CN113226360A - 用于肠杆菌素治疗铁缺乏和相关贫血的新用途的方法、系统和组合物 - Google Patents

Abstract

在一个实施例中，本发明涉及肠杆菌素(Ent)和/或Ent类似物作为治疗剂用于治疗铁缺乏和铁缺乏相关贫血的用途。在优选实施例中，Ent和/或Ent类似物可以递送到宿主生物，如人类受试者，以治疗铁相关疾病病状。在这种实施例中，Ent和/或Ent类似物可以通过药物组合物和/或通过基因工程化细菌或益生菌生物递送到有需要的人类受试者。

Description

用于肠杆菌素治疗铁缺乏和相关贫血的新用途的方法、系统 和组合物

相关申请的交叉引用

本国际PCT申请要求于2018年7月19日提交的美国临时申请第62/700,480号的权益和优先权。上文引用的申请的整个说明书和附图在此以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及宿主动物中各个微生物群衍生的分子的新益处。例如，细菌分泌的肠杆菌素(Ent)是对宿主具有假定的负面影响的铁清除性铁载体。然而，人类肠道中Ent产生性共生菌的高发生率指示了用于有益地使用Ent来治疗与铁代谢相关的疾病病状以及具体地铁缺乏的潜在宿主机制。通过新颖且独特的测定，本发明的发明人发现了Ent在支持生长和示例性真核宿主生物中的不稳定铁池中的意外且惊人的作用。本发明的发明人证明，Ent促进线粒体铁摄取并且令人惊讶的是通过与ATP合酶α亚基结合来这样做，所述ATP合酶α亚基在线粒体内与ATP合酶无关地起作用。本发明的发明人还证明了哺乳动物细胞中保留了此机制。本研究揭示了共生菌与其宿主之间的“铁拔河(iron tug-of-war)”的新范式以及用于线粒体铁摄取和稳态的重要机制。

背景技术

基于世界卫生组织(WHO)和其它文献(Stevens等人,2013；WHO,2015)的分析，铁缺乏是最普遍的营养缺乏病症和最常见的贫血原因，影响了超过1/4的全球人口，特别是妇女和儿童。贫血也是全球约9％的残疾的原因。重要的是，此病症的主要治疗口服铁补充存在严重问题。首先，口服铁补充的功效非常低，部分原因是口服铁补充会诱导阻断铁摄取的激素变化(铁调素增加)(Muckenthaler等人,20l7)(Cook和Reddy,1995；Moretti等人,2015)。其次，此治疗具有的众所周知的不良副作用，可能会导致死亡率增加，特别是在患有其它疾病的人中(Sazawal等人,2006)。例如，已知口服铁补充通过诱导自由基和对人微生物群组成的不利变化来促进炎症，所述不利变化可能是一些不良副作用的原因(Jaeggi等人,2015；Kortman等人,2015；Lund等人,1999；Tang等人,2017)。还已知的是，贫血在患有如炎性肠病(IBD)等常见GI疾病的人中非常普遍(在美国超过50％的IBD患者还患有贫血(Koutroubakis等人,2015))。包含患有其它GI疾病的那些患者在内的许多贫血患者完全无法忍受口服铁补充，从而需要同样众所周知与健康风险和副作用相关联的静脉输注(Auerbach和Macdougall,2017；Munoz等人,2009)。铁运输系统中的缺陷是某些缺铁性贫血的原因(Brissot等人,2011)，并且增加的铁摄取效率可能会是用于大多数贫血患者的变革性治疗的关键。

如下文详细介绍的，本发明的发明人证明，肠杆菌素(Ent)有潜力增加铁吸收效率，而没有高水平的口服铁补充和其相关副作用。事实上，这一发现出乎意料的临床显著性在专家在顶级期刊中的评论中得到了认可(Anderson,2018)。例如，2018年11月《新英格兰医学期刊(New England Journal of Medicine)(NEJM)》的文章强调了发明人的基础研究的新颖且意外的临床意义并强调了预测Ent能够使铁进入人类的几种细胞类型中的线粒体中(Gregory Anderson:“铁竞争-宿主反击(Iron Wars-The Host Strikes Back)”NEJM2018)(图17)。值得注意的是，Ent是几乎仅由肠杆菌产生以从环境中清除铁的儿茶酚酶铁载体。鉴于已知铁载体是病原体的关键毒力介体，Ent的清除作用预计将对宿主的铁稳态和某些细胞过程产生负面影响。为了抑制依赖Ent从宿主细胞中清除铁的致病细菌的生长，哺乳动物免疫系统产生螯合Ent的Ent结合蛋白脂钙蛋白2。这种防御系统可能会对宿主铁池和动物功能产生负面影响。更重要的是，此机制不能解释宿主动物将如何应对来自非感染性肠道微生物群的大量Ent，在非感染性肠道微生物群中，肠杆菌是人类和秀丽隐杆线虫(C.elegans)中最普遍的共生微生物。鉴于共生大肠杆菌(E.coli)与宿主之间的共生关系，可能会存在已在动物体内进化以将细菌Ent用于宿主铁稳态的未知有益机制。

铁转运到线粒体中是铁稳态的关键事件，因为许多贫乏的细胞不稳定性铁被转运到线粒体中以并入血红素和Fe-S复合物中(Muckenthaler等人,2017)。在正常情况下，人体内约70％的铁存在于血红蛋白中(Zhang和Enns,2009)。由于血红素生物合成的铁结合步骤发生于线粒体中，因此铁转运到线粒体中对血红蛋白产生或红细胞生成至关重要。在血红蛋白计数低的贫血病状下，需要将更高比例的铁转运到线粒体中。

事实上，由细菌使用补充的Ent可能会有几个有益的效果。在一个实施例中，这可以包含具有更多的Ent可能提升Ent利用性细菌(主要是人体内的大肠杆菌)的发生率，这在一些情况下可以具有积极的治疗效果。事实上，共生大肠杆菌过少可能会引起贫血或其它不健康病状。共生大肠杆菌的发生率在群体之间各不相同。在另一个实例中，现在众所周知的是，肠道微生物群组成(向不健康的方面)的变化是服用口服铁补充剂的非常显著的消极副作用。如果服用Ent允许大幅度地减少有效铁补充剂剂量，则患者更有可能通过潜在地最小化肠道微生物群组成的不利变化来获得强大的整体益处。

另外，作为哺乳动物宿主免疫反应的一部分，脂钙蛋白2的表达是由病原体攻击诱导的并且已知脂钙蛋白2与Ent结合，目的是螯合Ent和其结合的铁，以免对某些感染性细菌的增殖有益。因此，在此感染条件下添加更多Ent可能干扰脂钙蛋白2在对抗这些细菌中的作用。然而，此问题可能不是Ent用于治疗贫血的潜在治疗性使用的严重阻碍。首先，由于脂钙蛋白2的抗感染作用确实会为细菌营造低铁环境，因此与Ent在贫血患者中通过脂钙蛋白2来损害计划时将具有的效果相比，通过口服补充服用高水平的铁将可能具有更强的效果使缺铁的感染性细菌受益。需要记住，细菌可以通过与Ent无关的方式来摄取铁，并且细菌仅在低铁条件下才需要Ent。因此，在这点上Ent的潜在副作用已经存在于需要服用口服铁的贫血患者中。

因此，本领域中仍切实需要对细菌Ent分子生物学中涉及的分子组分和宿主相互作用进行鉴定和表征。

具体地，需要新的系统、方法和组合物用于开发可以用于调节和治疗动物和人类的铁相关疾病病状的基于Ent的疗法和药物组合物。

发明内容

在一个实施例中，本发明的发明人展现了用于测试大肠杆菌基因对动物发育的影响的独特且敏感的测定。具体地，本发明的发明人鉴定了关于共生菌产生的铁载体(肠杆菌素或Ent)对宿主生理学的影响的新范式。本发明的发明人发现，Ent促进宿主动物的线粒体铁水平并且有益地影响宿主发育。Ent通过与宿主线粒体ATP合酶的α亚基结合来执行这一功能，并且此结合与整个ATP合酶复合物无关。这一先前未知的机制可以抵消细菌Ent的清除作用和其对宿主不稳定性铁池的影响(图7)，并且此功能应增强微生物与动物之间的共生关系。由于保留了秀丽隐杆线虫与人类之间的这一功能，本发明可以与肠杆菌在这两种动物物种的肠道中有高发生率以及哺乳动物中的共生大肠杆菌能够产生Ent相一致。这项新颖的发明技术呈现了关于微生物与宿主细胞之间的竞争(铁“拔河”)的新范式，这不同于与Ent结合作为针对致病细菌的防御机制的充分研究的哺乳动物脂钙蛋白2的功能(图7)。

铁缺乏是威胁着世界上大量儿童和妇女的健康的最普遍的营养病症之一(WHO,2002)。产生各种铁结合铁载体的人类肠道微生物组的组成和行为可能会对此病症的发生和治疗具有很大的影响。本发明证明，动物和人类模型中的Ent和Ent补充在低铁条件和高铁条件两者下均促进铁摄取和生长，这进而可以表明，肠道中的铁水平通常达不到导致对从肠道微生物群产生Ent进行完全抑制的高度。缺铁条件下另外的Ent补充对铁水平和动物生长的深刻影响(图2G)表明，微生物组成的破坏可能会显著地引起人类铁缺乏病症并且作为

本发明的一个具体实施例可能会显著地有助于Ent补充作为对此广泛传播的人类健康问题的治疗的潜力。

本发明的发明人还已经提供了实验证据：ATP合酶α亚基不太可能以共转运模型促进线粒体铁摄取，其中当ATP合酶α亚基被转运到线粒体中时，Ent-Fe可能只是搭乘。相反，在本发明的一个实施例中展现了转运保留模型，其中线粒体内的ATP合酶α亚基结合并保留Ent-Fe，这意味着Ent-Fe可以通过被动机制或涉及蛋白转运体的系统进入和离开线粒体。近期在哺乳动物细胞中的研究表明，Ent可以通过渗透进入哺乳动物细胞，而在酵母中的研究已经指示了可以将Ent运输到真菌细胞中的转运体。在一个实施例中，在保留模型下，被动扩散似乎更直接，因为Ent-Fe也将在与ATP合酶α亚基无相互作用的情况下离开线粒体。

本发明的技术进一步证明，ATP合酶α亚基在线粒体铁保留中的作用可能与ATP合酶无关；其既不需要与其它亚基相互作用也不需要其酶活性。因此，Ent-Fe³⁺可以能够与定位于线粒体内，但物理上与ATP合酶分离的ATP合酶α亚基相互作用。然而，在一个实施例中，可能的是，α亚基定位于远离野生型动物中的ATP合酶的位点，并且因此，即使在不存在β亚基的情况下Ent也可以能够与α亚基相互作用，但是Ent仍然可以与在正常条件下与ATP合酶缔合的α亚基结合。

铁摄入线粒体中在很大程度上有助于调节不稳定铁池水平，但此过程的机制仍有待理解。在本发明的发明人对秀丽隐杆线虫的分析中，Ent和ATP-1对不稳定铁水平的影响非常深刻(图2和4)。这些影响表明，涉及Ent和ATP合酶α亚基的此新发现的系统表示铁摄入线粒体中背后的重要机制，从而解到Ent产生性肠杆菌是秀丽隐杆线虫和人类两者中最普遍的共生微生物。另外，本文描述的本发明技术的某些实施例可以指示可以对理解铁运输到线粒体中所涉及的其它系统具有显著影响的机制。例如，保留模型还可能参与包含哺乳动物铁载体在内的其它铁载体的功能。本文描述的本发明技术进一步证明了使秀丽隐杆线虫来研究各个微生物群生成的代谢物对宿主生理学以及动物与肠道微生物之间的共生关系的影响的价值并且提供了可能患有铁缺乏相关疾病病状或处于铁缺乏相关疾病病状风险中的人类和动物的治疗性Ent补充。

因此，本发明对细菌Ent进行了鉴定并将其表征为动物的铁水平和生长的主要调节剂和表征。本发明的一个目的可以包含用于示例性真核模型生物中的新测定的系统、方法和组合物，所述示例性真核模型生物在这种情况下为阐明细菌Ent在支持动物生长和一个或多个铁水平方面的作用的秀丽隐杆线虫。

本发明的另一个方面包含证明Ent与促进秀丽隐杆线虫和哺乳动物两者中的线粒体铁摄取的ATP合酶α亚基之间相互作用的系统、方法和组合物。

本发明的又另一个方面包含Ent通过其与ATP合酶α亚基之间的相互作用促进宿主铁稳态的用途。在此优选实施例中，可以利用Ent补充作为治疗剂来治疗一种或多种铁缺乏相关疾病病状。在此优选实施例中，可以将治疗有效量的Ent补充引入到有需要的受试者。Ent的递送可以是通过药物组合物或甚至是通过引入被配置成产生/过度产生外源性、经过修饰的和/或内源性Ent的基因工程化益生菌和/或共生菌。

本发明的另一个方面可以进一步包含治疗铁缺乏相关病状和其相关贫血的系统、方法和组合物。在一个优选实施例中，治疗和/或预防性地预防铁缺乏相关病状和其相关贫血的这种系统、方法和组合物可以包含如本文描述的Ent补充。

本发明的另外方面可以包含用于使用Ent和/或ATP-1作为铁相关疾病病状的生物标志物以及用于诊断铁缺乏相关疾病病状和/或受试者对铁缺乏相关疾病病状的易感性的诊断性生物标志物的系统、方法和组合物。

本发明的另外方面可以包含以下实施例中的一个或多个实施例：

1.一种治疗有需要的受试者的铁缺乏的方法，所述方法包括施用治疗有效量的肠杆菌素(Ent)或其药学上可接受的盐。

2.根据实施例1所述的方法，其中所述治疗有效量的Ent是分离的。

3.根据实施例1所述的方法，其中所述治疗有效量的Ent包括其中所述治疗有效量的Ent类似物。

4.根据实施例3所述的方法，其中所述Ent类似物选自由以下组成的组：TRENCAM、SERSAM、SER(3M)SAM、TRENSAM和TREN(3M)SAM。

5.根据实施例1或4所述的方法，其中所述Ent或所述Ent类似物与药学上可接受的载体组合。

6.根据实施例5所述的方法，其中所述药学上可接受的载体为营养补充剂。

7.根据实施例1所述的方法，其中所述铁缺乏包括缺铁性贫血。

8.根据实施例1和7所述的方法，其中所述有需要的受试者包括人类受试者。

9.一种预防有需要的受试者的铁缺乏的方法，所述方法包括施用预防有效量的肠杆菌素(Ent)或其药学上可接受的盐。

10.根据实施例9所述的方法，其中所述治疗有效量的Ent是分离的。

11.根据实施例9所述的方法，其中所述治疗有效量的Ent包括其中所述治疗有效量的Ent类似物。

12.根据实施例11所述的方法，其中所述Ent类似物选自由以下组成的组：TRENCAM、SERSAM、SER(3M)SAM、TRENSAM和TREN(3M)SAM。

13.根据实施例9或14所述的方法，其中所述Ent或所述Ent类似物与药学上可接受的载体组合。

14.根据实施例13所述的方法，其中所述药学上可接受的载体为营养补充剂。

15.根据实施例9所述的方法，其中所述铁缺乏包括缺铁性贫血。

16.根据实施例9和15所述的方法，其中所述有需要的受试者包括人类受试者。

17.一种用于治疗受试者的铁缺乏的治疗剂，所述治疗剂包括由以下通式(I)表示的活性成分：

以及药学上可接受的载体。

18.根据实施例17所述的方法，其中所述治疗有效量的式I化合物是分离的。

19.根据实施例17所述的方法，其中所述治疗有效量的式I化合物包括其中所述治疗有效量的式I化合物的类似物。

20.根据实施例19所述的方法，其中所述式I化合物的类似物选自由以下组成的组：

21.根据实施例17或20所述的方法，其中所述式I-VI化合物与药学上可接受的载体组合。

22.根据实施例21所述的方法，其中所述药学上可接受的载体为营养补充剂。

24.根据实施例17所述的方法，其中所述铁缺乏包括缺铁性贫血。

25.根据实施例17和24所述的方法，其中所述有需要的受试者包括人类受试者。

26.根据实施例6、14和22所述的方法，其中所述营养补充剂包括益生菌。

27.一种用于治疗有需要的受试者的铁缺乏的经过基因修饰的益生菌，所述经过基因修饰的益生菌包括被配置成表达与对一个或多个用于肠杆菌素(Ent)的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸的益生菌。

28.根据实施例27所述的经过基因修饰的细菌，其中所述益生菌包括肠杆菌属益生菌。

29.根据实施例27所述的经过基因修饰的细菌，其中所述与对一个或多个用于Ent的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸包括与对选自由以下组成的组的基因中的一个或多个基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸：entA、entB、entC、entD、entE、entF。

31.根据实施例27所述的经过基因修饰的细菌，其中所述与对一个或多个用于Ent的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸包括与对选自由以下组成的组的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸：SEQ ID NO.1-6。

31.根据实施例27所述的经过基因修饰的细菌，其中所述有需要的受试者为人类受试者。

32.根据实施例31所述的经过基因修饰的细菌，其中所述铁缺乏包括缺铁性贫血。

33.一种用于治疗有需要的受试者的铁缺乏的营养药物组合物，所述营养药物组合物包括被配置成表达与对一个或多个用于肠杆菌素(Ent)的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸的益生菌以及赋形剂。

34.根据实施例33所述的营养药物组合物，其中所述益生菌包括肠杆菌属益生菌。

35.根据实施例33所述的营养药物组合物，其中所述与对一个或多个用于Ent的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸包括与对选自由以下组成的组的基因中的一个或多个基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸：entA、entB、entC、entD、entE、entF。

36.根据实施例33所述的营养药物组合物，其中所述与对一个或多个用于Ent的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸包括与对选自由以下组成的组的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸：SEQ ID NO.1-6。

37.根据实施例33所述的营养药物组合物，其中所述有需要的受试者为人类受试者。

38.根据实施例37所述的营养药物组合物，其中所述铁缺乏包括缺铁性贫血。

本申请涉及各种期刊文章和其它公开，所有所述各种期刊文章和其它公开均通过参考并入本文。本文中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征、目的和优点将根据具体实施方式、附图、实例和权利要求书变得显而易见。

附图说明

根据结合附图进行的以下详细描述将更好地理解本公开的以上和其它方面、特征和优点，所有附图仅通过说明的方式给出并且不限制本公开的实施例，在附图中：

图1：微生物代谢物肠杆菌素(Ent)支持秀丽隐杆线虫发育。(A)示出痕量活细菌支持喂食热灭活的大肠杆菌的蠕虫的胚后生长的草图、显微镜图像和条形图。将幼虫放置在板上4天后测量蠕虫的体积。(B-C)细菌突变体筛选鉴定出肠杆菌素(Ent)生物合成路径中的5个基因，当在测定条件下喂食这5个突变体中的每个突变体时，所述基因支持宿主发育(如蠕虫体积减小所指示的)。在筛选(B)中鉴定了呈红色的酶(C)。(D)通过膳食补充Ent完全抑制了由喂食entA或entF活大肠杆菌突变体以及热灭活的大肠杆菌引起的生长缺陷。代表性显微镜图像示出在图8A中。(E)补充2,3-DHBA挽救了喂食entA突变体细菌的蠕虫的生长，但未挽救喂食entF突变体细菌的蠕虫的生长，这证实了只有最终产物Ent对蠕虫生长有益。(F)由喂食ent活大肠杆菌突变体连同热灭活的大肠杆菌引起的生长缺陷未通过编码大肠杆菌Ent铁受体的基因fepA的突变进行表型模拟，这表明Ent不能通过其清除细菌铁的作用来有益于蠕虫生长。关于fepA的作用和蠕虫图像还参见图8B和8C。(G)补充其它铁载体(荧光嗜铁素或铁色素)并不能挽救喂食entF突变体连同热灭活的食物的蠕虫的生长。这些铁载体的毒性测试示出在图8F-H中。(H)示出喂食entF突变体细菌的蠕虫的Ent水平显著低于喂食野生型细菌的蠕虫的Ent水平的全蠕虫裂解物CAS染色结果。(I)喂食条件的草图、条形图和统计分析示出，仅喂食活entA或entF大肠杆菌菌株(菌苔)的蠕虫幼虫与喂食亲本野生型大肠杆菌的蠕虫相比显示出降低的生长速率，这表明即使在此喂食条件下Ent不是绝对需要的，但宿主发育显著受益于Ent。针对所有图，“n”＝评定的蠕虫数。数据表示为平均值±SEM。***P<0.00l。所有数据表示至少三个独立实验。

图2：细菌肠杆菌素促进宿主铁池水平。(A-E)描绘喂食条件对宿主铁水平和pftn-2::GFP表达的影响的喂食条件草图、荧光图像和条形图。(A)喂食entA或entF大肠杆菌与热灭活的大肠杆菌的蠕虫表现出钙黄绿素-AM荧光大幅增加(这表明不稳定铁水平下降)，并且此变化通过膳食补充Ent得到完全抑制。(B)铁反应性报告基因pftn-2::GFP的表达在喂食entA或entF大肠杆菌和热灭活的大肠杆菌的蠕虫中下降。(C和D)对热灭活的大肠杆菌的Ent补充恢复了生长停滞的蠕虫的铁水平(由钙黄绿素AM荧光和pftn-2::GFP两者指示)，但未挽救生长，这表明(A)中Ent对宿主铁池的影响不太可能是由于蠕虫的较慢生长速率的间接影响。(E)仅喂食entA或entF活细菌的蠕虫的钙黄绿素-AM荧光强度增加，这表明Ent对宿主铁水平增加的益处不限于(A)中图解表示的喂食条件。(F)示出将FeCl₃添加到野生型大肠杆菌源抑制了喂食热灭活的大肠杆菌的蠕虫的生长的草图和条形图，所述添加预计将抑制Ent产生。然而，此生长通过Ent补充在很大程度上得到恢复。代表性蠕虫图像示出在图D中。(G)在用CaEDTA处理的缺铁条件下，蠕虫显示出生长阻滞。在补充FeCF(以剂量依赖性方式)或Ent的情况下，蠕虫的钙黄绿素-AM荧光减少(铁水平增加)。Ent补充对荧光水平降低的影响相当于向食物补充10ul的FeCl₃(175ug/ul)，“n”＝评定的蠕虫数。数据表示为平均值±SEM。***P<0.00l。所有数据表示至少三个独立实验。

图3：细菌肠杆菌素与ATP合酶的α亚基结合。(A)使用生物素缀合的Ent通过亲和色谱法从全蠕虫裂解物中鉴定出Ent结合蛋白的程序的示意图。保留的蛋白通过质谱分析进行鉴定。指示了两个独立实验中鉴定出的两种蛋白质。(B)示出Ent补充未成功挽救用atp-1(RNAi)处理的动物的生长的喂食条件草图、显微镜图像和条形图。ctl-2RNAi未改变Ent补充的益处。(C)用于Ent与ATP-1的结合的体内测试。使用生物素-Ent从全蠕虫裂解物中下拉相互作用的蛋白质，然后进行链霉亲和素珠纯化。使用抗ATP5Al抗体(抗体特异性参见图10A)来检测IP中的ATP-1的蛋白质印迹分析。(D-E)Ent与ATP-1的结合的体外测试。带ATP-1::His标签的蛋白质与生物素-Ent(D)结合，并且所述结合通过增加的蛋白质浓度来增加并且通过添加过量的非生物素标记的Ent(E)来降低。(F)示出在铁结合测定中Ent介导Fe³⁺与ATP-1之间的相互作用的草图和条形图。用55FeCl₃+/-铁载体(Ent、铁色素或荧光嗜铁素)处理全蠕虫裂解物，然后用抗ATP5A1进行免疫沉淀。通过测量放射性确定了相对铁水平。Ent的存在使与ATP-1-IP缔合的55Fe增加超过10倍。数据表示为平均值±SEM。***P<0.00l。除了D和E(两个独立实验)之外，所有数据表示至少三个独立实验。

图4：Ent在促进宿主铁水平方面需要ATP-1，而不是ATP合酶。(A-D)描绘喂食条件对宿主铁水平的影响的喂食条件草图、钙黄绿素-AM染色荧光图像和定量数据条形图。(A)常规喂食条件下atp-1功能丧失(lf)纯合动物(100％L1停滞，n>50)的宿主铁水平下降，并且铁水平的降低而不是生长停滞(100％，n>50)通过表达来自转基因[Prpl28::atp-1(del)]的ATP结合缺陷ATP-1突变体蛋白得到有效抑制。数据表示为平均值±SEM。(B)RNAi敲除atp-f而不是ATP合酶的其它三个亚基中的每个亚基致使常规喂食条件下蠕虫的铁水平下降。数据表示为平均值±SD。(C)当动物被喂食entF突变体细菌时，用atp-1RNAi预处理动物会消除Ent补充的益处，这表明Ent的作用依赖于ATP-1。数据表示为平均值±SEM。(D)当动物仅喂食热灭活的细菌时，用atp-1RNAi预处理动物会消除Ent补充的益处。数据表示为平均值±SEM。(E).在体外结合测定中，ATP结合结构域的8AA(DRQTGKTA)的缺失并没有改变ATP-1与Ent的结合，类似于图3D中的情况。“n”＝评定的蠕虫数。***P<0.00l。所有数据表示至少三个独立实验。

图5：线粒体中的Ent-ATP-1相互作用促进线粒体中的铁水平增加。(A)来自体内线粒体铁摄取测定的草图图示和数据。为蠕虫喂食55FeCl₃+/-Ent。从这些蠕虫中提取线粒体，并且针对每个RNAi处理测定两个样品之间的相对55Fe水平。Ent的存在致使线粒体中的55Fe水平增加约3倍，并且Ent效应由atp-f的RNAi而非其它ATP合酶基因的RNAi消除。(B)示出喂食entF突变体细菌的蠕虫的显著较低的线粒体铁载体水平的CAS染色测定。(C)atp-1RNAi致使线粒体铁载体水平下降。(D)体外线粒体铁摄取测定。首先从蠕虫裂解物中纯化出线粒体，然后用55FeCl₃+/-Ent温育并针对每个RNAi处理测量两个样本之间的相对55Fe水平。Ent的存在导致线粒体中有10倍高的55Fe水平，并且此效应通过ap-1的RNAi显著降低，但未通过其它ATP合酶基因的RNAi降低。(E和F)Ent补充导致含有Fe-S簇的酶的活性增加，这由喂食缺乏Ent的食物的蠕虫的线粒体顺乌头酸酶(E)和琥珀酸脱氢酶(F)的增加的活性来指示。*P<0.05、**P<0.0l、***p<0.00l。数据表示为平均值±SD。所有数据表示至少三个独立实验。

图6：.Ent还通过与ATP合酶的α亚基相互作用来促进哺乳动物细胞中的线粒体铁水平。(A)表明Ent补充导致HEK293T细胞中的铁载体水平增加的CAS染色。数据表示为平均值±SD。(B)使用来自培养的人HEK293T细胞+/-生物素-Ent的总蛋白提取物的体内Ent-生物素下拉测定以及蛋白质印迹鉴定ATP5A1为Ent结合蛋白。(C)用于Ent与哺乳动物ATP5A1的结合的体外测试。带ATP5Al::His标签的蛋白质与生物素-Ent结合，并且所述结合被过量的非生物素标记的Ent竞争超过。(D)示出Ent介导ATP5A1与铁之间的相互作用的条形图。HEK293T全细胞裂解物用55FeCl₃+/-Ent进行处理，然后用抗ATP5A1进行免疫沉淀并且测量放射性。数据表示为平均值±SD。(E)体内线粒体铁摄取测定的结果(类似于图5A中针对秀丽隐杆线虫的结果)示出Ent补充显著增加了Fe³⁺到线粒体中的摄入并且所述增加通过ATP5A1的siRNA敲除来进行消除。siRNA的有效性示出在图13A中。数据表示为平均值±SD。(F)示出Ent对HEK293T细胞的线粒体的铁摄取的ATP5A1依赖性影响的体外线粒体铁摄取测定结果。与秀丽隐杆线虫(图5D)中一样，Ent的添加提升了到线粒体中的铁摄取，而这一益处通过ATP5A1的siRNA敲除而急剧减少。数据表示为平均值±SD。(G)用荧光线粒体铁指示剂RPA染色的HEK293T细胞的荧光图像和定量数据。Ent补充致使染色显著减少(从而指示铁的增加)，这通过敲除ATP5A1来消除。数据表示为平均值±SEM。**P<0.0l、***P<0.00l。所有数据表示至少三个独立实验。

图7：针对共生菌与宿主动物之间的铁“拔河”提出的新范式。(A)脂钙蛋白2(lcn2)的作用的发现产生了致病细菌与宿主免疫系统之间的经典概念铁“拔河”。感染后，lcn2被诱导与Ent-Fe³⁺结合，这阻断了Ent从宿主细胞获取铁以用于细菌生长的作用(Baumler和Sperandio,2016；Ellermann和Arthur,2017；Xiao等人,2017)。此螯合功能抑制细菌生长，但可能不益于宿主铁稳态和其它生理作用。(B)Ent-ATP合酶α亚基在促进线粒体铁浓度方面令人惊讶的有益作用指向进化以抵消Ent对铁稳态的已知负面影响并且从而增强肠道细菌与动物之间的共生关系的新机制。

图8：细菌肠杆菌素促进秀丽隐杆线虫发育。(A)示出结合entA或entF突变体大肠杆菌喂食热灭活的大肠杆菌的蠕虫生长得较慢并且这一缺陷通过Ent补充得到完全抑制的喂食条件草图和显微镜图像。定量数据示出在图1D中。B)细菌外膜上的有助于大肠杆菌中摄取Ent-Fe³⁺复合物的铁肠杆菌素受体FepA的草图。(C)示出与用entA或entF突变体喂食不同，结合fepA突变体大肠杆菌喂食热灭活的大肠杆菌的蠕虫未示出生长缺陷的喂食条件草图和显微镜图像。定量数据示出在图1F中。(D)entA和entF突变体大肠杆菌菌株表现出与亲本野生型菌株大肠杆菌K12-BW25113的生长速率类似的生长速率。(E)entA和entF突变体大肠杆菌菌株与亲本野生型菌株一样高效地对宿主肠道进行定殖。(F)示出荧光嗜铁素和铁色素均未致使在喂食热灭活的食物加上野生型活大肠杆菌的蠕虫有明显的生长缺陷的喂食条件草图、显微镜图像和条形图。(G)在与(F)中相同的喂食条件下含有mtGFP的蠕虫的荧光显微镜检查。补充三种铁载体中的每种铁载体不影响本发明测定系统中的线粒体形态。(H)在液体培养中，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)产生的铁载体荧光嗜铁素对蠕虫有毒性，因为荧光嗜铁素会损害宿主线粒体(mtGFP网络图案碎片化并且减小为大的点状体)(Kirienko等人,2015)。然而，Ent不会破坏线粒体形态。(I)喂食条件草图、显微镜图像和条形图示出向热灭活的大肠杆菌OP50补充Ent不能挽救宿主发育，从而证明了这样的观点：支持蠕虫生长需要来自活细菌的多种细菌生成的代谢物(Qi等人,2017)。“n”＝评定的蠕虫数。数据表示为平均值±SEM。***P<0.000l。

图9：.Ent、铁浓度和蠕虫生长之间的功能性关系。(A)示出向热灭活的食物中添加更多Fe³⁺(FeCl₃)未抑制由Ent缺乏(参见图1B)引起的生长缺陷(A)的喂食条件草图、显微镜图像和条形图。数据表示为平均值±SD。(B)示出与Ent补充不同，添加更多Fe³+未使喂食热灭活的大肠杆菌的蠕虫的铁水平升高的钙黄绿素-AM染色。

数据表示为平均值±SEM。(C)向食物中添加更多血红素未抑制由Ent缺乏引起的生长缺陷。数据表示为平均值±SEM。(D)示出在新测定系统中向野生型大肠杆菌添加更多三氯化铁抑制了蠕虫生长的显微镜图像。通过Ent补充恢复了生长缺陷。定量数据示出在图2F中。“n”＝评定的蠕虫数。

图10：ATP-1的Ent结合序列的体外标测。(A)用针对哺乳动物ATP合酶α亚基的抗体在全蠕虫提取物中检测到单条带，并且带强度在经过atp-1(RNAi)处理的样品中大幅下降，从而证明了此抗体对蠕虫蛋白ATP-1的特异性。(B-C)用于铁结合的Ent与ATP-1之间的结合的体外测试。增加带ATPl::His标签的蛋白的浓度使与生物素-Fe-Ent的结合增加(B)。所述结合通过添加过量的非生物素标记的Ent来降低(C)。数据表示为平均值±SEM。(D)将ATP-1蛋白全长序列分成三段并且然后在大肠杆菌中表达。使用经纯化蛋白的体外结合测定示出，中间段保留了Ent结合能力。(E)测试覆盖ATP-1(在D中鉴定)的中间段的八种肽的结合，从而揭示了21氨基酸肽(FCIYVAVGQKRSTVAQIVKRL)足以在体外结合测定中结合Ent。(F)缺失21氨基酸序列的ATP-1蛋白丧失了Ent结合能力。因此，即使此21残基肽对其铁摄取功能而言不足，但其对Ent结合既是必不可少的又是足够的。

图11：ATP-1与Ent的结合与ATP合酶的β亚基以及ATP-1与人ATP5A1的序列比较无关。(A)示出在HEK293T细胞中α亚基与ATP合酶β亚基共定位的免疫染色。(B)atp-1(RNAi)显示出秀丽隐杆线虫中的缓慢生长表型。(C)示出ATP-1与Ent的结合与ATP合酶的β亚基(ATP-2)无关的蛋白质印迹。向用对照或atp-2RNAi处理的蠕虫喂食生物素-Ent，并且分离出总蛋白提取物，然后进行链霉亲和素珠纯化。使用针对ATP合酶的α亚基的抗体通过蛋白质印迹检测两个样品中的ATP-1蛋白。蠕虫在atp-2(RNAi)处理之后生长得更慢，这表明RNAi有效敲除了atp-2。(D)对来自秀丽隐杆线虫和人的ATP合酶的α亚基的蛋白质序列比对。指示了预测的ATP与Ent结合位点。

图12：ATP-1与MitoTracker共定位。示出ATP-1与MitoTracker共定位的经解剖肠免疫染色图像。atp-1RNAi处理导致免疫染色减少。

图13：siRNA有效降低了ATP5A1的水平。ATP5A1蛋白水平在用siRNA ATP5A1处理的细胞中降低。

图14：小鼠在entF细菌定殖的情况下生长缓慢。用野生型或entF(缺乏肠杆菌素的)细菌对5周龄的无菌小鼠进行定殖。定殖之后，小鼠生长4周。每周测量体重并且计算增重。

图15：肠杆菌素的2-D化学结构。(配位的氧原子用红色指示)。

图16：肠杆菌素和其合成类似物：儿茶酚酶TRENCAM以及水杨酸盐SERSAM、SER(3M)SAM、TRENSAM和TREN(3M)SAM配体(配位的氧原子用红色指示)。

图17：展现分泌三价铁结合化合物Ent的肠腔中的示例性大肠杆菌微生物的示意图，取自G.J.Anderson.“铁竞争-宿主反击”《新英格兰医学期刊》.2018年11月22日。

图18：在具有铁螯合剂的培养基中，Ent添加增加了人HEK293细胞中的铁摄取。当向培养基添加铁螯合剂去铁胺(DFO)时，细胞中的铁水平显著降低，如钙黄绿素AM染色荧光的增加所指示的。通过向培养基中添加Ent(1.5μM)，铁水平基本恢复。在添加Ent(45％)的情况下钙黄绿素AM荧光的减少比不使用DFO的测试更强。

图19：Ent和ATPSα促进铁跨脂质体的脂质双层运输。(A)实验条件的草图图示和钙黄绿素AM染色的图形定量。向脂质体+/-ATPSα添加钙黄绿素AM染料并且测量脂质体的荧光强度。(B)实验条件的草图图示和铁摄取的图形定量。将脂质体与放射性标记的Fe³⁺(⁵⁵FeCl₃)温育，并且测量脂质体的放射性(相对CPM)。

图20：通过口服管饲法进行Ent补充促使贫血小鼠模型(膳食贫血)的血红蛋白和脾铁水平增加。向3周龄的雌性小鼠喂食缺铁膳食(IDD)(或对照膳食)6周以诱导贫血(通过血红蛋白测量来证实)。然后在两周内通过口服管饲法(每两天一次)用+/-Ent(两个浓度)或+/-FeSO₄对小鼠(5只/组)进行处理。

图21：通过饮用水(随意)补充的Ent促使贫血小鼠模型(膳食贫血)的血红蛋白水平增加。向3周龄的小鼠喂食缺铁膳食(IDD)(或对照膳食)以诱导贫血。然后在另外两周内向所述小鼠喂食添加到饮用水的IDD+/-Ent。每周提供一次Ent在水中的新鲜稀释液。

图22：通过饮用水(随意)补充的Ent促进喂食对照(铁充足)膳食的小鼠的生长。用图20和图21中使用的与缺铁膳食(IDD)相匹配的对照铁充足对照膳食(CD)处理4.5周龄的雄性小鼠。

图23：Ent促进用单株大肠杆菌菌株定殖的小鼠的小鼠生长。补充图14，本发明的发明人展现了(A)。用单株非致病性大肠杆菌(K12)菌株、野生型或entF来定殖五周龄的雌性无菌(GF)小鼠。在接下来的4周内测量小鼠生长(增重)。与用野生型大肠杆菌定殖的小鼠相比，用entF大肠杆菌定殖的无菌(GF)小鼠显示出更慢的生长。有趣的是，在定殖后的前两周内，增重的差异最大。(B和C)晚期小鼠的铁水平仅在脾中显著较低(约35％)，而在肝或其它组织中则不是这样，这与图20中看到的结果相一致。测量铁水平。(D)Ent补充克服了用entF大肠杆菌定殖的GF小鼠的生长延迟。为用entF细菌定殖的GF雌性小鼠补充Ent[每周一次向饮用水(pH 5.5)添加2个浓度]。

图24：肠杆菌素(Ent)在促进动物发育方面的影响在其它铁载体中未看到。向新孵化的秀丽隐杆线虫幼虫喂食野生型K12大肠杆菌或补充有指示的铁载体的entF大肠杆菌。

图25：不同溶剂和pH条件的Ent稳定性测试。(A)通过CAS液体测定(改编自Arora&Verma 2017)测量了Ent稳定性。由增加的吸光度指示降解。在H₂O(pH 5.5)(具有10％DMSO)中稀释的Ent在首个60分钟内迅速降解。相比之下，在100％DMSO中稀释的Ent在测定期期间几乎未示出变化。(B)通过CAS液体测定测量了不同pH下H₂O中的Ent稳定性。在H₂O(pH 6.5/7)中稀释的Ent比酸性和碱性H₂O中的其它稀释物更稳定。(C)通过NGAL荧光测定(改编自Goetz等人,2002)测量了Ent相对于Fe-Ent的稳定性，并且用线性趋势线对其进行图形表示。以相同的浓度在相同的缓冲液中制备Ent和Fe-Ent。由增加的相对荧光指示降解。Fe-Ent比单独的Ent更稳定。针对所有测试，将稀释剂保持在室温下并暴露于光。误差为平均值的标准偏差。

具体实施方式

本发明可以包含用于Ent和/或Ent类似物的治疗性施用以治疗受试者的铁缺乏的新系统、方法和组合物。如上文所指出的，图15是由包含大肠杆菌(Escherichia coli)(大肠杆菌(E.coli))、沙门氏菌和克雷伯氏菌的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性物种生物合成的典型铁载体肠杆菌素(Ent)。关于肠杆菌素生物合成和配位化学的数十年探索以及参与肠杆菌素的细胞转运和加工的蛋白质研究提供了对此螯合物如何有助于细菌铁稳态和定殖的详细分子和生理理解(Raymond等人《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)》2003,100,3584-3588)。肠杆菌素合成酶包含四种蛋白质EntB、EntD、EntE、EntF并且负责从L-丝氨酸和2,3-二羟基苯甲酸(DHB)产生肠杆菌素。在生物合成之后，Ent被输出到其清除Fe³的细胞外隙中。肠杆菌素在约1049M-1的Ka下通过其三个儿茶酚酶基团与Fe³配位。

例如，本发明的一个方面涉及治疗有需要的受试者的铁缺乏以及优选地缺铁性贫血的方法，所述方法包含向受试者施用治疗有效量的Ent和其药学上可接受的载体和/或其药学上可接受的盐和/或其药物组合物。在此实施例中，Ent可以包括纯化的、基本上纯化的和/或分离的Ent，所述纯化的、基本上纯化的和/或分离的Ent可以进一步与药学上可接受的组合物如赋形剂组合。

本发明的另一个方面涉及预防有需要的受试者的铁缺乏以及优选地缺铁性贫血的方法，所述方法包含向受试者施用预防有效量的Ent和/或Ent类似物和其药学上可接受的载体和/或其药学上可接受的盐和/或其药物组合物。

在另一个实例中，本发明的一个方面涉及治疗有需要的受试者的铁缺乏的方法，所述方法包含通过引入益生菌和/或共生递送载体向受试者施用治疗有效量的Ent。在另一个实例中，本发明的一个方面涉及治疗有需要的受试者的铁缺乏的方法，所述方法包含通过引入益生菌和/或共生递送载体向受试者施用预防有效量的Ent。

例如，本发明的一个方面涉及治疗有需要的受试者的铁缺乏以及优选地缺铁性贫血的方法，所述方法包含通过非致病性共生菌和/或益生菌向受试者施用治疗有效量的Ent或其类似物。在此实施例中，本发明可以包含可以被配置成在受体宿主中表达和/或过表达Ent的经过基因修饰的非致病性共生供体细菌和/或益生菌供体细菌。在一个实施例中，经过基因修饰的非致病性共生供体细菌和/或益生菌供体细菌可以被配置成表达和/或过表达参与Ent生物合成的一个或多个基因。例如，在此优选实施例中，参与Ent生物合成的一个或多个基因可以是表达盒的一部分并且进一步与一个或多个表达控制序列可操作地连接。在优选实施例中，此启动子可以是组成型启动子。

在一个实施例中，上文提及的基因工程化益生菌和/或共生菌中的一种或多种基因工程化益生菌和/或共生菌可以是药物组合物和/或营养药物组合物的一部分。在另外的实施例中，分离的Ent和/或上文提及的基因工程化益生菌和/或共生菌中的一种或多种基因工程化益生菌和/或共生菌可以是可以施用治疗有效量以治疗疾病病状的食物或饮品添加剂的一部分。在另一个实施例中，分离的Ent和/或上文提及的基因工程化益生菌和/或共生菌中的一种或多种基因工程化益生菌和/或共生菌可以是补充剂的一部分并且可以进一步与另外的膳食补充剂如膳食铁补充剂偶联。

当表达控制序列控制并调节多核苷酸序列的转录和/或翻译时，核苷酸序列或所述多核苷酸序列“与一个或多个表达控制序列(或例如启动子和任选地增强子)可操作地连接”。如本文所用，短语“基因产物”是指RNA分子或蛋白质。

此外，术语“基因”有时可以是指基因序列、所述基因的经过转录的和可能经过修饰的mRNA或所述mRNA的经过翻译的蛋白质。

这种Ent生物合成基因的实例可以包含entB、entD、entE和/或entF。另外的实施例可以包含参与Ent前体的生物合成的基因，包含entC、entB和entA。这种基因对于受试者可以是异源的和或内源的并且包含所述基因的所有同源物和直系同源物。应当注意，上文提及的基因的核酸和氨基酸序列在本领域普通技术人员的知识范围内并且通过引用明确地并入本文。如本文所用，术语“益生菌”通常是指可以在足以向目标宿主递送治疗有效量的Ent的时间内定殖所述宿主的细菌。

术语“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”是指本发明中有用的化合物不含其它不相似化合物，所述化合物通常以其自然状态与所述其它不相似化合物缔合，使得所述化合物占给定样品或组合物的质量的至少0.5重量％、1重量％、5重量％、10重量％、20重量％、50重量％、75重量％、80重量％、85重量％、90重量％、95重量％、96重量％、97重量％、98重量％、99重量％、99.5重量％或99.9重量％。在一个实施例中，这些术语是指化合物占给定样品或组合物的质量的至少95重量％、98重量％、99重量％或99.9重量％。

术语“药学上可接受的盐”是指在合理医学判断范围内适用于与人和其它动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的效益/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，Berge等人在通过引用并入本文的《药物科学期刊(J.Pharmaceutical Sciences)》,1977,66,1-19中详细描述了药学上可接受的盐。

本发明的化合物的药学上可接受的盐包含衍生自合适的无机和有机酸和碱的盐。盐可以在化合物的最终分离和纯化期间制备或者通过使呈游离碱形式的适当化合物与合适的酸反应来单独制备。代表性酸加成盐包含乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、L-抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)(苯磺酸盐(besylate))、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、二葡萄糖酸盐、甲酸盐、富马酸盐、龙胆酸盐、戊二酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、马尿酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、

马来酸盐、丙二酸盐、DL-扁桃酸盐、均三甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、膦酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、焦谷氨酸盐、琥珀酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、L-酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐(para-toluenesulfonate)(对甲苯磺酸盐(p-tosylate))和十一烷酸盐。此外，本文公开的化合物中的碱基可以用以下季铵化：甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯；癸基、月桂基、肉豆蔻基和甾醇基氯化物、溴化物和碘化物；以及苯甲基和苯乙基溴化物。可以用来形成治疗上可接受的盐的酸的实例包含：无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸；以及有机酸，如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。“碱加成盐”是指衍生自适当的碱的盐，这些盐包含碱金属、碱土金属和季胺盐。因此，本发明设想了本文公开的化合物的钠盐、钾盐、镁盐和钙盐等。碱加成盐可以在化合物的最终分离和纯化期间通常通过使羧基与合适的碱(如金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。治疗上可接受的盐的阳离子包含：锂、钠(通过使用例如NaOH)、钾(通过使用例如KOH)、钙(通过使用例如Ca(OH)₂)、镁(通过使用例如Mg(OH)₂和乙酸镁)、锌(通过使用例如Zn(OH)₂和乙酸锌)和铝；以及无毒季胺阳离子，如铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因(procaine)、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺、l-非那明(l-ephenamine)和N,N-二苄基乙二胺。可用于形成碱加成盐的其它代表性有机胺包含乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪、氢氧化胆碱、羟乙基吗啉、羟乙基吡咯烷酮、咪唑、n-甲基-d-葡糖胺、N,N'-二苄基乙二胺、N,N'-二乙基乙醇胺、N,N'-二甲基乙醇胺、三乙醇胺和氨丁三醇。还设想了碱性氨基酸(例如，1-甘氨酸和1-精氨酸)和在中性pH下(例如，甜菜碱(N,N,N-三甲基甘氨酸))呈两性离子的氨基酸。

术语“施用(administer、administering或administration)”是指注射、植入、吸收、摄入可以是药物组合物的一部分的Ent或者摄入被配置成产生如本文描述的Ent的益生菌或其药物组合物中的益生菌。

术语“治疗(treatment、treat和treating)”是指逆转、缓解、延迟本文描述的“病理病状”(例如，疾病、病症或病状或其一种或多种体征或症状)的发作或抑制其进展。在一些实施例中，可以在出现或观察到一种或多种体征或症状后施用治疗。在其它实施例中，可以在不存在疾病或病状的体征或症状的情况下施用治疗。例如，可以在症状发作之前(例如，根据症状历史和/或根据遗传或其它易感因素)向易感个体施用治疗。症状小退后，也可以继续治疗，例如以延迟或预防复发。在优选实施例中，治疗可以针对铁缺乏相关病症，如缺铁性贫血。

“治疗有效量”的本发明的化合物，优选地Ent或Ent类似物，或其药物组合物为足以在治疗疾病或者延迟与病状相关的一个或多个症状或将与病状相关的一个或多个症状减到最少时提供治疗益处的量。治疗有效量的化合物意指单独的或与其它疗法组合的治疗剂的量，所述量在治疗病状时提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以涵盖改善整体疗法、减少或避免病状的症状或原因和/或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。“治疗有效量”还可以意指“预防有效量”的本发明的化合物为足以预防疾病或与病状相关的一个或多个症状或预防其复发的量。预防有效量的化合物意指单独的或与其它疗法组合的治疗剂的量，所述量在预防病状时提供预防益处。术语“预防有效量”可以涵盖改善整体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。

本文描述的药物组合物可以通过药理学领域中已知的任何方法来制备。通常，这种制备方法包含以下步骤：使化合物Ent或Ent类似物或Ent缀合物或被配置成产生和或过产Ent(即，“活性成分”)的益生菌与载体或赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分缔合并且然后如果需要和/或期望则使产物成形和/或包装成期望的单剂量单位或多剂量单位。药物组合物或营养药物组合物可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量批量制备、包装和/或出售。“单位剂量”为包括预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将被施用于受试者的活性成分的剂量和/或这种剂量的合宜部分，例如这种剂量的一半或三分之一。

活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或本发明的药物组合物中的任何另外的成分的相对量将有所不同，这取决于被治疗受试者的身份、大小和/或病状并且进一步取决于组合物将被施用的途径。组合物可以包括介于0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。

在制造所提供药物组合物时使用的药学上可接受的赋形剂包含惰性稀释剂、分散剂和/或成粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、结合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。组合物中还可以存在如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂等赋形剂。

示例性稀释剂包含碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉和其混合物。

示例性成粒剂和/或分散剂包含马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羧甲淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木材产物、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯基-吡咯烷酮)(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羧甲淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预胶凝淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝(威格姆(Veegum))、月桂基硫酸钠、季铵化合物以及其混合物。

示例性表面活性剂和/或乳化剂包含天然乳化剂(例如，阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄蓍胶、角叉菜胶(chondrux)、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶质粘土(例如，膨润土(硅酸铝)和铝硅酸镁盐(硅酸铝镁))、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如，硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、三乙酸甘油酯、单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯和单硬脂酸丙二醇酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如，羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、卡拉胶(carrageenan)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素钠、粉状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、山梨醇酐脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯(

20)、聚氧乙烯山梨醇酐(

60)、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(

80)、山梨醇酐单棕榈酸酯(

40)、山梨醇酐单硬脂酸酯(

60)、山梨醇酐三硬脂酸酯(

65)、单油酸甘油酯、山梨醇酐单油酸酯(

80)、聚氧乙烯酯(例如，聚氧乙烯单硬脂酸酯(

45)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸脂和

)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如，

)、聚氧乙烯醚(例如，聚氧乙烯月桂基醚(

30))、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、二甘醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、

F-68、泊咯沙姆(Poloxamer)P-188、溴化十六烷基三甲铵、氯化十六烷基吡啶、苯扎氯铵、多库酯钠和/或其混合物。

示例性结合剂包含淀粉(例如，玉米淀粉和淀粉糊)、明胶、糖(例如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇等)、天然胶和合成胶(例如，阿拉伯胶、海藻酸钠、角叉菜提取物、潘瓦胶(panwar gum)、印度树胶(ghatti gum)、依莎贝果壳粘液(mucilageof isapol husks)、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、硅酸铝镁((

和落叶松阿拉伯半乳聚糖)、海藻酸盐、聚氧化乙烯、聚乙二醇、无机钙盐、硅酸、聚甲基丙烯酸酯、蜡、水、醇和/或其混合物。

示例性防腐剂包含抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、抗原生动物防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和其它防腐剂。在某些实施例中，防腐剂是抗氧化剂。在其它实施例中，防腐剂是螯合剂。

示例性抗氧化剂包含α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠。

示例性螯合剂包含乙二胺四乙酸(EDTA)以及其盐和水合物(例如，依地酸钠、依地酸二钠、依地酸三钠、依地酸钙钠、依地酸二钾等)、柠檬酸以及其盐和水合物(例如，一水柠檬酸)、富马酸以及其盐和水合物、苹果酸以及其盐和水合物、磷酸以及其盐和水合物以及酒石酸以及其盐和水合物。示例性抗微生物防腐剂包含苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、溴硝醇、溴化十六烷基三甲铵、氯化十六烷基吡啶、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和硫柳汞。

示例性抗真菌防腐剂包含对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和山梨酸。

示例性醇防腐剂包含乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚类化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸盐和苯乙醇。

示例性酸性防腐剂包含维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和植酸。

其它防腐剂包含生育酚、乙酸生育醇、甲磺酸得立肟(deteroxime mesylate)、溴化十六烷基三甲铵、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基乙醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、

Plus、

对羟基苯甲酸甲酯、

115、

II、

和

示例性缓冲剂包含柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、D-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、戊酮酸钙(calcium levulinate)、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、磷酸氢氧化钙(calcium hydroxide phosphate)、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、乙醇和其混合物。

示例性润滑剂包含硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠和其混合物。

示例性天然油包含扁桃仁油、杏仁油、鳄梨油、巴巴苏油、佛手柑油、黑加仑籽油、琉璃苣油、杜松油、洋甘菊油、芥花油、葛缕子油、棕榈蜡油、蓖麻油、肉桂油、可可脂油、椰子油、鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉花籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶醇油、葫芦油、葡萄籽油、榛子油、海索草油、肉豆蔻酸异丙酯油、荷荷巴油、夏威夷核果油、杂薰衣草油、薰衣草油、柠檬油、山苍子油、夏威夷果仁油、锦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、水貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙子油、橙连鳍鲑油、棕榈油、棕仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、山茶花油、香薄荷油、沙棘油、芝麻油、乳木果油、硅油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、椿油、香根草油、胡桃油和小麦胚芽油。示例性合成油包含但不限于硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、二甲硅油360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和其混合物。

用于口服和肠胃外施用的液体剂型包含药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂，所述药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂优选地含有单位剂量的Ent或单位剂量的被配置成表达或过表达Ent的益生菌。除了活性成分之外，液体剂型还可以包括本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(例如，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯以及其混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包含佐剂，如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂。在肠胃外施用的某些实施例中，本发明的缀合物与增溶剂如

醇、油、改性油、乙二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和其混合物混合。

可注射制剂例如无菌可注射水性或油性悬浮液可以使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂根据已知技术进行调配。无菌可注射制剂可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如，如在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒剂和溶剂是水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油常规被用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包含合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，在制备可注射剂时使用脂肪酸如油酸。

可注射调配物可以例如通过经由细菌保留过滤器过滤或通过掺入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可以在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。

为了延长药物的作用，通常希望减缓来自皮下注射或肌内注射的药物的吸收。这可以通过使用水溶性差的晶体或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶解速率进而可以取决于晶体大小和晶形。可替代地，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收可以通过将药物溶解或悬浮于油性媒剂中来实现。

用于口服施用的固体剂型包含胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒剂。在这种固体剂型中，活性成分与以下混合：至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体，如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或(a)填充剂或增充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)结合剂，例如羧甲纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，如甘油；(d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(e)溶液阻滞剂，如石蜡；(f)吸收促进剂，如季铵化合物；(g)湿润剂，例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(h)吸收剂，如高岭土和膨润土；以及(i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型可以包含缓冲剂。

可以采用类似类型的固体组合物作为使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充剂。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以制备有包衣和外壳，如肠溶包衣和药理学领域中众所周知的其它包衣。所述固体剂型可以任选地包括乳浊剂并且可以是这样的组合物：所述固体剂型可以仅或者优先在肠道的某个部分中任选地以延迟的方式释放一种或多种活性成分。可以使用的包囊组合物的实例包含聚合物质和蜡。可以采用类似类型的固体组合物作为使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充剂。

活性成分可以与如上文所指出的一或多种赋形剂一起呈微包囊形式。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以制备有包衣和外壳，如肠溶包衣、控释包衣和药物调配领域中众所周知的其它包衣。在这种固体剂型中，活性成分可以与至少一种惰性稀释剂，如蔗糖、乳糖或淀粉混合。按照一般的惯例，这种剂型除了惰性稀释剂以外可以包括另外的物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型可以包括缓冲剂。所述固体剂型可以任选地包括乳浊剂并且可以是这样的组合物：所述固体剂型可以仅或者优先在肠道的某个部分中任选地以延迟的方式释放一种或多种活性成分。可以使用的包囊剂的实例包含聚合物质和蜡。

本文提供的化合物和组合物可以通过任何途径施用，所述途径包含肠内(例如，口服)、肠胃外、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、心室内、透皮、真皮间、直肠、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉末、软膏剂、霜剂和/或滴剂)、粘膜、鼻、颊或舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入施用；和/或作为口腔喷雾、鼻腔喷雾和/或气雾剂施用。本文公开的化合物和组合物的具体设想的施用途径为吸入和鼻内施用、皮下施用、粘膜施用和真皮间施用。最适当的施用途径通常将取决于各种因素，包含药剂的性质(例如，其在胃肠道的环境中的稳定性)和/或受试者的病状(例如，受试者是否能够耐受口服施用)。

达到有效量所需的“活性成分”的确切的量将因受试者的不同而不同，这取决于例如受试者的物种、年龄和一般情况、副作用或病症的严重程度、特定化合物的性质(identity)、施用模式等。可以一天三次、一天两次、一天一次、每隔一天、每隔两天、每周、每两周、每三周或每四周递送期望的剂量。在某些实施例中，可以使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)递送期望的剂量。

在某些实施例中，用于向70kg成年人一天施用一次或多次的化合物的有效量可以包括每单位剂量约0.0001mg到约3000mg、约0.0001mg到约2000mg、约0.0001mg到约1000mg、约0.001mg到约1000mg、约0.01mg到约1000mg、约0.1mg到约1000mg、约1mg到约1000mg、约1mg到约100mg、约10mg到约1000mg或约100mg到约1000mg的化合物。

本发明还涵盖了试剂盒(例如，药物包)。所提供的试剂盒可以包括化合物Ent或组合物(例如，药物组合物或诊断组合物)以及容器(例如，小瓶、安瓿、瓶、注射器和/或分配器包装或其它合适的容器)。所提供的试剂盒可以包括选择性地结合肠杆菌素或组合物(例如，药物组合物或诊断组合物)的抗体以及容器(例如，小瓶、安瓿、瓶、注射器和/或分配器包装或其它合适的容器)。在一些实施例中，所提供的试剂盒可以任选地进一步包含第二容器，所述第二容器包括用于稀释或悬浮本发明的药物组合物或化合物的赋形剂(例如，药学上可接受的赋形剂)。在一些实施例中，将第一容器和第二容器中所提供的化合物Ent或组合物组合以形成一个单位剂型。在另一个方面，本发明提供了包含包括使用化合物Ent产生的抗体，即选择性地结合肠杆菌素的抗体的第一容器的试剂盒。

术语“受试者”是指任何动物。在某些实施例中，受试者是哺乳动物。在某些实施例中，受试者是人(例如，男人、女人或儿童)。人可以是任何性别并且可以处于任何发育阶段。在某些实施例中，受试者已被诊断出患有要治疗的病状或疾病。在其它实施例中，受试者处于患上病状或疾病的风险中。在某些实施例中，受试者为实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猪或灵长类动物)。实验动物可以是基因工程化的。在某些实施例中，受试者是家养动物(例如，狗、猫、鸟、马、奶牛、山羊、绵羊或鸡)。

实例

实例1：细菌突变体筛选鉴定大肠杆菌产生的肠杆菌素对宿主发育的益处。

在本发明技术的一个实施例中，本发明的发明人创建用于促进对有益于宿主动物的生长和发育的微生物代谢物的鉴定的独特测定。本发明的发明人的先前研究揭示了，热灭活的(HK)大肠杆菌缺乏秀丽隐杆线虫幼虫生长共同所需的某些分子。当向HK大肠杆菌板补充痕量活大肠杆菌(单独的HK大肠杆菌不能支持蠕虫生长(图1A))时幼虫生长恢复，这表明痕量活细菌生成了使HK食物可用的代谢物。此独特的喂食条件被用于寻找潜在地由于其不能提供特定代谢物以使宿主动物受益而因此未能支持正常的蠕虫生长的大肠杆菌突变体。在筛选大肠杆菌单基因敲除库(大肠杆菌Keio收藏(Keio collection))之后，本发明的发明人发现，喂食肠杆菌素(Ent)生物合成遭到破坏的五种大肠杆菌突变体中的痕量任何大肠杆菌突变体的蠕虫生长得显著较慢(图1B、C)。引人注目的是，本发明的发明人观察到，通过膳食补充Ent，完全克服了蠕虫生长缺陷(图1D和图8A)。另外，补充代谢中间物2,3-DHBA挽救了entA大肠杆菌上的蠕虫生长，但未挽救entF大肠杆菌上的蠕虫生长(图1C、E)，这证实了仅最终产物Ent可以向蠕虫提供此益处。

本发明的发明人进一步表明，Ent对蠕虫生长的此有益作用可能与Ent作为铁载体的细菌性使用无关。具体地，破坏对铁Ent的大肠杆菌外膜受体进行编码(图8B)的fepA不影响蠕虫发育(图1F和图8C)。本发明的发明人还发现，entA和entF突变体细菌在概述的培养条件下或在蠕虫肠道定殖中未表现出明显的生长缺陷(图8D和E)。

补充两种其它铁载体(荧光嗜铁素和铁色素)未能对蠕虫生长产生类似的影响(图1G和图8F)，这表明观察到的Ent的作用具有特异性。先前的研究表明，铜绿假单胞菌产生的铁载体因在液体培养中损害宿主线粒体而对秀丽隐杆线虫有毒性(Kirienko等人,2015)，从而提出了这样的问题：荧光嗜铁素或铁色素的负面结果是否主要是由于这些铁载体的毒性。本发明的发明人因此利用固体培养基在鉴定的培养条件下进行了测试并观察到喂食野生型大肠杆菌并且补充有荧光嗜铁素或铁色素的秀丽隐杆线虫中没有明显的生长缺陷(图8F)或线粒体形态缺陷(图8G)。另外，本发明的发明人发现，即使在液体培养中Ent补充也不会破坏线粒体形态(图8H)，这与荧光嗜铁素的影响不同。

为了评价整个蠕虫的铁载体水平，对已建立的测定(Schwyn和Neilands,1987)进行改良，并且本发明的发明人发现，喂食野生型大肠杆菌的蠕虫含有的铁载体水平显著高于喂食entF突变体大肠杆菌的蠕虫(图1H)。鉴于已知高铁水平会抑制Ent生物合成(Kwon等人,1996)，在培养条件下从大肠杆菌产生Ent与参考的实验中的相对较低的铁培养基相一致。

单独的Ent补充不能对仅喂食HK细菌的蠕虫的发育产生任何可感知的影响(图81)，这表明HK细菌不仅仅只是缺乏Ent或任何一种特定代谢物(Qi等人,2017)。相反，喂食大量活entA或entF突变体细菌的蠕虫继续以较慢速率生长(图1I)，这证实了通过新灵敏测定系统明显检测到Ent对宿主发育的显著益处(图1BD)。Ent对动物生长的这种益处在某些自然环境中也可以是明显的。

实例2：细菌肠杆菌素促进宿主的铁池。

由于Ent对Fe³⁺具有高亲和力，因此Ent可以通过影响铁稳态潜在地有益于宿主动物的生长和发育。本发明的发明人采用常用的荧光细胞可渗透性染料钙黄绿素AM(所述钙黄绿素AM的发射通过铁结合进行猝灭)并且如先前所描述的将所述钙黄绿素AM应用于活蠕虫以估计宿主的整体铁水平。喂食entA或entF突变体细菌的蠕虫具有低得多的铁水平，如大幅增加的荧光强度所证明的，并且贴水平通过Ent补充得到恢复(图2A)。本发明的发明人还检查对铁储存蛋白铁蛋白的秀丽隐杆线虫同源物进行编码的铁反应性基因ftn-2的表达(Romney等人,2011)。pfln-2::GFP报告基因的表达在喂食entA或entF突变体细菌的蠕虫中大幅减少(图2B)。因此，细菌Ent提升了宿主秀丽隐杆线虫的铁水平。

为了排除蠕虫生长状态对Ent促进的铁水平增加的影响，本发明的发明人使用两种铁标志物表明，喂食HK大肠杆菌的蠕虫显示出较低的铁水平，并且这种缺陷通过Ent补充得到抑制(图2C、D)，而蠕虫在两种条件下均保持停滞。相反，铁水平在仅喂食大量活entA或entF突变体细菌的蠕虫中较低(图2E)，其中虽然速率减慢，但蠕虫继续生长(图1H)。因此，Ent对宿主铁水平的影响与其它喂食条件和蠕虫生长无关。

来自仅喂食HK食物的结果(图2C、D)提供了另外的证据：有益的Ent效应不是由于Ent的细菌性使用的二次效应。

基于配方以及在充满铁的条件下细菌内的Ent生物合成将受到抑制的事实，接种有大肠杆菌作为食物的典型蠕虫生长培养基(NGM板)似乎呈现出低铁环境。向食物添加更多Fe³⁺(FeCl₃)既未抑制喂食缺乏Ent的食物的动物的生长缺陷(图9A)也未提高细胞铁水平(图9B)。添加血红素也不影响动物生长(图9C)。因此，无论食物中的铁水平如何，Ent均可以促进最佳的铁摄取和秀丽隐杆线虫的生长。如果Ent是最佳的秀丽隐杆线虫发育所需的，则在本发明的新测定系统中向野生型大肠杆菌添加更多三氯化铁(图2F)预计将抑制活大肠杆菌源中的Ent产生并且因此使蠕虫生长减缓。事实上，本发明的发明人在向活大肠杆菌添加三氯化铁的情况下观察到蠕虫生长缺陷，并且此生长缺陷通过Ent补充得到抑制(图2F、9D)。这证明即使在富铁环境中也需要Ent，这进而可以表明，秀丽隐杆线虫的肠道中的铁水平通常达不到导致来自肠道微生物群的Ent产生被完全抑制的高度。

此外，先前的研究表明，在用CaEDTA处理蠕虫的缺铁条件下，蠕虫的铁水平和生长速率降低(Klang等人,2014)(图2G)。然而，通过添加更多FeCl₃或通过Ent补充，这两种缺陷得到抑制(图2G)。引人注目的是，10倍FeCl₃补充将喂食CaEDTA的蠕虫的铁水平恢复到在喂食CaEDTA加上另外的Ent的蠕虫中观察到的水平(图2G)，这间接地表明，在此条件下，Ent介导的铁摄取可以负责蠕虫的至少10倍铁水平增加。结果表明，在缺铁条件下Ent对宿主铁稳态有深刻影响。

实例3：细菌肠杆菌素与宿主ATP合酶α亚基结合。

为了理解Ent对蠕虫铁稳态的影响背后的机制，本发明的发明人采用使用固定化Ent的亲和色谱法和随后的质谱分析来鉴定蠕虫的Ent结合蛋白(图3A)。在两个独立实验中均捕获到仅两种候选蛋白CTL-2和ATP-1(图3A和表1)。CTL-2是已知结合铁的过氧化氢酶的同源物。ATP-1是线粒体ATP合酶的在铁的生物学中的作用未知的α亚基(Junge和Nelson,2015)。本发明的发明人然后测试每种蛋白质对于Ent对动物生长的影响的需要。atp-1基因的RNAi而非ctl-2阻止了通过Ent补充来挽救蠕虫生长(图3B)，这表明ATP-1而不是CTL-2可能在介导宿主中观察到的Ent功能中发挥关键作用。

本发明的发明人然后进行三个另外的测试来证实Ent与ATP-1的结合。首先，在体内测定中，向蠕虫喂食细菌+/-生物素-Ent并分离出总蛋白提取物，然后进行链霉亲和素珠纯化和SDS-PAGE。使用针对哺乳动物ATP合酶α亚基的抗体通过蛋白质印迹清晰地检测到ATP-1蛋白(图3C和图10A)，这表明Ent与ATP-1之间相互作用。其次，在体外结合测定中，本发明的发明人发现生物素-Ent(无铁)高效地与ATP-1-His结合(图3D)，并且所述结合可能会被过量的Ent竞争超过(图3E)。正如无铁生物素-Ent一样，铁结合的生物素-Ent还结合了ATP-1蛋白(图10B、C)。

最后，本发明的发明人测试Ent介导ATP-1与铁之间的相互作用的能力。本发明的发明人向蠕虫裂解物添加了放射性标记的铁(55FeCl₃)并且然后对ATP-1进行免疫沉淀。通过测量ATP-1-IP样品中的放射性，本发明的发明人发现，添加Ent(而不是其它两种铁载体)大幅增加了ATP-1与55Fe的结合(图3F)，从而证明了Ent在介导ATP-1与铁之间的相互作用中的特定作用。另外的分析表明，ATP-1的21氨基酸序列在Ent结合中起关键作用(图10D-F)。(值得注意的是，关于图11D，秀丽隐杆线虫的ATP-1氨基酸序列在本文中被鉴定为SEQID NO.7，而人ATP-1氨基酸序列在本文中被鉴定为SEQ ID NO.8。)这些结果共同表明，细菌Ent与真核ATP-1直接结合，这促进了ATP-1与铁的相互作用。

实例4：ATP-1是以肠杆菌素依赖性方式促进宿主铁水平所需要的。

本发明的发明人接下来测试Ent是否通过Ent-ATP-1复合物来促进宿主铁池。通过表明ATP-1功能丧失(lf)秀丽隐杆线虫突变体或用atp-1(RNAi)处理的野生型蠕虫的铁水平大幅降低，如钙黄绿素-AM荧光的增加所指示的(图4A、B)，本发明的发明人首先确定ATP-1在铁稳态中的作用。本发明的发明人然后确定Ent

在促进蠕虫的铁水平方面的效应依赖于ATP-1，因为atp-1的RNAi消除了在向entF突变体细菌补充Ent的情况下看到的铁水平增益(图4C)。还发现HK大肠杆菌+/-Ent对生长停滞的动物的影响(图2C)也依赖于atp-1(图4D)。最后，通过对ATP合酶的其它三个亚基中的每个亚基的RNAi敲除，未显著改变宿主铁水平(图4B)，这表明ATP-1对铁水平的影响不太可能是由于破坏ATP合酶功能的间接影响。因此，细菌Ent通过其与ATP合酶α亚基的相互作用来促进宿主铁稳态。

实例5：观察到的ATP-1功能与其在ATP合酶中的作用无关。

如同ATP合酶α亚基，ATP-1预计将与此大型酶复合物的β亚基和其它亚基相互作用。使用免疫染色，本发明的发明人观察到哺乳动物ATP合酶的α亚基(ATP5A1)和β亚基(ATP5B)在线粒体中的共定位(图11A)。与ATP合酶必不可少的作用相一致，atp-1和alp-2两者中的功能丧失突变显示出秀丽隐杆线虫的L1停滞表型(图4A)。atp-1或atp-2的RNAi也显示出生长缺陷(图11B、C)。因此，测试ATP-1在促进宿主铁池方面的功能是否依赖于ATP合酶的其它亚基。发现，ATP-1与Ent的结合不受ATP合酶(ATP-2)的β亚基的RNAi的影响(图11C)，并且如图4B中指示的，在用基因针对β、b和O亚基的RNAi处理的蠕虫中未看到由atp-1(RNAi)引起的铁水平下降。因此，ATP-1的此作用与其它ATP合酶亚基无关。

由于与ATP结合是α亚基在ATP合酶中的作用的关键部分，因此本发明的发明人寻求确定ATP结合结构域是否是Ent相互作用和在促进铁水平方面的作用所需要的。因此，本发明的发明人使ATP-1蛋白序列中缺失残基198-205(DRQTGKTA)(图11D)并通过体外结合测定发现，此缺失没有降低此蛋白与Ent结合的能力(图4E)，从而表明ATP-1-Ent结合与ATP-1-ATP结合无关。本发明的发明人接下来测试此ATP-1(del)蛋白的转基因表达是否足以在Ent介导的铁摄取中发挥ATP-1的功能。如图4A中指示的，此蛋白在[Prpl-28::atp-1(del)]转基因的核糖体基因启动子之后的表达显著抑制了由atp-1(lf)突变引起的铁水平下降。因此，ATP-1在与Ent相互作用和促进铁摄取两方面的功能与其在ATP结合中的作用无关。

实例6：肠杆菌素-ATP-1相互作用促进宿主线粒体中的铁水平。

由于铁向线粒体中的转运在很大程度上影响不稳定铁池和整体铁稳态，因此本发明的发明人寻求确定细菌Ent和其与宿主ATP-1的相互作用是否促进线粒体中的铁水平。本发明的发明人首先观察到ATP-1与MitoTracker标志物在肠内的共定位(图12A)，这与ATP-1在线粒体中的功能相一致。本发明的发明人然后进行从针对哺乳动物细胞发表的方案(Devireddy等人,2010)改良的体内测定，以检查Ent-ATP-1相互作用在促进线粒体铁水平方面的作用。将蠕虫用RNAi处理并且喂食55FeCl₃+/-Ent，然后进行线粒体的分离和放射性(55Fe)的测量。在Ent补充下，线粒体铁(55Fe)增加了三倍，并且此增加依赖于ATP-1，但不依赖于其它ATP合酶亚基(图5A)。另外，本发明的发明人表明，从喂食野生型大肠杆菌的蠕虫中分离出的线粒体含有比喂食entF突变体细菌的蠕虫显著更高的铁载体水平，这表明Ent也进入线粒体(图5B)，并且当通过RNAi使ATP-1减少时，线粒体中的Ent水平显著降低(图5C)。因此，细菌Ent促进宿主线粒体铁水平增加，并且此过程需要ATP-1在宿主线粒体中具有新的与ATP合酶无关的功能。

实例7：ATP-1在线粒体中起促进线粒体中的Ent-Fe3+水平增加的作用。

ATP合酶α亚基驻留于线粒体基质中，并且此蛋白通过充分表征的线粒体蛋白转运机制转运到线粒体中。因此，ATP-1可以通过“共转运”模型促进Ent-Fe³⁺输入线粒体种，所述共转运模型需要ATP-1在转运之前与Ent结合。为了测试此模型，本发明的发明人寻求确定是否可以在没有ATP-1合成或穿梭到线粒体的情况下观察到Ent和ATP-1在纯化的线粒体中的作用。

在从针对哺乳动物细胞发表的方案(Devireddy等人,2010；通过引用并入本文)改良的此体外测定中，本发明的发明人首先从经过RNAi处理的蠕虫中提取线粒体并且然后添加55FeCl₃+/-Ent，之后进行55Fe的定量。添加Ent将线粒体中的铁(55Fe)水平大幅增加了10倍，并且当用atp-1的RNAi处理蠕虫时，此增加大大减少，但对于用靶向其它三个ATP合酶亚基的RNAi处理的蠕虫则没有(图5D)。

这一结果进一步证明了Ent和ATP-1而非ATP合酶的其余部分在促进线粒体铁水平方面的作用。由于在测定混合中不可能产生新的ATP-1蛋白，因此此测定的结果可能排除潜在的“共转运”模型并且可以表明ATP-1通过与线粒体内的Ent结合来促进线粒体Ent-Fe输入。此“保留”模型进而表明，Ent-Fe³⁺通过其它方式进入线粒体并且可以具有在无ATP-1相互作用的情况下离开的较高倾向，这可以与Ent可以通过被动渗透进入哺乳动物细胞的假设相一致。与体内测定(图5A)相比在体外测定(图5D)中观察到的更强的Ent效应可以是由于Ent在体外测定条件下针对线粒体环境对溶液有更强的亲和力。

为了观察Ent介导的线粒体铁水平增加的功能性影响，本发明的发明人在本发明的发明人的培养条件下测试蠕虫中Ent对铁依赖性线粒体酶的影响。发现，两种线粒体Fe-S簇酶顺乌头酸酶和琥珀酸脱氢酶的活性通过补充Ent得到了显著增加(图5E、F)，从而证明了Ent-ATP-1复合物在向线粒体中的Fe-S簇和其它含铁分子供应铁的作用。

实例8：Ent与ATP5A1相互作用以促进线粒体铁摄取到哺乳动物细胞中。

序列比对表明来自秀丽隐杆线虫(ATP-1，线虫(Wormbase)；SEQ ID NO.7)与人(ATP5A1，NCBI；SEQ ID NO.8)的ATP合酶α亚基之间存在78％的同一性(图11D)。使用CAS染色，本发明的发明人观察到补充到培养基的Ent可以进入人HEK293T细胞(图6A)。为了测试哺乳动物体内是否保留了此Ent-ATP-1功能，本发明的发明人使用来自人HEK293T细胞培养的+/-生物素-Ent的总蛋白提取物重复前述生物素-Ent下拉测定(图3A)。清晰地检测到ATP5A1(图6B)，从而证明Ent也与哺乳动物细胞中的ATP5A1结合。在体外结合测定中，生物素-Ent直接与人蛋白ATP5A1结合，并且所述结合因过量的游离Ent的存在而被有效地竞争掉(图6C)。在第三测定中，本发明的发明人向细胞裂解物+/-Ent添加放射性标记的铁(55FeCl₃)，然后使用ATP5A1抗体进行IP。Ent的存在增加了ATP5A1-IP样品中的55Fe水平(图6D)。这些数据一起表明，哺乳动物细胞中保留了Ent与ATP合酶α亚基之间的相互作用。

为了测试人类细胞中是否也保留了Ent-ATP-1复合物在促进线粒体铁摄取方面的功能，本发明的发明人执行体内线粒体铁摄取测定和体外线粒体铁摄取测定两者并且发现在两个测定中Ent的添加显著地增加了线粒体中的铁水平(图6E、F)。此外，使用siRNA敲除(图13A)，本发明的发明人观察到，此Ent介导的增加以与针对秀丽隐杆线虫的测定(图5A、D)类似的方式依赖于ATP5A1(图6E、F)。本发明的发明人还通过使用荧光线粒体铁指示剂RPA测量细胞中的线粒体铁水平，铁与RPA的结合会猝灭RPA的荧光。补充Ent增加了细胞中的线粒体铁水平，并且此铁提升性效应在用ATP5A1 siRNAi处理的细胞中未看到(图6G)。与喂食热灭活的食物的蠕虫中的差异(图2)相比针对培养的细胞看到的相对较小的变化可能潜在地是由于细胞培养条件下更高的原铁水平。这些数据证明，Ent影响哺乳动物线粒体铁水平并且以ATP5A1依赖性方式影响。

实例9：在具有铁螯合剂的培养基中，Ent添加增加了人HEK293细胞中的铁摄取。

在图2G中，本发明的发明人示出了在缺铁条件下(添加了铁螯合剂)Ent将铁移入活秀丽隐杆线虫的强效应。这里，在人HEK293细胞中进行类似测试。当向培养基添加铁螯合剂去铁胺(DFO)时，细胞中的铁水平显著降低，如钙黄绿素AM染色荧光的增加所指示的。通过向培养基中添加Ent(1.5μM)，铁水平基本恢复。在添加Ent(45％)的情况下钙黄绿素AM荧光的减少比图6G所示的不使用DFO的情况下的测试更强，从而表明低铁条件对Ent的存在更敏感。此结果证明了Ent将铁(低水平游离铁或与DFO结合的铁)移入细胞中的有效性。

实例10：Ent和ATPSα促进铁跨脂质体的脂质双层运输。

发明人在体外使用合成的脂质体来测试Ent使铁跨脂质双层移动的能力。简要来说，将FeCl₃+/-Ent(1.5μM)添加到由商业脂质(阿凡提脂质公司(Avanti Lipids))形成的新鲜脂质体。通过已建立的方法将ATPSα(ATP-1或ATP5A1)添加到脂质体。如图19中示出的，与脂质体缔合的Fe³⁺水平

通过两种方法测量：(A)钙黄绿素AM染色：将钙黄绿素AM染料添加到脂质体+/-ATPSα并且测量脂质体的荧光强度；(B)将脂质体与放射性标记的Fe³⁺(⁵⁵FeCl₃)温育并且测量脂质体的放射性(相对CPM)。由于钙黄绿素AM仅存在于内部，因此方法(A)测量脂质体内部的铁。方法(B)是可能不排除脂质体外部的铁的更简单方法。在每个测试中，Ent的存在明显提升了脂质体内部(A)或与脂质体缔合(B)的铁水平。

实例11：通过口服管饲法进行Ent补充促使贫血小鼠模型(膳食贫血)的血红蛋白 和脾铁水平增加。

发明人向3周龄的雌性小鼠6周喂食缺铁膳食(IDD)(或对照膳食)以诱导贫血(通过血红蛋白测量来证实)。然后在两周内通过口服管饲法(每两天一次)用+/-Ent(两个浓度)或+/-FeS0₄对小鼠(5只/组)进行处理。如图20A-B总体上示出的，喂食IDD引起了血红蛋白和铁水平两者的大幅下降。尽管有较大误差条，但Ent补充部分地但显著地恢复了血红蛋白水平，从而表明Ent可能有增加重度贫血条件下的铁摄取效率的作用。在添加Ent的情况下，脾中的铁水平增加，但肝中的铁水平未增加。使用商业试剂盒(生物测定系统公司(BioAssay system))来获得血红蛋白水平。在正常条件下，吸收自肠的约70％的铁用于生成血红蛋白，并且如果铁过量，则只有较小百分比可以储存在肝或其它体细胞组织中。在贫血条件下，进入线粒体(然后与血红素结合)的较大百分比的铁可以传送至红细胞生成。因此，看到Ent补充对肝铁水平(铁储存)几乎无影响并不意外。

实例12：通过饮用水(随意)补充的Ent促使贫血小鼠模型(膳食贫血)的血红蛋白 水平增加。

发明人向3周龄的雄性小鼠5周喂食缺铁膳食(IDD)(或对照膳食)以诱导贫血。然后在另外两周内向所述小鼠喂食添加到饮用水的IDD+/-Ent。每周提供一次Ent在水中的新鲜稀释液。如图21总体上示出的，连续喂食铁充足对照膳食(CD)的小鼠作为对照纳入。通过Hemavet血液分析仪测量血红蛋白水平。示出平均值±SD。Ent补充显著提高了贫血小鼠的血红蛋白水平。因为稍后发现Ent在测试(pH 5.5)中使用的去离子水中高度不稳定(参见图25)，所以在此测试中，Ent的效应可能降低。未来的测试将在经过pH调整的水中施用Ent并且将包含更频繁的新鲜Ent稀释液以确保稳定性。

实例13：通过饮用水(随意)补充的Ent促进喂食对照(铁充足)膳食的小鼠的生长。

本发明的发明人用上述与缺铁膳食(IDD)相匹配的对照铁充足对照膳食(CD)处理4.5周的雄性小鼠。如上文在图20和21中示出的，喂食此膳食的小鼠具有相对正常的血红蛋白水平和铁水平。如图22进一步所示，当在饮用水(pH 5.5)中补充Ent时，小鼠具有增加的生长速率。此实验室是不完整的，因为没有测量血红蛋白水平和铁水平，这将会重复。然而，增重数据仍然是有意义的，因为发明人已经表明，Ent对秀丽隐杆线虫的幼虫生长具有深刻作用，并且所述效应是由于能够促进动物的铁水平增加(图1和2)。

实例14：Ent促进用单株大肠杆菌菌株定殖的小鼠生长小鼠。

如图23总体上示出的，(A)用单株非致病性大肠杆菌(K12)菌株、野生型或entF(缺乏Ent的大肠杆菌)来定殖五周龄的雌性无菌(GF)小鼠。在接下来的4周内测量小鼠生长(增重)。与用野生型大肠杆菌定殖的小鼠相比，用entF大肠杆菌定殖的无菌(GF)小鼠显示出更慢的生长。有趣的是，在定殖后的前两周内，增重的差异最大。(B和C)晚期小鼠的铁水平仅在脾中显著较低(约35％)，而在肝或其它组织中则不是这样，这与图20中看到的结果相一致。测量铁水平。(D)Ent补充克服了用entF(-)大肠杆菌定殖的GF小鼠的生长延迟。为用entF细菌定殖的GF雌性小鼠补充Ent[每周一次向饮用水(pH 5.5)添加2个浓度]。

数据指示生长的显著恢复。Ent效应在前2周内更加明显。可以注意的是，由于Ent在低pH水中的不稳定性，Ent在这里的效应可能有限。另外的实施例可以在经过pH调整的水中施用Ent并且将进一步包含更频繁的新鲜Ent稀释液以确保稳定性。由于Ent被大肠杆菌用于支持其生长，因此在无Ent的情况下肠道中的定殖可能减少，并且前2周内的发育延迟可能是由于肠道中有较少大肠杆菌的间接效应。然而，如此大的重量不可能是由于大肠杆菌定殖的潜在差异。更重要的是，发明人已经表明，Ent在促进秀丽隐杆线虫发育方面的作用与Ent的细菌性使用无关(参见图1F)并且Ent生物合成对秀丽隐杆线虫的肠道定殖不具有明显的影响(Qi和Han,2018)。在1-2周与3-4周之间的增重的差异可以表明Ent(或大肠杆菌)在早期阶段有更为突出的作用，其中快速生长需要更多铁获取。可替代地，在后来的两周内，小鼠可能具有一些适应性/代偿性变化(不那么依赖于Ent)。

实例15：肠杆菌素(Ent)在促进动物发育方面的影响在其它铁载体中未看到。

在发明人的已建立的测定(Qi和Han,2018)之后，如图24所示，向新孵化的秀丽隐杆线虫幼虫喂食野生型K12大肠杆菌或补充有指示的铁载体的entF大肠杆菌。在此测定中，Ent是支持秀丽隐杆线虫生长所必需的。3天后测量蠕虫的体积(如针对图1中描述的实验所进行的)。虽然补充肠杆菌素恢复了用entF看到的生长缺陷，但测试的其它五个铁载体未能示出效应(与图1G中的其它结果相一致)。因此，Ent在促进铁转运和动物发育方面的作用是Ent特定的。

实例16：材料和方法。

秀丽隐杆线虫菌株和维持。20℃下，将线虫储液维持在接种有细菌(大肠杆菌OP50)的线虫生长培养基(NGM)板上。从隐杆线虫属遗传学中心(Caenorhabditis GeneticsCenter)(CGC)获得以下菌株/等位基因：N2 Bristol(称为野生型)；VC2824:H28Ol6.l(ok2203)I/hT2[bli-4(e937)let-？(q782)qls48](I；III)；XA6901:qaEx690l[ftn-2p::pes-lO::GFP::his+lin-l 5(+)]；SJ4l03:zclsl4[myo-3::GFP(mit)]。对于Prpl-28:atp-1(del)转基因，将缺失全编码区的ATP结合序列(残基198-205：DRQTGKTA)克隆到pPD95.77中、由普遍存在的RPL28启动子驱动，然后将具有5ng/μl注射标志物(pCFJ90)的lO ng/μl质粒注射到atp-1(lf)突变体(VC2824)中。

细胞系。HEK293T细胞获自ATCC并且在37℃下维持在具有5％CO2的加湿柜中。用补充有10％FBS、4mM L-谷氨酰胺、100单位盘尼西林/mL、100μg链霉素/mL和0.25μg两性霉素B/mL的DMEM来培养细胞。

大肠杆菌Keio收藏筛选。在前述程序(Qi等人,2017)之后制备热灭活的(HK)OP50板。将在LB肉汤中生长的大肠杆菌OP50的标准过夜培养物浓缩至1/10体积并且然后在75℃水浴中热灭活90分钟。将150μl的HK-OP50铺展到NGM板的一侧。对于细菌突变体测定板的制备，在37℃下使大肠杆菌Keio(Baba等人,2006)突变体在具有10mg/mL卡那霉素(kanamycin)的LB培养基中生长过夜。将0.2μL的细菌培养物(OD₆₀₀)接种到HK OP50板的另一侧。将约300个同步的L1蠕虫添加到筛选板并在20℃下培养，然后在第3天和第4天对蠕虫大小进行评分。将整个库用于初次筛选；将每个细菌突变体筛选一次。对于二次筛选，筛选200个候选突变体(3次重复)，以证实慢生长表型。

对培养板的化学补充。对于化学补充，将每种化学品溶解在水或DMSO中以生成储液。将储备溶液添加到HK OP50并且然后点到NGM板上。用于每种化学品的化学名称、供应商、储液浓度和体积如下列出：2,3-DHBA(西格玛公司(Sigma)126209-5G，300mM，5μl)、肠杆菌素(西格玛公司E3910-1MG，1mg/ml，5μl)、荧光嗜铁素(西格玛公司P8124-1MG，0.5mg/ml，5μl)、铁色素(西格玛公司F8014-1MG，0.5mg/ml，5μl)、血红素(西格玛公司51280，1mg/ml，5μl)、FeCl3(西格玛公司236489，175μg/μl，测定中指示的体积)。对于CaEDTA补充(Klang等人,2014)，将50μl的CaEDTA(50μg/μl)铺展到接种了OP50的NGM板的中心，然后将不同体积的FeCl3[175μg/μl](0μl、1μl、5μl、10μl、50μl)或20μl的Ent(0.5mg/ml)添加到菌苔的中心。

细菌生长分析。在200μL的NGM液体培养基中将过夜的培养物稀释到最终OD₆₀₀＝0.01。通过在Synergy2读板仪(伯腾公司(BioTek))中振荡使细菌在37℃下在96孔板中生长17小时。以20分钟的间隔记录OD₆₀₀。

蠕虫测定中的细菌定殖。使用改编自已发表的程序(Portal-Celhay和Blaser,2012)的方法确定秀丽隐杆线虫的细菌定殖。简要来说，从NGM板收集L3阶段蠕虫并用10mLM9缓冲液大面积地冲洗3次。然后将动物放在具有100mg/mL氨苄青霉素(ampicillin)的空NGM板中1小时，以去除表面细菌。将10只蠕虫单独地拾入M9缓冲液中并通过超声处理均质化。然后将部分或全部混合物铺板到LB板上。在37℃下温育过夜后，确定细菌菌落的数量。

对铁载体的定量。根据已发表的方法(Schwyn和Neilands，1987)制备CAS琼脂板。然后收集喂食野生型或entF突变体大肠杆菌的蠕虫、用10mL M9洗涤5次，然后将蠕虫在10mL M9中饥饿过夜以消化并清除肠细菌。然后通过超声处理将蠕虫均质化，并且通过BCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)，23225)测量上清液的蛋白质浓度。基于蛋白质浓度对蛋白质输入进行归一化。将上清液放置在CAS琼脂板上并在室温下温育过夜并监测其橙色晕的形成，并且通过图像J对颜色强度进行定量。CAS与铁复合时呈现独特的蓝色。当通过铁载体螯合铁时，橙色晕在样品周围形成。晕形成的强度与铁载体的浓度成正比。

通过测量蠕虫大小对幼虫生长的分析。将同步的L1蠕虫接种在指示的NGM板上并生长到指示的时间。拍照片并且通过WormSizer软件(Moore等人,2013)测量每张照片中的蠕虫体积。

对蠕虫中的铁确定。如前所述，对蠕虫体内的铁进行了实时成像(James等人,2015)。简要来说，在不同培养条件下收集蠕虫。然后在具有0.05μg/ML钙黄绿素-AM(英杰公司(Invitrogen))的M9中共培养1小时、然后在1ml M9中洗涤3次。然后封固样品以进行荧光显微镜检查。

蛋白质印迹。为了测量ATP合酶α亚基的水平，将用RNAi处理的蠕虫或用siRNA处理的细胞通过标准的蛋白质印迹法进行分析并利用抗ATP合酶α亚基(稀释度＝l:5000；赛默飞世尔公司，43-9800)和抗肌动蛋白(稀释度＝l:5000；西格玛公司-A2066)作为上样对照进行探测。

通过生物素-IP和LC-MS对肠杆菌素结合蛋白的分离。将总蛋白从混合阶段蠕虫中提取出并且然后通过添加100μl

M-280链霉亲和素预清洗三次。然后将等体积的这些总蛋白提取物分到两个试管中。向一个试管添加生物素-Ent(5μg)以进行IP，并且向另一个试管仅添加生物素(5μg)作为对照，两者均于4℃下温育过夜。与

M-280链霉亲和素温育2小时后，通过1mL PBS将珠洗涤至少3次。然后从珠中去除PBS，并且添加200μL 0.1M碳酸氢铵(ABC)/0.00l％脱氧胆酸(DCA)。将样品使用5mM(最终)TCEP在60℃下还原30分钟并使用15mM碘乙酰胺在室温下烷基化20分钟。向每个样品添加0.5μg的胰蛋白酶并温育过夜。然后使用7uL的甲酸将样品酸化。使用乙酸乙酯通过相转移法从样品中去除DCA。将样品使用Pierce C18旋转柱脱盐并使用speed vac干燥。将样品在10μL缓冲液A(0.1％甲酸水溶液)中进行重构，对其中的5μL进行LC-MSMS分析。

肠杆菌素和ATP-1蛋白相互作用的测定。体内结合测定：使蠕虫在Ent-生物素(5μg/ml)膳食补充的情况下生长，然后进行链霉亲和素珠IP。使用针对哺乳动物ATP合酶α亚基(赛默飞世尔公司43-9800)的抗体执行蛋白质印迹以检测ATP-1。

体外结合测定。(a)总蛋白的Ent-生物素下拉：使用Ent-生物素和链霉亲和素珠下拉来自蠕虫总蛋白提取物的相互作用的蛋白质(方法与针对Ent结合蛋白的初步筛选中的方法相同)。执行蛋白质印迹以检测ATP-1(赛默飞世尔公司43-9800)。(b)Ent-生物素与纯化的ATP-1::HIS标记的蛋白质的结合:在30℃下在测定缓冲液(50mM 2-[4-(2-羟乙基)-l-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)pH 8.0、100mM NaCl、0.5mM二硫苏糖醇(DTT))中用Ent-生物素(1μg/μL；1mg/ml储液，在DMSO中)+/-Ent(1μg/μl)处理纯化的蛋白质1小时，总测定体积为20μL。然后用标准的5X SDS-PAGE上样缓冲液猝灭测定(从而还原)。将蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素膜。在室温下用具有0.1％Tween 20(TBST)的含5％BSA Tris缓冲盐水(TBS)中阻断膜1小时，然后用辣根过氧化物酶链霉亲和素(细胞信号传导技术有限公司(Cell Signaling Technology)，3999S)在TBST中温育1小时。在TBST中每15分钟变化地洗涤四次后，将生物素化蛋白通过增强的化学发光可视化(通用电气医疗集团(GEHealthcare)，RPN2232)。当与Ent的结合处于最大水平的1/2时，计算Ka作为ATP-1-His蛋白的浓度。(c)供ATP-1与铁相互作用的Ent依赖性：将放射性标记铁(55FeCl₃，1uCi)或55FeCl₃(1uCi)+Ent(2μg)添加到蠕虫裂解物中并且然后使用针对ATP-1的抗体(稀释度＝l:5000；赛默飞世尔公司，43 9800)进行免疫沉淀。在IP之后，通过液体闪烁法来测定55Fe的量。

免疫荧光。如前所述(Zhang等人,2007)执行抗体染色。简要来说，通过喂食atp-1RNAi对L1野生型蠕虫(N2)进行处理并使其生长至L4阶段。在抗体染色前，使蠕虫在20℃下在补充有1μg/ml MitoTracker Red(细胞信号传导技术有限公司#9082)的NGM琼脂上生长1天。在-20℃下将解剖后的蠕虫固定在具有6mM K2HPO4的(pH 7.2)和75％甲醇的3％甲醛中10分钟。将固定的蠕虫在PBS中冲洗三次并在室温下在含有0.5％BSA和0.1％Tween-20的PBS中阻断1小时。分别使用抗ATP合酶α亚基(以1:200稀释)和抗兔抗体(以1:400稀释)(英杰公司，A11011)作为一级抗体和二级抗体。

RNAi处理。L1蠕虫通过喂食第一代RNAi(Ahringer,《反向遗传学(Reversegenetics)》,虫书(WormBook)2006)进行处理并生长至成体。然后将成虫漂白并使其在M9缓冲液中孵化18小时。将同步的L1蠕虫接种在具有entF细菌的热灭活OP50板上或补充有Ent的热灭活OP50板上。4天后，测量蠕虫大小。为了测定不同的ATP合酶亚基对蠕虫的铁水平的作用，对L1蠕虫进行喂食RNAi处理并使其生长至幼年成体。测量相同阶段的蠕虫的铁水平。针对体外/体内线粒体铁摄取，用靶向指示的ATP合酶亚基的RNAi处理L1蠕虫并使其生长至幼年成体，然后再进行进一步的程序。

哺乳动物细胞中的siRNA处理。从西格玛公司购买ATP5A1 siRNA(SASI_Hs01_00119735)。按照制造商的说明书，使用

RNAiMAX转染试剂(赛默飞世尔公司，13778075)将siRNA递送到HEK293T细胞中。通过免疫印迹来评估敲除效率。

线粒体铁摄取测定。针对体外线粒体铁摄取测定，本发明的发明人改良了用于分析哺乳动物细胞的已发表程序(Devireddy等人,2010)。具体地，在室温下将1uCi 55FeCl₃与2μg无铁Ent(1mg/ml，在DMSO中)或DMSO温育3小时，然后添加从用不同RNAi处理的蠕虫或用siRNA处理的细胞纯化的线粒体。在室温下将样品温育4小时，并且通过液体闪烁法来测定裂解的线粒体中55Fe的量。

体内线粒体铁摄取测定也基于已发表程序(Devireddy等人,2010)进行改良。具体地，在室温下将1uCi 55FeCl₃与2μg无铁Ent(1mg/ml储液，在DMSO中)或DMSO温育了3小时。向用第一代RNAi处理的幼年成体中添加55FeCl₃+DMSO或55FeCl ₃ +肠杆菌素。

在蠕虫生长过夜之后，将蠕虫在M9中洗涤。然后分离出线粒体，之后通过液体闪烁法测量掺入的55Fe的量。

哺乳动物细胞中的线粒体铁测量。如所描述的确定线粒体铁池(Mena等人,2015)。简要来说，用2μM线粒体铁螯合剂罗丹明B-[(1,10-邻二氮菲-5-基)氨基羰基]苄基酯(RPA)在37℃下将细胞上样20分钟。洗涤之后，通过荧光显微镜检查对细胞进行成像。

线粒体提取。使用所培养细胞用线粒体分离试剂盒(Mitochondria IsolationKit for Cultured Cells)(赛默飞世尔公司，89874)从HEK293T细胞中提取线粒体。使用组织用线粒体分离试剂盒(Mitochondria Isolation Kit for Tissue)(赛默飞世尔公司，89801)从蠕虫中提取线粒体。

酶活性。使用试剂盒根据制造商的方案测量琥珀酸脱氢酶(MAK197；西格玛公司)和顺乌头酸酶(MAK051；西格玛公司)的酶活性。简要来说，将L1蠕虫接种在测定板+/-Ent上。在48小时培养之后，使用补充有蛋白酶的在试剂盒中提供的裂解缓冲液在冰冷条件下对蠕虫进行裂解。使用等量的蛋白质用于酶活性测定。

显微镜检查。在具有Zeiss AxioCam MRm CCD相机的Zeiss Axioplan2显微镜上在Nomarski光学器件下执行荧光分析。使用具有Hamamatsu C4742-95 CCD相机的LeicaMZ16F解剖显微镜观察板表型。

定量。使用ImageJ软件用于对用于Ent-蛋白质结合测定的钙黄绿素-AM染色和蛋白质印迹进行定量。针对钙黄绿素-AM染色，使用用GFP通道拍摄的原始图像来测量强度。通过从经过钙黄绿素-AM染色的肠中减去背景强度来确定染色强度值。

统计分析。除了通过使用χ²检验分析的图1I、2G和11B之外，使用学生t检验执行所有统计分析，并且将p<0.05视为显著差异。

表

表1.通过质谱分析鉴定的潜在Ent结合蛋白。

参考文献

以下参考文献在此以全文引用的方式并入：

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[72]Zhang,A.S.和Enns,C.A.(2009).铁稳态：最近鉴定的蛋白质提供了新型控制机制方面的思路(Iron Homeostasis:Recently Identified Proteins Provide Insightinto Novel Control Mechanisms).《生物化学期刊(Journal of BiologicalChemistry)》284,711-715。

序列标识

SEQ ID NO.1

EntB

氨基酸

大肠杆菌

SEQ ID NO.2

EntD

氨基酸

大肠杆菌

SEQ ID NO.3

EntE

氨基酸

大肠杆菌

SEQ ID NO.4

EntE

氨基酸

大肠杆菌

SEQ ID NO.5

EntA

氨基酸

大肠杆菌

SEQ ID NO.6

EntC

氨基酸

大肠杆菌

序列表

<110> 法人团体科罗拉多大学董事会董事（The Regents of the University ofColorado, a body corporate）

<120> 用于肠杆菌素治疗铁缺乏和相关贫血的新用途的方法、系统和组合物

<130> 90245.00071

<150> US 62/700,480

<151> 2018-07-19

<160> 6

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 285

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（E. Coli）

<400> 1

Met Ala Ile Pro Lys Leu Gln Ala Tyr Ala Leu Pro Glu Ser His Asp

1 5 10 15

Ile Pro Gln Asn Lys Val Asp Trp Ala Phe Glu Pro Gln Arg Ala Ala

20 25 30

Leu Leu Ile His Asp Met Gln Asp Tyr Phe Val Ser Phe Trp Gly Glu

35 40 45

Asn Cys Pro Met Met Glu Gln Val Ile Ala Asn Ile Ala Ala Leu Arg

50 55 60

Asp Tyr Cys Lys Gln His Asn Ile Pro Val Tyr Tyr Thr Ala Gln Pro

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Lys Glu Gln Ser Asp Glu Asp Arg Ala Leu Leu Asn Asp Met Trp Gly

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100 105 110

Thr Pro Asp Ala Asp Asp Thr Val Leu Val Lys Trp Arg Tyr Ser Ala

115 120 125

Phe His Arg Ser Pro Leu Glu Gln Met Leu Lys Glu Ser Gly Arg Asn

130 135 140

Gln Leu Ile Ile Thr Gly Val Tyr Ala His Ile Gly Cys Met Thr Thr

145 150 155 160

Ala Thr Asp Ala Phe Met Arg Asp Ile Lys Pro Phe Met Val Ala Asp

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225 230 235 240

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<210> 2

<211> 207

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（E. Coli）

<400> 2

Met Arg His His Arg Thr Val Leu Pro Leu Ala Gly Tyr Thr Ile Gln

1 5 10 15

Gln Ile Asp Phe Asp Pro Ala Thr Phe Gln Pro Glu Asp Leu Phe Trp

20 25 30

Leu Pro Tyr His Ala Ser Leu Thr Gly Trp Gly Arg Lys Arg Gln Ala

35 40 45

Glu His Leu Ala Gly Arg Ile Ala Ala Ala Tyr Ala Leu Arg Glu Val

50 55 60

Gly Glu Lys Arg Leu Pro Ala Ile Gly Asp Gln Arg Gln Pro Leu Trp

65 70 75 80

Pro Thr Pro Trp Phe Gly Ser Ile Ser His Cys Gly Gln Arg Ala Leu

85 90 95

Ala Val Ile Ala Asp Arg Pro Val Gly Val Asp Ile Glu Arg Arg Phe

100 105 110

Thr Pro Gln Leu Ala Ala Glu Leu Glu Ser Ser Ile Ile Ser Pro Ala

115 120 125

Glu Lys Thr Ala Leu Leu Arg Ser Gly Leu Pro Phe Pro Leu Ala Leu

130 135 140

Thr Leu Ala Phe Ser Ala Lys Glu Ser Gly Phe Lys Ala Cys His Pro

145 150 155 160

Asp Val Gln Ala Gly Val Gly Phe Asn Asp Phe Thr Leu Ala Ala Ile

165 170 175

Lys Glu Gly Asn Leu Arg Leu Arg Leu Ser Thr Val Glu Tyr Arg Leu

180 185 190

Gln Trp Ile Gln Ala Gly Glu Tyr Ile Ile Thr Leu Cys Ala Pro

195 200 205

<210> 3

<211> 536

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（E. Coli）

<400> 3

Met Ser Ile Pro Phe Thr Arg Trp Pro Glu Glu Phe Ala Arg Arg Tyr

1 5 10 15

Arg Glu Lys Gly Tyr Trp Gln Asp Leu Pro Leu Thr Asp Ile Leu Thr

20 25 30

Arg His Ala Ala Ser Asp Ser Ile Ala Val Ile Asp Gly Glu Arg Gln

35 40 45

Leu Ser Tyr Arg Glu Leu Asn Gln Ala Ala Asp Asn Leu Ala Cys Ser

50 55 60

Leu Arg Arg Gln Gly Ile Lys Pro Gly Glu Thr Ala Leu Val Gln Leu

65 70 75 80

Gly Asn Val Ala Glu Leu Tyr Ile Thr Phe Phe Ala Leu Leu Lys Leu

85 90 95

Gly Val Ala Pro Val Leu Ala Leu Phe Ser His Gln Arg Ser Glu Leu

100 105 110

Asn Ala Tyr Ala Ser Gln Ile Glu Pro Ala Leu Leu Ile Ala Asp Arg

115 120 125

Gln His Ala Leu Phe Ser Gly Asp Asp Phe Leu Asn Thr Phe Val Thr

130 135 140

Glu His Ser Ser Ile Arg Val Val Gln Leu His Asn Asp Ser Gly Glu

145 150 155 160

His Asn Leu Gln Asp Ala Ile Asn His Pro Ala Glu Asp Phe Thr Ala

165 170 175

Thr Pro Ser Pro Ala Asp Glu Val Ala Tyr Phe Gln Leu Ser Gly Gly

180 185 190

Thr Thr Gly Thr Pro Lys Leu Ile Pro Arg Thr His Asn Asp Tyr Tyr

195 200 205

Tyr Ser Val Arg Arg Ser Val Glu Ile Cys Gln Phe Thr Gln Gln Thr

210 215 220

Arg Tyr Leu Cys Ala Ile Pro Ala Ala His Asn Tyr Ala Met Ser Ser

225 230 235 240

Pro Gly Ser Leu Gly Val Phe Leu Ala Gly Gly Thr Val Val Leu Ala

245 250 255

Ala Asp Pro Ser Ala Thr Leu Cys Phe Pro Leu Ile Glu Lys His Gln

260 265 270

Val Asn Val Thr Ala Leu Val Pro Pro Ala Val Ser Leu Trp Leu Gln

275 280 285

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290 295 300

Leu Gln Val Gly Gly Ala Arg Leu Ser Ala Thr Leu Ala Ala Arg Ile

305 310 315 320

Pro Ala Glu Ile Gly Cys Gln Leu Gln Gln Val Phe Gly Met Ala Glu

325 330 335

Gly Leu Val Asn Tyr Thr Arg Leu Asp Asp Ser Ala Glu Lys Ile Ile

340 345 350

His Thr Gln Gly Tyr Pro Met Cys Pro Asp Asp Glu Val Trp Val Ala

355 360 365

Asp Ala Glu Gly Asn Pro Leu Pro Gln Gly Glu Val Gly Arg Leu Met

370 375 380

Thr Arg Gly Pro Tyr Thr Phe Arg Gly Tyr Tyr Lys Ser Pro Gln His

385 390 395 400

Asn Ala Ser Ala Phe Asp Ala Asn Gly Phe Tyr Cys Ser Gly Asp Leu

405 410 415

Ile Ser Ile Asp Pro Glu Gly Tyr Ile Thr Val Gln Gly Arg Glu Lys

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Asp Gln Ile Asn Arg Gly Gly Glu Lys Ile Ala Ala Glu Glu Ile Glu

435 440 445

Asn Leu Leu Leu Arg His Pro Ala Val Ile Tyr Ala Ala Leu Val Ser

450 455 460

Met Glu Asp Glu Leu Met Gly Glu Lys Ser Cys Ala Tyr Leu Val Val

465 470 475 480

Lys Glu Pro Leu Arg Ala Val Gln Val Arg Arg Phe Leu Arg Glu Gln

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Gly Ile Ala Glu Phe Lys Leu Pro Asp Arg Val Glu Cys Val Asp Ser

500 505 510

Leu Pro Leu Thr Ala Val Gly Lys Val Asp Lys Lys Gln Leu Arg Gln

515 520 525

Trp Leu Ala Ser Arg Ala Ser Ala

530 535

<210> 4

<211> 1339

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（E. Coli）

<400> 4

Met Ala Ala Thr Met Arg Leu Thr Gly Arg Leu Gly His Cys Val Ser

1 5 10 15

Ala Ala Val Thr Gly Val Leu Pro Ala Val Ala Gly Ser Pro Leu Ala

20 25 30

Tyr Ser Asp Thr Asp Glu Phe Tyr Pro Val Ala Gly Gly Thr Met Ser

35 40 45

Gln His Leu Pro Leu Val Ala Ala Gln Pro Gly Ile Trp Met Ala Glu

50 55 60

Lys Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ala Trp Ser Val Ala His Tyr Val Glu

65 70 75 80

Leu Thr Gly Glu Val Asp Ser Pro Leu Leu Ala Arg Ala Val Val Ala

85 90 95

Gly Leu Ala Gln Ala Asp Thr Leu Arg Met Arg Phe Thr Glu Asp Asn

100 105 110

Gly Glu Val Trp Gln Trp Val Asp Asp Ala Leu Thr Phe Glu Leu Pro

115 120 125

Glu Ile Ile Asp Leu Arg Thr Asn Ile Asp Pro His Gly Thr Ala Gln

130 135 140

Ala Leu Met Gln Ala Asp Leu Gln Gln Asp Leu Arg Val Asp Ser Gly

145 150 155 160

Lys Pro Leu Val Phe His Gln Leu Ile Gln Val Ala Asp Asn Arg Trp

165 170 175

Tyr Trp Tyr Gln Arg Tyr His His Leu Leu Val Asp Gly Phe Ser Phe

180 185 190

Pro Ala Ile Thr Arg Gln Ile Ala Asn Ile Tyr Cys Thr Trp Leu Arg

195 200 205

Gly Glu Pro Thr Pro Ala Ser Pro Phe Thr Pro Phe Ala Asp Val Val

210 215 220

Glu Glu Tyr Gln Gln Tyr Arg Glu Ser Glu Ala Trp Gln Arg Asp Ala

225 230 235 240

Ala Phe Trp Ala Glu Gln Arg Arg Gln Leu Pro Pro Pro Ala Ser Leu

245 250 255

Ser Pro Ala Pro Leu Pro Gly Arg Ser Ala Ser Ala Asp Ile Leu Arg

260 265 270

Leu Lys Leu Glu Phe Thr Asp Gly Glu Phe Arg Gln Leu Ala Thr Gln

275 280 285

Leu Ser Gly Val Gln Arg Thr Asp Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu

290 295 300

Trp Leu Gly Arg Leu Cys Asn Arg Met Asp Tyr Ala Ala Gly Phe Ile

305 310 315 320

Phe Met Arg Arg Leu Gly Ser Ala Ala Leu Thr Ala Thr Gly Pro Val

325 330 335

Leu Asn Val Leu Pro Leu Gly Ile His Ile Ala Ala Gln Glu Thr Leu

340 345 350

Pro Glu Leu Ala Thr Arg Leu Ala Ala Gln Leu Lys Lys Met Arg Arg

355 360 365

His Gln Arg Tyr Asp Ala Glu Gln Ile Val Arg Asp Ser Gly Arg Ala

370 375 380

Ala Gly Asp Glu Pro Leu Phe Gly Pro Val Leu Asn Ile Lys Val Phe

385 390 395 400

Asp Tyr Gln Leu Asp Ile Pro Asp Val Gln Ala Gln Thr His Thr Leu

405 410 415

Ala Thr Gly Pro Val Asn Asp Leu Glu Leu Ala Leu Phe Pro Asp Val

420 425 430

His Gly Asp Leu Ser Ile Glu Ile Leu Ala Asn Lys Gln Arg Tyr Asp

435 440 445

Glu Pro Thr Leu Ile Gln His Ala Glu Arg Leu Lys Met Leu Ile Ala

450 455 460

Gln Phe Ala Ala Asp Pro Ala Leu Leu Cys Gly Asp Val Asp Ile Met

465 470 475 480

Leu Pro Gly Glu Tyr Ala Gln Leu Ala Gln Ile Asn Ala Thr Gln Val

485 490 495

Glu Ile Pro Glu Thr Thr Leu Ser Ala Leu Val Ala Glu Gln Ala Ala

500 505 510

Lys Thr Pro Asp Ala Pro Ala Leu Ala Asp Ala Arg Tyr Leu Phe Ser

515 520 525

Tyr Arg Glu Met Arg Glu Gln Val Val Ala Leu Ala Asn Leu Leu Arg

530 535 540

Glu Arg Gly Val Lys Pro Gly Asp Ser Val Ala Val Ala Leu Pro Arg

545 550 555 560

Ser Val Phe Leu Thr Leu Ala Leu His Ala Ile Val Glu Ala Gly Ala

565 570 575

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580 585 590

Met Leu Glu Asp Ala Arg Pro Ser Leu Leu Ile Thr Thr Asp Asp Gln

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625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

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675 680 685

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690 695 700

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705 710 715 720

Pro Leu Ala Met Gln Gln Phe Phe Ala Glu Tyr Gly Val Thr Thr Thr

725 730 735

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740 745 750

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755 760 765

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885 890 895

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Leu Ser Ala Asn Gly Lys Leu Asp Arg Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu

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Thr Ile Ile Ala Ala Ala Phe Ala Ser Leu Leu Gly Cys Asp Val

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Leu Ala Met Lys Leu Ala Ala Gln Leu Ser Arg Gln Phe Ala Arg

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1070 1075 1080

Leu Ala Thr Ile Ile Asp Gly Glu Glu Asp Ser Ser Arg Arg Met

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1145 1150 1155

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1160 1165 1170

Pro His Gly Pro Tyr Tyr Leu Leu Gly Tyr Ser Leu Gly Gly Thr

1175 1180 1185

Leu Ala Gln Gly Ile Ala Ala Arg Leu Arg Ala Arg Gly Glu Gln

1190 1195 1200

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1205 1210 1215

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1220 1225 1230

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1235 1240 1245

Gly Ser Thr Ser Thr Glu Leu Phe Thr Thr Ile Glu Gly Asn Tyr

1250 1255 1260

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Gly Met Ser Pro Glu Arg Ala Trp Ser Pro Trp Ile Ala Glu Leu

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1325 1330 1335

Arg

<210> 5

<211> 248

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（E. Coli）

<400> 5

Met Asp Phe Ser Gly Lys Asn Val Trp Val Thr Gly Ala Gly Lys Gly

1 5 10 15

Ile Gly Tyr Ala Thr Ala Leu Ala Phe Val Glu Ala Gly Ala Lys Val

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Gly Ile Leu Arg Met Gly Ala Thr Asp Gln Leu Ser Lys Glu Asp Trp

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Gln Thr Met Asn Gln Phe Arg Arg Gln Arg Gly Gly Ala Ile Val Thr

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Val Ala Ser Asp Ala Ala His Thr Pro Arg Ile Gly Met Ser Ala Tyr

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Gly Ala Ser Lys Ala Ala Leu Lys Ser Leu Ala Leu Ser Val Gly Leu

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180 185 190

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Leu Gly Lys Ile Ala Arg Pro Gln Glu Ile Ala Asn Thr Ile Leu Phe

210 215 220

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245

<210> 6

<211> 395

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（E. Coli）

<400> 6

Met Glu Asp Asp Met Asp Thr Ser Leu Ala Glu Glu Val Gln Gln Thr

1 5 10 15

Met Ala Thr Leu Ala Pro Asn Arg Phe Phe Phe Met Ser Pro Tyr Arg

20 25 30

Ser Phe Thr Thr Ser Gly Cys Phe Ala Arg Phe Asp Glu Pro Ala Val

35 40 45

Asn Gly Asp Ser Pro Asp Ser Pro Phe Gln Gln Lys Leu Ala Ala Leu

50 55 60

Phe Ala Asp Ala Lys Ala Gln Gly Ile Lys Asn Pro Val Met Val Gly

65 70 75 80

Ala Ile Pro Phe Asp Pro Arg Gln Pro Ser Ser Leu Tyr Ile Pro Glu

85 90 95

Ser Trp Gln Ser Phe Ser Arg Gln Glu Lys Gln Thr Ser Ala Arg Arg

100 105 110

Phe Thr Arg Ser Gln Ser Leu Asn Val Val Glu Arg Gln Ala Ile Pro

115 120 125

Glu Gln Thr Thr Phe Glu Gln Met Val Ala Arg Ala Ala Ala Leu Thr

130 135 140

Ala Thr Pro Gln Val Asp Lys Val Val Leu Ser Arg Leu Ile Asp Ile

145 150 155 160

Thr Thr Asp Ala Ala Ile Asp Ser Gly Val Leu Leu Glu Arg Leu Ile

165 170 175

Ala Gln Asn Pro Val Ser Tyr Asn Phe His Val Pro Leu Ala Asp Gly

180 185 190

Gly Val Leu Leu Gly Ala Ser Pro Glu Leu Leu Leu Arg Lys Asp Gly

195 200 205

Glu Arg Phe Ser Ser Ile Pro Leu Ala Gly Ser Ala Arg Arg Gln Pro

210 215 220

Asp Glu Val Leu Asp Arg Glu Ala Gly Asn Arg Leu Leu Ala Ser Glu

225 230 235 240

Lys Asp Arg His Glu His Glu Leu Val Thr Gln Ala Met Lys Glu Val

245 250 255

Leu Arg Glu Arg Ser Ser Glu Leu His Val Pro Ser Ser Pro Gln Leu

260 265 270

Ile Thr Thr Pro Thr Leu Trp His Leu Ala Thr Pro Phe Glu Gly Lys

275 280 285

Ala Asn Ser Gln Glu Asn Ala Leu Thr Leu Ala Cys Leu Leu His Pro

290 295 300

Thr Pro Ala Leu Ser Gly Phe Pro His Gln Ala Ala Thr Gln Val Ile

305 310 315 320

Ala Glu Leu Glu Pro Phe Asp Arg Glu Leu Phe Gly Gly Ile Val Gly

325 330 335

Trp Cys Asp Ser Glu Gly Asn Gly Glu Trp Val Val Thr Ile Arg Cys

340 345 350

Ala Lys Leu Arg Glu Asn Gln Val Arg Leu Phe Ala Gly Ala Gly Ile

355 360 365

Val Pro Ala Ser Ser Pro Leu Gly Glu Trp Arg Glu Thr Gly Val Lys

370 375 380

Leu Ser Thr Met Leu Asn Val Phe Gly Leu His

385 390 395

Claims (37)

1.一种治疗有需要的受试者的铁缺乏的方法，所述方法包括施用治疗有效量的肠杆菌素(Ent)或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量的Ent是分离的。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量的Ent包括其中所述治疗有效量的Ent类似物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Ent类似物选自由以下组成的组：TRENCAM、SERSAM、SER(3M)SAM、TRENSAM和TREN(3M)SAM。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述Ent或所述Ent类似物与药学上可接受的载体组合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述药学上可接受的载体为营养补充剂。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述铁缺乏包括缺铁性贫血。

8.根据权利要求1和7所述的方法，其中所述有需要的受试者包括人类受试者。

9.一种预防有需要的受试者的铁缺乏的方法，所述方法包括施用预防有效量的肠杆菌素(Ent)或其药学上可接受的盐。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述治疗有效量的Ent是分离的。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述治疗有效量的Ent包括其中所述治疗有效量的Ent类似物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述Ent类似物选自由以下组成的组：TRENCAM、SERSAM、SER(3M)SAM、TRENSAM和TREN(3M)SAM。

13.根据权利要求9或14所述的方法，其中所述Ent或所述Ent类似物与药学上可接受的载体组合。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述药学上可接受的载体为营养补充剂。

15.根据权利要求9所述的方法，其中所述铁缺乏包括缺铁性贫血。

16.根据权利要求9和15所述的方法，其中所述有需要的受试者包括人类受试者。

17.一种用于治疗受试者的铁缺乏的治疗剂，所述治疗剂包括由以下通式(I)表示的活性成分：

以及药学上可接受的载体。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗有效量的式I化合物是分离的。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗有效量的式I化合物包括其中所述治疗有效量的式I化合物的类似物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述式I化合物的类似物选自由以下组成的组：

21.根据权利要求17或20所述的方法，其中所述式I-VI化合物与药学上可接受的载体组合。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述药学上可接受的载体为营养补充剂。

23.根据权利要求17所述的方法，其中所述铁缺乏包括缺铁性贫血。

24.根据权利要求17和23所述的方法，其中所述有需要的受试者包括人类受试者。

25.根据权利要求6、14和22所述的方法，其中所述营养补充剂包括益生菌。

26.一种用于治疗有需要的受试者的铁缺乏的经过基因修饰的益生菌，所述经过基因修饰的益生菌包括被配置成表达与对一个或多个用于肠杆菌素(Ent)的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸的益生菌。

27.根据权利要求26所述的经过基因修饰的细菌，其中所述益生菌包括肠杆菌属(Enterobacter)益生菌。

28.根据权利要求26所述的经过基因修饰的细菌，其中所述与对一个或多个用于Ent的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸包括与对选自由以下组成的组的基因中的一个或多个基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸：entA、entB、entC、entD、entE、entF。

29.根据权利要求26所述的经过基因修饰的细菌，其中所述与对一个或多个用于Ent的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸包括与对选自由以下组成的组的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸：SEQ ID NO.1-6。

30.根据权利要求26所述的经过基因修饰的细菌，其中所述有需要的受试者为人类受试者。

31.根据权利要求30所述的经过基因修饰的细菌，其中所述铁缺乏包括缺铁性贫血。

32.一种用于治疗有需要的受试者的铁缺乏的营养药物组合物，所述营养药物组合物包括被配置成表达与对一个或多个用于肠杆菌素(Ent)的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸的益生菌以及赋形剂。

33.根据权利要求32所述的营养药物组合物，其中所述益生菌包括肠杆菌属益生菌。

34.根据权利要求32所述的营养药物组合物，其中所述与对一个或多个用于Ent的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸包括与对选自由以下组成的组的基因中的一个或多个基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸：entA、entB、entC、entD、entE、entF。

35.根据权利要求32所述的营养药物组合物，其中所述与对一个或多个用于Ent的生物合成的基因进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸包括与对选自由以下组成的组的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列进行编码的启动子可操作地连接的异源核苷酸：SEQ ID NO.1-6。

36.根据权利要求32所述的营养药物组合物，其中所述有需要的受试者为人类受试者。

37.根据权利要求36所述的营养药物组合物，其中所述铁缺乏包括缺铁性贫血。

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