CN113156113A - 用于体外评价新型冠状病毒ade效应的系统及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于体外评价新型冠状病毒ADE效应的系统及其构建方法，所述系统包括免疫球蛋IgG受体FcγR的表达细胞、和/或含新型冠状病毒抗体的溶液、和/或新型冠状病毒假病毒；其中，所述免疫球蛋IgG受体FcγR为FcγRIIA，即CD32A；新型冠状病毒抗体促进新型冠状病毒假病毒感染免疫球蛋IgG受体FcγRIIA(CD32A)的表达细胞；根据上述系统评价待测新型冠状病毒或新型冠状病毒抗体的ADE效应。本发明利用SARS‑CoV‑2假病毒和外源性表达CD32A的细胞，体外鉴定出新型冠状病毒抗体及抗血清的ADE活性，本发明实验证明基于外源性表达CD32A细胞的ADE评价体系相比于免疫细胞系具有更敏感、更可靠，是一种很有潜力的评价新型冠状病毒ADE效应的系统。

Description

用于体外评价新型冠状病毒ADE效应的系统及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于体外评价新型冠状病毒 ADE效应的系统及其构建方法。
背景技术
抗体依赖性感染增强(antibody-dependent enhancement，ADE)作用最早 在登革病毒的感染中被发现，即不同血清型病毒的继往感染会加重疾病的进 程，其机制为：继往感染所产生的弱结合能力的抗体可以通过结合病毒包膜蛋 白，及同时结合免疫细胞表面的Fc受体，介导病毒对免疫细胞的感染增强。 靶向登革病毒包膜蛋白PrM及E的抗体均有可能产生ADE作用。另外，ADE 在HIV、流感、埃博拉病毒感染中均有报导。
在冠状病毒中，人们早已发现，猫传染性腹膜炎病毒感染或疫苗接种对再 次感染均起到加重作用，证明ADE可能存在于冠状病毒感染中。SARS和 MERS的疫苗研究显示，用全长S蛋白免疫动物可能诱导无保护作用的非中和 性抗体，加重病毒感染时的病理变化，提示ADE在这两种冠状病毒感染及疾 病加重中可能也起到一定作用，并给疫苗研发增加了复杂性和难度。在 SARS-CoV中，S471-503、S604-625和S1164-1191可诱导中和抗体，有效防止非人灵长类动物感染。相反，肽S597-603通过表位序列依赖机制诱导的抗 体可以增强非人类灵长类动物的感染，提示特定抗原表位对ADE可能存在特 殊的贡献。另外，具有强中和活性的MERS-CoV单抗可以和S蛋白结合，并 与细胞表面的Fc受体结合，在亚中和浓度下增强病毒对靶细胞的感染。 SARS-CoV产生的抗体在高浓度下抑制病毒进入ACE2表达细胞，但在低浓度 下促进病毒进入Fc受体表达细胞，进一步证明抗体浓度是影响中和作用和 ADE作用的重要因素。
但是，对于SARS-CoV-2引起的COVID-19，ADE所起的作用目前尚无定 论。康复者血清的治疗有效性以及灭活疫苗未观察到ADE效应，提示ADE 在SARS-CoV-2感染中可能不起主要作用。但是，有文献报导抗体或抗血清可 能在体外存在ADE效应，提示仍应关注ADE的潜在风险。因此，明确 SARS-CoV-2感染中是否存在ADE作用，不同种冠状病毒感染是否诱导ADE 抗体，明确治疗性抗体能否产生ADE效应，疫苗是否可以诱导ADE效应，对 COVID-19的预防和治疗意义重大。目前体外评价ADE效应的细胞系主要包 括Raji等免疫细胞系，但具体起作用的分子仍存在争议。探明SARS-CoV-2潜 在ADE中的关键Fc受体分子，构建方便可靠的ADE评价系统则成为研究新 型冠状病毒ADE的关键步骤。
发明内容
为此，本发明提供一种用于体外评价新型冠状病毒ADE效应的系统及其 构建方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明实施例提供一种用于体外评价新型冠状病毒ADE效应的系统，所 述系统包括免疫球蛋IgG受体FcγR的表达细胞、和/或含新型冠状病毒抗体的 溶液、和/或新型冠状病毒假病毒；
其中，所述免疫球蛋IgG受体FcγR为FcγRIIA，即CD32A；
新型冠状病毒抗体促进新型冠状病毒假病毒感染免疫球蛋白IgG受体 FcγRCD32A的表达细胞；
根据上述系统评价待测新型冠状病毒或新型冠状病毒抗体的ADE效应。
本发明的一个实施例中，所述新型冠状病毒假病毒为HIV/SARS-CoV-2。
本发明的一个实施例中，所述含新型冠状病毒抗体的溶液为新型冠状病毒 抗体、抗血清或康复者血浆。
本发明实施例还提供一种用于体外评价新型冠状病毒ADE效应的系统的 构建方法所述方法包括：构建免疫球蛋IgG受体FcγR的表达细胞，获得含新 型冠状病毒抗体的溶液以及新型冠状病毒假病毒；其中，所述免疫球蛋IgG受 体FcγR为FcγRIIA，即CD32A。
本发明的一个实施例中，所述构建稳定表达CD32A的细胞系方法包括：
根据CD32A的基因序列合成CD32A的编码基因；
将所述CD32A的编码基因替换pLenti-Cas9-Blast载体XbaI/BamHI位点 中的Cas9基因，得到pLenti-CD32A-Blast载体；
将所述pLenti-CD32A-Blast载体、pVSVG、pLP1和pLP2共转染至293T 细胞；
将获得的共转染的293T细胞上清感染Huh7细胞，筛选得到免疫球蛋IgG 受体FcγRIIA表达细胞。
本发明的一个实施例中，所述共转染体系为：1.5μg pVSVG、2μg pLP1、 2μg pLP2和5μg pLenti-CD32A-Blast共同转染至2.5×106 293T细胞。
本发明具有如下优点：
本发明利用SARS-CoV-2假病毒和外源性表达CD32A的细胞，体外鉴定 出新型冠状病毒抗体及抗血清的ADE活性，本发明实验证明基于外源性表达 CD32A细胞的ADE评价体系相比于免疫细胞系具有更敏感、更可靠的特点， 是一种很有潜力的评价新型冠状病毒ADE效应的系统。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将 对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见 地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在 不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附 图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的 内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限 定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大 小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落 在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的新型冠状病毒假病毒感染Cos7-hACE2的情况 (图中A)，及单克隆抗体CB6抗体中和HIV/SARS-CoV-2假病毒感染 Cos7-hACE2的情况(图中B)；
图2为本发明小鼠抗血清、康复者血浆中和HIV/SARS-CoV-2假病毒感 染Cos7-hACE2的情况；
图3为本发明实施例提供的新型冠状病毒单克隆抗体CB6抗体存在条件 下，HIV/SARS-CoV-2感染Raji或Daudi细胞的情况；
图4为本发明实施例提供的Huh7、Huh7-CD16A、Huh7-CD32A、 Huh7-CD32B、Huh7-CD64A细胞中CD16A、CD32A、CD32B、CD64A的表 达情况，内参基因为GAPDH；
图5为本发明实施例提供的没有抗体存在的条件下，HIV/SARS-CoV-2假 病毒感染Huh7、Huh7-CD16A、Huh7-CD32A、Huh7-CD32B、Huh7-CD64A 细胞的情况；
图6为本发明实施例提供的不同浓度CB6抗体存在条件下， HIV/SARS-CoV-2对Huh7、Huh7-CD16A、Huh7-CD32A、Huh7-CD32B、 Huh7-CD64A细胞的感染情况，相对感染强度以没有抗体存在下的感染强度 作为对照(100％)；
图7为本发明实施例提供的不同浓度CB6抗体(图中A)、小鼠抗血清 (图中B)、COVID-19康复者血浆(图中C)存在条件下，HIV/SARS-CoV-2 对Huh7-CD32A细胞的感染情况，其中，614D为野生型毒株；614G为突变 型毒株。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可 由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描 述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，pLenti-Cas9-Blast、pLP1、pLP2、pNL-LucE-R-质粒来自 Addgene。
pTRIOZ-hIgG1载体购自InvivoGen公司。293T、Huh7细胞均源自 ATCC。Raji、Daudi细胞源自南京科佰生物科技有限公司。
Cos7-hACE2细胞来自北京维通达生物技术有限公司。
Lipofectamine 3000购自Thermo Fisher公司。
polybrene购自Sigma公司。
Blasticidin购自翊圣生物科技上海有限公司。
新型冠状病毒单克隆抗体CB6抗体购自缔码生物科技(武汉)有限公司。
SARS-CoV-2S1蛋白购自深圳重链生物技术有限公司。三周快速佐剂购 自苏州博奥龙公司。Trizol购自Sigma公司。
逆转录及Real-time PCR试剂购自翊圣生物科技上海有限公司。
HIV p24定量用Vironostika HIV-1抗原MicroELISA试剂盒购自 Biomerieux bv公司。
实施例1、Fc受体慢病毒表达载体的构建
Wuhan-Hu-1毒株SARS-CoV-2序列见
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1798174254。
Wuhan-Hu-1毒株SARS-CoV-2的S基因除去末端的19个氨基酸，序列 经密码子优化后，克隆至pcDNA3.1(+)的BamHI/EcoRI位点，得到 pcDNA-SARS2-S-614D。
614位氨基酸突变株假病毒SARS-CoV-2(SARS-CoV-2USA-WA1/2020 毒株，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MT576563.1)S蛋白表达载体的 构建：合成含有614G突变株的序列，构建至pcDNA3.1(+)的BamHI/EcoRI位 点，得到pcDNA-SARS2-S-614G。
Fc受体慢病毒表达载体构建：
合成CD16A(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000569.8)、 CD32A(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001136219.3)、CD32B (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001002273.3)、CD64A (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000566.4)基因，替换 pLenti-Cas9-Blast载体XbaI/BamHI位点中的Cas9基因，得到 pLenti-CD16A-Blast、pLenti-CD32A-Blast、pLenti-CD32B-Blast和 pLenti-CD64A-Blast。
实施例2、免疫球蛋IgG受体FcγR的表达细胞系的构建
将293T、Huh7细胞在37℃和5％CO2条件下培养。培养基为添加10％胎 牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM。为构建表达Fc受体基因的细胞系，将 1.5μg pVSVG、2μg pLP1、2μg pLP2和5μg实施例1构建的 pLenti-CD16A-Blast或pLenti-CD32A-Blast或pLenti-CD32B-Blast或 pLenti-CD64A-Blast分别共同转染至2.5×106 293T细胞，12小时后更换为新 鲜培养基，转染48小时后收集转染细胞的上清液，并通过0.45μm的过滤器(millipore)。
将含病毒的上清液和新鲜培养基按照1：1比例混合，添加8μg/ml polybrene，感染Huh7细胞，48小时后用10μg/ml Blasticidin筛选，得到 Huh7-CD16A、Huh7-CD32A、Huh7-CD32B、Huh7-CD64A细胞。
实施例3、Real-time RT PCR验证细胞系中免疫球蛋IgG受体FcγR的表 达
5×105Huh7及其衍生细胞Huh7-CD16A、Huh7-CD32A、Huh7-CD32B、 Huh7-CD64A细胞接种于6cm dish，以Trizol裂解，提取总RNA，逆转录后 进行real-time PCR，PCR引物序列如下：
CD16A：forward:GACAGCGGCTCCTACTTCTG；
reverse:AGTCCTGTGTCCACTGCAAA；
CD32A：forward:TCCCACAAGCAAACCACAGT；
reverse:TGCTACAGCAGTCGCAATGA；
CD32B：forward:AGCGGATTTCAGCCAATCCC；
reverse:ATACGGTTCTGGTCATCAGGC；
CD64A：forward:AAGTCACAATGGCACCTACC；
reverse:GCTCAGGGTGACCAGATTCC；
GAPDH:forward:CTGCACCACCAACTGCTTAG；
reverse:GAGCTTCCCGTTCAGCTCAG。
本实施例为建立更敏感的SARS-CoV-2ADE检测细胞系，并鉴定具有 ADE活性的FcγR分子，构建了稳定表达IIIA型、IIA型、IIB型、IA型FcR 的Huh7细胞：Huh7-CD16A、Huh7-CD32A、Huh7-CD32B、Huh7-CD64A。 如图4所示，本实施例通过real-time RT PCR验证了免疫球蛋IgG受体FcγR 的表达细胞系中CD16A、CD32A、CD32B、CD64A分子的表达情况。
实施例4、新型冠状病毒抗血清的获得
以SARS-CoV-2S1蛋白20μg和50μl佐剂混合，于Balb/c小鼠后腿进行 多点注射，2周后加强注射一次，3周后取血，分离得到抗血清。康复者血浆 来自COVID-19康复者。
实施例5、假病毒的包装实验
将10μg pNL-Luc E-R-质粒和10μg S蛋白表达载体共转染到5×106 293T 细胞中，12小时后更换为新鲜培养基，转染48小时后收集转染细胞的上清 液，并通过0.45μm的过滤器，得到HIV/SARS-CoV-2假病毒溶液。
使用HIV p24定量试剂盒对假病毒p24蛋白进行标准化，用含5ng假型 病毒(p24)的上清液感染96孔板(1×104细胞/孔)。48小时后，细胞用20μl 裂解液裂解，取15μl裂解液测定荧光素酶活性。
统计分析：本发明采用学生t检验比较两组间的统计学差异。对于包含多 个组的数据，使用单因素方差分析进行统计分析，然后使用GraphPad Prism 软件(6.01版；GraphPad software，Inc.)进行Tukey事后检验。
如图1A所示，HIV/SARS-CoV-2假病毒可有效感染Cos7-hACE2细胞， 且614G毒株较614D毒株感染力强。
实施例6、中和实验
将抗体或抗血清按照1:3.16梯度稀释后，加入等体积的实施例5制备的 HIV/SARS-CoV-2假病毒溶液，室温孵育1小时，之后感染Cos7-hACE2细 胞，48小时后检测荧光素酶活性。
如图1B和图2所示，图1B为本实施例提供的新型冠状病毒单克隆抗体 CB6抗体中和HIV/SARS-CoV-2假病毒感染Cos7-hACE2的情况；图2为本实 施例的小鼠抗血清、康复者血浆中和HIV/SARS-CoV-2假病毒感染 Cos7-hACE2的情况。
实施例7、用于体外评价新型冠状病毒ADE效应的系统
基于Cos7-hACE2细胞的假病毒感染模型用于评价抗体及抗血清的中和 活性。如图1B所示，新型冠状病毒单抗CB6可以抑制HIV/SARS-CoV-2假 病毒感染Cos7-hACE2细胞，其中和活性随抗体浓度升高而增强。如图2所 示，SARS-CoV-2S1蛋白免疫小鼠得到的抗血清，以及COVID-19康复者血 浆均具有中和HIV/SARS-CoV-2假病毒感染Cos7-hACE2细胞的活性，且中和 活性随抗血清/浆浓度升高而增强。
Raji为检测病毒ADE现象常用的细胞系。但HIV/SARS-CoV-2假病毒不 能感染Raji细胞，且新型冠状病毒单抗CB6抗体在所检测的浓度范围内均不 能促进感染。
而新型冠状病毒单抗CB6抗体在亚中和浓度可以微弱促进 HIV/SARS-CoV-2-614G假病毒对Daudi细胞的感染，如图3所示，为本发明 实施例提供的新型冠状病毒单克隆抗体CB6抗体存在条件下， HIV/SARS-CoV-2感染Raji或Daudi细胞的情况。
将抗体或实施例3制备的抗血清按照1:3.16梯度稀释后，加入等体积的 实施例4制备的HIV/SARS-CoV-2假病毒溶液，室温孵育1小时，之后感染 Huh7-CD32A细胞，48小时后，检测荧光素酶活性。
本实施例通过假病毒感染实验发现，在没有抗体存在的条件下，仅 Huh7-CD16A、Huh7-CD32B、Huh7-CD64A的表达即可明显促进新型冠状病 毒的感染，而Huh7-CD32A的表达可轻度促进病毒的感染，如图5所示，没 有抗体存在的条件下，HIV/SARS-CoV-2假病毒感染Huh7、Huh7-CD16A、 Huh7-CD32A、Huh7-CD32B、Huh7-CD64A细胞的情况。
在新型冠状病毒单抗CB6抗体存在的条件下，发现其在亚中和浓度下表 现出明显促进HIV/SARS-CoV-2-614G对Huh7-CD32A细胞感染的作用，而在 更高或更低浓度下，该促进作用消失。而在Huh7-CD16A、Huh7-CD32B、 Huh7-CD64A细胞上，新型冠状病毒单抗CB6抗体主要表现为高浓度下抑制 病毒感染的作用，ADE作用并不明显，如图6所示。
新型冠状病毒单抗CB6抗体、SARS-CoV-2S1蛋白小鼠抗血清、 COVID-19康复者血浆在特定浓度下均表现出促进HIV/SARS-CoV-2假病毒对 Huh7-CD32A的感染，并且对HIV/SARS-CoV-2-614G突变型毒株的感染增强 作用强于HIV/SARS-CoV-2-614D野生型毒株，如图7所示。
本实施例利用外源性表达CD32A的细胞和SARS-CoV-2假病毒，建立了 用于体外评价新型冠状病毒ADE效应的系统，且本系统较未经人工修饰的免 疫细胞系相比，检测ADE效应更为敏感可靠。
本实施例证明某些SARS-CoV-2病毒单抗及抗血清/浆在亚中和浓度下可 以促进SARS-CoV-2假病毒对细胞的感染。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是 显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均 属于本发明要求保护的范围。
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Claims (6)

1.一种用于体外评价新型冠状病毒ADE效应的系统，其特征在于，所述系统包括免疫球蛋IgG受体FcγR的表达细胞、和/或含新型冠状病毒抗体的溶液、和/或新型冠状病毒假病毒；
其中，所述免疫球蛋IgG受体FcγR为FcγRIIA，即CD32A；
新型冠状病毒抗体促进新型冠状病毒假病毒感染免疫球蛋白IgG受体FcγR CD32A的表达细胞；
根据上述系统评价待测新型冠状病毒或新型冠状病毒抗体的ADE效应。
2.如权利要求1所述的用于体外评价新型冠状病毒ADE效应的系统，其特征在于，
所述新型冠状病毒假病毒为HIV/SARS-CoV-2。
3.如权利要求1所述的用于体外评价新型冠状病毒ADE效应的系统，其特征在于，
所述含新型冠状病毒抗体的溶液为新型冠状病毒抗体、抗血清或康复者血浆。
4.一种用于体外评价新型冠状病毒ADE效应的系统的构建方法，其特征在于，所述方法包括：构建免疫球蛋IgG受体FcγR的表达细胞，获得含新型冠状病毒抗体的溶液以及新型冠状病毒假病毒；其中，所述免疫球蛋IgG受体FcγR为FcγRIIA，即CD32A。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，
所述构建稳定表达CD32A的细胞系方法包括：
根据CD32A的基因序列合成CD32A的编码基因；
将所述CD32A的编码基因替换pLenti-Cas9-Blast载体XbaI/BamHI位点中的Cas9基因，得到pLenti-CD32A-Blast载体；
将所述pLenti-CD32A-Blast载体、pVSVG、pLP1和pLP2共转染至293T细胞；
将获得的共转染的293T细胞上清感染Huh7细胞，筛选得到免疫球蛋IgG受体FcγRIIA表达细胞。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，
所述共转染体系为：1.5μg pVSVG、2μg pLP1、2μg pLP2和5μg pLenti-CD32A-Blast共同转染至2.5×106 293T细胞。
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