CN113151547A - 一种金针菇fl1980菌种的微卫星dna标记指纹图谱的鉴定方法及其构建方法与应用 - Google Patents

一种金针菇fl1980菌种的微卫星dna标记指纹图谱的鉴定方法及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的鉴定方法及其构建方法与应用，包括该指纹图谱由6对微卫星DNA标记组成。构建方法包括：(1)菌丝培养；(2)基因组DNA的提取；(3)微卫星DNA分子标记的检测；(4)毛细管电泳检测。应用包括：对金针菇菌种进行微卫星DNA标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该组指纹图谱一致即为金针菇FL1980菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的国内外105个金针菇栽培主栽菌种中具有金针菇FL1980菌种的专一性。

Description

一种金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的鉴定方 法及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于金针菇菌种的检测技术领域，具体涉及一种金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的鉴定方法及其构建方法与应用。
背景技术
金针菇(Flammulina filiformis)是一种普遍栽培的食用菌，通常分为白色和黄色品种。其栽培历史悠久，生产总量逐年提升，目前已成为我国工厂化食用菌企业中发展速度最快、规模最大的一个品种。我国工厂化栽培金针菇的日产量约占我国食用菌工厂化总产量的47.12％。金针菇营养丰富、味道鲜美且兼具药用价值，不仅富含蛋白质、矿物质和维生素等各种营养成分，而且具有抗肿瘤、增强免疫调节、抗病毒、降血脂、抗疲劳和护肝等多种药用保健作用，深受消费者喜爱。
优质菌种在金针菇单产和质量中的贡献率举足轻重。我国的金针菇工厂化栽培菌株以国外选育的首潮产量高、生长周期短和耐储藏的白色菌株为主导。金针菇育种工作相对滞后，也是导致目前国产菌株市场占有率小的原因。但是相对于目前主导的工厂化菌株而言，我国有着丰富的金针菇野生和自然栽培资源，高效利用这些优质的资源，拓展菌株的遗传基础，有利于国内高产、优质、特色金针菇菌株的选育。
为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。就国内而言，金针菇栽培菌种多样性低导致的产品同质化现象，不仅给生产企业带来了经济损失，也极大地影响了中国金针菇产业的快速发展；另一方面，工厂化栽培方式和菌株退化现象对金针菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、精准的菌株鉴定技术，以保证每批次使用的都是优质、准确的菌种。
针对上述金针菇产业发展现状，利用现代分子生物学技术开发精准有效的金针菇菌种鉴定体系是一项极为重要的工作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种金针菇“FL1980”菌种的微卫星DNA 标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。
金针菇(Flammulina filiformis)FL1980，于2021年2月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所(Building 59,No.100Central Xian Lie Road,Guangzhou,China)，保藏编号为GDMCC No：61515。
本发明的一种金针菇“FL1980”菌种的微卫星DNA标记指纹图谱，该指纹图谱由6对微卫星DNA标记组成，是基于金针菇基因组简单重复序列片段开发 SSR引物，扩增带型好，重复性高的SSR引物，标记详细信息如表1：
表1微卫星DNA标记详细信息列表
Figure RE-GDA0003109256650000021
本发明的一种金针菇“FL1980”菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的构建方法，包括：
(1)菌丝培养：将金针菇菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)上， 25℃培养5～10d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取：用TAKARA公司的TaqHotStart扩增试剂盒提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品 DNA的浓度一致；
(3)微卫星DNA分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因微卫星DNA标记的PCR扩增；
(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与甲酰胺加样缓冲液混匀，变性，上机检测；
(5)GeneMapper数据分析。
所述步骤(2)中的试剂盒法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括：
(1)将菌丝样本加入液氮充分研磨；
(2)向研磨好的粉末中迅速加入360μL BufferSTE和40μL Buffer SDS，迅速涡旋混匀后，将离心管放在65℃水浴15min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次；
(3)加入5μL RNase Solution至裂解液中，涡旋混匀，室温静置15-30min；
(4)加入140μL Buffer PS，涡旋震荡30s，冰上放置10min；
(5)室温下，13000g离心5min，小心转移400μL上清液至新的离心管中；
(6)加入600μL Buffer PBD(已用无水乙醇稀释)至样品中，涡旋混匀30s；
(7)把DNA结合柱装在收集管，转移一半混合液至柱子中，8000g离心1min； (8)倒弃滤液把柱子装回收集管，转移剩余混合液至柱子中，8000g离心1min； (9)倒弃滤液把柱子装回收集管，加入600μL Buffer GW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中，8000g离心1min；
(10)重复步骤9；
(11)倒弃滤液把柱子装回收集管，10000g离心2min去除柱子中残留的乙醇；
(12)将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入30μL预热至65℃的Buffer AE 至柱子的膜中央，室温静置2min，10000g离心1min；
(13)取2μL DNA用于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μL DNA用于NanoDrop 分光光度计测浓度，剩余DNA保存于-20℃。
所述步骤(3)中的PCR扩增体系为：总体积10μL，包括：10×PCR buffer 1μL，2.5mmol/L dNTP 0.8μL，5U/μL HSTaq DNA酶0.1μL，5μmol/L微卫星DNA标记正向引物和反向引物总体积各0.6μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA 1μL，ddH2O 5.9μL；
PCR反应条件：95℃5min；95℃30second，59℃30second，72℃30 second，35个循环；60℃30min。
所述步骤(4)中的加样缓冲液为分子量内标和甲酰胺混合液(0.5：8.5) 9μL；PCR扩增产物加样量1μL。
所述步骤(4)中的变性的具体工艺为于95℃变性3min，结束后置于冰水混合物中冷却3min。
所述步骤(4)中的电泳的工艺参数为：变性聚丙烯酰胺凝胶为商用POP7 胶，电泳缓冲液为3730buffer EDTA，注入电压2000V，运行电压15000V，进样时间10s，温度60℃，毛细管长度50cm，功率200W，电泳20min，电流和功率均为动态。
所述步骤(5)中的数据分析具体为：将检测得到的原始数据文件导入到分析软件genemapper ID3.2中，运用POPGENE、NTSYS等软件进行群体结构分析、聚类及杂合度的分析，核心种质资源计算分析。分析等位基因数(Na，Ne)、 Nei’s遗传多样性指数(He)、shannon’s多样性信息指数(I)和基因观测杂合度(Ho)。
表2SSR引物扩增的等位片段信息汇总表
Figure RE-GDA0003109256650000041
Figure RE-GDA0003109256650000051
Figure RE-GDA0003109256650000061
本发明的一种金针菇“FL1980”菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的应用，是利用金针菇基因组简单重复序列片段开发的6对SSR引物，本发明对大量的 SSR引物进行了筛选，通过对收集的105份金针菇主要栽培品种的SSR引物带型扩增，确定了6对SSR引物在各个金针菇栽培品种中扩增出的等位片段的数量并编号(表2)，通过不同SSR等位位点的编号组合能够在所收集的105份主栽品种中有效识别“FL1980”菌种。通过毛细管电泳结合软件分析可确定各SSR 引物扩增的等位位点的相对分子量，存在“FL1980”菌种特异SSR等位片段组合的菌种即是金针菇“FL1980”菌种，该菌种的编号组合为： (2+9)/(5+12)/(6+8)/(2+6)/6/(1+3)。
本发明的有益效果：本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需的操作时间在24h以内(包括提取基因组DNA、PCR扩增、电泳分析、数据分析)，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；本发明方法在所收集的105个市售金针菇主栽培菌种(包括Fv-DY、Fv-FY、Fv-SB、Fv-CYS、 Fv-YH、Fv-KL、Fv-MG、Fv-MH、Fv-MI、Fv-MJ、Fv-SY、Fv-FM、Fv-WC、Fv-GF、 Fv-BY、Fv-HL、Fv-RYJ、Fv-XH、Fv-HTC、Fv-GR等)中具有“FL1980”菌种的专一性，具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为引物FfSSR2分别在所选金针菇栽培材料“FL1980”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图2为引物FfSSR4分别在所选金针菇栽培材料“FL1980”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图3为引物FfSSR8分别在所选金针菇栽培材料“FL1980”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图4为引物FfSSR13分别在所选金针菇栽培材料“FL1980”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图5为引物FfSSR15分别在所选金针菇栽培材料“FL1980”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；
图6为引物FfSSR20分别在所选金针菇栽培材料“FL1980”和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
(1)菌丝培养：将金针菇菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)上， 25℃培养7d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取：用TAKARA公司的TaqHotStart扩增试剂盒提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品 DNA的浓度一致；
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
①将菌丝样本加入液氮充分研磨；
②向研磨好的粉末中迅速加入360μL BufferSTE和40μL Buffer SDS，迅速涡旋混匀后，将离心管放在65℃水浴15min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次；
③加入5μL RNase Solution至裂解液中，涡旋混匀，室温静置15-30min；
④加入140μL Buffer PS，涡旋震荡30s，冰上放置10min；
⑤室温下，13000g离心5min，小心转移400μL上清液至新的离心管中；
⑥加入600μL Buffer PBD(已用无水乙醇稀释)至样品中，，涡旋混匀30s；
⑦把DNA结合柱装在收集管，转移一半混合液至柱子中，8000g离心1min；
⑧倒弃滤液把柱子装回收集管，转移剩余混合液至柱子中，8000g离心1min；⑨倒弃滤液把柱子装回收集管，加入600μL Buffer GW2(已用无水乙醇稀释) 至柱子中，8000g离心1min；
⑩重复步骤9；
Figure RE-GDA0003109256650000081
倒弃滤液把柱子装回收集管，10000g离心2min去除柱子中残留的乙醇；
Figure RE-GDA0003109256650000082
将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入30μL预热至65℃的Buffer AE 至柱子的膜中央，室温静置2min，10000g离心1min；
Figure RE-GDA0003109256650000083
取2μL DNA用于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μL DNA用于NanoDrop分光光度计测浓度，剩余DNA保存于-20℃。
(3)微卫星DNA分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因微卫星DNA 标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积10μL，包括：10×PCR buffer 1μL，2.5mmol/L dNTP 0.8μL，5U/μL HSTaqDNA酶0.1μL，5μmol/L微卫星DNA标记正向引物和反向引物总体积各0.6μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA 1μL，ddH2O 5.9 μL；
PCR反应条件：95℃5min；95℃30second，59℃30second，72℃30 second，35个循环；60℃30min。
(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与1μL加样缓冲液混匀，95℃变性3min，结束后置于冰水混合物中冷却3min；点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝为商用POP7胶，电泳缓冲液为3730buffer EDTA，注入电压2000V，运行电压15000V，进样时间10s，温度60℃，毛细管长度50cm，功率200W，电泳20min，电流和功率均为动态，
(5)结果分析
采用6对SSR引物对金针菇菌株进行PCR扩增和毛细管电泳，通过分析等位基因数(Na，Ne)、Nei’s遗传多样性指数(He)、shannon’s多样性信息指数(I)和基因观测杂合度(Ho)，结合等位位点的相对分子量峰图，找到符合编号组合为：FfSSR2、FfSSR4、FfSSR8、FfSSR13、FfSSR15、FfSSR20，相应带型为：(2+9)/(5+12)/(6+8)/(2+6)/6/(1+3)的菌种，即可确定该菌种为金针菇“FL1980”菌种。为保证鉴定的准确性，建议进行三次重复实验。
以几种主栽商业品种为例，给出6对引物依次检测得到的等位位点相对分子量峰图，如图1～6所示(依次为①FL1980②Fv-SY③Fv-FM④Fv-WC⑤Fv-GF ⑥Fv-BY⑦Fv-HL⑧Fv-RYJ⑨Fv-XH⑩Fv-HTC
Figure RE-GDA0003109256650000091
Fv-GR)。
本发明所述指纹图谱，是指所述引物及其带型组合。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的鉴定方法及其构建方法与应用
<130> 2021040803-zf-wjn
<141> 2021-04-08
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcttcttggg tggaagacg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgagctagg ttcctctac 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtgtgt tcgctgttc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cattggagtg ggtaaagag 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catggatgtt gacgggaa 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggaacggt ggtagactct c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atttcttcgg atgctttgga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttctctttgc acacgtcgaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtcgtcgtt caaggtgtcg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggttgtttg ttccactttt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaatgaacgt cgagtgattc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacgagtcaa tccatccact 20

Claims (9)

1.一种金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的鉴定方法，其特征在于：所述指纹图谱由6对微卫星DNA标记组成，具体序列如下：
Figure FDA0003012507390000011
相应带型编号组合为：(2+9)/(5+12)/(6+8)/(2+6)/6/(1+3)。
2.权利要求1所述的金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括，
(1)菌丝培养：将金针菇菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃培养5～10d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取：用TAKARA公司的TaqHotStart扩增试剂盒提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
(3)微卫星DNA分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因微卫星DNA标记的PCR扩增；
(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与甲酰胺加样缓冲液混匀，变性，上机检测；
(5)GeneMapper数据分析；找到相应带型编号组合为：(2+9)/(5+12)/(6+8)/(2+6)/6/(1+3)的菌种。
3.根据权利要求2所述的金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)基因组DNA的提取，其具体方法包括：
(1)将菌丝样本加入液氮充分研磨；
(2)向研磨好的粉末中迅速加入360μL BufferSTE和40μL Buffer SDS，迅速涡旋混匀后，将离心管放在65℃水浴15min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次；
(3)加入5μL RNase Solution至裂解液中，涡旋混匀，室温静置15-30min；
(4)加入140μL Buffer PS，涡旋震荡30s，冰上放置10min；
(5)室温下，13000g离心5min，小心转移400μL上清液至新的离心管中；
(6)加入600μL Buffer PBD至样品中，涡旋混匀30s；
(7)把DNA结合柱装在收集管，转移一半混合液至柱子中，8000g离心1min；
(8)倒弃滤液把柱子装回收集管，转移剩余混合液至柱子中，8000g离心1min；
(9)倒弃滤液把柱子装回收集管，加入600μL Buffer GW2至柱子中，8000g离心1min；
(10)重复步骤9；
(11)倒弃滤液把柱子装回收集管，10000g离心2min去除柱子中残留的乙醇；
(12)将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入30μL预热至65℃的Buffer AE至柱子的膜中央，室温静置2min，10000g离心1min；
(13)取2μL DNA用于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μL DNA用于NanoDrop分光光度计测浓度，剩余DNA保存于-20℃。
4.根据权利要求2所述的金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述PCR扩增，扩增体系为：总体积10μL，包括：10×PCR buffer1μL，2.5mmol/L dNTP 0.8μL，5U/μL HSTaq DNA酶0.1μL，5μmol/L微卫星DNA标记正向引物和反向引物总体积各0.6μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA 1μL，ddH2O 5.9μL；
PCR反应条件：95℃5min；95℃30second，59℃30second，72℃30second，35个循环；60℃30min。
5.根据权利要求2所述的金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述将上述PCR扩增得到的产物与甲酰胺加样缓冲液混匀，其中，加样缓冲液的分子量内标与甲酰胺的体积比为0.5：8.5，所述加样缓冲液的分子量内标与甲酰胺的体积共9μL；PCR扩增得到的产物加样量1μL。
6.根据权利要求2所述的金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述变性，为95℃变性3min，结束后置于冰水混合物中冷却3min。
7.根据权利要求2所述的金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述电泳，其变性聚丙烯酰胺凝胶为商用POP7胶，电泳缓冲液为3730buffer EDTA，注入电压2000V，运行电压15000V，进样时间10s，温度60℃，毛细管长度50cm，功率200W，电泳20min，电流和功率均为动态。
8.根据权利要求2所述的金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(5)中，所述数据分析为，将原始数据文件导入到分析软件genemapperID3.2中，运用POPGENE、NTSYS软件进行群体结构分析、聚类及杂合度的分析，核心种质资源计算分析；分析等位基因数(Na，Ne)、Nei’s遗传多样性指数(He)、shannon’s多样性信息指数(I)和基因观测杂合度(Ho)。
9.一种权利要求1所述的金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱的应用，其特征在于：所述金针菇FL1980菌种的微卫星DNA标记指纹图谱用于鉴定金针菇FL1980菌种的特异等位变异，和/或鉴定金针菇FL1980菌种的特异性。
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RUIYING ZHANG等: ""Development and characterization of simple sequence repeat (SSR) markers for the mushroom Flammulina velutipes"", <JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING> *

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