS MGs，分别采用荧光分光光度计(F-7000，日本日立公司)，激发波长为600nm，狭缝宽度均为10nm光谱条件下得到扫描范围：620～800nm对应的荧光光谱，结果参见图5A；
从图5A得到结论：PC的负载与否并未使其荧光性能有明显损失，由此说明负载是可行的且理想的。
(2)体外缓释曲线
试验组1：实施例1制备得到的藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶；
试验组2：与试验组不同的是，直接采用糯米淀粉作为原料，选择与实施例1相同的反应条件参数，得到藻蓝蛋白-酪蛋白/糯米淀粉微凝胶；
试验组3：游离的藻蓝蛋白
对上述三组物质，具体过程：PC-MGs在超滤离心管中以4000r/min的速度离心30min，截留分子量为10KDa(游离PC可以通过超滤离心管的膜，而装载PC的MGs不能通过超滤膜。)然后在荧光分光光度计(F-7000，日本日立公司)下测定藻蓝蛋白在650nm处的荧光强度，计算得到0～50h内的缓释曲线，结果参见图5B所示。
从图5B得到结论：游离PC溶液在透析袋中始终保持突释状态，释放曲线明显陡峭短促。PC-casein/糯米淀粉MGs和PC-casein/PS MGs，由于MGs对PC的包埋作用，PC的释放过程相对缓慢，具有明显的缓释特性，证明本发明最终材料的包埋缓释性能特点。
(3)急性毒性试验
对照组：曝光三天的自来水；
试验组1：藻蓝蛋白PC；
试验组2：实施例1得到的casein/PS MGs
试验组3：实施例1得到的PC-casein/PS MGs
具体试验过程是：分别采用上述几组物质作为试样液，试样液0.5mg/mL，体积2000mL，并在每个试样液中投放10只斑马鱼，每24小时更换一次新的试样液，观察72h内不同时间下斑马鱼的死亡率，结果如图5C所示。
从图5C得到结论：与游离PC相比，负载PC的缓释特性成功使其72h急性毒性降低了50％，证明负载行为能够成功减低PC的毒性。
(4)Cu2+浓度对PC-casein/PS MGs的荧光强度影响
试验过程：准备7份浓度均为0.5mg/mL的藻蓝蛋白溶液10mL，分别7份溶液中对应加入浓度为0μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、20μM的Cu2+溶液，然后分别采用荧光分光光度计(F-7000，日本日立公司)，激发波长为600nm，狭缝宽度均为10nm光谱条件下得到扫描范围：620～800nm对应的荧光光谱，得到对应的7份溶液的荧光光谱，结果参见图5D；
从图5D得到结论：当用2μM和10μM的Cu2+处理时荧光强度变化尤其明显，因此本试验采用2μM和10μM的Cu2+进行荧光抑制实验。
试验4荧光成像
试验组1：实施例1制备的casein/PS MGs
试验组2：藻蓝蛋白PC
试验组3：实施例1得到的PC-casein/PS MGs
试验组4：具有2μMCu2+的PC-casein/PS MGs
试验组5：具有10μMCu2+的PC-casein/PS MGs
试验过程是：
分别采用上述试验组的物质作为试样液，试样液浓度0.5mg/mL、体积100mL，在每个试样液中投放1只斑马鱼，培养12h后，在明场下、荧光场下观察斑马鱼头部和斑马鱼尾部的激光共聚焦显微镜照片，所有比例尺均为300μm，激发波长：559nm。结果参见图6。
图6中，A表示试验组1，B表示试验组2，C表示试验组3，D表示试验组4，E表示试验组5；(A1～E1)表示5个试验组在明场下的斑马鱼头的显微镜照片；(A2～E2)表示5个试验组在荧光场下的斑马鱼头的显微镜照片，(A3～E3)表示5个试验组在明场下的斑马鱼尾的显微镜照片，(A4～E4)表示5个试验组在荧光场下的斑马鱼尾的显微镜照片。
通过图6可以明显看出本发明制备的PC-casein/PS MGs具备荧光性能，体现了其优良的优良成像效果，具有可应用性。
Claims (7)
1.一种藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
1）制备酪蛋白/多孔淀粉微凝胶，备用；
2）在避光条件下，将藻蓝蛋白粉末溶解于酪蛋白/多孔淀粉微凝胶中，搅拌均匀，得到产物藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶；
所述步骤1）中酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的制备过程是：
1.1）将淀粉溶于水形成淀粉悬浮液；
1.2）向淀粉悬浮液中加入复合酶液，再加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH为5.8~6.0，经复合酶水解反应、分离后，将得到的沉淀物经洗涤、干燥、破碎和筛分，得到多孔淀粉；
1.3）将上述得到的多孔淀粉与酪蛋白混合，调节pH为6.8~7.2，经加热、均质，得到酪蛋白/多孔淀粉微凝胶；
所述步骤1.2）中，所述复合酶液的酶活力比为糖化酶：α-淀粉酶=3000:2000~2400 IU/mL；水解温度55~60℃；水解时间10~14h；
所述步骤2），产物中藻蓝蛋白浓度为0.40~0.60 mg/mL；溶解温度20~25℃；搅拌时间1~2h。
2.根据权利要求1所述的藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤1.2）中，淀粉悬浮液与复合酶液的体积比为9~11:1~2；所述淀粉悬浮液浓度为8~12mg/mL。
3.根据权利要求2所述的藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的制备方法，其特征在于：所述淀粉为糯米淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉或马铃薯淀粉。
4.根据权利要求3所述的藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤1.3）中，多孔淀粉与酪蛋白的质量比为6:3~6:5；加热温度25~35℃，加热时间10~15min；均质压力为80~100MPa。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶的制备方法所制备的藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶。
6.一种如权利要求5所述的藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶在荧光成像中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶中藻蓝蛋白浓度为0.40~0.60 mg/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110741695.9A CN113278193B (zh) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110741695.9A CN113278193B (zh) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113278193A CN113278193A (zh) | 2021-08-20 |
| CN113278193B true CN113278193B (zh) | 2022-07-01 |
Family
ID=77286289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110741695.9A Active CN113278193B (zh) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113278193B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102640933A (zh) * | 2012-04-17 | 2012-08-22 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种藻蓝蛋白微胶囊及其制备方法 |
| CN112190697A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-01-08 | 暨南大学 | 一种高负载藻蓝蛋白的纳米颗粒及其制备方法与应用 |
-
2021
- 2021-06-30 CN CN202110741695.9A patent/CN113278193B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102640933A (zh) * | 2012-04-17 | 2012-08-22 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种藻蓝蛋白微胶囊及其制备方法 |
| CN112190697A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-01-08 | 暨南大学 | 一种高负载藻蓝蛋白的纳米颗粒及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Fluorescent and magnetic dual-responsive coreshell imprinting microspheres strategy for recognition and detection of phycocyanin;Zhang, Zhong et.al.;《Royal Society of Chemistry》;20141231;第4卷(第40期);第20677-20685页 * |
| Phycocyanin/PEG-b-(PG-g-PEI) attenuated hepatic ischemia/reperfusion-induced pancreatic islet injury and enlarged islet functionality;Tong, F et.al.;《INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE》;20191231;第14卷;第339-351页 * |
| 空气悬浮包衣法制备藻蓝蛋白微胶囊;吕晓玲等;《食品科技》;20131231;第38卷(第2期);第260-263页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113278193A (zh) | 2021-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kafshgari et al. | Preparation of alginate and chitosan nanoparticles using a new reverse micellar system | |
| Xu et al. | Formation of egg yolk-modified starch complex and its stabilization effect on high internal phase emulsions | |
| CN110051006B (zh) | 玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶复合纳米颗粒及其制备方法 | |
| Liu et al. | Effects of ultrasonication on the properties of maize starch/stearic acid/sodium carboxymethyl cellulose composite film | |
| CN110897161A (zh) | 一种高荷载姜黄素的大豆多肽基纳米颗粒及其pH驱动制备方法与应用 | |
| Wang et al. | Facile preparation of zein nanoparticles with tunable surface hydrophobicity and excellent colloidal stability | |
| CN109081927B (zh) | 一种水凝胶的制备方法 | |
| Jing et al. | Formation and stability of Pickering emulsion gels by insoluble soy peptide aggregates through hydrophobic modification | |
| Yan et al. | Development of corn fiber gum–soybean protein isolate double network hydrogels through synergistic gelation | |
| Xu et al. | Formation, stability and the application of Pickering emulsions stabilized with OSA starch/chitosan complexes | |
| He et al. | Enhanced gelling properties and hydration capacity of ginkgo seed proteins by genipin cross-linking | |
| Songsurang et al. | Mucoadhesive drug carrier based on functional-modified cellulose as poorly water-soluble drug delivery system | |
| Khodaverdi et al. | Casein-based hydrogel carrying insulin: preparation, in vitro evaluation and in vivo assessment | |
| Martins et al. | Dry Bacterial Cellulose and Carboxymethyl Cellulose formulations with interfacial-active performance: processing conditions and redispersion | |
| Zhang et al. | Effect of ionic strength and mixing ratio on complex coacervation of soy protein isolate/Flammulina velutipes polysaccharide | |
| Xu et al. | Soy protein isolate-citrus pectin-gallic acid ternary composite high internal phase Pickering emulsion for delivery of β-carotene: Physicochemical, structural and digestive properties | |
| Wang et al. | Development and characterization of a casein-hyaluronic acid emulsion gel with high water-holding capacity and excellent rheological properties for 3D printing | |
| Li et al. | Controlled ibuprofen release from Pickering emulsions stabilized by pH-responsive cellulose-based nanofibrils | |
| Wang et al. | Ultra-stable pickering emulsions stabilized by zein-cellulose conjugate particles with tunable interfacial affinity | |
| Hu et al. | Load phycocyanin to achieve in vivo imaging of casein-porous starch microgels induced by ultra-high-pressure homogenization | |
| Li et al. | OSA-linear dextrin enhances the compactness of pea protein isolate nanoparticles: increase of high internal phase emulsions stability | |
| Zhu et al. | Physicochemical and functional properties of a novel xanthan gum-lysozyme nanoparticle material prepared by high pressure homogenization | |
| Cheng et al. | pH-induced complex coacervation of fish gelatin and carboxylated chitosan: Phase behavior and structural properties | |
| CN113278193B (zh) | 藻蓝蛋白-酪蛋白/多孔淀粉微凝胶及其制备方法和应用 | |
| Chen et al. | Regulate the interfacial characteristic of emulsions by casein/butyrylated dextrin nanoparticles and chitosan based on ultrasound-assisted homogenization: Fabrication and characterization |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |