CN113214508A - 一种用于皮肤修复的天然抗菌凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于皮肤修复的天然抗菌凝胶及其制备方法,该凝胶以羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素为凝胶的骨架材料,利用单宁酸将Ag+在凝胶内还原成Ag粒子,在Ag粒子的存在下可以在单独加入交联剂EDC的情况下缓慢成胶。凝胶具备较好的抗压性能及抗菌性,同时生物相容性良好,制备成本低,有望成为一种治疗皮肤损伤的潜在材料。

Description

一种用于皮肤修复的天然抗菌凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于材料制备领域,具体涉及一种用于皮肤修复的天然抗菌凝胶及其制备方法。
背景技术
正常皮肤主要由表皮、真皮和皮下组织组成。无血管的表皮层通过基底膜与真皮层紧密相连,皮肤的屏障功能和防止水分流失功能主要由表皮层的角质结构提供的。皮肤是身体和环境之间的界面,作为人体第一道抗菌屏障,能够防止外来病源微生物的入侵。皮肤充当着抵御外部世界的保护屏障,因此任何破损都必须迅速有效地修复。细菌感染是皮肤伤口面临的最主要威胁,感染后皮肤的正常恢复流程会遭到破坏,影响正常恢复的效果。传统抗菌剂面临的问题包括耐药性、过量使用和细胞毒性。这些问题迫使我们寻找新的抗菌物质以及新的治疗方法。生物材料在慢性感染治疗中的潜在应用受到广泛关注,水凝胶是具有三维网状结构的聚合物,具有吸收和保留水分的能力,通过引入功能抗菌物质,这种抗菌凝胶在皮肤遭受耐药病原菌感染时能起到较好的效果,同时功能性抗菌凝胶可以作为理想的障碍物防止微生物等外部威胁物进入。
纤维素是自然界中存在最为广泛的多糖,其最显著的特点之一是其优良的生物相容性,这也是纤维素在生物医学领域中具有重要地位的原因。羧甲基纤维素作为纤维素的衍生物因其良好的保湿性能作为凝胶的主要材料,羧甲基纤维素能有效地发挥还原剂和稳定剂的作用,天然水凝胶具有较弱的抗菌性能,但它们可以作为Ag和其他药物的良好载体。
羧甲基壳聚糖因其优异的止血、抗菌和生物相容性而受到人们的广泛关注,其分子链上含有丰富的羧基和氨基基团,可以作为中间分子通过化学交联与其他带氨基或羧基的物质形成凝胶,同时其上丰富的基团可以发挥还原剂的作用。
在各种抗菌药物中,Ag是最常见和研究最广泛的抗菌剂,具有广谱的抗菌性。可能是由于其多种抗菌作用机制,银对各种需氧、厌氧、革兰氏阳性、革兰氏阴性、真菌和病毒都有效果。
为了制备能将Ag稳定负载的凝胶,羧甲基纤维素和羧甲基壳聚糖作为主体材料和中间体,利用单宁酸将Ag+在凝胶内成功还原。EDC活化羧基后容易水解而丧失作用无法有效交联,交联效率较低,根据本实验现象发现Ag在羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素分子沉积后降低了分子链的亲水性,能促进溶液向凝胶的转化,在Ag的存在下EDC能够单独有效交联羧甲基纤维素和羧甲基壳聚糖成胶,随着Ag沉积量增加,成胶时间逐渐缩短。EDC水解后细胞毒性低,这种通过单一EDC交联成胶可制备具有良好生物相水凝胶。
发明内容
本发明提供了一种天然抗菌凝胶的制备方法,通过一种相对缓慢的交联,避免了局部凝固,利用羧甲基壳聚糖作为中间体将羧甲基纤维素进行交联形成凝胶,凝胶内部含有大量活性基团,可以防止Ag粒子被氧化,具有持久的抗菌性。制备的凝胶具有良好的孔隙结构,具有一定的透气性,适合细胞的附着与生长,同时经过化学键交联,凝胶具有良好的抗压性能,能够防止外界对伤口处的进一步损伤,为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种用于皮肤修复的天然抗菌凝胶,以羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素为凝胶的骨架材料,将Ag+在凝胶内还原,经过EDC交联制备了天然抗菌凝胶。
该抗菌凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)取20 ml 去离子水,加入0.2 g 硝酸钾,搅拌至完全溶解;
(2)往溶液中加入0.3g 羧甲基纤维素和0.15 g 羧甲基壳聚糖,搅拌一晚形成均匀透明溶液;
(3)将0.005-0.015 g 单宁酸加入到步骤(2)得到的溶液中,再往其中加入0.017-0.051 g AgNO3,充分搅拌直至Ag+被还原;
(4)加入0.15 g EDC,搅拌3 min 后倒入模具中,等待成胶;
(5)待完全成胶后在去离子水中浸泡30 min 去除多余水溶性物质,用去离子水冲洗后得到所述的天然抗菌凝胶。
进一步的,步骤(2)中搅拌条件为25℃密封搅拌。
进一步的,步骤(3)中单宁酸的加入量分别为0.005 g,0.01 g,0.015 g,固定单宁酸与AgNO3的质量比,AgNO3对应的加入量分别为0.017 g,0.034 g,0.051 g,制备三组凝胶Gel-1,Gel-2,Gel-3。
进一步的,步骤(4)中的EDC为交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺,用量为7.5mg/ml。
本发明的显著有点在于:本发明中的天然抗菌凝胶以羧甲基壳聚糖作为中间体,将羧甲基纤维素进行交联形成凝胶,制备的凝胶具有持续的抗菌性,同时凝胶具有良好的生物相容性无明显细胞毒性,凝胶具有良好的孔隙结构,利于细胞在其上的生长。
本发明充分利用羧甲基纤维素和羧甲基壳聚糖的特点,利用氨基与羧基的交联,同时利用这些基团辅助单宁酸将Ag+在凝胶内成功还原。本发明所得的凝胶主要表现为固体的特点,同时具有较高的抗压强度,最高可达0.83±0.03MPa。
大鼠感染模型显示制备的凝胶在细菌感染的伤口愈合方面具有潜在的应用前景。
本发明合成的天然抗菌凝胶相比于其它皮肤修复材料有以下优点:
(1)合成的复合凝胶具有持久的抗菌性。
(2)羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素都是天然产物的衍生物,生物相容性良好。
(3)制备的凝胶具有良好的孔隙结构。
(4)可以单独通过EDC交联成胶,通过改变Ag粒子的生成量可以调节成胶速度,避免引起局部的过快凝固。
(5)该成胶反应温和,利于对凝胶塑形,交联剂毒性小且在反应结束后会水解成无毒物质。
(6)成本低,操作简单。
附图说明
图1是制备的天然抗菌凝胶样品图;
图2是制备的三组凝胶电镜图;
图3是凝胶组分及三组凝胶的红外分析图;
图4是三组凝胶的XRD分析图;
图5是三组凝胶的对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈图;
图6是三组凝胶与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养后吸光度柱状图;
图7是三组凝胶与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养后菌液稀释接种在平板上菌落形成图;
图8是三组凝胶压缩曲线(A)和最大压缩情况(B);
图9是三组凝胶浸提液与NIH-3T3细胞共培养的AO/EB染色。
具体实施方式
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂,下文特举实施例,作详细说明。本发明的方法如无特殊说明,均为本领域常规方法。
实施例1
1)取20 ml 去离子水,加入0.2 g 硝酸钾,搅拌至完全溶解;
2)往溶液中加入0.3g 羧甲基纤维素和0.15 g 羧甲基壳聚糖,25℃密封搅拌一晚形成均匀透明溶液;
3)将0.005 g 单宁酸加入到步骤(2)得到的溶液中,再往其中加入0.017 gAgNO3,充分搅拌直至Ag+被还原;
4)加入EDC 0.15 g,搅拌3 min 后倒入模具中,等待成胶;
5)待完全成胶后在去离子水中浸泡30 min 去除多余水溶性物质,用去离子水冲洗后得到最后的凝胶,编号Gel-1。
实施例2
1)取20 ml 去离子水,加入0.2 g 硝酸钾,搅拌至完全溶解;
2)往溶液中加入0.3g 羧甲基纤维素和0.15 g 羧甲基壳聚糖,25℃密封搅拌一晚形成均匀透明溶液;
3)将0.01 g 单宁酸加入到步骤(2)得到的溶液中,再往其中加入0.034 g AgNO3,充分搅拌直至Ag+被还原;
4)加入EDC 0.15 g,搅拌3 min 后倒入模具中,等待成胶;
5)待完全成胶后在去离子水中浸泡30 min 去除多余水溶性物质,用去离子水冲洗后得到最后的凝胶,编号Gel-2。
实施例3
1)取20 ml 去离子水,加入0.2 g 硝酸钾,搅拌至完全溶解;
2)往溶液中加入0.3g 羧甲基纤维素和0.15 g 羧甲基壳聚糖,25℃密封搅拌一晚形成均匀透明溶液;
3)将0.015 g 单宁酸加入到步骤(2)得到的溶液中,再往其中加入0.051 gAgNO3,充分搅拌直至Ag+被还原;
4)加入EDC 0.15 g,搅拌3 min 后倒入模具中,等待成胶;
5)待完全成胶后在去离子水中浸泡30 min 去除多余水溶性物质,用去离子水冲洗后得到最后的凝胶,编号Gel-3。
图1是实施例1,实施例2和实施例3制备的三组凝胶实物图,从图中可以看出随着Ag含量的增加凝胶的颜色逐渐加深。
图2是实施例1,实施例2和实施例3制备的三组凝胶的电镜图,从图中可以看出凝胶的孔隙结构和Ag粒子的生成,三组凝胶都具有明显的孔状结构,具有一定透气性。
图3是实施例1,实施例2和实施例3制备的三组凝胶的红外吸收光谱图,从图中可以看出酰胺键在凝胶内的生成。
图4是实施例1,实施例2和实施例3制备的三组凝胶的X射线衍射图谱,从中可以看到Ag的特征衍射峰。
图5是实施例1,实施例2和实施例3制备的三组凝胶的抑菌圈图,将Gel-1,Gel-2,Gel-3凝胶(直径10 mm,高2 mm)置于涂覆菌液的平板中,37℃下培养12 h得到抑菌圈图,从中可以看出Gel-1组在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌两组试验中抑菌圈都不明显,Gel-2组中相比Gel-1组抑菌圈明显增加,大肠杆菌的抑菌圈为1.5mm左右,金黄色葡萄球菌中的抑菌圈更为明显,抑菌圈范围达5mm左右。Gel-3组的抑菌圈大小和Gel-2中类似,抑菌圈略微增加。
图6是三组凝胶与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液培养12h后吸光度柱状图,将两种菌液在600nm波长下测定吸光度并将吸光度调至0.01,将凝胶接种在其中,在37℃下共培养12h,从图中可以看出在不含凝胶的组中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌吸光度显著增加,大肠杆菌的生长活性强于金黄色葡萄球菌,Gel-1组中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的吸光度相比空白组降低,但与最初的吸光度相比增加明显,Gel-2组中金黄色葡萄球菌吸光度与最初菌液的吸光度相比几乎没有增加,说明Gel-2组凝胶可以抑制金黄色葡萄球菌的增值活性,大肠杆菌吸光度增加但和空白组及Gel-1组相比明显降低,说明Gel-2组凝胶对大肠杆菌的增值也具有比较好的抑制作用。Gel-3组凝胶与Gel-2组凝胶效果类似,金黄色葡萄球菌的吸光度没有增加,降低较少,可能与细菌死亡溶液变浑浊有关,大肠杆菌的吸光度相比Gel-2组略有降低,但吸光度相比最初吸光度仍有明显增加。
图7是实施例1,实施例2和实施例3制备的三组凝胶与菌液共培养后涂覆在平板上培养12h后菌落形成图,将与凝胶共培养12h后的菌液稀释107倍接种在平板上进一步验证凝胶的抑菌效果。从图中可以看出Gel-2和Gel-3组凝胶能抑制金黄色葡萄球菌的增值,对大肠杆菌也有较好抑制作用,Gel-1组中凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌也有抑制作用,但两组细菌仍增值较快,Gel-2和Gel-3组凝胶能比较好的满足抑菌要求。
图8是三组凝胶的压缩曲线和最大压缩情况,从压缩曲线(A)中可以看出Gel-2组的硬度最高,最大压缩最早出现,最大压缩也最高为0.83±0.03MPa(B),Gel-3组硬度较低但柔韧性更好最大压缩仅低于Gel-2组,Gel-1组压缩强度最低,可以看出Gel-2组在抵抗外界压力上表现最好。
图9是三组凝胶浸提液与NIH-3T3细胞共培养的AO/EB染色,可以看到在培养到第3天时细胞Gel-1和Gel-2组细胞数量与空白组无明显差异,Gel-3组细胞数量相比空白组明显减少,说明Gel-3组存在一定细胞毒性,这与其Ag含量过高有关,Gel-1和Gel-2组生物相容性良好。培养到第5天时,Gel-3组细胞数量进一步减少,Gel-1和Gel-2组细胞数量继续增加,与空白组相比无明显差异,Gel-1和Gel-2组生物相容性满足要求。
以上所述仅为本发明的制备方法,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一种用于皮肤修复的天然抗菌凝胶,其特征在于:以羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素为凝胶的骨架材料,将Ag+在凝胶内还原,经过EDC交联制备了天然抗菌凝胶。
2.根据权利要求1所述的抗菌凝胶的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)取20 ml 去离子水,加入0.2 g 硝酸钾,搅拌至完全溶解;
(2)往溶液中加入0.3g 羧甲基纤维素和0.15 g 羧甲基壳聚糖,搅拌一晚形成均匀透明溶液;
(3)将0.005-0.015 g 单宁酸加入到步骤(2)得到的溶液中,再往其中加入0.017-0.051 g AgNO3,充分搅拌直至Ag+被还原;
(4)加入0.15 g EDC,搅拌3 min 后倒入模具中,等待成胶;
(5)待完全成胶后在去离子水中浸泡30 min 去除多余水溶性物质,用去离子水冲洗后得到所述的天然抗菌凝胶。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤(2)中搅拌条件为25℃密封搅拌。
4. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤(3)中单宁酸的加入量分别为0.005 g,0.01 g,0.015 g,固定单宁酸与AgNO3的质量比,AgNO3对应的加入量分别为0.017g,0.034 g,0.051 g,制备三组凝胶Gel-1,Gel-2,Gel-3。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤(4)中的EDC为交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
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