CN113226062A - 包含2’-岩藻糖基乳糖（2’fl）以改善胃肠屏障的营养组合物 - Google Patents

包含2’-岩藻糖基乳糖（2’fl）以改善胃肠屏障的营养组合物 Download PDF

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F·法塔
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Abstract

本发明涉及用于改善胃肠屏障的包含2'‑岩藻糖基乳糖(2'FL)的营养组合物。具体地讲，本发明涉及改善婴儿、幼儿或3岁以上至8岁的儿童的胃肠屏障。

Description

包含2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)以改善胃肠屏障的营养组合物
技术领域
本发明涉及用于改善胃肠屏障的包含2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)的营养组合物。具体地讲，本发明涉及改善婴儿、幼儿或3岁以上至8岁的儿童的胃肠屏障。
背景技术
建议所有婴儿采用母乳喂养。然而，在一些情况下，由于某些医学原因，母乳喂养并不足够或不成功，或者母亲不选择母乳喂养。已针对这些情况研发了婴儿配方食品。还研发了用特殊成分丰富母乳或婴儿配方食品的强化剂。在此类情况下，甚至更优选的是提供通过营养干预诸如通过完全营养或营养补充剂来改善婴儿和幼儿的胃肠屏障的手段。
在产后发育期间，新生儿肠道经历成熟过程，该成熟过程以建立对大分子和病原菌的功能屏障而结束。这种现象被称为肠道闭合，并且似乎受饮食的影响。因此，对婴儿(JPGN，1995，21:383-6)和动物模型(Pediatr Res，1990，28:31-7)的不同研究表明，母乳喂养中的屏障成熟比配方食品喂养的新生儿更快。这可解释与用母乳喂养的婴儿相比，用配方食品喂养的婴儿的变态反应和感染患病率更高。
婴儿和幼儿的一些特定人群特别需要能够提供健康有益效果诸如改善肠屏障功能的组合物。此类婴儿和幼儿为例如早产婴儿、低出生体重婴儿、和/或生长迟缓的婴儿或幼儿。实际上，与健康足月婴儿相比，肠屏障在此类婴儿中更易渗透并且更易受伤，并且其结构和功能更不成熟。这继而可导致其他问题，诸如感染或变态反应。对于此类婴儿，用能够改善肠屏障功能的营养组合物来补充药理学管理是特别有利的。
先前已研究了营养成分诸如人乳低聚糖改善胃肠屏障的效果。
在WO2013/032674(胃肠屏障功能)、WO2017/144062(经由微生物区系维持或修复胃肠屏障通透性)、WO2017/71716(治疗受损的粘膜屏障)、WO2017/046711(治疗受损的粘膜屏障)、WO2016/91265(降低肠通透性)和WO2016/66174(保持粘膜完整性)中，在其它低聚糖中列出的2′FL被描述为对胃肠屏障有利。
因此，改进的营养组合物将是有利的，并且具体地讲，更有效和/或更可靠的早产婴儿用营养组合物将是有利的。
进一步优化营养组合物对所有婴儿和儿童的胃肠屏障的效果将是有用的。
为了改善婴儿和幼儿的胃肠屏障，显然需要开发合适的方法。
此外，由于这类婴儿或幼儿特别娇弱，因此还需要递送此类健康有益效果的方式应当是特别适合年幼个体(婴儿和幼儿)的方式，该方式不涉及传统的药物干预。
需要以下列方式向这些婴儿或幼儿递送此类健康有益效果：不引发副作用的方式和/或不仅容易递送还能获得父母或健康护理人员广泛认可的方式。
还需要以保持此类递送价格合理且大多数人可负担的方式递送此类有益效果。
因此，至少由于副作用的相关风险，显然需要开发另选方法，而不是传统的药物干预诸如使用药物。
发明内容
本发明涉及用于改善胃肠屏障的包含2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)的营养组合物。效果由对肠上皮细胞模型的体外研究的结果证实。如实施例部分所公开，已经发现，2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)在改善胃肠屏障方面优于其它测试的HMO，其次是包含2′FL的HMO的共混物。
进一步的实验已鉴定出涉及2′FL改善胃肠屏障的机制。一方面，本发明人证实肠屏障的改善至少通过下调上皮细胞上的TNF-α受体来实现，具体地导致改善的胃肠屏障保护。黏膜保护的此类机制与改善的胃肠屏障功能、结构、修复和成熟相关，并且具体地与改善的胃肠屏障功能和结构相关。
另一方面，进一步的实验已表明，2′FL也通过以下方式起作用：增加食用该组合物的婴儿或幼儿的微生物区系产生的犬尿酸，并且经由犬尿酸随后对G-蛋白偶联受体35(GPR35)的激活。事实上已发现，犬尿酸能够触发GPR35受体的激活(Wang等人，2006年)。犬尿酸作为孤儿G蛋白偶联受体GPR35的配体。J Biol Chem.281:22021-22028。GPR35参与增加的肠上皮细胞迁移，这是粘膜损伤后的重要机制，用于快速恢复致密化的绒毛表面区域上的上皮连续性。Tsukahara等人已发现GPR35的激活促进了结肠中的粘膜修复(Pharmacological Research 123(2017)27–39)。此类粘膜修复机制与改善的胃肠屏障功能、结构、保护和成熟相关，并且具体地与改善的胃肠屏障功能、结构和保护相关。
因此，本发明的目的涉及改善肠屏障诸如改善屏障成熟、改善屏障保护、改善屏障结构、改善屏障功能和/或改善屏障修复的营养组合物。肠胃屏障的此类方面都是相互关联的。适当的胃肠成熟促成适当的胃肠结构和功能，这继而通过适当的屏障保护来维持并通过适当的屏障修复来恢复。因此，一起考虑或单独考虑的这些方面中的任一个方面有助于持续降低疾病易感性。
因此，本发明的一个方面涉及包含2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)营养组合物，其用于改善婴儿(年龄在12个月以下的儿童)或幼儿(1岁至不到3岁之间)的胃肠屏障；或包含2′岩藻糖基乳糖(2′FL)的成长乳形式的营养组合物，其用于改善儿童(3岁至不到8岁)的胃肠屏障。在一个具体实施方案中，通过增加食用该营养组合物的婴儿或幼儿(相应的3岁至小于8岁的儿童)的微生物区系产生的犬尿酸来获得该效果。
在本发明的一个优选的实施方案中，对胃肠屏障的所述改善为改善的屏障保护、改善的屏障结构和改善的屏障功能，优选地为改善的屏障保护和/或改善的屏障修复。
附图说明
图1：HMO减少炎症诱导的上皮屏障功能障碍的功效。共培养物用HMO处理，然后由细胞因子介导的炎症诱导上皮屏障功能障碍。除对照组-ve(完整屏障)之外的所有组均受到炎症攻击。通过分析炎症攻击后相对于对照组-ve(任意设定为1)和对照组+ve(任意设定为0)FITC标记的葡聚糖(FD4)从顶腔到基底外侧腔的易位来计算上皮屏障完整性。误差条表示LSD。
图2：通过下调TNF-α受体表达获得对炎症诱导的肠上皮屏障功能障碍的抗性。共培养物用2′FL处理，然后由细胞因子介导的炎症诱导上皮屏障功能障碍。该图表示TNF-α受体(TNFR1)相对于对照组-ve的mRNA表达。除对照组-ve(完整屏障)之外的所有组均受到炎症攻击。误差条表示SD。
图3示出了在存在乳糖(乳糖)、2′FL、2′FL+LNT或2′FL、DFL、LNT、LNnT、3′SL和6′SL(6-HMO)的情况下，发酵的婴儿粪便的上清液中的犬尿酸的相对丰度，显示出在存在包含2′FL的HMO的任意组合的情况下与乳糖相比增加的犬尿酸。相比乳糖，*P<0.05，**P<0.01(实施例5)。
图4示出了抑制蛋白模式下的GPR35激活对具有或不具有200μM KYNA的等摩尔6′SL+LNT以及对100μM和200μM KYNA的剂量响应，显示出在介于940μM和2500μM之间的浓度下具有累加效应。该实验进行三次，结果相当(实施例6)。
现将在下文中更详细地描述本发明。
具体实施方式
定义
在进一步详细讨论本发明之前，首先定义下列术语和惯例。
术语“婴儿”是指年龄在12个月以下的儿童(<12个月)。表述“幼儿”是指年龄介于一岁和小于三岁(≥1岁至<3岁)之间的儿童，也称为学步儿童。表述“儿童”是指年龄介于三岁和小于八岁(≥3岁至<8岁)之间的儿童。
“剖腹产出生的婴儿或幼儿”是指通过剖腹产术分娩的婴儿或幼儿。这意味着婴儿或幼儿不是经阴道分娩的。
“阴道娩出婴儿或幼儿”是指经阴道分娩而不是通过剖腹产术分娩的婴儿或幼儿。
“早产儿”是指不足月出生的婴儿或幼儿。通常是指在妊娠满37周之前出生的婴儿或幼儿。
“低出生体重婴儿”是指由于早产或胎儿生长受限，体重低于2500g(5.5磅)的新生婴儿。因此其涵盖：
-出生时体重为1500g至2500g的婴儿或幼儿(通常称为“低出生体重”或LBW)
-出生时体重为1000g至1500g的婴儿或幼儿(称为“极低出生体重”或VLBW)
-出生时体重不足1000g的婴儿或幼儿(称为“超低出生体重”或ELBW)。
“小于胎龄出生的婴儿(SGA)”是指出生体重低于相同胎龄婴儿的第10个百分位数的婴孩。
表述“营养组合物”是指供给个体养分的组合物。这种营养组合物通常为口服，并且其通常包括脂质或脂肪源以及蛋白质源。
在一个具体实施方案中，本发明的组合物是低变应原营养组合物。表述“低变应原营养组合物”是指不大可能引起过敏反应的营养组合物。
在一个具体实施方案中，本发明的组合物是“合成营养组合物”。表述“合成的营养组合物”是指通过化学和/或生物方法所获得的混合物，该混合物的化学性质可能与哺乳动物乳汁中天然存在的混合物相同(也就是说，合成的组合物不是母乳)。
如本文所用，表述“婴儿配方食品”是指旨在专用于供给在生命的头几个月期间的婴儿营养，而且本身满足这类人的多种营养需求的食料(符合欧盟委员会2006年12月22日颁发的针对婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的第91/321/EEC 2006/141/EC号指令中第2(c)条的规定)。也是指旨在用于婴儿的营养组合物，并且如在食品法典委员会(法典STAN72-1981)和婴儿特殊品(包括针对特殊医学目的的食物)中所定义。表述“婴儿配方食品”既涵盖“一段婴儿配方食品”，也涵盖“二段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”。
“二段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”从第6个月开始给予。婴儿配方食品构成了这类人逐渐多样化饮食中的主要液体元素。
表述“婴孩食物”是指旨在专用于供给在生命的头一年期间的婴儿或幼儿营养的食料。
表述“婴儿谷物组合物”是指旨在专用于供给在生命的头一年期间的婴儿或幼儿营养的食料。
表述“成长乳”(或GUM)是指通常添加有维生素和矿物质的乳基饮料，其旨在用于幼儿或儿童。
术语“强化剂”是指适用于强化或混合人乳、婴儿配方食品、成长乳或用其它营养物质强化的人母乳的液体或固体营养组合物。因此，本发明的强化剂可在溶解于人母乳、婴儿配方食品、成长乳或用其它营养物质强化或以其它方式强化的人母乳中之后施用，它可作为独立组合物施用。当作为独立组合物施用时，本发明的乳强化剂也可被鉴定为“补充剂”。在一个实施方案中，本发明的乳强化剂是补充剂。
表述“离乳期”是指在婴儿或幼儿的饮食中逐步用其它食物替代母乳期间的时期。
表述“天龄/周龄/月龄/年龄”和“出生天数/周数/月数/年数”可互换使用。
表述“改善的胃肠屏障”可涵盖下列中的一者或多者：
-改善的屏障修复，诸如(但不限于)胃肠屏障的完整性恢复，诸如被破坏屏障的修复、胃肠粘膜炎性激发时的通透性降低以及粘膜修复。
-改善的屏障成熟，诸如(但不限于)婴儿、优选为早产婴儿的屏障成熟和/或发育。
-改善的屏障结构，诸如(但不限于)胃肠屏障强化、胃肠屏障完整性、紧密连接结构和肠上皮内层完整性。
-改善的屏障功能，诸如改善胃肠屏障抗性、降低胃肠屏障通透性，诸如减少病原体通过肠屏障迁移出肠道，诸如减少共生细菌通过肠屏障迁移出肠道、减少过敏原通过肠屏障迁移出肠道、减少毒性化合物通过肠屏障迁移出肠道以及降低疾病易感性。
-改善的屏障保护，诸如(但不限于)屏障功能障碍的预防、屏障渗漏的预防、紧密连接结构的保护、肠上皮内层完整性的保护。
在一个优选的实施方案中，改善胃肠屏障涉及胃肠屏障的成熟。
术语“增加犬尿酸的产生”意指通过食用根据本发明的营养组合物的婴儿和/或幼儿的微生物区系的作用而增加、增强和/或促进此类分子种类(和/或其生理上可接受的盐或离子)的产生。在一个实施方案中，食用根据本发明的营养组合物的婴儿和/或幼儿的肠道中出现犬尿酸的产生增加。在一个实施方案中，术语“增加犬尿酸的产生”意指通过食用根据本发明的营养组合物的婴儿和/或幼儿的微生物区系的作用而增加此类分子种类(和/或其生理上可接受的盐或离子)的产生。在另一个实施方案中，术语“增加犬尿酸的产生”意指通过食用根据本发明的营养组合物的婴儿和/或幼儿的微生物区系的作用而促进此类分子种类(和/或其生理上可接受的盐或离子)的产生。
“母乳”应理解为母亲的乳汁或初乳。
“低聚糖”为含有少量(通常三份至十份)普通糖(单糖)的糖类聚合物。
术语“HMO”或“HMOs”或“HMO’s是指人乳低聚糖。这些碳水化合物高度耐受酶促水解，这表明其表现的重要功能可能不与其热值直接相关。本领域已特别指出，这些碳水化合物在婴儿和幼儿的早期发育(诸如，免疫系统的成熟)过程中发挥关键作用。在人乳中发现了许多不同种类的HMO。每种单独的低聚糖都基于葡萄糖、半乳糖、唾液酸(N-乙酰神经氨酸)、岩藻糖和/或N-乙酰基葡糖胺与这些分子间各式各样的键的组合，因此人乳含有大量种类各不相同的低聚糖，迄今已鉴定出逾130种此类结构。几乎所有低聚糖的还原端都有乳糖分子，且非还原端的末端位置都由唾液酸和/或岩藻糖(如果有的话)占据。HMO可以呈酸性(例如，含带电唾液酸的低聚糖)或呈中性(例如，岩藻糖基化低聚糖)。
“岩藻糖基化低聚糖”是具有岩藻糖残基的低聚糖。这种低聚糖呈中性。一些示例为2-FL(2′-岩藻糖基乳糖)、3-FL(3-岩藻糖基乳糖)、二岩藻糖基乳糖、乳糖-N-岩藻五糖(例如，乳糖-N-岩藻五糖I、乳糖-N-岩藻五糖II、乳糖-N-岩藻五糖III、乳糖-N-岩藻五糖V)、乳糖-N-岩藻六糖、乳糖-N-二岩藻六糖I、岩藻糖基乳糖-N-六糖、岩藻糖基乳糖-N-新六糖、二岩藻糖基乳糖-N-六糖I、二岩藻糖基乳糖-N-新六糖II以及这些物质的任意组合。尽管不希望受理论约束，但据信，岩藻糖基化低聚糖的岩藻糖基表位可在粘膜表面处充当“诱饵(decoy)”。该表位可利用竞争效应来防止并/或限制致感染的病原体(病毒或细菌来源)或病原体所分泌物质(如毒素)发挥作用，尤其是避免病原体或病原体所分泌物质与天然配体结合，并且不希望受理论约束，但据信这将因此降低感染/炎症风险，特别是LRT/耳部感染和/或炎症风险。另外，岩藻糖基化低聚糖被认为可促进特定共生微生物的生长和代谢活动，从而降低炎症反应并形成不利于病原体的环境，因此产生定植抗力。
表述“包含2′-岩藻糖基表位的岩藻糖基化低聚糖”和“2-岩藻糖基化低聚糖”涵盖了具有一定同源形式的岩藻糖基化低聚糖，这些同源形式的岩藻糖基化低聚糖都含有2’-岩藻糖基表位，因而可推测它们具有一定同源功能。不希望受理论约束，但据信，这些岩藻糖基化低聚糖的2’-岩藻糖基表位特别针对与LRT和/或耳部感染相关的病原体(或病原体所分泌物质)。
表述“N-乙酰化低聚糖”涵盖“N-乙酰基-乳糖胺”和“含N-乙酰基-乳糖胺的低聚糖”两者。这种低聚糖是具有N-乙酰基-氨基乳糖苷残基的中性低聚糖。合适的示例为LNT(乳糖-N-四糖)、对-乳糖-N-新六糖(对-LNnH)、LNnT(乳糖-N-新四糖)以及它们的任意组合。其它示例为乳糖-N-六糖、乳糖-N-新六糖、对-乳糖-N-六糖、对-乳糖-N-新六糖、乳糖-N-八糖、乳糖-N-新八糖、异-乳糖-N-八糖、对-乳糖-N-八糖和乳糖-N-十糖。
表述“至少一种岩藻糖基化低聚糖”和“至少一种N-乙酰化低聚糖”是指“至少一种类型的岩藻糖基化低聚糖”和“至少一种类型的N-乙酰化低聚糖”。
“HMO前体”是干涉制造HMO的关键化合物，诸如唾液酸和/或岩藻糖。
“唾液酸化低聚糖”是含带电唾液酸的低聚糖，即具有唾液酸残基的低聚糖。这种低聚糖呈酸性。一些示例为3-SL(3′唾液酸乳糖)和6-SL(6′唾液酸乳糖)。
本发明的营养组合物可为固体形式(例如，粉末)或液体形式。各种成分(例如低聚糖)的量在组合物为固体形式(例如粉末)时可按照基于干重的g/100g组合物来表示，或者在组合物是指液体形式时表示为g/L组合物的浓度(后者还涵盖可由粉末在液体(诸如乳、水…)中重构之后获得的液体组合物，例如重构的婴儿配方食品或较大/二段婴儿配方食品或成长乳或婴儿谷物产品或任何其他被设计用于为婴儿提供营养的配制物)。
术语“益生元”是指通过选择地刺激健康细菌(诸如，人类结肠中的双歧杆菌)的生长和/或其活性，而对宿主产生有利作用的非消化性碳水化合物(Gibson GR,RoberfroidMB.Dietary modulation of the human colonic microbiota:introducing the conceptof prebiotics.J Nutr.1995；125:1401-12)。
术语“益生菌”是指对宿主的健康或良好状态具有有益效果的微生物细胞制剂或微生物细胞组分。(Salminen S,Ouwehand A.Benno Y.等人，“Probiotics:how shouldthey be defined”Trends Food Sci.Technol.1999:10107-10)。微生物细胞一般为细菌或酵母。
术语“cfu”应理解为菌落形成单位。
除非另外指明，否则所有百分比均按重量计。
另外，在本发明的上下文中，术语“包含”或“包括”不排除其它可能的要素。本发明的组合物(包括本文所述的多个实施方案)可包含下列要素、由或基本上由下列要素组成：本文所述的本发明的基本要素和必要限制，以及本文所述的或视需求而定的任何另外的或任选的成分、组分或限制。
不能将本说明书中对现有技术文献中的任何参考视为承认此类现有技术为众所周知的技术或形成本领域普遍常识的一部分。
现在开始更详细描述本发明。应当注意，本申请中描述的各个方面、特征、实施例和实施方案可以相容和/或可以组合在一起。
营养组合物
也如上文所概述。本发明涉及用于改善胃肠屏障的包含2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)的营养组合物。如实施例部分所公开，已经发现，2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)在改善胃肠屏障方面优于其它测试的HMO，其次是包含2′FL的HMO的共混物。因此，本发明的一个方面涉及包含2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)营养组合物，其用于改善婴儿(年龄在12个月以下的儿童)或幼儿(1岁至不到3岁之间)的胃肠屏障；
或包含2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)的成长乳形式的营养组合物，所述营养组合物用于改善儿童(年龄在3岁至不到8岁)的胃肠屏障。
在一个实施方案中，对胃肠屏障的所述改善为改善的屏障成熟、改善的屏障结构、改善的屏障功能、改善的屏障保护和/或改善的屏障修复。
在另一个实施方案中，对胃肠屏障的所述改善为改善的屏障功能、改善的屏障结构和/或改善的屏障保护。
在又一个实施方案中，对胃肠屏障的所述改善为改善的屏障保护。
在另一个实施方案中，所述用途是用于改善屏障功能障碍的预防、屏障渗漏的预防、紧密连接结构的保护以及肠上皮内层完整性的保护。在又一个实施方案中，屏障渗漏的所述预防是预防病原体、过敏原和/或毒性化合物从肠道穿过肠屏障迁移到身体中。如实施例3所述，已发现2′FL在改善肠胃屏障保护方面优于其它测试的HMO。
胃肠屏障保护得到改善的胃肠屏障结构和功能，因为缺少适当保护的胃肠屏障将丧失其最佳结构和功能，即处于炎症攻击下。
因此，在一个实施方案中，所述用途是用于改善胃肠屏障的强度、胃肠屏障的完整性、紧密连接结构以及肠上皮内层完整性。
在另一个实施方案中，所述用途是用于改善胃肠屏障抗性以及用于降低胃肠屏障通透性。优选地所述用途是用于减少病原体穿过肠屏障迁移出肠道，诸如减少共生细菌穿过肠屏障迁移出肠道、减少过敏原穿过肠屏障迁移出肠道、减少毒性化合物穿过肠屏障迁移出肠道以及降低疾病易感性。
在一个具体实施方案中，通过下调上皮细胞上的TNF-α受体来实现上述改善。在一个优选的实施方案中，营养组合物用于通过下调上皮细胞上的TNF-α受体来改善胃肠屏障保护。在一个更优选的实施方案中，营养组合物用于通过下调上皮细胞上的TNF-α受体来预防屏障功能障碍、预防屏障渗漏、保护紧密连接结构和/或保护肠上皮内层完整性。
在本发明的另一个具体实施方案中，通过增加食用该营养组合物的婴儿或幼儿的微生物区系产生的犬尿酸来实现上述改善。在一个优选的实施方案中，营养组合物用于通过增加食用该营养组合物的婴儿或幼儿的微生物区系产生的犬尿酸来改善胃肠屏障修复。在一个更优选的实施方案中，营养组合物用于通过增加食用该营养组合物的婴儿或幼儿的微生物区系产生的犬尿酸来恢复胃肠屏障的完整性，诸如修复被破坏的屏障、降低胃肠粘膜受炎症攻击时的通透性和/或修复粘膜。
在本发明的另一个具体实施方案中，通过增加食用该营养组合物的三岁至小于八岁的儿童的微生物区系产生的犬尿酸来实现上述改善。在一个优选的实施方案中，成长乳形式的营养组合物用于通过增加食用该营养组合物的儿童的微生物区系产生的犬尿酸来改善胃肠屏障修复。在一个更优选的实施方案中，成长乳形式的营养组合物用于通过增加食用该成长乳形式的营养组合物的儿童的微生物区系产生的犬尿酸来恢复胃肠屏障的完整性，诸如修复被破坏的屏障、降低胃肠粘膜受炎症攻击时的通透性和/或修复粘膜。
上述效果/有益效果优选地在小肠中获得。
在又一个实施方案中，营养组合物被配制用于施用给婴儿。在另一个实施方案中，所述婴儿选自早产婴儿、小于胎龄婴儿和低出生体重婴儿，优选地婴儿为早产婴儿。根据本发明的营养组合物被认为对这些类型的婴儿特别有用，因为所述有益效果对于这些婴儿而言比对于“正常”婴儿更重要，因为与健康足月婴儿相比，这些婴儿屏障不太成熟并且更易渗透。
在一些实施方案中，2′FL的量可为0.005g/L-5g/L组合物，诸如0.01g/L-3g/L组合物、或0.02g/L-2g/L组合物、或0.1g/L-2.5g/L组合物、或0.15g/L-2g/L组合物、或0.25g/L-1.9g/L组合物、或0.75g/L-1.65g/L组合物。在一个具体实施方案中，2′FL的量为1g/L组合物。在另一个具体实施方案中，2′FL的量为0.25g/L或0.26g/L组合物。在一个实施方案中，2′FL的量大于0.1g/L并且任选地小于1g/L或大于0.2g/L且小于0.8g/L。在一个实施方案中，2′FL以至少0.1g/L、至少0.25g/L、至少0.26g/L、至少0.5g/L、至少0.7g/L、至少0.8g/L、至少1g/L、至少1.25g/L、至少1.5g/L、至少1.5g/L或至少2g/L的量存在。
基于干重，2′FL可以0.004g/100g组合物-3.8g/100g组合物的总量存在于营养组合物中。2′FL的量可为0.008g/100g组合物-2.3g/100g组合物，诸如0.015g/100g组合物-1.5g/100g组合物、或0.08g/100g组合物-1.9g/100g组合物、或0.12g/100g组合物-1.5g/100g组合物、或0.15g/100g组合物-1.5g/100g组合物、或0.19g/100g组合物-1.5g/100g组合物。在一个具体实施方案中，2′FL的量为0.075g/100g组合物或0.78g/100g组合物。在另一个具体实施方案中，2′FL的量为0.2g/100g组合物。在一个具体实施方案中，2′FL的量为至少0.01g/100g组合物、至少0.02g/100g组合物、至少0.05g/100g组合物、至少0.1g/100g组合物、至少0.2g/100g组合物、至少0.25g/100g组合物、至少0.4g/100g组合物、至少0.5g/100g组合物、至少0.75g/100g组合物、至少0.9g/100g组合物、至少1g/100g组合物、至少1.5g/100g组合物、至少2g/100g组合物或至少3g/100g组合物。
在另一个具体实施方案中，2′FL的量为5g/L组合物-500g/L组合物、10g/L组合物-400g/L组合物、40g/L组合物-300g/L组合物、60g/L组合物-200g/L组合物、80g/L组合物-180g/L组合物、100g/L组合物-150g/L组合物或110g/L组合物-130g/L组合物。在一个具体实施方案中，HMO混合物的量为120g/L。当营养组合物为补充剂或强化剂的形式时，此类量是特别足够的。
当补充剂或强化剂为粉末形式时，2′FL优选地以每份0.05g至5g、0.1g至4.5g、0.15g至4g、0.2g至3.5g、0.25g至3g、0.3g至2.5g、0.35g至2g、0.4g至1.5g、0.45g至1g、0.5g至0.75g、例如0.6g的量提供于本发明的营养组合物中。
在一个具体实施方案中，2′FL以一定量提供于本发明的营养组合物中，使得营养组合物的正常食用将提供给婴儿或幼儿(相应的儿童)食用0.003g/天-6.5g/天、优选0.006g/天-3.9g/天、例如0.012g/天-2.6g/天的总日剂量。据信，需要最小量的2′FL，从而以可测量的方式具有期望的效果。
对于早产、低出生体重和小于胎龄婴儿，2′FL的日剂量优选地为0.05g/kg体重/天至1g/kg体重/天，优选0.06g/kg体重/天-0.9g/kg体重/天或0.07g/kg体重/天-0.8g/kg体重/天或0.08g/kg体重/天-0.7g/kg体重/天或0.09g/kg体重/天-0.6g/kg体重/天或0.1g/kg体重/天-0.5g/kg体重/天或0.2g/kg体重/天-0.4g/kg体重/天，最优选0.34g/kg体重/天。
在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种另外的HMO或其一种或多种前体。
在本发明的一个实施方案中，2′FL与6-SL和LNT组合。不希望受理论的约束，在此类实施方案中，2′-FL用于经由增加婴儿或幼儿的微生物区系产生的犬尿酸来激活GPR35受体。在此类实施方案中，6SL和LNT也被认为用于GPR35的激活，如(同一申请人的)国际专利申请WO2019/121929中所述。
在本发明的一个实施方案中，LNT以0.005/L组合物-3g/L组合物的量存在于营养组合物或成长乳中。在一些实施方案中，LNT的量可为0.01-1.5g/L组合物，诸如0.04-1.2g/L或0.05-1g/L或0.09-0.8g/L组合物。在一个具体实施方案中，LNT的量为0.5g/L组合物。在另一个具体实施方案中，LNT的量为0.1g/L组合物。
LNT可以基于干重计0.004-2.3g/100g组合物的量存在于营养组合物或成长乳中，LNT可以0.008-1.2g/100g组合物诸如0.03-0.9g/100g或0.04-0.8g/100g或0.07-0.6g/100g组合物的量存在。在一个具体实施方案中，LNT以0.38g/100g组合物的量存在。在另一个具体实施方案中，LNT以0.08g/100g组合物的量存在。
LNT可采用酶转移法，即使用糖基转移酶将供体部分的糖单元转移到受体部分来化学合成，如例如美国专利号5,288,637和WO 96/10086中所述。
在本发明的另一个实施方案中，营养组合物或成长乳可包含0.005g/L-5g/L、或0.008g/L-2.5g/L、或0.01g/L-1g/L、或0.03g/L-0.7g/L、例如0.04g/L或0.5g/L的6′SL。
根据本发明的营养组合物或成长乳可包含基于干重每100g组合物0.004g-3.8g的6′SL，例如基于干重每100g组合物0.006g-1.9g或0.008g-0.8g或0.023g-0.5g或0.031g-0.4g的6′SL，例如基于干重每100g组合物0.18g或0.04g的6′SL。
可通过色谱技术或过滤技术从天然来源(诸如动物乳)中分离出6′SL。另选地，其也可使用特定唾液酸转移酶或唾液酸酶、神经氨酸苷酶，通过生物技术手段，通过基于酶(重组酶或天然酶)的发酵技术、通过化学合成或通过微生物发酵技术来产生。在后一种情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者可经工程化以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物或混合培养物。6′SL的形成可由起始于任意聚合度(DP)的受体底物(从DP＝1开始)引发。另选地，6′SL可通过由乳糖和游离N′-乙酰神经氨酸(唾液酸)的化学合成来产生。
在一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物或成长乳中包含的6′SL和LNT通常以6′SL:LNT为3:1至1:3诸如2:1至1:2或2:1至1:1的比率存在。在一个特别有利的实施方案中，该比率为2:1或约2.1，优选地该比率为1:1或约1:1。
在本发明的一个具体方面，营养组合物或成长乳包含6′SL和LNT，其中：
-6′SL的量为0.005g/L组合物-5g/L组合物，和/或其量为基于干重0.004g/100g组合物-3.8g/100g组合物；和/或
-LNT的量为0.005g/L组合物-3g/L组合物，和/或其量为基于干重0.004g/100g组合物-2.3g/100g组合物。
在本发明的一个具体方面，营养组合物或成长乳包含6′SL和LNT，其中：
-6′SL的量为0.008g/L组合物-2.5g/L组合物，和/或其量为基于干重0.006g/L组合物-1.9g/100g组合物；和/或
-LNT的量为0.01g/L组合物-1.5g/L组合物，和/或其量为基于干重0.008g/100g组合物-1.2g/100g组合物。
在另一个具体实施方案中，本发明的营养组合物或成长乳包含6′SL和LNT，其中：
-6′SL的量为0.01g/L组合物-1g/L组合物，和/或其量为基于干重0.008g/100g组合物-0.8g/100g组合物；和/或
-LNT的量为0.04g/L组合物-1.2g/L组合物，和/或其量为基于干重0.03g/100g组合物-0.9g/100g组合物。
在另一个具体实施方案中，本发明的营养组合物或成长乳包含6′SL和LNT，其中：
-6′SL的量为0.03g/L组合物-0.7g/L组合物，和/或其总量为基于干重0.023g/100g组合物-0.5g/100g组合物；和/或
-LNT的量为0.05g/L组合物-1g/L组合物，和/或其量为基于干重0.04g/100g组合物-0.8g/100g组合物。
在另一个具体实施方案中，本发明的营养组合物或成长乳包含6′SL和LNT，其中：
-6′SL的量为0.04g/L组合物-0.5g/L组合物，和/或其量为基于干重0.031g/100g组合物-0.4g/100g组合物；和/或
-LNT的量为0.09g/L组合物-0.8g/L组合物，和/或其量为基于干重0.07g/100g组合物-0.6g/100g组合物。
在一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物或成长乳包含6′SL和LNT，其中：
-6′SL的量为0.24g/L组合物或0.05g/L组合物，和/或其量为基于干重0.18g/100g组合物或0.04g/100g组合物；和/或
-LNT的量为0.5g/L组合物或0.1g/L组合物，和/或其量为基于干重0.38g/100g组合物或0.08g/100g组合物。
在一个具体实施方案中，6′SL以一定量提供于本发明的营养组合物或成长乳中，使得营养组合物或成长乳的正常食用将向消耗其的婴儿或幼儿(相应的儿童)提供0.003g至6.5g的总日剂量，优选每天0.005g-3.3g或0.006g-1.3g或0.02g-0.9g，例如0.024g-0.7g。
在一个具体实施方案中，LNT以一定量提供于本发明的营养组合物或成长乳中，使得营养组合物或成长乳的正常食用将向消耗其的婴儿或幼儿(相应的儿童)提供0.003g-3.9g的总日剂量，优选每天0.006g-2g或0.02g-1.6g或0.03g-1.3g，例如0.05g-1g。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含至少一种N-乙酰化低聚糖。N-乙酰化低聚糖优选为LnNT。本发明人已发现，不受理论的约束，LnNT与肠道菌群产生最佳相互作用并促进所述效果。
在一个实施方案中，N-乙酰化低聚糖为乳糖-N-新四糖(LNnT)、乳糖-N-四糖(LNT)、对-乳糖-N-新六糖(对-LNnH)、二唾液酸乳糖-N-四糖(DSLNT)或它们的任意组合，优选乳糖-N-新四糖(LNnT)和/或乳糖-N-四糖(LNT)。
在一个实施方案中，N-乙酰化低聚糖以介于0.025g/L组合物-1.5g/L组合物之间、优选至少0.1g/L组合物或至少0.25g/L组合物的总量存在，和/或基于干重，以介于0.003g/100g组合物-0.23g/100g组合物之间、优选至少0.015g/100g组合物或至少0.03g/100g组合物的总量存在。
N-乙酰化低聚糖可采用酶转移法，即使用糖基转移酶将供体部分的糖单元转移到受体部分来化学合成，如例如美国专利号5,288,637和WO96/10086所述。另选地，LNT和LNnT可通过将游离的或与低聚糖(例如，乳果糖)结合的酮-六糖(例如，果糖)化学转化成N-乙酰六糖胺或包含N-乙酰六糖胺的低聚糖来制备，如Wrodnigg,T.M.；Stutz,A.E.(1999)Angew.Chem.Int.Ed.38:827-828)。然后可将用这种方式制得的N-乙酰基-乳糖胺转移到作为受体部分的乳糖。
在本发明的一个特别有利的实施方案中，N-乙酰化低聚糖以一些具体量存在于营养组合物中。除非另外指明，否则术语“量”是指营养组合物中这两种组分中每一者的总量。因此，除非存在这些组分的单个类型(在这种情况下总量和单个量相等)，否则它不指单个量。这同样适用于本发明的所有化合物/成分。作为示例性示例，如果组合物中存在仅一种(即，仅一种类型的)N-乙酰化低聚糖(例如LNnT)，则其单个量(及因此N-乙酰化低聚糖的总量)将在0.75g/L-1.65g/L的范围内。如果存在若干种(即，若干种类型的)N-乙酰化低聚糖，则其单个量将较低(例如，如果存在2种不同类型的N-乙酰化低聚糖例如LNnT+LNT，则每一者可例如具有0.5g/L的单个量)，但N-乙酰化低聚糖的总量将在0.75g/L-1.65g/L的范围内。
在一个具体实施方案中，N-乙酰化低聚糖以一定量提供于本发明的营养组合物中，使得营养组合物的正常食用将提供给婴儿或幼儿(相应的儿童)食用0.003g/天-3.9g/天、优选0.006g/天-3.25g/天或0.03g/天-1.95g/天或0.03g/天-1.3g/天或0.03g/天-1g/天、例如0.05g/天-1g/天的总日剂量。
对于早产、低出生体重和小于胎龄婴儿，日剂量优选为0.005g/kg体重/天至0.1g/kg体重/天，优选0.006g/kg-0.09g/kg体重/天或0.007g/kg-0.08g/kg体重/天或0.008g/kg-0.07g/kg体重/天或0.009g/kg-0.06g/kg体重/天或0.01g/kg-0.05g/kg体重/天或0.02g/kg-0.04g/kg体重/天，最优选0.034g/kg体重/天。
当存在2′FL和N-乙酰化低聚糖两者时，根据本发明的营养组合物中包含的2′FL和N-乙酰化低聚糖通常以1:20至2:1、优选1:15至1:1、最优选1:10至1:2的N-乙酰化低聚糖:2′FL存在。在一个特别有利的实施方案中，该比率为(或为约)1:2、1:5或1:10。
2′FL和LNnT的共混物被认为是特别有利的，因为数据表明此类共混物在处理48小时之后已经实现了显著的有益效果(并且该效果是随后持续的)，而不含LNnT的2′FL在中期更起作用。因此，在一个实施方案中，本发明的用途是用于快速改善胃肠屏障，诸如在72小时内，优选在48小时内，或诸如在24小时内。
在另一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物可包含唾液酸化低聚糖。可存在一种或若干种唾液酸化低聚糖。唾液酸化低聚糖可选自3′-唾液酸乳糖(3′SL)、6′-唾液酸乳糖(6′SL)以及它们的任意组合。在本发明的一些实施方案中，组合物包含3′SL和6′SL。在一些具体实施方案中，3′-唾液酸乳糖(3′SL)和6′-唾液酸乳糖(6′SL)之间的比率的范围可介于5:1和1:10之间、或介于3:1和1:1之间、或介于1:1至1:10之间。在一些特定实施方案中，组合物中的唾液酸化低聚糖为6′-唾液酸乳糖(6′SL)。
可通过色谱技术或过滤技术从天然源诸如动物乳分离唾液酸化低聚糖。另选地，也可使用特定唾液酸基转移酶或唾液酸酶、神经氨酸苷酶，通过生物技术手段，通过基于酶(重组酶或天然酶)的发酵技术、通过化学合成或通过微生物发酵技术，来制备唾液酸化低聚糖。在后一种情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者可经工程化以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物或混合培养物。可以最初具有任意聚合度(DP)的受体底物开始形成唾液酸基低聚糖，从DP＝1开始。另选地，可通过由乳糖和游离N′-乙酰神经氨酸(唾液酸)的化学合成来产生唾液酸基乳糖。唾液酸基乳糖也可从例如日本的Kyowa HakkoKogyo商购获得。
在本发明的另一个优选实施方案中，营养组合物可包含0.005g/L-5g/L、或0.008g/L-2.5g/L、或0.01g/L-1g/L、或0.02g/L-0.7g/L、例如0.03g/L-0.5g/L的唾液酸化低聚糖。
根据本发明的营养组合物可包含基于干重每100g组合物0.004g-3.8g的唾液酸化低聚糖，例如基于干重每100g组合物0.006g-1.9g或0.008g-0.8g或0.015g-0.5g的唾液酸化低聚糖，例如0.023g-0.4g的唾液酸化低聚糖。
在本发明的一些具体实施方案中，基于干重，营养组合物包含量低于0.1g/100g组合物的唾液酸化低聚糖。
在一个具体实施方案中，唾液酸化低聚糖以一定量提供于本发明的营养组合物中，使得营养组合物的正常食用将提供给婴儿或幼儿(相应的儿童)食用0.003g/天-6.5g/天、优选0.005g/天-3.3g/天或0.006g/天-1.3g/天或0.01g/天-0.9g/天、例如0.018g/天-0.65g/天的总日剂量。
在本发明的一些具体实施方案中，营养组合物不含任何唾液酸化低聚糖。
根据本发明的营养组合物可任选地还包含至少一种低聚糖前体。可存在一种或若干种低聚糖前体。例如，人乳低聚糖的前体为唾液酸、岩藻糖或者它们的混合物。在一些具体实施方案中，该组合物包含唾液酸。
在具体示例中，营养组合物包含0g/L至3g/L的低聚糖前体，或0g/L至2g/L、或0g/L至1g/L、或0g/L至0.7g/L、或0g/L至0.5g/L、或0g/L至0.3g/L、或0g/L至0.2g/L的低聚糖前体。根据本发明的组合物可包含基于干重每100g组合物0g至2.1g的低聚糖的前体，例如基于干重每100g组合物0g至1.5g或0g至0.8g或0g至0.15g的低聚糖的前体。
除2′FL外，本发明的营养组合物还可包含至少一种另外的岩藻糖基化低聚糖。可存在一种或若干种类型的岩藻糖基化低聚糖。岩藻糖基化低聚糖实际上可选自包括以下项的列表：3′-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳糖-N-岩藻五糖(诸如，乳糖-N-岩藻五糖I、乳糖-N-岩藻五糖II、乳糖-N-岩藻五糖III、乳糖-N-岩藻五糖V)、乳糖-N-岩藻六糖、乳糖-N-二岩藻六糖I、岩藻糖基乳糖-N-六糖、岩藻糖基乳糖-N-新六糖(诸如，岩藻糖基乳糖-N-新六糖I、岩藻糖基乳糖-N-新六糖II)、二岩藻糖基乳糖-N-六糖I、二岩藻糖基-乳糖-N-新六糖、二岩藻糖基乳糖-N-新六糖I、二岩藻糖基乳糖-N-新六糖II、岩藻糖基-对-乳糖-N-六糖、三岩藻基-对-乳糖-N-六糖I以及它们的任意组合。
在一些具体实施方案中，另外的岩藻糖基化低聚糖包含2′-岩藻糖基表位。另外的岩藻糖基化低聚糖例如可选自包括以下项的列表：二岩藻糖基乳糖、乳糖-N-岩藻五糖、乳糖-N-岩藻六糖、乳糖-N-二岩藻六糖、岩藻糖基乳糖-N-六糖、岩藻糖基乳糖-N-新六糖、二岩藻糖基乳糖-N-六糖、二岩藻糖基-乳糖-N-新六糖、二岩藻糖基乳糖-N-新六糖、岩藻糖基-对-乳糖-N-六糖以及它们的任意组合，优选二岩藻糖基乳糖。
在一个具体实施方案中，不存在除2’-岩藻糖基乳糖以外的其它类型的岩藻糖基化低聚糖，即，本发明的营养组合物仅包含2’-岩藻糖基乳糖作为岩藻糖基化低聚糖。
可通过色谱技术或过滤技术从天然源诸如动物乳来分离岩藻糖基化低聚糖。另选地，也可使用特定岩藻糖基转移酶和/或岩藻糖苷酶，通过生物技术手段，通过使用基于酶(重组酶或天然酶)的发酵技术或微生物发酵技术，来制备岩藻糖基化低聚糖。在后一种情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者可经工程化以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物和/或混合培养物。可以最初具有任意聚合度(DP)的受体底物开始形成岩藻糖基化低聚糖，从DP＝1开始。另选地，可以通过由乳糖和游离岩藻糖化学合成来制备岩藻糖基化低聚糖。岩藻糖基化低聚糖也可从例如日本协和发酵工业株式会社(Kyowa,Hakko,Kogyo)购得。
在一些实施方案中，岩藻糖基化低聚糖(包括2′FL)的总量可为0.005g/L组合物-5g/L组合物，诸如0.01g/L组合物-3g/L组合物、或0.02g/L组合物-2g/L组合物、或0.1g/L组合物-2.5g/L组合物、或0.15g/L组合物-2g/L组合物、或0.25g/L组合物-1.9g/L组合物、或0.75g/L组合物-1.65g/L组合物。在一个具体实施方案中，岩藻糖基化低聚糖的总量为1g/L组合物。在另一个具体实施方案中，岩藻糖基化低聚糖的总量为0.25g/L或0.26g/L组合物。在一个实施方案中，岩藻糖基化低聚糖的总量大于0.1g/L并且任选地小于1g/L或大于0.2g/L且小于0.8g/L。在一个实施方案中，岩藻糖基化低聚糖的总量为至少0.1g/L、至少0.25g/L、至少0.26g/L、至少0.5g/L、至少0.7g/L、至少0.8g/L、至少1g/L、至少1.25g/L、至少1.5g/L、至少1.5g/L或至少2g/L。
基于干重，岩藻糖基化低聚糖可以0.004g/100g组合物-3.8g/100g组合物的总量存在于营养组合物中。岩藻糖基化低聚糖的总量可为0.008g/100g组合物-2.3g/100g组合物，诸如0.015g/100g组合物-1.5g/100g组合物、或0.08g/100g组合物-1.9g/100g组合物、或0.12g/100g组合物-1.5g/100g组合物、或0.15g/100g组合物-1.5g/100g组合物、或0.19g/100g组合物-1.5g/100g组合物。在一个具体实施方案中，岩藻糖基化低聚糖的总量为0.075g/100g组合物或0.78g/100g组合物。在另一个具体实施方案中，岩藻糖基化低聚糖的总量为0.2g/100g组合物。在一个具体实施方案中，岩藻糖基化低聚糖的总量为至少0.01g/100g组合物、至少0.02g/100g组合物、至少0.05g/100g组合物、至少0.1g/100g组合物、至少0.2g/100g组合物、至少0.25g/100g组合物、至少0.4g/100g组合物、至少0.5g/100g组合物、至少0.75g/100g组合物、至少0.9g/100g组合物、至少1g/100g组合物、至少1.5g/100g组合物、至少2g/100g组合物或至少3g/100g组合物。
在一个具体实施方案中，岩藻糖基化低聚糖以一定量提供于本发明的营养组合物中，使得营养组合物的正常食用将提供给婴儿或幼儿(相应的儿童)食用0.003g/天-6.5g/天、优选0.006g/天-3.9g/天、例如0.012g/天-2.6g/天的总日剂量。据信，需要最小量的岩藻糖基化低聚糖，从而以可测量的方式具有期望的效果。
对于早产、低出生体重和小于胎龄婴儿，岩藻糖基化低聚糖的日剂量优选为0.05g/kg体重/天至1g/kg体重/天，优选0.06g/kg体重/天至0.9g/kg体重/天或0.07g/kg-0.8g/kg体重/天或0.08g/kg-0.7g/kg体重/天或0.09g/kg-0.6g/kg体重/天或0.1g/kg-0.5g/kg体重/天或0.2g/kg-0.4g/kg体重/天，最优选0.34g/kg体重/天。
在又一个实施方案中，组合物还包含选自LNnT、2′FL、diFL和3′SL的一种或多种HMO，诸如包含选自LNnT、2′FL、diFL和3′SL的两种或更多种HMO，诸如选自LNnT、diFL、LNT、6′SL和3′SL的三种或更多种HMO，诸如还包含LNnT、diFL、LNT、6′SL和3′Sl中的全部。如实施例3中所述，2′FL、LNnT、3′SL和DiFL的混合物保有2′FL的优异效果。
在一个特定实施方案中，本发明的营养组合物包含由2′FL、6′SL、LNT、DiFL、LNnT和3′SL组成的低聚糖混合物。
在另一个特定实施方案中，本发明的营养组合物包含由2′FL、6′SL、LNT、DiFL、LNnT和3′SL组成的低聚糖混合物。
在另一个特定实施方案中，本发明的营养组合物包含由2′FL、6′SL、LNT、DiFL和3′SL组成的低聚糖混合物。
在本发明的一个具体实施方案中，营养组合物包含2′FL并且不包含其它低聚糖。在本发明的单独实施方案中，营养组合物包含2′FL和另一种低聚糖，优选人乳低聚糖，更优选乳糖-N-新四糖(LNnT)或LNT(乳糖-N-四糖)。
在本发明的一个具体实施方案中，营养组合物包含2′FL和LNnT。
在一个特定实施方案中，本发明的营养组合物包含由2′FL和LNnT组成的低聚糖混合物。
还可能有利的是，组合物仅包含一种HMO。因此，在一个实施方案中，不同于2′FL的HMO或其前体不存在于营养组合物中，或者以小于0.1％(w/w)、优选诸如小于0.01％(w/w)、或更优选诸如小于0.001％的总量存在。如实施例3中所述，包含2′FL作为唯一HMO的组合物显示出最高效果。
在一个相关实施方案中，不同于2′FL和LNnT的HMO不存在于营养组合物中，或者以小于0.1％(w/w)、优选诸如小于0.01％(w/w)、或更优选诸如小于0.001％的总量存在。
根据本发明的营养组合物或成长乳还可包含其他类型的低聚糖(即，除上文所提及的人乳低聚糖之外)和/或至少其纤维和/或至少其前体。其他低聚糖和/或其纤维和/或前体可选自低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、菊粉、低聚木糖(XOS)、聚右旋糖以及它们的任意组合。它们的量可介于组合物的0重量％和10重量％之间。在一个具体实施方案中，营养组合物或成长乳还可含有至少一种BMO(牛乳低聚糖)。
可用于制备根据本发明的营养组合物或成长乳的合适商用产品包括FOS与菊粉的组合，诸如由BENEO公司以商标Orafti出售的产品，或者由泰莱公司(Tate&Lyle)以商标
Figure BDA0003115476160000211
出售的聚右旋糖。
根据本发明的营养组合物或成长乳可任选地还包含至少一种低聚糖的前体。可存在一种或若干种低聚糖前体。例如，人乳低聚糖的前体为唾液酸、岩藻糖或者它们的混合物。在一些具体实施方案中，该组合物包含唾液酸。
在具体示例中，该营养组合物或成长乳包含0g/L至3g/L的低聚糖的前体，或0g/L至2g/L、或0g/L至1g/L、或0g/L至0.7g/L、或0g/L至0.5g/L、或0g/L至0.3g/L、或0g/L至0.2g/L的低聚糖的前体。根据本发明的组合物可包含基于干重每100g组合物0g至2.1g的低聚糖的前体，例如基于干重每100g组合物0g至1.5g或0g至0.8g或0g至0.15g的低聚糖的前体。
本发明的营养组合物或成长乳可还包含至少一种益生菌(或益生菌菌株)，诸如益生细菌菌株。
最常用的益生微生物主要是以下属的大部分细菌和酵母：乳酸杆菌属菌种(Lactobacillus spp.)、链球菌属菌种(Streptococcus spp.)、肠球菌属菌种(Enterococcus spp.)、双歧杆菌属菌种(Bifidobacterium spp.)和酵母属菌种(Saccharomyces spp.)。
在一些具体实施方案中，益生菌为益生细菌菌株。在一些特定实施方案中，其具体地为双歧杆菌(Bifidobacteria)和/或乳酸杆菌(Lactobacilli)。
合适的益生细菌菌株包括得自芬兰瓦利奥公司(Valio Oy,Finland)的商标为LGG的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ATCC 53103、鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.3724、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CNCM I-2116、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)CNCM I-1225、新西兰BLIS科技有限公司(BLIS Technologies Limited,NewZealand)以商品名KI2销售的唾液链球菌(Streptococcus salivarius)DSM 13084、丹麦克里斯蒂安汉森公司(Christian Hansen company,Denmark)以商标Bb 12特别销售的乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)CNCM 1-3446、日本森永乳业株式会社(Morinaga MilkIndustry Co.Ltd.,Japan)以商标BB536销售的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ATCC BAA-999、丹尼斯克公司(Danisco)以商标Bb-03销售的短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、森永(Morinaga)以商标M-16V销售的短双歧杆菌、宝洁公司(Procter&GambIe Co.)以商标Bifantis销售的婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，以及加拿大Rosell生物研究所(Institut Rosell-Lallemand)以商标R0070销售的短双歧杆菌。
基于干重，根据本发明的营养组合物或成长乳每g组合物可含有10e3cfu至10e12cfu的益生菌菌株、更优选介于10e7 cfu和10e12 cfu之间、诸如介于10e8 cfu和10e10 cfu之间的益生菌菌株。
在一个实施方案中，益生菌是活的。在另一个实施方案中，益生菌是非复制的或失活的。在一些其它实施方案中，可同时存在活的益生菌和失活的益生菌。还可添加益生菌组分和代谢物。
在一个实施方案中，本发明的营养组合物是完全营养组合物(满足个体全部或大部分营养需求)。在另一个实施方案中，营养组合物是用来例如补充人乳或者补充婴儿配方食品或较大/二段婴儿配方食品的补充剂或强化剂。
在一些具体实施方案中，本发明的组合物为可旨在针对4月龄、6月龄或12月龄的婴儿配方食品、强化剂或补充剂。在一个优选的实施方案中，本发明的营养组合物是婴儿配方食品。实际上据信，本发明的营养干预在生命的早期阶段(例如，出生后前1、4、6、12个月)进行时可能最有效。
根据本发明的营养组合物可为例如婴儿配方食品、一段婴儿配方食品、较大或二段婴儿配方食品、成长乳、婴孩食物、婴儿谷物组合物、强化剂(诸如人乳强化剂)或补充剂。在一些具体实施方案中，本发明的组合物为旨在针对前4月龄或6月龄的婴儿配方食品、强化剂或补充剂。在一个优选的实施方案中，本发明的营养组合物是婴儿配方食品。
在一些其他实施方案中，本发明的营养组合物是强化剂。强化剂可为母乳强化剂(例如，人乳强化剂)或配方食品强化剂(诸如婴儿配方食品强化剂或较大/二段婴儿配方食品强化剂)。
当营养组合物是补充剂时，其可以单位剂量的形式提供。在此类情况下，特别有用的是，根据施用给婴儿或幼儿的日剂量来限定2′FL和任选其它低聚糖的量，诸如上文所述。
当营养组合物是补充剂时，其可包含2′-FL，并且在赋形剂的顶层不包含获得稳定营养组合物所必需的其它附加营养物质。
本发明的营养组合物可为固体(例如粉末)、液体或凝胶形式。
在一个具体的实施方案中，营养组合物是粉末形式的补充剂，并且以片剂、胶囊剂、锭剂或液体的形式提供在小袋中，诸如将作为液滴分配在母乳或营养组合物中或直接分配在婴儿或幼儿口中的液体。
在另一个实施方案中，补充剂可还含有载体、保护性亲水胶体(诸如胶类、蛋白质、改性淀粉)、粘结剂、成膜剂、包囊剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油类、脂肪类、蜡类、卵磷脂类等)、吸附剂、载体、填充剂、共化合物、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、掩味剂、增重剂、胶凝剂和凝胶形成剂。补充剂可还含有常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂和稀释剂，包括但不限于：水、任何来源的明胶、植物胶、木素磺酸盐、滑石、糖类、淀粉、阿拉伯树胶、植物油、聚亚烷基二醇、风味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、润湿剂、填充剂等。当补充剂为粉末形式时，其可包含载体。然而，优选的是补充剂不含载体。当补充剂为糖浆形式时，HMO优选溶解或悬浮于用柠檬酸盐酸化的水中。
另外，补充剂可含有维生素、矿物质痕量元素和根据政府机构(诸如USRDA)推荐的其它微量营养素。
本发明的营养组合物可为固体(例如粉末)、液体或凝胶形式。在一个特定实施方案中，营养组合物为包含2′FL的补充剂，其中补充剂为粉末形式并且以小袋提供，优选地小袋具有1g至10g的2′FL的混合物/小袋，或者以糖浆形式提供，优选地糖浆具有5g/100mL至75g/100mL(5％至75％(w/v))的总固体浓度。当补充剂为粉末形式时，其可包含载体。然而，优选的是补充剂不含载体。当补充剂为糖浆形式时，HMO优选溶解或悬浮于用柠檬酸盐酸化的水中。
根据本发明的营养组合物或成长乳通常含有蛋白质源。蛋白质的量可为1.6g/100kcal至3g/100kcal。在一些实施方案中，特别是当组合物旨在用于早产婴儿时，蛋白质的量可介于2.4g/100kcal和4g/100kcal之间或超过3.6g/100kcal。在一些其他的实施方案中，蛋白质的量可低于2.0g/100kcal，例如介于1.8g/100kcal至2g/100kcal之间，或者量低于1.8g/100kcal。
只要满足必需氨基酸含量的最低要求并确保令人满意的生长，蛋白质的类型被认为对本发明无关紧要。因此，可使用基于乳清、酪蛋白以及其混合物的蛋白质源，也可使用基于大豆的蛋白质源。就所关注的乳清蛋白质而言，蛋白质源可基于酸乳清或甜乳清或其混合物，并且可包含任何所需比例的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。
在一些有利的实施方案中，蛋白质源以乳清为主(即，超过50％的蛋白质来自乳清蛋白质，诸如60％或70％)。
该蛋白质可为完整的或水解的，或为完整蛋白质和水解蛋白质的混合物。所谓的术语“完整的”是指蛋白质的主要部分是完整的，即分子结构未发生改变，例如至少80％的蛋白质未发生改变，诸如至少85％的蛋白质未发生改变，优选至少90％的蛋白质未发生改变，甚至更优选至少95％的蛋白质未发生改变，诸如至少98％的蛋白质未发生改变。在一个具体实施方案中，100％的蛋白质未发生改变。
术语“水解的”是指在本发明的上下文中，蛋白质已被水解或分解成其组成氨基酸。该蛋白质可以是完全水解或部分水解的。例如，对于被认为处于发生牛乳变应性风险的婴儿或幼儿而言，提供部分水解的蛋白质(水解程度介于2％和20％之间)可能是可取的。如果需要水解的蛋白质，则可根据需要并且如本领域已知的那样进行水解过程。例如，可通过在一个或多个步骤中对乳清级分进行酶法水解来制备乳清蛋白质水解产物。如果用作原料的乳清级分基本上不含乳糖，则发现该蛋白质在水解过程期间经受少得多的赖氨酸封闭(lysine blockage)。这使得能够将赖氨酸封闭的程度从约15重量％的总赖氨酸减少至小于约10重量％的赖氨酸；例如约7重量％的赖氨酸，这大大地改善蛋白质源的营养质量。
在本发明的一个实施方案中，至少70％的蛋白质被水解，优选至少80％的蛋白质被水解，诸如至少85％的蛋白质被水解，甚至更优选至少90％的蛋白质被水解，诸如至少95％的蛋白质被水解，特别地至少98％的蛋白质被水解。在一个具体实施方案中，100％的蛋白质被水解。
在一个具体实施方案中，营养组合物的蛋白质是水解的、完全水解的或部分水解的。蛋白质的水解程度(DH)可为介于8和40之间、或介于20和60之间、或介于20和80之间，或超过10、20、40、60、80或90。
另选地，蛋白质组分可替换为混合物或合成氨基酸，例如用于早产或低出生体重婴儿。
在一个具体实施方案中，根据本发明的营养组合物或成长乳是低变应原组合物。在另一个具体实施方案中，根据本发明的组合物是低变应原营养组合物或成长乳。
根据本发明的营养组合物或成长乳通常含有碳水化合物源。这在本发明的营养组合物为婴儿配方食品的情况下是特别优选的。在这种情况下，可使用通常存在于婴儿配方食品中的任何碳水化合物源，诸如乳糖、蔗糖(sucrose)、糖精(saccharose)、麦芽糖糊精、淀粉以及它们的混合物，但是优选的碳水化合物源之一是乳糖。
根据本发明的营养组合物或成长乳通常含有脂质源。这在本发明的营养组合物为婴儿配方食品的情况下为特别相关的。在这种情况下，脂质源可为适合用于婴儿配方食品的任何脂质或脂肪。一些合适的脂肪源包括棕榈油、结构化甘油三酯油、高油酸葵花油和高油酸红花油、中链甘油三酯油。也可添加必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸，以及少量含有大量预先形成的花生四烯酸和二十二碳六烯酸的油，诸如鱼油或微生物油。脂肪源中n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比例可为约5:1至约15:1；例如约8:1至约10:1。
本发明的营养组合物或成长乳可还含有被认为是日常饮食所必需的且以营养显著量的所必需的所有维生素和矿物质。已确定某些维生素和矿物质的最低需求。矿物质、维生素和任选地存在于本发明组合物中的其他营养物质的示例包括维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸和左旋肉碱。矿物质通常呈盐形式添加。特定矿物质和其它维生素的存在和量将根据目标群体而有所不同。
如有必要，本发明的营养组合物或成长乳可含有乳化剂和稳定剂，诸如大豆、卵磷脂、柠檬酸甘油单酯和柠檬酸甘油二酯等。
本发明的营养组合物或成长乳可还含有可能具有有益效果的其它物质，诸如乳铁蛋白、核苷酸、核苷等。
本发明的营养组合物或成长乳可还含有类胡萝卜素。在本发明的一些具体实施方案中，本发明的营养组合物不包含任何类胡萝卜素。
根据本发明的营养组合物或成长乳可以任何合适的方式制备。现将以举例的方式描述组合物。
例如，可通过将蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源以适当的比例共混在一起来制备配方食品诸如婴儿配方食品。如果使用，则乳化剂可在此时加入。可在此时添加维生素和矿物质，但其通常在稍后添加以避免热降解。在共混之前，可先将任何亲脂性维生素、乳化剂等溶解于脂肪源中。然后可混入水(优选经受反渗透的水)，以形成液体混合物。水温适宜地在约50℃至约80℃的范围内以有助于分散成分。可使用可商购获得的液化剂来形成液体混合物。
尤其是如果最终产物是液体形式，则可在此阶段加入岩藻糖基化低聚糖和N-乙酰化低聚糖。如果最终产物为粉末，可根据需要同样在此阶段添加这些成分。
然后，例如以两个阶段对液体混合物进行均质化。
然后，可对液体混合物进行热处理以减少细菌载量，例如通过将液体混合物快速加热至约80℃至约150℃的范围内的温度持续介于约5秒和约5分钟之间的持续时间。这可通过蒸汽注入、高压灭菌器或热交换器(例如，板式热交换器)来进行。
然后，例如通过急速冷却将液体混合物冷却至介于约60℃至约85℃之间。然后再次例如分两个阶段对液体混合物进行均质化，其中第一阶段的压力为介于约10MPa至约30MPa，并且第二阶段的压力为介于约2MPa至约10MPa之间。然后可将均质化的混合物进一步冷却以添加任何热敏组分，诸如维生素和矿物质。此时便利地调节均质化的混合物的pH和固体含量。
如果最终产物将为粉末，则将该均质化的混合物转移至合适的干燥装置，诸如喷雾干燥器或冷冻干燥器且将其转化为粉末。该粉末的水分含量应小于约5重量％。还可以或作为替代在此阶段加入岩藻糖基化低聚糖和N-乙酰化低聚糖，方法是通过将其与益生菌菌株(如果使用)干混，或通过以晶体的糖浆形式与益生菌菌株共混，然后对混合物进行喷雾干燥或冷冻干燥。
如果优选液体组合物，可对该均质化的混合物进行灭菌，然后在无菌条件下将其填充至合适的容器中或者先将其填充至容器中并且然后进行蒸馏。
在另一个实施方案中，本发明的组合物可为补充剂。补充剂可以是例如片剂、胶囊、锭剂或液体的形式。补充剂可还含有保护性亲水胶体(诸如胶类、蛋白质、改性淀粉)、粘结剂、成膜剂、包囊剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油类、脂肪类、蜡类、卵磷脂类等)、吸附剂、载体、填充剂、共化合物、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、掩味剂、增重剂、胶凝剂和凝胶形成剂。补充剂可还含有常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂和稀释剂，包括但不限于：水、任何来源的明胶、植物胶、木素磺酸盐、滑石、糖类、淀粉、阿拉伯树胶、植物油、聚亚烷基二醇、风味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、润湿剂、填充剂等。
另外，补充剂可含有适用于口服或非肠道施用的有机或无机载体材料，以及维生素、矿物质痕量元素和根据政府机构(诸如USRDA)推荐的其它微量营养素。
根据本发明的营养组合物用于婴儿或幼儿。婴儿或幼儿可为足月儿或早产儿。在一个具体实施方案中，本发明的营养组合物用于早产、具有低出生体重和/或小于胎龄出生(SGA)的婴儿或幼儿。在一个具体实施方案中，本发明的营养组合物用于早产婴儿、低出生体重婴儿和/或小于胎龄出生的婴儿(SGA)。
本发明的营养组合物可还用于剖腹产出生或经阴道分娩的婴儿或幼儿。
在一些实施方案中，根据本发明的组合物可用于离乳期之前和/或离乳期期间中。
营养组合物的施用(或给予或喂食)年龄和持续时间可根据需要而确定。
营养组合物可例如在婴儿出生后立即提供。本发明的组合物可还在婴儿的生命的头1周期间、或在生命的头2周期间、或在生命的头3周期间、或在生命的头1个月期间、或在生命的头2个月期间、或在生命的头3个月期间、或在生命的头4个月期间、或在生命的头6个月期间、或在生命的头8个月期间、或在生命的头10个月期间、或在生命的头1年期间、或在生命的头2年期间、或甚至更长时间内给予。在本发明的一些特别有利的实施方案中，营养组合物在婴儿出生后头4、6或12个月内给予(或施用于)所述婴儿。在一些其他实施方案中，本发明的营养组合物在出生之后几天(例如，1天、2天、3天、5天、10天、15天、20天…)、或几周(例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周…)或几个月(例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月…)给予。这可以尤其指婴儿是早产儿的情况，但这并不是必需的。
在一个实施方案中，将本发明的组合物作为母乳的补充组合物给予婴儿或幼儿。在一些实施方案中，婴儿或幼儿在至少头2周、头1个月、头2个月、头4个月或头6个月期间接收母乳。在一个实施方案中，本发明的营养组合物在用母乳提供营养的这段时间之后给予婴儿或幼儿，或者在用母乳提供营养这段时间内与母乳一起给予婴儿或幼儿。在另一个实施方案中，在至少一段时间期间(例如，在生命的第1个月、第2个月、第4个月之后)，在至少1个月、2个月、4个月或6个月期间，将该组合物作为唯一或主要的营养组合物给予婴儿或幼儿。
在一个实施方案中，本发明的营养组合物是完全营养组合物(满足个体全部或大部分营养需求)。在另一个实施方案中，营养组合物是用来例如补充人乳或者补充婴儿配方食品或较大/二段婴儿配方食品的补充剂或强化剂。
本申请所引用的所有专利和非专利参考文献均据此全文以引用方式并入。
现将在下面的非限制性实施例中进一步详细描述本发明。
实施例
实施例1
下表1给出了根据本发明的营养组合物(例如，婴儿配方食品)的组成的示例。该组合物仅以例证的方式给出。
表1：实施例1的婴儿配方食品的组成
Figure BDA0003115476160000291
实施例2
下表2给出了根据本发明的营养组合物(例如，婴儿配方食品)的组成的示例。该组合物仅以例证的方式给出。
表2：实施例2的婴儿配方食品的组成
Figure BDA0003115476160000301
Figure BDA0003115476160000311
实施例3-HMO的直接效果
研究目的
在包含Caco-2和HT29-MTX细胞的肠上皮细胞的共培养细胞系模型中，测试2′FL、LNT、LNnT、3′SL和DiFL在炎症攻击之前和之后直接保护和增强上皮屏障的能力。
材料和方法
人Caco-2和HT29-MTX细胞系分别得自美国典型菌种保藏中心(ATCC)和欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC)。在37℃、10％湿度的CO2气氛中，将Caco-2细胞和HT29-MTX分别保持在培养瓶中，处于Dulbecco最低必需培养基(DMEM)中，并补充有GlutaMAX(Invitrogen)、1％最低必需培养基、100μg/ml链霉素、100UI/ml青霉素和热灭活胎牛血清(FBS，对于Caco-2为15％，对于HT29-MTX为10％)。
为了制备用于上皮屏障研究的共培养物，将每个细胞系在其相应烧瓶中扩增，直至达到90％汇合单层。然后用1x胰蛋白酶使细胞系胰蛋白酶化。将Caco-2和HT29-MTX的共培养物以6×104/cm2接种于1.12cm2的Transwell聚碳酸酯半透膜(0.4μm)上并在补充有GlutaMAX、1％最低必需培养基、100μg/ml链霉素、100UI/ml青霉素和10％热灭活FBS的DMEM中生长21天。
在实验当天，在处理前至少4小时用新鲜培养基替换培养基。首先通过在Transwell的顶腔处以30mg/ml的浓度添加HMO，用2′FL、LNT、LNnT、3′SL、DiFL或HMO的组合(2′FL、3′SL、6′SL和LNnT)预处理共培养物。在预处理48小时后，通过在Transwell的基底外侧腔处添加TNF-α(2.5ng/ml)和IFN-γ(10ng/ml)，将上皮屏障功能障碍再诱导48小时。在实验结束时，在2小时内定量FITC标记的葡聚糖(4000Da)从顶腔到基底外侧腔的易位。
结果
从图1所示的结果可以看出，2′FL对FITC标记的葡聚糖(4000Da)从顶腔到基底外侧腔的易位的减少具有最高效果。这证明在所测试的HMO中，在炎症攻击前后保护胃肠屏障以及保持足够的胃肠屏障结构(屏障完整性)和功能(通透性降低，诸如减少病原体、共生细菌、过敏原和毒性化合物穿过肠屏障迁移出肠道以及降低疾病易感性)方面，2′FL是最成功的。从2′FL、3′SL、6′SL和LNnT的组合观察到第二高效果。
结论
所呈现的数据表明，2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)在改善胃肠屏障并且特别是改善胃肠屏障保护方面优于其它测试的HMO，其次是包含2′FL、3′SL、6′SL和LNnT的HMO的共混物。
实施例4：2′FL下调TNF-α受体表达
材料和方法
细胞系。
人结肠直肠腺癌细胞系Caco-2(HTB-37)是得自美国典型菌种保藏中心(ATCC，美国马纳萨斯)的第21代，并且用于第23代至第33代的实验。人结肠腺癌细胞系HT29(HTB-38；ATCC)先前用甲氨蝶呤调适，是得自欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC，英国索尔兹伯里)的第51代，并且用于第23代至第33代的实验。在37℃、10％的CO2、95％空气/水饱和气氛的湿润气氛中，将两种细胞系分别保持在75cm2组织培养瓶(Fischer Scientific)中。
细胞培养模型。
Caco-2和HT29-MTX细胞系均保持在Dulbecco最低必需培养基(DMEM；11965092，Gibco)中，并补充有10％(v/v)热灭活FBS(10270-106，Gibco)和1％(v/v)青霉素和链霉素溶液(P4333，Sigma)。每周更换生长培养基最少两次。每周用0.4％胰蛋白酶–EDTA(T3924，Sigma)在汇合前密度下对细胞系进行继代培养。
就实验研究而言，Caco-2和HT29-MTX细胞用台盼蓝(T8154，Sigma)染色、计数、以76:24的比率重悬于完全生长培养基中，以模拟大肠，并以6×104个细胞/cm2的密度接种在具有0.4μM孔径和1.12cm2表面积的TranswellTM聚碳酸酯半透膜(3460，Corning)中。通过每周使用MillicellTMERS-2伏安计手动测量经上皮电阻，评估Caco-2:HT29-MTX培养物的汇合度和完整性。细胞用于接种后21天的实验。
HMO处理和炎症诱导的上皮屏障功能障碍模型。
将得自Glycom(
Figure BDA0003115476160000331
Denmark)的HMO以250mg/ml的浓度稀释于无菌水中，使用0.2μM孔径的过滤器过滤并在-20℃下保持最多6个月。在处理当天，用包含所有补充剂但不含酚红的新鲜培养基替换细胞生长培养基。将比例为0.55:0.7:0.09:0.05:0.18:0.06的2′FL:3′SL:6′SL:LNnT:LNT:diFL的共混物或单独的HMO进一步稀释于生长培养基中，并以不同的最终浓度添加到TranswellTM的顶腔中48小时，然后用TNF-α和IFN-γ细胞因子在基底外侧腔中再攻击48小时。对照组是非HMO处理的细胞和未被细胞因子攻击的细胞(对照组-ve)，以及非HMO处理的细胞但被细胞因子攻击的细胞(对照组+ve)。用乳糖作为对照物刺激另外的细胞。
mRNA提取
在实验结束时，去除生长培养基并用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(Sigma)洗涤细胞两次。通过将细胞悬浮于缓冲液RLT(Qiagen)中并用移液管尖端刮擦来使细胞与TranswellTM膜分离。将两个小室合并在一起，并且使用RNA MiniEasy提取套件(Qiagen)按照制造商的规程提取总RNA。使用2100生物分析仪(Agilent)测量RNA质量和数量。实验仅使用RIN大于9的RNA。使用100ng RNA和QuantaBio qScript cDNA Supermix按照制造商的规程制备cDNA。
qPCR分析
在ABI 7300实时PCR系统(Applied Biosystems)中使用预制的
Figure BDA0003115476160000332
测定引物(Thermo Fisher Scientific)，执行人TNF-α受体1基因(tnfr1；NM_001065.3)的实时定量PCR分析(qPCR)。将针对gapdh(NM_001256799.2)的预制的
Figure BDA0003115476160000333
测定引物用作看家基因。所有测定均一式三份地进行，并且计算针对tnfr1和看家基因gapdh获得的阈值循环(CT)值之间的差值。Δ-Δ-CT公式用于比较组间tnfr1基因表达的倍数差异。
统计分析
使用ANOVA测定处理之间的统计学差异，然后进行多重比较事后测试。统计显著性被定义为P≤0.05。文本中的值为平均值±SD。
结果与讨论
上皮细胞上的2′FL下调的TNF-α受体
本实施例揭示了2′FL用来将其有益效果赋予胃肠屏障的机制中的一种机制。已发现，IFN-γ通过上调TNF-α受体的表达来扰乱胃肠屏障完整性。这继而使TNF-α细胞因子结合其受体(Wang等人，IFN-γ-induced TNFR2Upregulation is Required for TNF-dependent Intestinal Epithelial Barrier Dysfunction，Gastroenterology，2006年10月，131(4)：1153-1163)。TNF-α和IFN-γ的组合作用使上皮细胞信号传导途径发生级联，这最终破坏连接蛋白的完整性并增加细胞旁通透性(Wang等人，2006年)。本实施例示出了2′FL有效抑制上皮细胞对TNF-α受体表达的INF-γ驱动的上调，从而抑制炎症过程并防止明显的通透性改变。2′FL处理的细胞显示出与对照组+ve细胞相比更低的TNF-α受体mRNA表达(图2)，从而强调了2′FL在减少炎症反应和后续保护上皮屏障方面的一种作用机制。
实施例5
HMO 2′FL增加了微生物区系产生KYNA(犬尿酸)的量
粪便发酵和犬尿酸定量
将来自10个3个月至4个月大婴儿(7个母乳喂养(BF)，3个配方食品喂养(FF))的粪便样本用于接种不含碳水化合物(不含CHO)的YCFA培养基。研究设计涉及用最终浓度为0.5％的不同的碳水化合物补充不含CHO的YCFA培养基，不同的碳水化合物是单独的乳糖(F1对照组)或2′FL、2′FL和LnNT的组合、或2′FL、diFL、3′SL、6′SL、LNT和LNnT的组合。对每个个体进行四次重复发酵(F1至F4)，并在24小时和48小时后收集上清液。YCFA是包含胰蛋白胨、酵母提取物以及各种矿物质、维生素和短链脂肪酸的复合培养基；然而，在本例中不包含典型的CHO组分(葡萄糖、麦芽糖和纤维二糖)。
就代谢物分析而言，提取样品并分成等份用于在LC/MS/MS和极性LC平台上进行分析。使用专有软件将离子与用于代谢物鉴定和通过峰面积积分进行的代谢物定量的内部标准库进行匹配。
结果
我们评估了用HMO的各种组合补充体外发酵的婴儿粪便样品的培养基对KYNA的效果。我们发现，在发酵上清液中，与乳糖相比，2′FL或2′FL和LNnT的组合将上清液中的KYNA显著增加1.76倍和1.61倍(分别为P<0.01和P<0.05)(图3)。6种HMO的共混物使KYNA有增加的趋势(与乳糖相比平均增加1.56倍，p＝0.07)。任何HMO处理之间不存在显著差异，表明KYNA的增加主要是由于2′FL。
实施例6
6′SL+LNT和KYNA对GPR35的激活具有累加效应
方法
根据标准程序从冷冻原液中扩增稳定表达GPR35的细胞系。将细胞以20μL的总体积接种到白壁384孔微板中，并且在测试之前于37℃温育适当的时间。所有测试进行两次。在每个测试日，对于每个测试浓度，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备5x化合物工作中间体。将5μL的5x样品添加至细胞并在37℃或室温下温育90分钟。通过单次添加12.5μL或15μL(50％v/v)PathHunter检测试剂混合物(DiscoverX)，然后于室温温育一小时来产生测定信号。在信号产生后用PerkinElmer EnvisionTM仪器读取微板，该仪器用于化学发光信号检测。使用CBIS数据分析套件(ChemInnovation，CA)分析化合物活性。使用下式计算活性百分比：
％活性＝100％x(测试样品的平均RLU–溶媒对照的平均RLU)/(平均最大对照配体–溶媒对照的平均RLU)。
结果
用6′SL和LNT以及200μM KYNA刺激GPR35在介于940μM和2500μM之间的HMO浓度下显示出累加效应。

Claims (17)

1.包含2'-岩藻糖基乳糖(2'FL)的营养组合物，所述营养组合物用于改善婴儿(年龄在12个月以下的儿童)或幼儿(1岁至不到3岁之间)的胃肠屏障；
或
包含2'-岩藻糖基乳糖(2'FL)的成长乳形式的营养组合物，所述营养组合物用于改善儿童(年龄在3岁至不到8岁)的胃肠屏障。
2.根据权利要求1用于所述用途的营养组合物，其中对所述胃肠屏障的所述改善为改善的屏障成熟、改善的屏障结构、改善的屏障功能、改善的屏障保护和/或改善的屏障修复。
3.根据权利要求1或2用于所述用途的营养组合物，其中对所述胃肠屏障的所述改善为改善的屏障功能、改善的屏障结构和/或改善的屏障保护。
4.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中对所述胃肠屏障的所述改善为改善的屏障保护。
5.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述用途是用于改善屏障功能障碍的预防、屏障渗漏的预防、紧密连接结构的保护以及肠上皮内层完整性的保护。
6.根据权利要求5用于所述用途的营养组合物，其中屏障渗漏的所述预防是防止病原体、过敏原和/或毒性化合物从肠道穿过肠屏障迁移到身体中。
7.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中通过下调上皮细胞上的TNF-α受体来实现所述改善、所述预防和/或所述保护。
8.根据前述权利要求中任一项用于所述的用途的营养组合物，其中通过增加食用所述营养组合物的所述婴儿或所述幼儿、相应的食用成长乳形式的所述营养组合物的年龄介于三岁和小于八岁之间的所述儿童的所述微生物区系产生的犬尿酸来实现所述改善、所述预防和/或所述保护。
9.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述组合物还包含一种或多种HMO和/或其多种前体，诸如选自LNnT、LNT、6'SL、diFL和3'SL。
10.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述营养组合物还包含LNnT。
11.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述组合物还包含3'SL、6'SL和LNnT。
12.根据权利要求1至6中任一项用于所述用途的营养组合物，其中不同于2'FL的HMO或其前体不存在于所述营养组合物中，或者以小于0.1％(w/w)、优选诸如小于0.01％(w/w)或更优选诸如小于0.001％的总量存在。
13.根据权利要求1至6中任一项用于所述用途的营养组合物，其中不同于2'FL和LNnT的HMO不存在于所述营养组合物中，或者以小于0.1％(w/w)、优选诸如小于0.01％(w/w)或更优选诸如小于0.001％的总量存在。
14.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述营养组合物被配制用于施用给婴儿。
15.根据权利要求12所述的营养组合物，其中所述婴儿选自早产婴儿、小于胎龄婴儿和低出生体重婴儿，优选地所述婴儿为早产婴儿。
16.根据前述权利要求中任一项所述的营养组合物，其中2'FL以0.005g/L组合物至5g/L组合物或者基于干重0.004g/100g至3.8g/100g组合物的量存在。
17.根据前述权利要求中任一项用于所述用途的营养组合物，其中所述营养组合物是婴儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大或2段婴儿配方食品、成长乳、婴孩食物、婴儿谷物组合物、强化剂或补充剂，并且用于施用给婴儿或幼儿。
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