CN113223142B - 一种实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法 - Google Patents

一种实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法，包括步骤：获取记录了浮游生物全身轮廓信息的全息图；根据浮游生物的首尾位置确定重建距离范围，利用角谱重建算法对所述的全息图进行数值重建，得到多层浮游生物的再现图像；对所述的再现图像进行处理，获得清晰的浮游生物边缘，并提取每幅再现图像中的浮游生物区域，得到只含浮游生物的再现图像；利用等值面法将所述的只含浮游生物的再现图像中灰度相同的点进行连接，渲染出浮游生物的三维成像。本发明首次利用灰度层析重构法通过一幅全息图获得浮游生物的具体的三维形貌和内部结构，而不是许多浮游生物的空间分布，对浮游生物的现场监测具有重要的指导意义。

Description

一种实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法
技术领域
本发明涉及浮游生物的三维成像领域，特别涉及一种实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法。
背景技术
浮游生物泛指生活于水中而缺乏有效移动能力的漂流生物，其中分有浮游植物及浮游动物。部分浮游生物具游动能力，但其游动速度往往比它自身所在的洋流流速来得缓慢，因而不能有效地在水中灵活游动。浮游生物在海洋、湖泊及河川等水域的生物中，自身完全没有移动能力，或者有也非常弱，因而不能逆水流而动，而是浮在水面生活。
浮游生物的三维成像对了解浮游生物的形态特征和生活习性具有重要的意义。现有的扫描电子显微镜重构法能够获得具有很强立体感的高分辨率表面形貌，但样品的前处理操作复杂、耗时费力，无法得到浮游生物底部的表面形貌，且难以对大尺寸浮游生物(如50-70μm的海洋卡盾藻)进行成像；位相重构法因浮游生物不透明且内部结构复杂难以获得大尺寸浮游生物的相位分布图，而对于小尺寸的浮游生物，获得的相位分布图只是浮游生物的厚度分布图，无法正确地反映浮游生物的表面形貌；光学衍射层析重构法通过计算浮游生物的三维折射率分布可以获得其外部轮廓和内部结构，但需要在1秒钟获得上百张不同视角的浮游生物的全息图，难以拍摄快速游动的浮游生物。又因为浮游生物通过载玻片和盖玻片夹在高倍显微物镜的焦平面上，无法拍摄大尺寸的浮游生物。此外，该方法依赖于浮游生物的相位分布图，与位相重构法一样受到浮游生物不透明、内部结构复杂的影响；因此，扫描电子显微镜法和光学衍射层析重构法均不适合浮游生物的现场监测。
灰度层析重构法只需要一幅全息图便能够获得目标的三维成像，在粒子的三维空间分布中具有广泛的应用，2015年美国明尼苏达大学的Toloui等人的题为“High fidelitydigital inline holographic method for 3D flow measurement”的论文通过该方法获得了直径为2μm的SiO2粒子的空间分布图。但这种方法尚未用于浮游生物的三维成像，尤其是较大尺寸(>10μm)的浮游生物的具体的三维形貌和内部结构成像。实验发现，将灰度层析重构法应用于浮游生物的三维成像将面临两个严重的问题：一是浮游生物前半身的轮廓难以分辨，二是再现图像存在大量的离焦像噪声。
通过一幅全息图实现浮游生物的三维成像在浮游生物的现场监测中具有极大的优势，既简化了光学系统，降低了成本，也提高了抗外界干扰能力。根据前面对现有的三维重构方法的比较分析，灰度层析重构法符合要求。但灰度层析重构法难以得到浮游生物前半身的轮廓，且离焦像噪声严重，因此有必要研究一种改进型灰度层析重构法，获得浮游生物全身的轮廓，并有效地抑制离焦像噪声，从而使浮游生物全身的轮廓清晰，进而实现浮游生物的三维成像。
发明内容
本发明提供了一种实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法，在离焦像抑制算法上，提出了一种再现图像之间串扰的抑制方法，该方法与三维去卷积方法和非线性扩散方法相结合共同降低再现图像中的离焦像。最终获得了浮游生物全身的清晰轮廓，从而获得了完整、准确的浮游生物的三维图像。
本发明采用的具体技术方案如下：
一种实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法，包括步骤：
(1)获取浮游生物全身轮廓信息的全息图；
使用长相干长度的激光器作为照明光源，采用厚度很薄的比色皿盛放浮游生物试样，使激光尽可能地穿透浮游生物，获得记录了浮游生物全身轮廓信息的全息图；
由于浮游生物不透明且内部结构复杂，难以获得浮游生物背离图像传感器半身(前半身)的轮廓，正如人的眼睛一样，无法看到物体后面的轮廓。通过与多纵模激光器的对比实验发现，使用单纵模的长相干长度的激光器能够极大地提高激光穿透浮游生物的能力，使浮游生物的前半身轮廓凸显。具体地，优选采用相干长度为50m激光器作为照明光源，厚度为0.2mm的比色皿盛放浮游生物试样，使浮游生物的前半身轮廓得到凸显。
(2)根据浮游生物的首尾位置确定重建距离范围，利用角谱重建算法对步骤(1)中的全息图进行数值重建，得到许多层浮游生物的再现图像；
由于全息图本身是干涉图样，全息图的数值重建本质上是全息图记录的光场在空间中的传播过程。不同重建距离的再现图像对应全息图记录的光场在空间中传播至不同位置处的光场的幅值分布，某一重建距离的再现图像中的浮游生物的清晰物点在其他重建距离的再现图像中表现为离焦像，对该再现图像中的浮游生物的清晰物点造成干扰。为了抑制这种再现图像之间的干扰，提出了一种再现图像串扰抑制方法。
(3)依次通过三维去卷积方法、再现图像串扰抑制方法和非线性扩散方法，对步骤(2)中的再现图像进行处理，降低其中的离焦噪声，获得清晰的浮游生物边缘，从而提取每幅再现图像中的浮游生物区域，得到只含浮游生物的再现图像；
(4)利用等值面法将步骤(3)中的只含浮游生物的再现图像中灰度相同的点进行连接，渲染出浮游生物的三维成像。
对应浮游生物后半身的某一再现图像中的清晰物点在对应其前半身的待观察再现图像上产生的离焦像噪声可以通过前向传播算法得到，用待观察再现图像的复振幅分布减去该离焦像的复振幅分布即可抑制该离焦像噪声，作为优选的，所述再现图像串扰抑制方法的具体步骤包括：
3-1、在对应浮游生物后半身的再现图像中选出部分浮游生物轮廓清晰的连续的再现图像，记作Ii，其复振幅分布为Ii(x,y)；
3-2、考虑对应浮游生物前半身的一幅再现图像(待观察再现图像)Ik，其复振幅分布为Ik(x,y)；
3-3、在再现图像Ii中沿浮游生物的边缘绘制一条闭合曲线并进行二值化处理，得到闭合曲线的二值图像。然后对该二值图像进行孔洞填充操作，得到一幅标记图Mi，其中闭合曲线包围的像素被标记为1，其余像素被标记为0。最后根据标记图Mi提取再现图像Ii中的清晰浮游生物区域，得到只含清晰浮游生物区域的再现图像Ii'，该过程可以表示为：
Figure BDA0003016692800000041
3-4、利用前向传播算法，将清晰浮游生物向前传播至待观察再现图像Ik，得到对应的离焦像，其复振幅表示为：
Di′(x,y)＝FR[Ii′(x,y),li′-lk′],i＜k (2)
其中li'和lk'分别为再现图像Ii和Ik的重建距离，传播距离为li'-lk'；
3-5、令i＝n0,n0+1,…,n2(其中n0为对应浮游生物中线的再现图像的序号，n2为对应浮游生物尾部的再现图像的序号)，重复步骤3-3和步骤3-4，得到所有选出的浮游生物轮廓清晰的连续的再现图像传播至待观察再现图像的离焦像；
3-6、用待观察再现图像的复振幅分布Ik(x,y)减去所有离焦像的复振幅分布Di'(x,y)，从而抑制这些再现图像的串扰，得到降低了离焦像噪声的待观察再现图像。该过程可以表示为：
Figure BDA0003016692800000042
其中ωi为权重系数，随传播距离递增，即
Figure BDA0003016692800000043
其中c为调节因子；
3-7、令k＝1,2,…,n0,重复步骤(3-2)至步骤(3-6)，获得降低了离焦像噪声的浮游生物前半身的所有再现图像。
本发明的有益效果：
本发明从硬件和软件两个方面采取改进措施，在光学系统硬件上，使用长相干长度(50m)的激光器作为照明光源，使用厚度很薄(0.2mm)的比色皿盛放浮游生物试样，使激光尽可能地穿透浮游生物；
本发明的改进型灰度重构法通过使用长相干长度的单纵模激光器作为照明光源和使用厚度很薄的比色皿盛放浮游生物试样，使浮游生物的前半身轮廓得到凸显。并提出一种再现图像串扰抑制方法，与三维去卷积方法和非线性扩散方法相结合，有效地降低了离焦像噪声，获得了浮游生物全身的清晰轮廓。最终得到完整、准确的浮游生物的三维图像。本发明是首次通过灰度层析重构法获得了浮游生物的具体的外部轮廓和内部结构，而不是将浮游生物当作一个点获得其空间分布。
附图说明
图1为现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构法的示意图。
图2为基于马赫-曾德尔干涉仪结构的同轴光路的数字全息显微成像系统。其中Laser为激光器，SP为空间滤波器，L为准直透镜，BS为分光棱镜，M为平面反射镜，C为比色皿，MO为显微物镜，Image Sensor为图像传感器，PC为个人计算机。
图3为使用单纵模半导体激光器拍摄的强壮前钩藻(ACZJ)的全息图经过角谱重建得到的部分再现图像。
图4为使用多纵模半导体激光器拍摄的强壮前钩藻(ACZJ)的全息图经过角谱重建得到的部分再现图像。
图5为再现图像串扰抑制方法的示意图。
图6为图4经过再现图像串扰抑制方法处理后的结果。
图7为使用本发明的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构法得到的强壮前钩藻(ACZJ)的结果。(a)为使用前再现图像，(b)为使用后再现图像，(c)为提取的ACZJ，(d)为三维成像图。
图8为使用本发明的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构法得到的赤潮异湾藻(HAZJ)的结果。(a)为使用前再现图像，(b)为使用后再现图像，(c)为提取的HAZJ，(d)为三维成像图。
图9为使用本发明的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构法得到的斯氏锥状藻(STNJ)的结果。(a)为使用前再现图像，(b)为使用后再现图像，(c)为提取的STNJ，(d)为三维成像图。
图10为使用本发明的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构法得到的塔玛亚历山大藻(ATEC)的结果。(a)为使用前再现图像，(b)为使用后再现图像，(c)为提取的ATEC，(d)为三维成像图。
图11为使用本发明的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构法得到的海洋卡盾藻(CMSH)的结果。(a)为使用前再现图像，(b)为使用后再现图像，(c)为提取的CMSH，(d)为三维成像图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
本实施例中，实现浮游生物三维成像所需的全息图通过实验室搭建的基于马赫-曾德尔干涉仪结构的同轴光路拍摄得到。所有算法均在Matlab2018a的环境中编写，算法运行的硬件条件为core i5处理器，主频2.6GHz，内存4GB。
本实施例的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法的示意图如图1所示，包括以下步骤：
(1)使用相干长度为50m的单纵模半导体激光器(MGL-DS-532,长春新产业光电科技有限公司)作为照明光源，采用厚度为0.2mm的比色皿盛放浮游生物试样，如图2所示。使激光尽可能地穿透浮游生物，获得记录了浮游生物全身轮廓信息的全息图；
(2)根据浮游生物的首尾位置确定重建距离范围，利用角谱重建算法对步骤(1)中的全息图进行数值重建，得到许多层浮游生物的再现图像；
为了便于说明，以强壮前钩藻(ACZJ)为例。它的首尾对应的重建距离范围为11.1mm-56.5mm，相应的部分再现图像如图3所示。为了进行对比，图4给出了使用相干长度小于1cm的多纵模半导体激光器(MSL-DS-532,长春新产业光电科技有限公司)作为照明光源拍摄的某个ACZJ的部分再现图像，其重建距离范围为24.2mm-42.4mm。可以看到，在图3中，ACZJ的轮廓呈现明显的先增大后减小的变化趋势，而在图4中，当重建距离l'从33.3mm增大到42.4mm时，ACZJ的轮廓逐渐变小，但当重建距离l'从33.3mm减小到24.2mm时，ACZJ的轮廓没有呈现逐渐变小的趋势，即ACZJ的前半身轮廓消失了。
(3)依次通过三维去卷积方法、再现图像串扰抑制方法和非线性扩散方法，对步骤(2)中的再现图像进行处理，降低其中的离焦噪声，获得清晰的浮游生物边缘，从而提取每幅再现图像中的浮游生物区域，得到只含浮游生物的再现图像。其中再现图像串扰抑制方法的示意图如图5所示，具体过程如下：
3-1、在对应浮游生物后半身的再现图像中选出部分浮游生物轮廓清晰的连续的再现图像，记作Ii，其复振幅分布为Ii(x,y)；
3-2、考虑对应浮游生物前半身的一幅再现图像(待观察再现图像)Ik，其复振幅分布为Ik(x,y)；
3-3、在再现图像Ii中沿浮游生物的边缘绘制一条闭合曲线并进行二值化处理，得到闭合曲线的二值图像。然后对该二值图像进行孔洞填充操作，得到一幅标记图Mi，其中闭合曲线包围的像素被标记为1，其余像素被标记为0。最后根据标记图Mi提取再现图像Ii中的清晰浮游生物区域，得到只含清晰浮游生物区域的再现图像Ii'，该过程可以表示为：
Figure BDA0003016692800000071
3-4、利用前向传播算法，将清晰浮游生物向前传播至待观察再现图像Ik，得到对应的离焦像，其复振幅表示为：
Di′(x,y)＝FR[Ii′(x,y),li′-lk′],i＜k (2)
其中li'和lk'分别为再现图像Ii和Ik的重建距离，传播距离为li'-lk'；
3-5、令i＝n0,n0+1,…,n2(其中n0为对应浮游生物中线的再现图像的序号，n2为对应浮游生物尾部的再现图像的序号)，重复步骤3-3和步骤3-4，得到所有选出的浮游生物轮廓清晰的连续的再现图像传播至待观察再现图像的离焦像；
3-6、用待观察再现图像的复振幅分布Ik(x,y)减去所有离焦像的复振幅分布Di'(x,y)，从而抑制这些再现图像的串扰，得到降低了离焦像噪声的待观察再现图像。该过程可以表示为：
Figure BDA0003016692800000081
其中ωi为权重系数，随传播距离递增，即
Figure BDA0003016692800000082
其中c为调节因子；
3-7、令k＝1,2,…,n0,重复步骤(2)至步骤(6)，获得降低了离焦像噪声的浮游生物前半身的所有再现图像。
图6给出了图4经过再现图像串扰抑制方法处理后的结果，可以看到，当重建距离l'从33.3mm减小到24.2mm时，ACZJ的轮廓得到显现并呈现逐渐缩小的趋势。
由图3和图6的结果可知，采用本申请的方法，增大激光的相干长度和降低再现图像之间的串扰可以有效地解决常规灰度层析重构法面临的浮游生物前半身轮廓消失的问题。在硬件上，使用长相干长度的激光器和厚度很薄的比色皿，增强激光穿透浮游生物的能力；在算法上，提出了再现图像串扰抑制方法，与三维去卷积方法和非线性扩散方法共同降低离焦像。最终使浮游生物全身的轮廓清晰，从而得到浮游生物的三维图像。
(4)利用等值面法将步骤(3)中的只含浮游生物的再现图像中灰度相同的点进行连接，渲染出浮游生物的三维图像。
图7-图11分别给出了使用本发明的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法得到的强壮前钩藻(ACZJ)、赤潮异湾藻(HAZJ)、斯氏锥状藻(STNJ)、塔玛亚历山大藻(ATEC)和海洋卡盾藻(CMSH)的部分再现图像和提取的浮游生物区域，以及通过等值面法渲染出的三维图像。可以看到，5种浮游生物的三维图像均具有完整的表面形貌和内部结构，并能够观察到某些浮游生物的典型形态特征，例如ACZJ头部的钩子和ATEC的类似嘴巴的缺口。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法，其特征在于，包括步骤：
(1)获取浮游生物全身轮廓信息的全息图；
(2)根据浮游生物的首尾位置确定重建距离范围，利用角谱重建算法对所述的全息图进行数值重建，得到多层浮游生物的再现图像；
(3)对步骤(2)中的再现图像进行处理，获得清晰的浮游生物边缘，并提取每幅再现图像中的浮游生物区域，得到只含浮游生物的再现图像；
(4)将步骤(3)中的只含浮游生物的再现图像中灰度相同的点进行连接，渲染出浮游生物的三维成像；
所述再现图像串扰抑制方法的具体步骤包括：
(3.1)在对应浮游生物后半身的再现图像中选出部分浮游生物轮廓清晰的连续的再现图像，记作Ii，其复振幅分布为Ii(x,y)；
(3.2)考虑对应浮游生物前半身的一幅再现图像Ik，其复振幅分布为Ik(x,y)；
(3.3)在再现图像Ii中沿浮游生物的边缘绘制一条闭合曲线并进行二值化处理，得到闭合曲线的二值图像，在所述二值图像中提取只含浮游生物的再现图像；
(3.4)利用前向传播算法，将清晰浮游生物向前传播至待观察再现图像Ik，得到对应的离焦像，其复振幅表示为：
Di′(x,y)＝FR[Ii′(x,y),li′-lk′],i＜k
其中li′和lk′分别为再现图像Ii和Ik的重建距离，传播距离为li′-lk′；
(3.5)令i＝n0,…,n2，n0为对应浮游生物中线的再现图像的序号，n2为对应浮游生物尾部的再现图像的序号；重复步骤(3.3)和步骤(3.4)，得到所有选出的浮游生物轮廓清晰的连续的再现图像传播至待观察再现图像的离焦像；
(3.6)用待观察再现图像的复振幅分布Ik(x,y)减去所有离焦像的复振幅分布Di′(x,y)，得到降低离焦像噪声的待观察再现图像；
(3.7)令k＝1,2,…,n0,重复步骤(3.2)至步骤(3.6)，获得降低了离焦像噪声的浮游生物前半身的所有再现图像。
2.如权利要求1所述的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法，其特征在于，步骤(1)中，使用相干长度为50m的激光器作为照明光源。
3.如权利要求1所述的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法，其特征在于，步骤(1)中，采用厚度为0.2mm的比色皿盛放浮游生物试样。
4.如权利要求1所述的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法，其特征在于，步骤(3)中，依次通过三维去卷积方法、再现图像串扰抑制方法和非线性扩散方法对所述的再现图像进行处理，降低其中的离焦噪声，获得清晰的浮游生物边缘。
5.如权利要求1所述的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法，其特征在于，步骤(3.3)中，在所述二值图像中提取只含浮游生物的再现图像的过程为：
对该二值图像进行孔洞填充操作，得到一幅标记图Mi，其中闭合曲线包围的像素被标记为1，其余像素被标记为0；最后根据标记图Mi提取再现图像Ii中的清晰浮游生物区域，得到只含清晰浮游生物区域的再现图像Ii′，该过程可以表示为：
Figure FDA0003784699290000021
6.如权利要求5所述的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法，其特征在于，步骤(3.6)的具体过程表示为：
Figure FDA0003784699290000022
其中ωi为权重系数，随传播距离递增，即
Figure FDA0003784699290000023
其中c为调节因子。
7.如权利要求1所述的实现浮游生物三维成像的改进型灰度层析重构方法，其特征在于，利用等值面法将步骤(3)中的只含浮游生物的再现图像中灰度相同的点进行连接，渲染出浮游生物的三维成像。
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