CN113249520A - 用于定量检测乙肝病毒dna的探针、荧光传感器及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于定量检测乙肝病毒DNA的探针、荧光传感器及方法。所述荧光传感器包括第一条探针增强序列G‑rich与第二条探针DNA银纳米簇序列AgNCs‑HBV，将G‑rich和AgNCs‑HBV溶解于缓冲液中，加入待测靶物质，混合孵育，构建得到荧光反应体系，再进行荧光检测，即可获得荧光信号。本发明的荧光传感器是基于银纳米簇信标实现对HBV的高灵敏检测，通过邻位增强序列G‑rich调谐DNA银纳米簇序列AgNCs‑HBV荧光，能提升检测速度，且合成成本低廉，可克服传统PCR法检测HBV对场地和人员要求的限制，通用性、稳定性、重现性好，适合在社区或医院进行乙肝HBV大规模筛查或定量检测。

Description

用于定量检测乙肝病毒DNA的探针、荧光传感器及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于定量检测乙肝病毒DNA的探针、荧光传感器及方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是一种重要的人类传染性病原体，已经在全世界引起了公众关注的严重健康问题。这种病毒危害极大而且通过血液和体液广泛传播。乙型肝炎病毒感染可以导致肝脏相关疾病，如慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。通常，血清中HBV DNA的浓度水平被认为是评估慢性乙型肝炎的治疗效果的重要指标。因此，准确地定量检测血清HBV DNA对感染诊断有重要意义。
目前临床上最常用的HBV基因检测方法是定量聚合酶链式反应(quantitativetranscripase polymerase chain reaction，qPCR)和分子信标(molecular beacon，MB)技术。qPCR具有超高的灵敏度，但即使是训练有素的操作人员也难以避免各种情况造成的假阳性，而且昂贵的试剂和专业的PCR实验室建设更是进一步限制了该技术在基层单位的应用。MB技术是利用DNA聚合形成的发夹型探针(hairpin)达到检测目的。Hairpin探针的环(loop)上面具有和靶分子互补的核酸序列，茎(stem)部分具有自身互补的部分，在自由状态下，荧光分子和猝灭基团受stem的牵引相互靠近，此时荧光被猝灭(turn-off状态)。当存在乙肝病毒DNA的时候，靶序列和loop结合，借由stem部分延长后打开stem，此时MB分子变成长链的状态，此时荧光分子和猝灭基团的距离变长，荧光信号恢复，通过信号变化的强弱达到检测HBV DNA的目的(turn-on状态)。MB技术具有灵敏度高，特异性好的优点，但其设计受到DNA长度的限制，hairpin打开后30-nt的猝灭有效距离使得turn-on的发生需要对探针中荧光分子和猝灭分子的距离进行严格的设计。
基于上述情况，开发一种操作更加简便、成本更低的超敏快速HBV DNA检测方法具有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于定量检测乙肝病毒DNA的探针、荧光传感器及方法，用于解决现有技术中HBV DNA检测方法操作繁琐、成本高、稳定性不佳等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供用于定量检测乙肝病毒DNA的探针，包括第一条探针和第二条探针，所述第一条探针为增强序列G-rich，所述G-rich的核苷酸序列3’端具有18-nt富鸟嘌呤增强序列，5’端具有10-nt的HBV病毒的识别域，中间部分具有2-nt至10-nt的茎结构；所述第二条探针为DNA银纳米簇序列AgNCs-HBV，所述AgNCs-HBV的核苷酸序列5’端具有12-nt的银纳米簇模板序列，用于合成DNA银纳米簇，3’端具有10-nt的HBV病毒的识别域，中间部分具有2-nt至10-nt的茎结构，与第一条探针的茎结构互补；所述G-rich在已有HBV存在时能够拉近AgNCs-HBV和G-rich的距离，触发荧光增强反应。
进一步，所述G-rich、AgNCs-HBV的核苷酸序列中间部分具有4-nt至6-nt的茎结构。
进一步，所述G-rich、AgNCs-HBV的核苷酸序列中间部分具有5-nt的茎结构。
进一步，所述第一条探针G-rich的核苷酸序列为：
5′-TCCATATAACTTCGCATGGGTGGGGTGGGGTGGGG-3′(SEQ ID NO.1)。
进一步，所述第二条探针AgNCs-HBV的核苷酸序列为：
5′-CCTCCTTCCTCCATGCGTTTGAAAGCCAA-3′(SEQ ID NO.2)。
本发明第二方面提供一种定量检测乙肝病毒DNA的荧光传感器，含有第一方面所述的探针。
本发明第三方面提供一种如第二方面所述的荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：将第一条探针增强序列G-rich与第二条探针DNA银纳米簇序列AgNCs-HBV溶解于缓冲液中，加入待测靶物质，形成混合液，孵育，进行反应，构建得到荧光反应体系。
进一步，所述靶物质为靶序列HBV，靶序列HBV的核苷酸序列为：
5′-TTGGCTTTCAGTTATATGGA-3′(SEQ ID NO.3)。
进一步，所述混合液中靶物质的终浓度≥9pM。
进一步，所述G-rich与AgNCs-HBV的摩尔比为1∶1。
进一步，所述缓冲液选自PBS缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液的至少一种。
进一步，所述荧光反应体系的PH为6.2～7.6，优选为6.6～7.6，更6.8～7.2，最优选为7.0。
进一步，所述孵育反应温度为25～50℃，优选为32～48℃，更优选为35～42℃，最优选为37℃；孵育时间为20～55min，优选为30～50min，更优选为35～45min，最优选为40min。
进一步，所述第二条探针DNA银纳米簇序列AgNCs-HBV的合成方法为：
(a)将DNA模板溶解于缓冲液中，加入AgNO3或醋酸银溶液，混合孵育；
(b)再加入还原剂NaBH4溶液或抗坏血酸溶液，孵育，得到AgNCs-HBV。
可选地，所述步骤(a)中，所述DNA模板的核苷酸序列为5′-CCTCCTTCCTCC-3′(SEQID NO.4)。
可选地，所述步骤(a)、(b)中，DNA模板、Ag+、还原剂的摩尔比为1∶(6～36)∶(6～36)，优选为1∶6∶6、1∶9∶9、1∶12∶12、1∶18∶18、1∶18∶36、1∶36∶36，更优选为1∶9∶9。
可选地，所述步骤(a)、(b)中，孵育均在避光条件下进行，孵育温度为-4～12℃，优选为0～12℃，更优选为2～8℃，最优选为4℃。
可选地，所述步骤(a)中，孵育时间为1～3h，优选为2h。
可选地，所述步骤(b)中，孵育时间为8～12h。
可选地，所述步骤(a)中，缓冲液选自PBS缓冲液、柠檬酸钠溶液、醋酸-醋酸铵溶液的至少一种。
可选地，所述步骤(a)中，所述缓冲液的PH为6.2～7.6，优选为6.6～7.6，更6.8～7.2，最优选为7.0。
本发明第四方面提供一种一步定量检测乙肝病毒DNA的荧光检测方法，采用第一方面所述的探针和/或第二方面所述的荧光传感器和/或第三方面所述的方法制备得到的荧光传感器。
进一步，所述荧光检测方法包括以下步骤：
(1)石英比色皿清洗：将石英比色皿用酒精浸泡，并用ddH2O清洗；
(2)设置参数：设置激发波长为595nm，发射波长范围为605～750nm，电压为700V；
(3)调零：向石英比色皿中加入ddH2O，进行调零；
(4)进行检测：将反应液加入荧光比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。
如上所述，本发明的用于定量检测乙肝病毒DNA的探针、荧光传感器及方法，具有以下有益效果：
本发明首次利用纳米簇信标技术(NCB)应用于乙型肝炎病毒HBV的检测。本发明的荧光传感器是基于银纳米簇信标实现对HBV的高灵敏检测，通过邻位增强序列G-rich调谐DNA银纳米簇序列AgNCs-HBV荧光，提升了检测速度，且合成成本低廉，克服了传统PCR法检测HBV对场地和人员要求的限制，扩展了检测通用性，适合在社区或医院进行乙肝HBV大规模筛查或定量检测。
与现有技术相比，本发明的荧光传感器的制备方法及HBV DNA检测方法更加简便、成本更低、检测速度更快，有效防止非特异性反应的发生，且稳定性、重现性良好，有望在HBV的检测分析及应用研究方面推广使用。
附图说明
图1显示为本发明所述方法的检测原理图。
图2显示为本发明实施例2中验证可行性所得的荧光信号对比图和电泳图(插入图)。
图3为本发明实施例3中由不同长度茎结构构建的荧光传感器的信噪比结果图。
图4为本发明实施例3中由不同反应温度(A)、反应时间(B)、反应比例(C)、PH(D)条件下构建的荧光传感器的信噪比结果图。
图5显示为实施例4中荧光传感器的灵敏度(A)、线性分析(B)结果图。
图6显示为实施例5中荧光传感器的特异性检测结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本方案创新地提出了一种利用银纳米簇标记技术在均相中检测HBV DNA的生物传感器，通过利用邻位增强序列G-rich以及DNA银纳米簇序列AgNCs-HBV组成的双探针实现一步法检测HBV基因。本发明的技术方案主要具有以下几点优势：(1)相比复杂难上手的传统qPCR，NCB法能够实现检验一步完成；(2)反应条件温和(37℃)，快速(40min)，适用于多种应用场景；(3)无酶技术，具有经济学效应。
纳米簇信标技术(NanoCluster Beacon，NCB)在生物传感和细胞成像方面应用较为广泛，其基本原理是以DNA为模板合成的银纳米团簇(DNA-AgNCs)与增强序列——富鸟嘌呤增强子(guanine-rich，G-rich)相互靠近时会产生荧光增强现象。DNA-AgNCs具有易于合成，发光稳定，发射波长可调谐的优势，非常适合构建纳米传感器。在本发明中，当靶物质进入均相体系中时，G-rich，DNA-AgNCs和靶标形成三链结点(three way junction，3-WJ)结构，进而使得G-rich和DNA-AgNCs两者的距离靠近，G-rich序列大幅度增强DNA-AgNCs荧光产生强大的输出信号，而当靶物质不存在时，G-rich和DNA-AgNCs以单链形式存在在溶液中，不会产生“点亮”现象。在乙肝病毒检测方面，对比传统的分子信标(molecular beacon，MB)技术，NCB技术直接将银纳米簇修饰在DNA上，通过G-rich探针的还原能力直接大幅度增强荧光，不受猝灭距离限制；除此之外，银纳米簇探针和G-rich探针直接与靶分子结合免去了打开hairpin的过程，使得反应更加迅速；研究表明，通过NCB技术达到的信噪比是MB技术的5倍。对比传统的qPCR方法，NCB技术直接将银纳米簇合成在DNA序列多个胞嘧啶碱基存在的区域，无需昂贵的酶循环放大和荧光基团标记，极大地简化了检测过程。目前，NCB技术尚未应用于临床检测，直接利用NCB技术针对乙肝病毒的DNA核酸检验方法也尚未有相关的报道。
本发明的具体实施过程如下：
实施例1
制备荧光传感器并检测DNA
1.材料与方法
1.1材料
HPLC纯化的寡核苷酸由上海生工合成。AgNO3和NaBH4购自SIGMA-ALDRICH Co.，Ltd.(St.Louis，USA)公司。PBS缓冲液(20mM，PH 7.0)购自上海生工公司。
1.2检测仪器
Cary Eclipse荧光分光光度计为安捷伦公司产品。
1.3检测原理
图1显示了本发明的检测原理：在均相体系中，靶物质、第一条探针增强序列G-rich和第二条探针DNA银纳米簇序列AgNCs-HBV形成三链结构，G-rich可增强AgNCS-HBV的荧光信号。通过对荧光信号的检测即可获知靶物质的含量。
G-rich的核苷酸序列为：
5′-TCCATATAACTTCGCATGGGTGGGGTGGGGTGGGG-3′(SEQ ID NO.1)。
AgNCs-HBV的核苷酸序列为：
5′-CCTCCTTCCTCCATGCGTTTGAAAGCCAA-3′(SEQ ID NO.2)。
靶物质(靶序列HBV)的核苷酸序列为：
5′-TTGGCTTTCAGTTATATGGA-3′(SEQ ID NO.3)。
1.4构建邻近增强探针调谐DNA银纳米簇荧光的检测体系：
(1)DNA银纳米簇序列AgNCs-HBV的合成：
将20μL 20μM DNA模板溶解在156μL PBS缓冲液(20mM，PH 7.0)中，然后加入12μLAgNO3(300μM)，通过涡旋振荡器振荡60s，然后在黑暗环境下4℃孵育2h；再加入新鲜配置的12μL NaBH4(300μM)溶液，在4℃孵育过夜，得到合成好的AgNCs-HBV探针，待用。
DNA模板的核苷酸序列为5′-CCTCCTTCCTCC-3′(SEQ ID NO.4)。
(2)构建荧光检测体系：
将AgNCs-HBV与G-rich以1∶1的摩尔比溶解于20mM PBS缓冲液(20mM，PH 7.0)中，加入待测靶物质，形成混合液，在37℃条件下进行40min避光孵育反应。
Figure BDA0003038436750000061
(3)检测荧光信号：将步骤(2)所得反应液加入石英比色皿中，利用荧光分光光度计进行测量。具体包括以下步骤：
(1)石英比色皿清洗：将石英比色皿用酒精浸泡，并用ddH2O清洗；
(2)设置参数：设置激发波长为595nm，发射波长范围为605～750nm，电压为700V；
(3)调零：向石英比色皿中加入ddH2O，进行调零；
(4)进行检测：将反应液加入荧光比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。
实施例2
验证检测HBV DNA的荧光传感器的可行性
对实施例1中整体检测过程用page电泳荧光检测进行验证，结果如图2所示。
图2所示为验证可行性的荧光信号对比图和电泳图(插入图)，其中红色曲线为实验组，黑色曲线为缺乏靶物质的对照组，蓝色曲线为仅有AgNCs-HBV的对照组；图2中的插入图为电泳验证图，其中泳道1为靶物质，泳道2为AgNCs-HBV和G-rich。
由图2可知，当仅仅存在DNA银纳米簇时，荧光信号极低；当不存在靶物质时，纳米簇探针不会发生自身结合产生荧光信号；当靶物质存在时，纳米簇探针释放出增强的荧光信号。page电泳进一步验证了上述结果：如图2的插入图所示，泳道1出现了明亮的条带表明了三链复合物的成功构建，泳道2显示两条探针AgNCs-HBV和G-rich在靶物质不存在的时候不会相互杂交。
由上可知，只有在有靶物质的情况下，才能够得到明显的荧光信号。
实施例3
检测HBV DNA荧光传感器及其使用条件的优化
本实施例对实验过程中几个重要的条件：对三链结合的茎碱基个数；G-rich与AgNCs-HBV杂交体系反应温度、G-rich与AgNCs-HBV杂交体系反应时间；DNA，硝酸银以及硼氢化钠的配置比例；荧光反应体系反应PH(即缓冲液PH)；以及DNA，硝酸银以及硼氢化钠的反应温度进行了进一步的优化，对每一个优化条件都由低值到高值分别选取至少五个点进行一系列实验。
为考察茎结构的碱基个数对所开发的荧光传感器的稳定性和反应速度的影响，本实施例进一步研究了最佳的立足点碱基个数(2～10个)，结果如图3所示。由图3可知，茎碱基个数为4、5、6个时，信噪比较佳，当茎碱基个数为5个时，信噪比最佳。因此，5个碱基被选为最佳碱基个数。
本实施例还考察荧光反应体系中不同反应条件(A，杂交体系反应温度：25、32、37、42、48℃；B，杂交体系反应时间：20、25、30、35、40、45、50、55min；C，DNA、硝酸银以及硼氢化钠的配置比例：1∶6∶6、1∶9∶9、1∶12∶12、1∶18∶18、1∶18∶36、1∶36∶36；D，荧光反应体系反应PH：6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6；E，DNA、硝酸银以及硼氢化钠的反应温度)对DNA检测结果的影响，结果如图4所示。
如图4可见，荧光信噪比随杂交体系反应温度，杂交体系反应时间，DNA、硝酸银、硼氢化钠的反应比例，荧光反应体系反应PH，以及DNA、硝酸银、硼氢化钠的反应温度的变化而变化，当上述条件分别为37℃，40min，1∶9∶9，7.0，4℃时，信噪比达到最大值，而后续继续增加上述条件信噪比反而降低。
实施例4
检测HBV DNA荧光传感器的性能分析
为了评估本发明荧光传感器的性能，在实施例3所得的最佳实验条件下，探索所构建的荧光传感器的检测动态范围和灵敏度，结果如图5所示。
由图5可知，当HBV浓度在500pM到80nM之间时，得到的荧光信号与HBV浓度呈线性相关，线性方程式为F＝1.77C+5.82(R2＝0.9965)，检测限为9pM。将荧光传感器在空白溶液中重复检测10次，计算标准差(σ)。检测限＝3σ/S，S为线性方程斜率。
实施例5
检测HBV DNA荧光传感器的特异性分析
在最优实验条件下，采用所构建的荧光生物传感器分别对10nM的HBV样品；相似序列单碱基错配(SM)、双碱基错配(DM)；不同乙肝病毒亚型HAV、HCV；随机序列(NC)进行了测定，结果如图6所示。由图6可知，仅HBV使得荧光信号增强，表明所开发的荧光生物传感器具有良好的特异性。
上述过程中使用到的核苷酸序列为：
SM：5′-TTCGCTTTCAGTTATATGGA-3′(SEQ ID NO.5)；
DM：5′-TTGGCTATCAGCTATATGGA-3′(SEQ ID NO.6)；
HAV：5′-CAATTGAGGATCCAGTTTTA-3′(SEQ ID NO.7)；
HCV：5′-GCUCCACUGGCAAGGCCUGG-3′(SEQ ID NO.8)；
NC：5′-TAGCTTATCAAACAGAGGAT-3′(SEQ ID NO.9)。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Figure BDA0003038436750000091
Figure BDA0003038436750000101
Figure BDA0003038436750000111
Figure BDA0003038436750000121
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学
<120> 用于定量检测乙肝病毒DNA的探针、荧光传感器及方法
<130> PCQYK2110473-HZ
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tagcttatca aacagaggat 20

Claims (10)

1.用于定量检测乙肝病毒DNA的探针，其特征在于，包括第一条探针和第二条探针，所述第一条探针为增强序列G-rich，所述G-rich的核苷酸序列3’端具有18-nt富鸟嘌呤增强序列，5’端具有10-nt的HBV病毒的识别域，中间部分具有2-nt至10-nt的茎结构；所述第二条探针为DNA银纳米簇序列AgNCs-HBV，所述AgNCs-HBV的核苷酸序列5’端具有12-nt的银纳米簇模板序列，用于合成DNA银纳米簇，3’端具有10-nt的HBV病毒的识别域，中间部分具有2-nt至10-nt的茎结构，与第一条探针的茎结构互补；所述G-rich在已有HBV存在时能够拉近AgNCs-HBV和G-rich的距离，触发荧光增强反应。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述G-rich、AgNCs-HBV的核苷酸序列中间部分具有4-nt至6-nt的茎结构。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：所述G-rich、AgNCs-HBV的核苷酸序列中间部分具有5-nt的茎结构，所述第一条探针G-rich的核苷酸序列为：
5′-TCCATATAACTTCGCATGGGTGGGGTGGGGTGGGG-3′(SEQ ID NO.1)；
所述第二条探针AgNCs-HBV的核苷酸序列为：
5′-CCTCCTTCCTCCATGCGTTTGAAAGCCAA-3′(SEQ ID NO.2)。
4.一种定量检测乙肝病毒DNA的荧光传感器，含有权利要求1～3任一项所述的探针。
5.一种如权利要求4所述的荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将第一条探针增强序列G-rich与第二条探针DNA银纳米簇序列AgNCs-HBV溶解于缓冲液中，加入待测靶物质，形成混合液，孵育，进行反应，构建得到荧光反应体系。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述靶物质为靶序列HBV，靶序列HBV的核苷酸序列为：
5′-TTGGCTTTCAGTTATATGGA-3′(SEQ ID NO.3)；
和/或，所述混合液中靶物质的终浓度≥9pM；
所述G-rich与AgNCs-HBV的摩尔比为1∶1；
和/或，所述缓冲液选自PBS缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液中的至少一种；
和/或，所述荧光反应体系的PH为6.2～7.6；
和/或，所述孵育反应温度为25～50℃，孵育时间为20～55min。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述第二条探针DNA银纳米簇序列AgNCs-HBV的合成方法为：
(a)将DNA模板溶解于缓冲液中，加入AgNO3溶液或硝酸银溶液，混合孵育；
(b)再加入还原剂NaBH4溶液或抗坏血酸溶液，孵育，得到AgNCs-HBV。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)中，所述DNA模板的核苷酸序列为5′-CCTCCTTCCTCC-3′(SEQ ID NO.4)；
和/或，所述步骤(a)、(b)中，DNA模板、Ag+、还原剂的摩尔比为1∶(6～36)∶(6～36)；
和/或，所述步骤(a)、(b)中，孵育均在避光条件下进行，孵育温度为-4～12℃；
和/或，所述步骤(a)中，孵育时间为1～3h；
和/或，所述步骤(b)中，孵育时间为8～12h；
和/或，所述步骤(a)中，缓冲液选自PBS缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液中的至少一种；
和/或，所述步骤(a)中，所述缓冲液的PH为6.2～7.6。
9.一种一步定量检测乙肝病毒DNA的荧光检测方法，采用权利要求1～3任一项所述的探针和/或权利要求4所述的荧光传感器和/或权利要求5～8任一项所述的方法制备得到的荧光传感器。
10.根据权利要求9所述的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)石英比色皿清洗：将石英比色皿用酒精浸泡，并用ddH2O清洗；
(2)设置参数：设置激发波长为595nm，发射波长范围为605～750nm，电压为700V；
(3)调零：向石英比色皿中加入ddH2O，进行调零；
(4)进行检测：将反应液加入荧光比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。
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