CN113230391A - 尿酸酶在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用 - Google Patents

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    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase

Abstract

本发明公开了尿酸酶在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用。本发明经研究发现尿酸酶和5‑FU联合使用对癌细胞的抑制作用显著优于5‑FU单独处理，说明尿酸酶能够用于制备抗肿瘤药物增敏剂。本发明用尿酸酶和5‑FU联合处理肝癌细胞和结直肠癌细胞，发现其对细胞增殖有显著抑制作用，且抑制效果显著优于5‑FU单独处理组，为提高人类肿瘤的5‑FU化疗疗效提供策略，在医药领域具有一定应用前景。

Description

尿酸酶在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及尿酸酶在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用。
背景技术
肝癌是最常见的人类恶性肿瘤之一，预计2030年将有100多万人死于肝癌。由于缺乏早期症状和有效的诊断生物标志物，大多数肝癌患者被诊断为晚期，失去了治疗性切除的机会。尽管近年来靶向药物的研究有所进展，但常规化疗在晚期肝癌的治疗中仍发挥着关键作用。然而，在化学治疗过程中往往产生化疗药物的耐药现象，导致治疗效果不理想。
5-氟尿嘧啶(5-FU，结构如下式Ⅰ所示)是50年前开发的一种强效抗代谢物药物，目前仍广泛用于包括肝癌在内的各种实体肿瘤的化疗。在细胞中，5-FU被转化为各种氟核苷酸衍生物，随后插入到DNA或RNA中，最终导致细胞死亡(Longley DB,Harkin DP,JohnstonPG.5-fluorouracil:mechanisms of action and clinical strategies.Nat RevCancer.2003；3(5):330-338)。5-氟尿嘧啶的耐药机制可能有多种，以往的研究主要集中在5-氟尿嘧啶代谢相关基因方面。其中有尿苷单磷酸合成酶(UMPS)，它催化5-FU转化为其有毒代谢物氟尿苷单磷酸(FUMP)。大量研究表明，UMPS与几种癌症的5-FU耐药相关，包括结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胆管癌等(Blondy S,David V,Verdier M,Mathonnet M,Perraud A,Christou N.5-Fluorouracil resistance mechanisms in colorectal cancer:Fromclassical pathways to promising processes.Cancer Sci.2020；111(9):3142-3154)。
Figure BDA0003065030720000011
最近尿酸被发现是一种内源性的UMPS抑制剂，它直接抑制UMPS活性，从而影响细胞对5-FU的敏感性(Jason R.Cantor et.al.,Physiologic Medium Rewires CellularMetabolism and Reveals Uric Acid as an Endogenous Inhibitor of UMP Synthase,Cell.2017；169(2):258-272.e17.)。
发明内容
本发明经研究发现UMPS的表达水平在肝癌细胞的5-FU耐药株与非耐药株之间存在显著性差异。肝癌细胞的5-FU耐药株中UMPS表达水平低，而非耐药株中UMPS表达水平高。
本发明利用小干扰RNA(siRNA)下调肝癌细胞中UMPS表达水平，发现UMPS下调显著降低了细胞对5-FU的敏感性，而在肝癌细胞中过表达UMPS则增加了细胞对5-FU的敏感性。
本发明利用UMPS的抑制剂尿酸处理肝癌细胞，发现尿酸降低了肝癌细胞对5-FU的敏感性。
本发明用尿酸酶和5-FU联合处理肝癌细胞和结直肠癌细胞，发现其对细胞增殖有显著抑制作用，且抑制效果显著优于5-FU单独处理组，为提高人类肿瘤的5-FU化疗疗效提供策略，在医药领域具有一定应用前景。
本发明首先提供了尿酸酶在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用。优选的，抗肿瘤药物为5-氟尿嘧啶。更优选的，肿瘤为肝癌或结直肠癌。
本发明又提供了一种药物组合物，包括抗肿瘤药物和抗肿瘤药物增敏剂，所述抗肿瘤药物增敏剂为能够降低尿酸水平的药物。优选的，所述抗肿瘤药物增敏剂为尿酸酶。更优选的，所述抗肿瘤药物为5-氟尿嘧啶。更优选的，肿瘤为肝癌或结直肠癌。优选的，尿酸酶通过降低尿酸水平而提高尿苷单磷酸合成酶活性，进而提高肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。
本发明经研究发现尿酸酶和5-FU联合使用对癌细胞的抑制作用显著优于5-FU单独处理，说明尿酸酶能够用于制备抗肿瘤药物增敏剂。
附图说明
图1为5-FU对BEL7402和BEL/5-FU细胞增殖抑制情况检测结果图。
图2为UMPS在BEL7402和BEL/5-FU细胞中的表达差异检测结果图。
图3为siRNA敲低BEL7402细胞中的UMPS后验证结果图。
图4为5-FU对UMPS敲低的BEL7402细胞增殖抑制情况检测结果图。
图5为BEL/5-FU细胞中UMPS过表达后验证结果图。
图6为5-FU对UMPS过表达的BEL/5-FU细胞增殖抑制情况检测结果图。
图7为5-FU对尿酸处理的BEL7402细胞增殖抑制作用检测结果图。
图8为尿酸处理对BEL7402细胞的单克隆形成能力影响检测结果图。
图9为尿酸酶与5-FU联合处理对BEL7402细胞增殖抑制作用检测结果图。
图10为尿酸酶与5-FU联合处理对BEL/5-FU细胞增殖抑制作用检测结果图。
图11为尿酸酶与5-FU联合处理对SW620和Coca2细胞增殖影响检测结果图。
图12为尿酸酶通过尿酸酶-尿酸-UMPS轴提高细胞对5-FU敏感性的流程示意图。
具体实施方式
实施例1：UMPS的表达在BEL7402与BEL/5-FU细胞中存在显著性差异
采用浓度梯度持续递增诱导法建立5-FU耐药的人肝癌细胞株BEL/5-FU。用初始浓度为0.5μM的5-FU(Sigma)处理人肝癌细胞BEL7402，待培养瓶中细胞汇合度达到80～90％时增加5-FU浓度，5-FU浓度递增，直至浓度达150μM，使细胞能在含150μM的5-FU培养基中稳定生长，共历时一年以上。
BEL7402和BEL/5-FU细胞在含10％FBS(胎牛血清)的RPMI-1640培养基中培养。将细胞以3000个/孔的密度种植在96孔板中培养24小时，加入不同浓度5-FU处理细胞72小时，使用细胞增殖毒性检测试剂盒-8(CCK-8)(日本同仁化学)测定细胞活率。
结果如图1所示，BEL7402和BEL/5-FU细胞的5-FU IC50值分别为3.60±0.32μM和2085±81.64μM，表明BEL/5-FU细胞对5-FU的耐药性比亲本细胞系提高了大约580倍。
Western Blot检测BEL7402和BEL/5-FU细胞中UMPS蛋白的表达水平。
Western Blot检测方法为：将细胞(2×104个/孔)接种在6孔板上培养72小时，细胞用PBS缓冲液洗涤3次，用RIPA裂解缓冲液(碧云天生物技术)溶解，裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂(Roche)和苯基甲基磺酰氟(Sigma)。细胞裂解液的蛋白浓度采用Bradford蛋白测定试剂盒(碧云天生物技术)测定。蛋白质经SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维素薄膜上，薄膜依次进行封闭液封闭1小时、一抗4℃孵育过夜、TBST缓冲液清洗三次、二抗室温孵育2小时、TBST缓冲液清洗三次、化学发光试剂显影。一抗为抗UMPS抗体(Bethyl)和抗GAPDH抗体(BIOKER)，二抗为HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗兔IgG抗体(Cell SignalingTechnology)。
结果如图2所示，发现BEL/5-FU细胞中UMPS蛋白的表达较BEL7402细胞降低了～67％，证明UMPS的表达在5-FU耐药的肝癌细胞与亲本细胞之间存在显著差异。
实施例2：UMPS的表达与肝癌细胞对5-FU的耐药性相关
为了评估BEL/5-FU中UMPS的表达减少是否导致5-FU耐药，我们用siRNA敲低BEL7402细胞中的UMPS。siRNA(每条siRNA由两条合成的序列退火形成双链)购自GenePharma公司，序列如下：
对照组：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'；
5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'。
UMPS siRNA：5′-GCUGCUUGGGAAGCGUAUUdTdT-3′；
5'-AAUACGCUUCCCAAGCAGCdTdT-3'。
将细胞接种于6孔板，使细胞达到30～50％的汇合度。24小时后，将siRNA与RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)按照说明书进行混匀，并加入每个孔中，24小时后更换新鲜培养基继续培养。在转染UMPS siRNA 72小时后收集细胞，通过Western Blot进行验证，发现BEL7402细胞中的UMPS蛋白水平下降了～85％(图3)。
将细胞接种于96孔板，siRNA转染24小时后，更换新鲜培养基并加入不同浓度5-FU处理细胞72小时，同样用CCK-8法测定细胞活率。UMPS敲低后BEL7402细胞的5-FU IC50值为25.93±0.76μM，几乎是对照组(未敲低UMPS)的7倍(图4)。该数据表明，下调UMPS的表达增加了肝癌细胞对5-FU的耐药。
我们进一步在BEL/5-FU细胞中过表达UMPS，以检验提高UMPS的表达是否能恢复肝癌细胞对5-FU的敏感性。UMPS表达载体pcDNA3.1-UMPS购于金斯瑞生物科技公司，按照说明书，使用Lip2000转染试剂(Biosharp)将UMPS基因转染到BEL/5-FU细胞中。72小时后收集细胞，进行Western Blot验证，发现BEL/5-FU细胞中UMPS表达水平明显升高(图5)。
UMPS基因转染24小时后，加入不同浓度5-FU处理细胞72小时，同样用CCK-8法测定细胞活率。UMPS过表达的BEL/5-FU细胞5-FU IC50值为169.53±25.28μM，比未过表达UMPS的BEL/5-FU细胞降低近12倍(图6)。这些结果表明，UMPS的过表达提高了肝癌细胞对5-FU的敏感性。
实施例3：尿酸作为UMPS的抑制剂能够降低肝癌细胞对5-FU的敏感性
最近尿酸被发现是一种内源性的UMPS抑制剂，它直接抑制UMPS活性，从而影响细胞对5-FU的敏感性。鉴于此，我们想知道尿酸是否可以降低肝癌细胞对5-FU的敏感性。我们选择350μM作为尿酸的实验浓度，该浓度接近人血浆中尿酸的浓度。
将BEL7402细胞以3000个/孔的密度种植在96孔板中培养24小时，实验组用350μM尿酸与不同浓度(10000、1000、300、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.01μM)5-FU处理细胞，对照组用不同浓度(10000、1000、100、30、10、3、1、0.1、0.01μM)5-FU处理细胞，72小时后用CCK-8法测定细胞活率。结果如图7所示，细胞培养基中加入尿酸后，BEL7402细胞的5-FU IC50值为26.12±1.42μM，几乎是未加尿酸处理时的7倍。
用单克隆形成实验进一步验证尿酸对肝癌细胞的5-FU敏感性影响。将BEL7402细胞以3000个细胞/孔的密度接种到6孔板中，培养24小时后，实验组加入15μM 5-FU和350μM尿酸处理细胞，对照组只加入15μM5-FU单独处理细胞，在37℃下培养8天，细胞用0.1％结晶紫染色20分钟，在显微镜下计数阳性菌落的数量。结果如图8所示，相较于5-FU单独处理组，用尿酸处理后BEL7402细胞的细胞集落形成能力增强，进一步说明尿酸能够降低肝癌细胞对5-FU的敏感性。
实施例4：尿酸酶提高肝癌细胞以及结直肠癌细胞的5-FU敏感性
尿酸酶催化尿酸生成水溶性尿囊素，是治疗高尿酸血症及其并发症的一种有效的蛋白质药物。然而，与大多数哺乳动物不同的是，人体内缺乏尿酸酶，导致人血浆中的尿酸浓度比其他哺乳动物高一个数量级。因此，我们考察尿酸酶能否提高人类癌细胞的5-FU敏感性。
将细胞铺于96孔板中，用350μM尿酸预处理细胞24小时后，实验组加入10μg/mL尿酸酶和不同浓度5-FU共同处理细胞，对照组只加入不同浓度5-FU处理细胞，72小时后，用CCK-8法测定细胞活率。与对照组相比，尿酸酶处理后BEL7402细胞和BEL/5-FU细胞的5-FUIC50值均降低50％左右(BEL7402细胞的5-FU IC50值由3.60±0.32μM减少到1.75±0.06μM；BEL/5-FU细胞5-FU IC50值由2085±81.64μM减少至1022±70.74μM)(图9和图10)。说明尿酸酶能够提高肝癌细胞对5-FU的敏感性。
我们进一步检测了尿酸酶对结直肠癌细胞株SW620和Coca-2的5-FU敏感性影响。实验组，SW620细胞用10μg/mL尿酸酶和50μM 5-FU联合处理，Coca-2细胞用10μg/mL尿酸酶和2μM 5-FU联合处理；对照组，SW620细胞用50μM 5-FU单独处理，Coca-2细胞2μM 5-FU单独处理。72小时后用CCK-8法测定细胞活率。与对照组相比，尿酸酶与5-FU的联合处理降低了SW620和Coca-2细胞的活率(图11)。这些数据表明，尿酸酶通过降低尿酸水平提高UMPS活性，从而增强人癌细胞对5-FU的敏感性(图12)。
序列表
<110> 杭州医学院
<120> 尿酸酶在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcugcuuggg aagcguauut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aauacgcuuc ccaagcagct t 21

Claims (8)

1.尿酸酶在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，抗肿瘤药物为5-氟尿嘧啶。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，肿瘤为肝癌或结直肠癌。
4.一种药物组合物，其特征在于，包括抗肿瘤药物和抗肿瘤药物增敏剂，所述抗肿瘤药物增敏剂为能够降低尿酸水平的药物。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物增敏剂为尿酸酶。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物为5-氟尿嘧啶。
7.如权利要求4～6任一所述的药物组合物，其特征在于，肿瘤为肝癌或结直肠癌。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，尿酸酶通过降低尿酸水平而提高尿苷单磷酸合成酶活性，进而提高肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。
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