CN113163816A

CN113163816A - 可溶性豆类蛋白质

Info

Publication number: CN113163816A
Application number: CN201980075680.4A
Authority: CN
Inventors: J·L·文图莱拉
Original assignee: Roquette Freres SA
Current assignee: Roquette Freres SA
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2021-07-23
Also published as: WO2020109741A1; FR3089094A1; EP3886599A1; US20220007678A1; FR3089094B1; AU2019389833A1; JP2022513613A; CA3120956A1

Abstract

本发明涉及一种在酸性pH下具有低水解度和优异溶解度的豆类蛋白质，涉及用于制备该蛋白质的方法，以及涉及该蛋白质特别是在食物、化妆品或药物组合物中的用途。

Description

可溶性豆类蛋白质

技术领域

背景技术

人类每日对蛋白质的需求量占食物摄入量的12％至20％。这些蛋白质由动物来源的产品(肉、鱼、蛋、乳制品)和植物性食物(谷类、豆科植物、海藻)同等地提供。

然而，在发达国家，蛋白质摄入主要为动物来源的蛋白质形式。然而，大量研究表明，过度食用动物来源的蛋白质而损害植物蛋白质是癌症和心血管疾病增加的原因之一。

此外，动物蛋白质有许多缺点，既涉及它们的变应原性(特别是来自牛奶或蛋的蛋白质)，也涉及环境(与集约养殖造成的伤害有关)。

因此，制造商对具有有益营养和功能特性但不具有动物来源化合物的缺点的植物来源化合物的需求日益增加。

自20世纪70年代以来，豌豆是在欧洲(主要在法国)开发最多的种子豆类，作为旨在用于动物和人类食物的动物蛋白质的替代蛋白质来源。豌豆含有大约27重量％的蛋白质物质。术语“豌豆”在本文中被认为用于其最广泛接受的用途，并且特别地包括“光滑豌豆”的所有野生品种以及“光滑豌豆”和“皱皮豌豆”的所有突变品种，而不管所述品种通常用于何种用途(人类食物、动物饲料和/或其他用途)。

豌豆蛋白质(主要是豌豆球蛋白)在工业上已被提取和利用多年。作为提取豌豆蛋白质的方法的示例，可提及专利EP1400537。在该方法中，在不存在水的情况下研磨种子(称为“干磨”的方法)以便获得面粉。然后将该面粉悬浮在水中，以便从中提取蛋白质。

遗憾的是，已知该蛋白质是相对不溶的，特别是在酸性pH下。例如，文章(A.C.Y.Lam、A.Can Karaca、R.T.Tyler和M.T.Nickerson(2018年)，“Pea proteinisolates：Structure，extraction，and functionality.”，Food Reviews International，第34卷第2期，第1 26-147页)描述了豌豆蛋白质分离物的溶解度在其等电点pH附近(位于4.5附近)最小。市售豌豆蛋白质分离物在pH 4和pH 5之间的溶解度不超过20％。

申请人先前已通过专利申请WO2011124862提出改善该溶解度的解决方案，这是值得称赞的。所述申请提出进行精确的热处理，使得可以改善植物蛋白质的功能特性，特别是溶解度。然而，该溶解度在中性pH(7.5)下测量，并且在酸性pH(介于4和5之间)下总是小于20％。

蛋白质的酸和/或酶促水解是熟知的方法，其目的在于水解肽键，从而降低蛋白质的聚合度。本领域技术人员熟知的是，蛋白质的平均尺寸越小，其溶解度增加越多。因此，蛋白质的水解使得可以增加其溶解度。然而，随着水解，蛋白质也将失去其他功能，诸如其粘度或其乳化能力。文章(Poonam R.Bajaj、Kanishka Bhunia、Leslie Kleiner、HelenS.Joyner(Melito)、Denise Smith、Girish Ganjyal和Shyam S.Sablani(2017年)，“Improving functional properties of pea protein isolate formicroencapsulation of flaxseed oil.”，Journal of Microencapsulation，第34卷第2期，第218-230页)描述了用不同蛋白酶对市售豌豆蛋白质分离物进行的酶促水解。该文章证实了水解使得可以增加溶解度。然而，与WO2011124862一样，所述溶解度在中性pH(7.4，其为水解的pH)下测量。另一方面，酸性pH下的溶解度保持小于30％。

可以设想使用其他蛋白质级分，诸如白蛋白。然而，虽然后者在酸性pH下确实更易溶解，但是它们还具有功能特性，特别是非常高的发泡性，这在一些工业应用中可能是不希望的。

因此，本领域技术人员仍然感兴趣的是获得豆类蛋白质分离物，特别是豌豆蛋白质，其水解度低，例如小于15％，但是其在酸性pH下(例如，在pH 5下)的溶解度大于80％。

申请人开发了一种满足这些标准的豆类蛋白质，这是值得称赞的。

发明内容

本发明首先涉及相对于蛋白质的总重量含有超过90重量％的球蛋白的豆类蛋白质，所述豆类蛋白质具有：

-在pH 5下大于80％、优选大于85％、甚至更优选大于90％的溶解度；以及

-小于15％、优选小于12％的水解度。

本发明其次涉及用于制备根据本发明的豆类蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：

-在水性溶液中采用豆类蛋白质分离物；

-通过添加胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶水解该分离物，以便获得水解度小于15％、优选小于12％的水解的豆类蛋白质；

-任选地抑制该酶；

-任选地干燥该水解的豆类蛋白质。

最后，本发明还涉及根据本发明的豆类蛋白质用于制备人类或动物食物组合物、化妆品组合物或药物组合物的用途。

通过下面给出的具体实施方式将更好地理解本发明。

具体实施方式

特别地，本发明的豆类蛋白质可为包含从豆科植物提取的蛋白质的混合物的组合物。

相对于蛋白质的总重量，根据本发明的豆类蛋白质含有超过90重量％的球蛋白。

术语“蛋白质”在本申请中应理解为意指由一条或多条多肽链形成的大分子，所述一条或多条多肽链由通过肽键彼此键合的一系列氨基酸残基组成。在豌豆蛋白质的特定上下文中，本发明更具体地涉及球蛋白(豌豆的蛋白质的大约50％-60％)和白蛋白(20％-25％)。豌豆球蛋白主要细分为三个亚科：豆球蛋白、豌豆球蛋白和伴豌豆球蛋白(convicilins)。

“豆科植物”或“豆类”在本申请中将被理解为是指豆科(Fabales)目的双子叶植物家族。这是最大的开花植物科之一，就物种数量而言仅次于兰科(Orchidaceae)和菊科(Asteraceae)。它含有大约765个属，汇集了超过19,500个物种。几种豆科植物是重要的作物植物，包括大豆、菜豆、豌豆、鹰嘴豆、蚕豆、花生、栽培的扁豆、栽培的苜蓿、各种三叶草、胡豆、角豆和甘草。

从这些豆科植物提取的蛋白质主要属于球蛋白和白蛋白的亚组。在本发明中，豆类蛋白质主要由球蛋白组成；特别地，相对于蛋白质的总重量，该豆类蛋白质含有超过90重量％的球蛋白。可通过本领域技术人员熟知的各种方法将球蛋白与白蛋白区分开来，特别是通过它们在水中的溶解度来区分，其中自蛋白可溶于纯水，而球蛋白仅可溶于盐水。还可通过电泳或色谱法鉴定混合物中存在的白蛋白和球蛋白。优选的方法描述于文章“Peptideand protein molecular weight determination by electrophoresis using ahigh-molarity tris buffer system without urea.”，Fling SP，Gregerson DS，Anal.Biochem.，1986年，第155卷，第83-88页。相对于蛋白质的总重量，根据本发明的豆类蛋白质含有超过90重量％的球蛋白。

根据本发明的豆类蛋白质具有在pH5下大于80％、优选大于85％、甚至更优选大于90％的溶解度。

根据具体实施方案，根据本发明的豆类蛋白质还可具有在pH 7下大于80％、优选大于85％、甚至更优选大于90％的溶解度。

溶解度可根据下文所述的针对溶解度的测试A，通过在蒸馏水中稀释豆类蛋白质，将混合物离心并分析上清液来测量。

根据本发明的豆类蛋白质具有小于15％、优选小于12％的水解度。

水解度可根据下文所述的针对水解度的测试B(称为OPA测试的测试)，通过测量游离氨基氮相对于总氮的含量来测定。

豆类蛋白质优选地为蚕豆蛋白质或豌豆蛋白质。豌豆蛋白质是特别优选的。

术语“豌豆”在本文中被认为用于其最广泛接受的用途，并且特别地包括“光滑豌豆”和“皱皮豌豆”的所有品种以及“光滑豌豆”和“皱皮豌豆”的所有突变品种，而不管所述品种通常用于何种用途(人类食物、动物饲料和/或其他用途)。

本申请中的术语“豌豆”包括属于豌豆属(Pisum genus)、更具体地属于豌豆(sativum)和小麦(aestivum)种属的豌豆品种。所述突变体品种特别是命名为“突变体r”、“突变体rb”、“突变体rug 3”、“突变体rug 4”、“突变体rug 5”和“突变体lam”的那些，如C-LHEYDLEY等人在标题为“Developing novel pea starches.”，Proceedings of theSymposium of the Industrial Biochemistry and Biotechnology Group of theBiochemical Society，1996年，第77-87页的文章中所述。

甚至更优选地，根据本发明的豆类蛋白质为分离物，相对于干物质的重量，该分离物的蛋白质含量大于80重量％。

本申请中的“分离物”旨在表示相对于组合物干物质的重量蛋白质含量大于80重量％、优选大于90重量％的组合物。

蛋白质含量通过本领域技术人员熟知的任何技术来测量。优选地，测定总氮(以％/粗制物为单位)，并且将结果乘以系数6.25。这种在植物蛋白质领域中熟知的方法基于观察到蛋白质含有平均1 6％的氮。也可使用本领域技术人员熟知的任何干物质测定方法。

特别地，本发明的豆类蛋白质可通过包括以下步骤的方法获得：

-在水性溶液中采用豆类蛋白质分离物；

-通过添加胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶水解该分离物，以便获得小于15％、优选小于12％的水解度；

-任选地抑制该酶；

-任选地干燥该水解的豆类蛋白质。

根据优选的实施方案，豆类蛋白质分离物选自蚕豆蛋白质分离物或豌豆蛋白质分离物。豌豆蛋白质分离物是特别优选的。

所使用的豆类蛋白质分离物可来源于几种来源，无论是商业来源还是定制来源，但该分离物必须没有经历过预先水解，这减小形成它的蛋白质分子的尺寸。优选地，该分离物将通过实施申请人的专利EP1400537或EP1909593中所述的方法获得。

优选地，相对于水性溶液的重量，豆类蛋白质的水性溶液包含5重量％至20重量％、优选地8重量％至12重量％的干物质。

接下来，将胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶型酶添加到以这种方式制备的溶液中，以便获得水解度小于15％、优选小于12％的水解的豆类蛋白质。

在本申请中，“蛋白酶”旨在表示能够通过水解蛋白质或肽的肽键来切割蛋白质或肽的酶。在本申请中，“丝氨酸蛋白酶”旨在表示具有含有丝氨酸残基的活性位点的蛋白酶，该丝氨酸残基在催化中起重要作用。在国际分类中，不同的丝氨酸蛋白酶在EC 3.4.21家族中分组在一起。

用于本发明的丝氨酸蛋白酶是胰凝乳蛋白酶样的。“胰凝乳蛋白酶样”旨在表示具有如下作用模式的丝氨酸蛋白酶，该作用模式特征在于肽键的裂解特异性地位于芳族和疏水性氨基酸(诸如酪氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸)之后。

需要添加以获得所需水解度的酶的按重量计的量相对于在根据本发明的方法中采用的分离物中的蛋白质重量进行定量。根据具体实施方案，相对于分离物中的蛋白质重量，所添加的酶量按酶的重量计大于0.2％，优选地为0.25％至0.50％。还可添加大于0.5％的酶量。然后，这将得到相同的结果，但时间更短。本领域技术人员将知道如何调节酶量，以达到期望的反应时间。

在添加酶之后，水解反应可在搅拌下进行。根据具体实施方案，水解进行30分钟至2小时、优选大约一小时的持续时间。如上所述，可通过增加酶量来缩短该时间。这种调节对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。

根据具体实施方案，水解在45℃至65℃、优选50℃至60℃、更优选大约55℃的温度下进行。可使用本领域技术人员熟知的任何设施(诸如浸没式热交换器)进行加热。优选地，在加入酶之前将温度从45℃调节至65℃，然后在水解期间调节至+/-2℃。

根据具体实施方案，水解在8至10、优选大约9的pH下进行。可通过添加酸和/或碱(例如，氢氧化钠或盐酸)来调节pH。虽然不是必需的，但是可以设想缓冲溶液的使用。优选地，在加入酶之前将pH从8调节至10，然后在水解期间调节至+/-0.5pH单位。

任选地，一旦水解反应完成，酶就可被抑制。为此，例如，可将反应介质调节至pH 7并在90℃下保持5分钟。

任选地，水解的豆类蛋白质可通过任何熟知的干燥方法进行干燥，诸如喷雾干燥(单效或多效)或冷冻干燥。该干燥可任选地在过滤步骤之前进行，使得可以移除不需要的固体颗粒。

本发明的豆类蛋白质可用于制备人类或动物食物组合物、化妆品组合物或药物组合物。

实际上，由于其在酸性pH下具有优异的溶解度，这种豆类蛋白质在许多工业应用中特别受关注，特别是在农业食品、化妆品或制药工业中以及在动物饲料中。

根据具体实施方案，根据本发明的豆类蛋白质用于制备酸性饮料，例如苏打水。

将根据本发明的蛋白质掺入酸性饮料中是特别有利的。实际上，与标准蛋白质不同，根据本发明的蛋白质将保持溶解并且在储存期间将不会趋于沉淀。因此，使用根据本发明的蛋白质使得可以获得储存稳定的酸性饮料。

“食物组合物”旨在表示旨在用于人类或动物食物的组合物。术语食物组合物涵盖食物产品、膳食补充剂和饮料。“化妆品组合物”旨在表示旨在用于化妆品用途的组合物。“药物组合物”旨在表示旨在用于治疗用途的组合物。

通过以下实施例将更好地理解本发明。

实施例

测试方法

针对溶解度的测试A

将150g蒸馏水通过用磁力搅拌棒搅拌在20℃+/-2℃下引入到400ml烧杯中，然后精确地添加5g待测试的豆类蛋白质样品。如果需要，用0.1NNaOH将pH调节至所需值。用水补充内容物达到200g水。在1000rpm下混合30分钟，并且在3000g下离心1 5分钟。收集25g上清液，并且将其放入到预先干燥且去皮的结晶皿中。将结晶皿在103℃+/-2℃的烘箱中放置1小时。然后将其置于干燥器(具有干燥剂)中冷却至环境温度，并称重。

溶解度对应于可溶性干物质的含量，表示为相对于样品重量的重量％。溶解度用下式计算：

[公式.1]

其中：

P＝样品的重量(以g为单位)＝5g

m1＝干燥后结晶皿的重量(以g为单位)

m2＝空结晶皿的重量(以g为单位)

P1＝所收集样品的重量(以g为单位)＝25g

针对水解度的测试B(所谓的OPA测试)

首先用MEGAZYME试剂盒(参考货号K-PANOPA)测定根据本发明的蛋白质样品的氨基氮(游离NH₂)的含量。还测定了样品的蛋白质氮(总氮)的含量。然后可以计算水解度。

测定氨基氮的含量：

样品中游离氨基酸的“氨基氮”基团与N-乙酰基-L-半胱氨酸和邻苯二甲醛(OPA)反应形成异吲哚衍生物。

在该反应期间形成的异吲哚的量与游离氨基氮的量是化学计量的。它是异吲哚衍生物，通过在340nm处吸光度的增加来测量。

将精确称重的待分析样品的试样P*放入100ml烧杯中。基于样品的氨基氮含量，该试样将为0.5g至5.0g。加入大约50ml蒸馏水，进行均质化并将混合物滗析到100-ml带刻度的烧瓶中。加入5ml 20％的十二烷基硫酸钠(SDS)，并且用蒸馏水补充该混合物以达到100ml的体积。用磁力搅拌器以1000rpm搅拌15分钟。1号溶液通过将来自Megazyme试剂盒的瓶1的片剂溶解在3ml蒸馏水中并进行搅拌直至其完全溶解来制备。每次测试需要提供一片片剂。1号溶液在使用前临时制备。

在以下条件下，在分光光度计的比色皿中直接制备空白、标准品和样品：

-空白：加入3.00ml 1号溶液和50μl蒸馏水

-标准品：加入3.00ml 1号溶液和50μl Megazyme试剂盒的瓶3

-样品：加入3.00ml 1号溶液和50μl样品制备液。

混合每个比色皿的内容物，并且在置于340nm下的分光光度计(该分光光度计配备有1.0cm光程的比色皿，能够在340nm的波长下测量，并且根据相关制造商技术手册中所述的程序进行验证)中大约2mn后获取溶液的吸光度测量值(A1)。

然后通过在每个分光光度计比色皿中加入100μl 2号溶液(对应于Megazyme试剂盒的瓶2的OPA溶液)立即引发反应。

将每个比色皿的内容物混合，然后将它们在黑暗中放置大约20分钟。

然后从340nm下的分光光度计获取空白、标准品和样品的吸光度测量值A2。

游离氨基氮含量，表示为相对于产品重量的重量百分比，由下式给出：

[公式.2]

[公式.3]

ΔAech＝Aech2-Aech1

ΔAblc＝Ablc2-Ablc1

Aech2＝添加2号溶液后样品的吸光度

Aech1＝添加1号溶液后样品的吸光度

Ablc2＝添加2号溶液后空白的吸光度

Ablc1＝添加1号溶液后空白的吸光度

V＝烧瓶的体积

m＝试样的重量(以g为单位)

6803＝异吲哚衍生物在340nm下的消光系数(以1.mol-1.cm-1为单位)。

14.01＝氮的摩尔质量(以g.mol-1为单位)

3.15＝比色皿中的最终体积(以ml为单位)

0.05＝比色皿中的试样(以ml为单位)

测定蛋白质氮的含量：

根据标准ISO 16634(2016)中的DUMAS方法测定蛋白质氮的含量。其表示为相对于产品重量的重量百分比。

水解度的计算

用下式计算水解度(DH)：

[公式.4]

实施例1：制备根据本发明的蛋白质分离物

使用由ROQUETTE生产的市售豌豆蛋白质分离物

S85F。相对于干物质的重量，该分离物含有83重量％的蛋白质。

在20℃下将150g该分离物与1290g饮用水一起加入体积为1.5升的搅拌反应器中。使用连接到温度调节系统的内部浸没管道系统，将其温度调节至55℃。使用1M HCl和NaOH的溶液以及适当校准的pH计将pH调节至9。

然后加入0.3g得自NOVOZYMES的酶

CTL600(胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶)。

以这种方式控制反应1小时，并持续搅拌。

然后将pH调节至7并将温度调节至90℃持续5分钟，以抑制酶。

产物通过冷冻干燥来干燥并对应于“根据本发明的1号产品”。

实施例2：制备根据本发明的第二蛋白质分离物

使用0.6g酶

CTL600而不是0.3g，根据实施例1获得“根据本发明的2号产品”。

实施例3：制备不是根据本发明的蛋白质分离物以用于比较目的

该实施例的水解方案来源于上文的实施例1。与实施例相关的修改详述于下表中。酶量表示为相对于分离物中的蛋白质重量的重量百分比。

[表1]

应当指出的是，在该比较例中使用的酶不是胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。

实施例4：获得的不同产品的比较

对于每个样品，根据上述测试测量水解度(DH)、pH 5下的溶解度和pH 7下的溶解度。

结果汇总于下表中：

[表2]

样品参考	DH(％)	pH 5下的溶解度	pH 7下的溶解度
				根据本发明的1号产品	10.5	83.6	92.6
根据本发明的2号产品	11.5	92.4	94
				比较例2	7	57.4	76
比较例3	6.9	46	82.5
				比较例4	9	68.7	81.2
比较例5	8.7	65.7	73.5
				比较例6	11.6	74.8	80.4
比较例7	9.6	51.8	62.9
				比较例8	10.7	58.6	89
比较例10	9.3	59.5	68.5

在本文中显而易见的是，仅使用胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶使得可以获得豆科植物(在这种情况下为豌豆)的蛋白质分离物，该蛋白质分离物在pH 5下具有大于80％的溶解度，并且在pH 7下具有大于80％的溶解度，同时具有小于12的水解度。

Claims

1.一种豆类蛋白质，相对于蛋白质的总重量，所述豆类蛋白质含有超过90重量％的球蛋白，其特征在于，所述豆类蛋白质具有：

-在pH 5下大于80％、优选地大于85％、甚至更优选地大于90％的溶解度；以及

-小于15％、优选地小于12％的水解度。

2.根据权利要求1所述的豆类蛋白质，其特征在于，所述豆类蛋白质具有在pH 7下大于80％、优选地大于85％、甚至更优选地大于90％的溶解度。

3.根据权利要求1或2所述的豆类蛋白质，其特征在于，所述豆类蛋白质为蚕豆蛋白质或豌豆蛋白质，优选地为豌豆蛋白质。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的豆类蛋白质，其特征在于，所述豆类蛋白质为分离物，相对于干物质的重量，所述分离物的蛋白质含量大于80重量％。

5.一种用于制备根据权利要求1至4中任一项所述的豆类蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

-在水性溶液中采用豆类蛋白质分离物；

-通过添加胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶水解所述分离物，以便获得水解度小于15％、优选地小于12％的水解的豆类蛋白质；

-任选地抑制所述酶；

-任选地干燥所水解的豆类蛋白质。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，相对于所述分离物中的蛋白质重量，所添加的酶量按酶的重量计大于0.2％，优选地为0.25％至0.50％。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述水解在8至10、优选地大约9的pH下进行。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述水解在45℃至65℃、优选地50℃至60℃、更优选地大约55℃的温度下进行。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述水解进行30分钟至2小时、优选地大约1小时的持续时间。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的豆类蛋白质用于制备人类或动物食物组合物、化妆品组合物或药物组合物的用途，特别是用于制备具有酸性pH的饮料例如苏打水的用途。