CN113151339B - 一种基因突变表达盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因突变表达盒及其应用，所述基因突变表达盒包括必需基因、同源臂和筛选标记。利用本发明表达盒进行突变基因的两端筛选标记，具有极高的染色体必需基因突变效率；本发明能实现快速靶向两个基因并对其进行编辑；本发明两端筛选标记策略和CRISPR/Cas9系统能对快速染色体进行无痕定点突变，为酿酒酵母代谢改造提供了一个方便简洁的基因编辑方法，进一步为酿酒酵母作为细胞工厂奠定基础。

Description

一种基因突变表达盒及其应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程应用技术领域，具体涉及一种基因突变表达盒及其制备方法。

背景技术

随着近年来功能基因组学、代谢工程、系统及合成生物学的发展，微生物细胞越来广泛应用于合成天然活性化合物、生物燃料或化学品。为目标产物高效生物合成，通常须要对细胞天生的新陈代谢进行系统重编程，这个过程则需要下调竞争途径等代谢工程策略。往往通过敲除竞争途径关键基因来下调竞争途径，然而必需基因敲除会导致菌株出现营养缺陷或者致死表型，如ERG20、TPI、PYK、PGI等必需基因缺失会导致细胞死亡或者无法在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长。因此采用弱启动子表达必需基因从而通过在转录水平上下调竞争途径的备选策略被广泛应用于代谢工程中，如在利用酿酒酵母合成倍半萜化合物过程中，通过采用弱启动子或环境诱导抑制型启动子表达ERG9(角鲨烯合成酶基因)，能够减弱倍半萜前体物质FPP(法尼烯焦磷酸)流向竞争的甾醇途径，同时还能显著提高倍半萜产量。然而对于一些双功能酶如ERG20p(法尼烯合酶)能催化两步连续反应依次生成GPP(牻牛儿基焦磷酸)和FPP，中间产物GPP会迅速的被ERG20p生成FPP，导致酵母细胞内难以积累GPP。而单萜化合物又是来衍生于GPP，因此仅仅通过采用弱启动子下调表达ERG20虽然降低了转录水平，不仅降低了GPP衍生物单萜产量和细胞的生物量，还无法阻止大量GPP流向FPP。

酶的定向进化不仅能显著增加酶蛋白的反应活性，还能改变其特异性或选择性。以双功能酶编码基因ERG20为例，通过对其进行定点突变，使其具有倾向合成GPP的酶活性及降低FPP的合成酶活性，从而显著提高单萜化合物的产量。虽然通过游离质粒表达突变基因能在一定程度上实现代谢酶活性调控，然而游离质粒表达存在分离不稳定性和结构不稳定性等弊端，从而影响菌株的稳定性。突变基因等位染色体上替换野生型基因有助于构建一个基因稳定的菌株，成功将代谢通量重新导向单萜生物合成。更重要的是，必需基因突变体的等位替换是功能基因组分析的关键。

以ERG20基因为例。ERG20是下游合成细胞成分包括甾醇类、泛醌类、多萜醇等合成代谢通路的必需基因，无法将其敲除，因此其等位基因替换具有一定挑战性。一般情况下，会采用图1的复杂方法：首先，携带表达野生型必需基因的质粒转化进细胞以保证细胞正常生长；其次，通过使用URA3等筛选标记敲除染色体上必需基因；然后，在反向选择胁迫(如在5-FOA反筛剔除URA3)或在CRISPR/Cas9系统协助下，成功引入目标突变基因；最后，携带必需基因或以及导向RNA(gRNA)质粒被丢失。其中涉及的CRISPR/Cas9系统已被广泛应用于真核、原核、模式以及非模式等众多生物体系，并以其较高的编辑效率和精准性正逐步成为目前基因组编辑的常规工具。CRISPR/Cas9系统行使基因编辑功能依赖Cas9蛋白和gRNA。

显然上述传统方法不仅复杂，而且质粒上的野生型必需基因可能通过同源重组引起回复突变。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基因突变表达盒及其应用，利用表达盒中的必需基因、同源臂和筛选标记，能够快速实现目标基因的突变。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面，提出了一种基因突变表达盒，所述基因突变表达盒包括必需基因、同源臂和筛选标记。

可选地，同源臂包括上游同源臂和下游同源臂；

上游同源臂和下游同源臂分别为必需基因两端的同源序列；

筛选标记至少包括筛选标记A和筛选标记B。

可选地，基因突变表达盒还包括必需基因的启动子和终止子；

可选地，基因突变表达盒至少包括三个模块：

模块一包括：上游同源臂和筛选标记A-1；

模块二包括：筛选标记A-2、启动子、必需基因、终止子和筛选标记B-1；

模块三包括：筛选标记B-2和下游同源臂。

筛选标记A-1和筛选标记A-2通过将筛选标记A截断得到，筛选标记A-1和筛选标记A-2之间具有50-1000bp的同源序列；

筛选标记B-1和筛选标记B-2通过将筛选标记B截断得到，筛选标记B-1和筛选标记B-2之间具有50-1000bp的同源序列。

优选地，筛选标记A-1和筛选标记A-2之间具有50-1000bp的同源序列；

优选地，筛选标记B-1和筛选标记B-2之间具有50-1000bp的同源序列。

本发明另一方面，提出了一种菌株基因突变方法，其特征在于，采用上述任一项所述的基因突变表达盒进行基因突变；

所述方法至少包括：

将基因突变表达盒转化进菌株中，通过同源重组，将必需基因与菌株中基因等位替换，获得突变菌株。

可选地，所述方法至少包括：

在菌株中转入Cas9基因，得到携带Cas9基因的菌株；

将基因突变表达盒中同源臂、启动子、必需基因、终止子和筛选标记转入携带Cas9基因的菌株，进行菌株表达，得到突变工程菌株。

可选地，所述方法至少包括删除所述突变工程菌株携带的筛选标记；

优选地，删除所述突变工程菌株携带的筛选标记，具体为：

将gRNA表达质粒和供体DNA分子利用CRISPR/Cas9系统和同源重组删除筛选标记。

具体地，在携带有Cas9基因的突变工程菌株中，转入1个相应的gRNA质粒和2个供体DNA分子，先利用gRNA质粒(携带特异性的20bp序列)成功靶向/定位到两个筛选标记基因处，再通过该gRNA质粒招募Cas9蛋白过来，随后该Cas9蛋白将染色体上的两个筛选标记基因切断(切开一个口成断裂DNA)，最后通过同源重组利用转入的2个相应供体DNA分子对切口进行修复，从而得到了完整的突变菌株，并成功去掉两个筛选标记。

可选地，gRNA表达质粒选自pZYJ质粒、pYSg3质粒、pYSg4质粒中的至少一种。

具体地，以文章(Mans et al.FEMS Yeast Res.,2015,15(2):fov004.)中的质粒pROS10为载体扩增构建获得pZYJ质粒，构建方法可参考该文章。

可选地，pYSg3质粒的获得方法至少包括：

以pZYJ质粒为载体，将载体上的氨苄青霉素抗性基因bla与2μm序列调换位置，得到pYSg3质粒；

可选地，pYSg4质粒的获得方法至少包括：

以pYSg3质粒为载体，将bla抗性基因截成两段，然后将两段基因分别与携带两个不同20bp序列的gRNA表达引物进行扩增，并与线性骨架构建得到pYSg4质粒。

具体地，gRNA表达载体，包含2个gRNA表达盒，且该质粒带有URA3基因和氨苄抗生素抗性基因，具有简单筛选和质粒丢失特性。进一步地，将氨苄抗生素抗性基因(bla)置于两个gRNA表达盒之间，显著提高质粒筛选阳性率。在此基础上，质粒构建过程中通过截断bla基因将携带gRNA表达盒的整合片段分成2段，能高效率构建同时含有2个不同的20bp序列的gRNA表达盒的质粒。

本发明第三个方面，提出了上述基因突变表达盒或菌株基因突变方法的应用，能够应用于体内多片段定点整合等遗传操作。

本发明中“必需基因”为细胞生长所需要的基因，若该基因缺失细胞在标准培养基上不能生长。

本发明的有益效果在于：

(1)利用本发明表达盒进行突变基因的两端筛选标记，具有极高的染色体必需基因突变效率；

(2)本发明能实现快速靶向多个基因并对其进行编辑；

(3)利用本发明表达盒能够快速对染色体进行无痕定点突变，且能够利用CRISPR/Cas9系统对表达盒的两个筛选标记进行无缝剔除。为实现酿酒酵母代谢改造提供了一个方便简洁的基因编辑方法，进一步为酿酒酵母作为细胞工厂奠定基础。

(4)本发明菌株基因突变方法同样能够应用于体内多片段定点整合等遗传操作。

附图说明

图1是以ERG20为例，在染色体上等位突变必需基因的传统方法示意图；

图2是本发明实施例1中一模块表达盒构建及等位突变ERG20基因示意图；

图3是本发明实施例1中采用不同启动子表达ERG20^N127W的转化结果；其中图3A为原启动子ERG20p诱导表达ERG20^N127W的转化平板；图3B为强启动子GAL1p诱导表达ERG20^N127W的转化平板；

图4是本发明实施例1、2中表达盒用于ERG20基因定点突变的整合效率和突变效率比对图；其中图4A为表达盒用于ERG20基因定点单突变(ERG20^N127W)结果，图4B为表达盒用于ERG20基因定点双突变(ERG20^A99W,N127W)结果；

图5是本发明实施例2中三模块表达盒构建及突变ERG20基因示意图；

图6是本发明实施例3中等位突变必需基因CDC19示意图；其中图6A为一模块表达盒构建及其用于CDC19基因定点突变，图6B为三模块表达盒构建及其用于CDC19基因定点突变；

图7是本发明实施例3中突变CDC19基因的整合效率和突变效率；其中图7A为表达盒对单突变CDC19^R91I的结果，图7B为表达盒对单突变CDC19^R369A的结果；

图8是本发明实施例4中Cas9基因在酿酒酵母中的整合表达示意图；其中图8A为Cas9基因表达模块的构建和CRISPR/Cas9系统应用示意图；图8B为CRISPR/Cas9系统剔除KanMX抗性基因的菌落PCR验证和平板验证；

图9是本发明实施例4中gRNA质粒构建示意图；其中图9A为质粒pZYJ的构建示意图，图9B为质粒pYSg3的构建示意图，图9C为质粒pYSg4的构建示意图；

图10是本发明实施例4中三种gRNA质粒构建的情况示意图和效率对比图；其中图10A为pZYJ、pYSg3和pYSg4三个质粒构建时携带两个gRNA表达盒的分布情况；图10B为pZYJ、pYSg3和pYSg4三个质粒的构建效率对比图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的仪器，如无特殊说明，使用时采用的参数均为厂家推荐参数。

实施例1必需基因ERG20两端筛选标记表达盒与突变菌株的构建

如图2一模块表达盒构建所示，主要包括位于染色体ERG20基因两端的同源臂、两个筛选标记HIS3和amdSYM、以及突变基因ERG20*表达盒(包括启动子、突变基因和终止子)，采用融合PCR构建上述表达盒。设计引物并从基因组扩增获得的上述各个基因片段，随后利用来自TaKaRa公司的PrimeStar DNA聚合酶试剂盒和PCR仪器将各个片段经过一轮PCR条件(98℃-10s，55℃-15s，72℃-1min/kbp共15个循环)和二轮PCR条件(98℃-10s，55℃-15s，72℃-1min/kbp共35个循环)融合成一模块表达盒。

以下为一模块表达盒相应序列，包括ERG20上游同源臂(酿酒酵母染色体X：104451-105013序列)、ERG20下游同源臂(酿酒酵母染色体X：106073-106439序列)、HIS3筛选标记(酿酒酵母染色体XV：721745-722851序列)、amdSYM筛选标记(Daniel et al.FEMSYeast Res.,2013,13:126–139.为文献中的pUG-amdSYM质粒从启动子AgTEF1p、基因amds到终止子AgTEF1t的序列共2196bp)、GAL1p启动子(酿酒酵母染色体II：278353-279020序列)、单突变基因ERG20^N127W(或双突变基因ERG20^A99W,N127W)和FBA1t终止子(酿酒酵母染色体XI：c326407-326007序列)。在该模块中同源臂会根据所突变基因变化而变化；而筛选标记在本发明中以HIS3和amdSYM为例，这两个筛选标记同样可以根据出发菌株的不同而变化；启动子主要采用的是强启动子GAL1p，同样该强启动子也可换成其他强启动子；终止子更是有更多选择。

单突变基因ERG20^N127W序列(酿酒酵母染色体X：105014-106072序列)，不同之处在于其中第105392-105394位的碱基序列由AAT突变成TGG；双突变基因ERG20^A99W,N127W序列(酿酒酵母染色体X：105014-106072序列)，不同之处在于其中第105308-105310位的碱基序列和第105392-105394位的碱基序列为预突变位点。

表达盒中突变基因采用半乳糖诱导型强启动子GAL1p诱导表达，两个筛选标记外端再携带相应同源臂。表达盒中之所以采用强启动子GAL1p诱导，是因为文献表明ERG20基因下游产物FPP会合成对细胞生长及其关键的代谢产物(Anderson et al.J Biol Chem.,1989,264(32):19176-19184.)，因此突变基因ERG20^N127W会降低合成FPP的能力，影响细胞生长，从而给野生型基因等位替换带来一定难度。实验表明，表达盒构建时直接用原启动子ERG20p诱导表达ERG20^N127W使得在转化平板上无法长出单菌落(图3A)，由此可看出保持一定的ERG20p酶活力对细胞转化生长至关重要。因此，从转录水平上去提高ERG20p酶的表达量，即采用强启动子GAL1p在20g/L半乳糖条件下诱导表达能维持细胞的正常生长，成功获得正确的单菌落(图3B)。利用强启动子诱导表达突变基因能够从表达水平上去补偿酶活性降低导致的细胞生长不利情况。而GAL1p启动子会在后续CRISPR/Cas9系统被去除，从而实现必需基因的无痕等位替换。如图2去除筛选标记的步骤，在获得正确突变菌株前提下，设计合适供体DNA分子(两个供体DNA分子，第1个：包括ERG20上游部分同源臂序列+E-1(酿酒酵母染色体X：104815-105227序列)，；第2个：E-2+ERG20下游部分同源臂序列(酿酒酵母染色体X：105834-106288序列)，)并在CRISPR/Cas9系统帮助下同时去除两个筛选标记和GAL1p启动子。两个供体DNA分子只需要通过PCR扩增便能获得，供体DNA分子序列同样也是根据一模块里表达盒突变基因的变化而变化。

基于Euroscarf(Oberursel,Germany)公司的CEN.PK113-11C菌株(MATa MAL2-8cSUC2 his3Δ1ura3-52)转入携带KanMX抗性基因和Cas9基因表达盒DNA片段后构建获得的SY01菌株(MATa MAL2-8c SUC2 his3Δ1ura3-52 X1-5::KanMX+(TEF1p-Cas9))。随后利用该Cas9蛋白删除KanMX抗性基因表达盒获得SY02菌株(MATa MAL2-8c SUC2 his3Δ1ura3-52X1-5::TEF1p-Cas9)。成功构建一模块表达盒后，将其转化进携带Cas9基因的SY02菌株，根据同源重组和营养缺陷性筛选，在特殊培养基SM(3g/L磷酸二氢钾，0.5g/L七水硫酸镁，6.6g/L硫酸钾，20g/L半乳糖，2mL/L微量金属元素溶液和1mL/L维生素溶液)、0.6g/L乙酰胺和0.06g/L氨基酸尿嘧啶(URA)条件下，成功获得约几十个转化子。微量金属元素溶液和维生素溶液配方见文献(Verduyn et al.Yeast,1992,8(7):501-517.)。在这几十个转化子中挑取8～10转化子做菌落PCR验证，具体验证过程如下：以这些转化子基因组为模板采用南京诺唯赞公司的2×Taq Master Mix试剂盒在98℃-30s，55℃-30s，72℃-1min/kbp共35个循环的PCR条件下，用引物ERG20-YZ-1(酿酒酵母染色体X：104156-104180序列)和YZ-2(酿酒酵母染色体XV：722360-722379的反向序列)扩增获得1493bp目的片段，以及用引物YZ-3(Daniel et al.FEMS Yeast Res.,2013,13:126–139.为文献中的pUG-amdSYM质粒中amds基因序列从592bp到616bp)和ERG20-YZ-4(酿酒酵母染色体X：106731-106758的反向序列)扩增获得1943bp目的片段。

只要通过PCR扩增获得上述两个目的片段就说明一模块表达盒整合成功，在此验证正确的基础上将转化菌株的ERG20*基因PCR扩增产物进行测序验证是否突变成功。测序验证，先以上述菌落验证正确的转化子基因组为模板以引物ERG20-F(酿酒酵母染色体X：105014-105045序列)和ERG20-R(酿酒酵母染色体X：106037-106072的反向序列)在上述PCR条件下扩增ERG20*片段序列，将该片段序列送去测序，测序引物为ERG20-1-R(酿酒酵母染色体X：105653-105670的反向序列)。

从图4A一模块的突变效率可看出，ERG20^N127W的突变效率能高达96％，由此可见两端筛选标记策略获得的突变效率极高。此外本发明还举了一个例子的测序结果，如下：

一模块表达盒(ERG20^N127W)的测序结果见序列见SEQ ID NO.1，其中第246-248位为突变的碱基序列。为了证明该策略更广泛的应用，比如也能进行必需基因的双突变，将表达盒中的突变基因ERG20^N127W替换成ERG20^A99W,N127W，同样对表达盒进行转化，验证其突变效率高达93％(图4B)。因此该策略不仅能适用于必需基因的单突变也能适用于双突变。

一模块表达盒(ERG20^A99W,N127W)的测序结果见序列见SEQ ID NO.2，其中第245-247位和第329-331位为突变的碱基序列。

实施例2优化两端筛选标记表达盒促进必需基因ERG20整合效率和突变效率

上述一模块表达盒策略中，得到的转化子数量极少。比如，对于单突变ERG20^N127W菌株而言，仅得到13个转化子；而双突变ERG20^A99W,N127W对ERG20p酶活影响更大，仅得到11个转化子。除低酶活性外，一模块表达盒DNA偏度长度高达6469bp，造成转化效率低下。为了进一步增加表达盒整合效率，我们将一模块表达盒拆分成三个较短的表达盒模块。具体拆分方式如下，将两个筛选标记基因各截成两部分序列，为HIS3-1(酿酒酵母染色体XV：721745-722338序列，其中，第722110-722338位序列为同源序列)和HIS3-2(酿酒酵母染色体XV：722110-722851序列，其中，第722110-722338位序列为同源序列)或amdSYM-1(Daniel etal.FEMS Yeast Res.,2013,13:126–139.为文献中的pUG-amdSYM质粒从启动子AgTEF1p到基因amds前半序列共1249bp，其中从第982-1249位为同源序列)和amdSYM-2(Daniel etal.FEMS Yeast Res.,2013,13:126–139.为文献中的pUG-amdSYM质粒从基因amds后半序列到终止子AgTEF1t共1215bp，其中从第1-268位为开始为同源序列)，截断要求只需HIS3-1和HIS3-2，序列之间存在200bp左右的同源序列，同样amdSYM-1和amdSYM-2也需满足两者存在200bp左右的同源序列。上游同源臂和HIS3-1构成三模块中的第一模块，HIS3-2和启动子、突变基因、终止子以及amdSYM-1构成第二模块，amdSYM-2和下游同源臂构成第三模块(如图5所示)。

将这三模块同时转到菌株中，成功获得了单突变菌株或双突变菌株。三模块表达盒策略降低了表达盒长度，便于其转化进细胞中，显著地提高了整合效率。单突变ERG20^N127W或双突变ERG20^A99W,N127W整合效率分别提高了3.0倍或3.7倍(如图4所示)。同时，该三模块策略还能提高单突变或双突变效率，使其达到了100％。同样，还分别列举了三模块表达盒的测序结果，测序方法与实施例1中相同，测序结果如下：

三模块表达盒(ERG20 ^N127W)的测序结果见SEQ ID NO.3，其中第248-250位为突变的碱基序列。

三模块表达盒(ERG20^A99W,N127W)的测序结果见SEQ ID NO.4，其中第245-247位和第329-331位为突变的碱基序列。

实施例3两端筛选标记策略应用于其他必需基因

为证明该方法的通用性，我们进一步将两端筛选标记策略实施在其他必需基因如PYK1基因(编码丙酮酸激酶1，也称为CDC19)。同样，我们尝试构建两个单突变CDC19^R91I或CDC19^R369A基因的一模块和三模块表达盒。

如图6所示，无论是一模块或三模块，构建表达盒的方式和上述构建ERG20*突变基因表达盒方式一样，都是由同源臂、筛选基因、启动子、突变基因和终止子构成，只需将上下游同源臂换成野生型CDC19基因的两端同源臂，及将突变基因换成CDC19^R91I和CDC19^R369A。筛选基因、启动子和终止子序列前文已经给出(HIS3筛选标记在酿酒酵母染色体XV：721745-722851序列；amdSYM筛选标记在Daniel et al.FEMS Yeast Res.,2013,13:126–139文献中的pUG-amdSYM质粒从启动子AgTEF1p、基因amds到终止子AgTEF1t的序列共2196bp；GAL1p启动子在酿酒酵母染色体II：278353-279020序列；FBA1t终止子在酿酒酵母染色体XI：c326407-326007序列))，CDC19上游同源臂序列见(酿酒酵母染色体I：71399-71785序列)，CDC19下游同源臂序列见(酿酒酵母染色体I：73289-73608序列)，突变基因CDC19^R91I序列(酿酒酵母染色体I：71786-73288序列)，不同之处在于其中第72056-72058位的碱基序列由AGA突变成ATA)，CDC19^R369A序列(酿酒酵母染色体I：71786-73288序列)，不同之处在于其中第72890-72892位的碱基序列由AGA突变成GCA)。

在成功构建好表达盒后将其转化进SY02菌株中，在与实施例1相同的实验条件下，通过SM+乙酰胺+尿嘧啶培养基筛选获得正确的菌株。结果如图7所示，与上述突变ERG20基因的结果相似，同样采用三模块表达盒能显著提高整合效率，相比于一模块表达盒，无论是CDC19^R91I突变或CDC19^R369A突变都分别提高了3.7倍和3.8倍。同样，三模块表达盒对CDC19^R91I和CDC19^R369A的突变效率都有显著提高，分别达到了93％和85％。测序结果如下，同样也是相应举一个例子。这个拓展实施例表明两端筛选标记策略可以广泛应用于必需基因的高效突变。

一模块表达盒(CDC19^R91I)的测序结果见SEQ ID NO.5，其中第240-242位为突变的碱基序列。

三模块表达盒(CDC19^R91I)的测序结果见序列SEQ ID NO.6，其中第243-245位为突变的碱基序列。

一模块表达盒(CDC19^R369A)的测序结果见序列SEQ ID NO.7，其中第365-367位为突变的碱基序列。

三模块表达盒(CDC19^R369A)的测序结果见序列SEQ ID NO.8，其中第363-365位为突变的碱基序列。

实施例4CRISPR/Cas9系统构建及应用

(1)CAS9基因的整合表达

为了能同时无缝提出两个筛选标记，我们须借助于高效切割双链DNA序列的CRISPR/Cas9系统。为了Cas9稳定表达要，将Cas9基因整合到染色体上。前人研究工作已成功获得了在酿酒酵母中稳定表达的Cas9表达盒，并位于质粒pECAS9-gRNA-KanMX-tHFD1中(Zhu et al.Metab Eng.,2017,44:81-88.)，因此我们以该质粒为扩增模板将Cas9基因表达盒连同卡那霉素抗性基因KanMX表达盒(用于筛选转化子)整个序列通过PCR扩增获得，扩增引物为Cas9-kanMX-F(SEQ ID NO.9)和Cas9-kanMX-R(SEQ ID NO.10)。

同时还以酿酒酵母菌株基因组为模板扩增出XI-5位点的上游同源臂和下游同源臂，将这两个同源臂与上述Cas9-KanMX表达盒通过融合PCR构建成一个表达片段，融合过程同上。如图8A所示，将上述表达片段通过化学转化并涂布在筛选培养基为SD(6.7g/L酵母基础氮源培养基(YNB)和20g/L葡萄糖)+200mg/L卡那霉素+0.02g/L氨基酸尿嘧啶(URA)+0.02g/L氨基酸组氨酸(HIS)，利用卡那霉素抗性筛选整合酿酒酵母CEN.PK113-11C(MATaSUC2 MAL2-8c his3Δ1ura3-52)的XI-5位点上，获得正确的SY01菌株(MATa MAL2-8c SUC2his3Δ1 ura3-52 X1-5::KanMX+(TEF1p-Cas9))，菌落PCR验证菌株正确(如图8B所示)。菌落PCR验证过程同实施例1，不同之处则是采用验证引物X1-5-JDF(酿酒酵母染色体XI：117716-117735序列)和JDF-R(SEQ ID NO.11)获得1782bp目的片段，以及JDF-F(SEQ IDNO.12)和X1-5-JDR(酿酒酵母染色体XI：119062-119080的反向序列)获得1076bp目的片段。

在菌落PCR验证正确的基础上，构建了靶向抗性基因KanMX的gRNA质粒，该质粒的构建方法如文献(Mans et al.FEMS Yeast Res.,2015,15(2):fov004.)所述，同样以文献中的pROS10质粒为模板扩增获得的表达模块片段和以6005引物：GATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAG扩增的骨架片段一起构建质粒，随后将这两个片段通过南京诺唯赞公司的一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)进行体外组装，并转入大肠杆菌DH5α(lacZΔM15,recA1)通过氨苄抗性压力筛选成功构建了质粒。不同之处则是表达模块所用的引物不同，该实施例中携带的为靶向到抗性基因KanMX的特异性20bp序列，引物gRNA-kanMX-1L序列见SEQ ID NO.13(其中第51-70位为20bp序列)，gRNA-kanMX-2L序列见SEQ ID NO.14(其中第51-70位为20bp序列)。

构建好上述质粒后，设计供体DNA分子，如图8A所示，供体DNA分子主要是将Cas9-KanMX表达盒中的Cas9基因表达盒以及XI-5up上游同源臂通过融合PCR获得的。获得供体DNA分子后与质粒一起转化到SY01

菌株菌株中，通过CRISPR/Cas9系统作用和同源重组不仅成功将去除KanMX基因，同时还验证了CRISPR/Cas9系统的实用性，如图8B平板验证结果，表明gRNA质粒已经成功转入SY01菌株并且卡那霉素抗性已经丢掉。最终我们将gRNA质粒进行丢失，成功获得在染色体上稳定表达Cas9基因的SY02菌株。

因此，本发明以组成型启动子(TEF1p)表达Cas9蛋白，并以同源重组的方式整合至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XI-5位点，获得了整合型表达CAS9基因的酿酒酵母工程菌株。

Cas9-KanMX表达盒序列见(Zhu et al.Metab Eng.,2017,44:81-88.文献中的pECAS9-gRNA-KanMX-tHFD1质粒中的从KanMX筛选标记、TEF1p启动子、CAS9基因到CYC1t终止子共6471bp序列，其中第1622-6471位为Cas9基因表达盒序列)XI-5up上游同源臂序列见(酿酒酵母染色体XI：117779-118441序列)，XI-5up下游同源臂序列见(酿酒酵母染色体XI：118447-118957序列)。

(2)优化gRNA质粒

gRNA表达采用文献报道的骨架质粒pROS10(Mans et al.FEMS Yeast Res.,2015,15(2):fov004.)，该质粒中两个gRNA表达盒以背靠背形式分布在2μm序列两端(结构如图9A的质粒pZYJ)，该质粒的构建方式同上述靶向到KanMX基因表达盒质粒构建方式一样，不同之处仍然是20bp序列，引物gRNA-amdSYM-1L(SEQ ID NO.15)，其中第51-70位为20bp序列)；gRNA-amdSYM-2L(SEQ ID NO.16)，其中第51-70位为20bp序列。

通过这两个序列成功获得携带2个特异性靶向基因的表达模块，表达模块携带2个gRNA表达盒，表达盒序列如下，其中加粗标记序列即为上述的引物序列，而N₂₀表示的即为根据靶向基因不同而变化的20bp序列。比如质粒pZYJ的gRNA表达盒1的序列见下列gRNA表达盒1序列，其中加粗斜体N₂₀为引物gRNA-amdSYM-1L(SEQ ID NO.15)中特异性20bp序列：TGCTGACTTGGTTTCTAAGT，gRNA表达盒2的序列见下列gRNA表达盒2序列，其中加粗斜体N₂₀为引物为引物gRNA-amdSYM-2L(SEQ ID NO.16)中特异性20bp序列：CGTCAATCGTATGTGAATGC。该构建策略仅仅获得了40％的阳性质粒，且同时含有两个不同gRNA的质粒仅有10％(图10B质粒pZYJ)。原因是因为用于筛选的bla抗性基因位于线性骨架上，导致线性骨架自身更容易环化成质粒，没有筛选压力获得正确gRNA表达质粒。

gRNA表达盒1序列：

TCTTTGAAAAGATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGGTGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCATTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGCATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCN₂₀GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGGTGCTTTTTTTGTTTTTTATGTCTTCGAGTCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACGTTCACGCCCTCCGAgRNA表达盒2序列：

TCGGAGGGCGTGAACGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGACTCGAAGACATAAAAAACAAAAAAAGCACCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACN₂₀GATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAGTTTCGAACGCCGAAACATGCGCACCAACTTTCACTTCTACAGCGTTTGACCAAAATCTTTTGAACAGAACATTGTAGGGTGTGAAAAAATGCGCACCTTTACCGCTAGCCCAAGAGGGCACTACAAAATCTAGAGTTGTACTTCAAACGTACATGTAATCACCTTGTATATACTCGAAAGAAAACATCAAGTTTCTGTATAAATATGAGTGAAAGCATAATCATACATTATCTTTTCAAAGA

因此，我们将bla抗性基因表达盒与2μm序列位置调换(如图9B)：将bla抗性基因整合到表达模块中，使得抗性筛选压力的基因位于表达模块中，因此表达模块的序列如下，加粗标记的序列即为调换位置的bla抗性基因表达盒序列。在实现上述基因位置交换后，采用引物gRNA-His3-1L(SEQ ID NO.17，其中第51-70位为20bp序列)和gRNA-amdSYM-1L根据上述构建质粒方式扩增gRNA表达盒获得了pYSg3质粒。

该策略成功高效获得能同时表达gRNA的质粒pYSg3假阳性率由原来pZYJ质粒的60％降低到20％(图10B)。20％失败归因于：P4和P6引物在扩增时，由于长达20bp序列与扩增模板不同，扩增过程中容易退火温度设置不当而引起错配。

然而，pYSg3策略中能同时包含两种不同的gRNA表达盒的比例仍仅为22.5％。分析原因因为扩增引物的互补序列存在相同序列，会造成PCR过程中引物与模板随机结合，从而会产生4种gRNA组合：g1+g2、g2+g1、g1+g1和g2+g2(图10B)。

为了提高质粒中两个gRNA表达盒的特异性整合，我们采用互补引物P10(SEQ IDNO.18)和P11(SEQ ID NO.19)将下述表达模块分别分成2个序列去扩增获得，如下下划线标记加粗的序列将bla抗性基因截成长度分别为577bp和634bp的两段序列，即将表达模块分成模块1和模块2(图9C，pYSg4)。

pYSg4的构建方式如上述gRNA构建方式一样，唯一的不同之处就是在构建该质粒时原本为一段序列的表达模块被分成了2段，即分别采用引物gRNA-His3-1L和P10扩增获得携带gRNA表达盒的模块1，P11和gRNA-amdSYM-1L扩增获得携带gRNA表达盒的模块2。仅仅两个模块正确重组才能形成完成的bla表达模块，从而在转化大肠杆菌中获得氨苄青霉素抗性，大肠杆菌才能在带有氨苄青霉素的平板上生长。该策略显著提高了质粒pYSg4中的gRNA整合特异性，同时存在两个gRNA表达盒的构建效率达到了87.5％，效率为质粒pYSg3的3.9倍(图10B)。

pYSg4表达模块的序列(字体下划线标记为bla抗性基因表达盒，下划线中的加粗字体标记即为截断的P10和P11序列，加粗标记为携带20bp特异性序列的2个RNA表达盒扩增引物序列，N₂₀为变化的20bp序列)：

具体地，本申请实施例中pYSg4表达模块中第一个N₂₀为引物gRNA-His3-1L(SEQ IDNO.17)中特异性的20bp序列：ATTGCGATCTCTTTAAAGGG；第二个N₂₀为引物gRNA-amdSYM-1L(SEQ ID NO.15)中特异性的20bp序列：TGCTGACTTGGTTTCTAAGT。

最后，我们以携带ERG20^N127W的突变菌株为例，将供体DNA分子和构建的靶向到HIS3和amdSYM的gRNA质粒一起转入上述突变菌株中，成功去掉两个筛选标记，其效率达到了100％，说明该质粒能用于同时对两个基因进行高效编辑。

具体过程为：

在携带有Cas9基因的突变菌株中，转入1个相应的gRNA质粒和2个供体DNA分子，先利用gRNA质粒(携带特异性的20bp序列)成功靶向/定位到两个筛选标记基因处，再通过该gRNA质粒招募Cas9蛋白过来，随后该Cas9蛋白将染色体上的两个筛选标记基因切断(切开一个口成断裂DNA)，最后通过同源重组利用转入的2个相应供体DNA分子对切口进行修复，从而得到了完整的突变菌株，并成功去掉两个筛选标记。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种基因突变表达盒及其应用

<130> 2020

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 627

<212> DNA

<213> ERG20N127W

<400> 1

cccatgcgaa gggcagtaga agaatagtaa gcagtcttga aagtaactat gaaggagtgc 60

ttctttaggg agaacttact caagtcgact ttgtcttcag gtgcagtgat taagtccatc 120

aattggccca attcggtttg gaaggtgact tcatggaaca attcggtgat atctatgtag 180

tatttttcgt ttctgaagtg agatttcaaa agcttgtaga tagcagcctc taacatgaat 240

gcgtcccaga tggcaatttc cccaacttca ggaaccttgt accaacatgg ttggcctctt 300

ctggtaatgg acttgtccat catatcatcg gcgaccaaga agtaagcctg caacaactca 360

atgcaccaac ctagaatagc aaccttttcg tattcttctt gccccaattg ttcaacggtc 420

ttgttggaga gaatagcata cgtgtccaca acggacaaac ctctatttaa cttaccgcct 480

ggagtgttgt agttcaatga gtgggcatac cagtcacatg cttccttagg cataccgtaa 540

gccaaaagcg atgcgttcaa ttcctctact aatttaggga aaacgttcaa gaatctctct 600

ctcctaattt cttttttgaa agcccat 627

<210> 2

<211> 627

<212> DNA

<213> ERG20A99W, N127W

<400> 2

ggtacatgcg aggcagtaga tgatagtaag cagtcttgaa agtaactatg aaggagtgct 60

tctttaggga gaacttactc aagtcgactt tgtcttcagg tgcagtgatt aagtccatca 120

attggcccaa ttcggtttgg aaggtgactt catggaacaa ttcggtgata tctatgtagt 180

atttttcgtt tctgaagtga gatttcaaaa gcttgtagat agcagcctct aacatgaatg 240

cgtcccagat ggcaatttcc ccaacttcag gaaccttgta ccaacatggt tggcctcttc 300

tggtaatgga cttgtccatc atatcatccc agaccaagaa gtaagcctgc aacaactcaa 360

tgcaccaacc tagaatagca accttttcgt attcttcttg ccccaattgt tcaacggtct 420

tgttggagag aatagcatac gtgtccacaa cggacaaacc tctatttaac ttaccgcctg 480

gagtgttgta gttcaatgag tgggcatacc agtcacatgc ttccttaggc ataccgtaag 540

ccaaaagcga tgcgttcaat tcctctacta atttagggaa aacgttcaag aatctctctc 600

tcctaatttc ttttttggga agccata 627

<210> 3

<211> 630

<212> DNA

<213> ERG20N127W

<400> 3

taatgcggac ggggcaagta gaaagatagt aagcagtctt gaaagtaact atgaaggagt 60

gcttctttag ggagaactta ctcaagtcga ctttgtcttc aggtgcagtg attaagtcca 120

tcaattggcc caattcggtt tggaaggtga cttcatggaa caattcggtg atatctatgt 180

agtatttttc gtttctgaag tgagatttca aaagcttgta gatagcagcc tctaacatga 240

atgcgtccca gatggcaatt tccccaactt caggaacctt gtaccaacat ggttggcctc 300

ttctggtaat ggacttgtcc atcatatcat cggcgaccaa gaagtaagcc tgcaacaact 360

caatgcacca acctagaata gcaacctttt cgtattcttc ttgccccaat tgttcaacgg 420

tcttgttgga gagaatagca tacgtgtcca caacggacaa acctctattt aacttaccgc 480

ctggagtgtt gtagttcaat gagtgggcat accagtcaca tgcttcctta ggcataccgt 540

aagccaaaag cgatgcgttc aattcctcta ctaatttagg gaaaacgttc aagaatctct 600

ctctcctaat ttctttttct ggaagccata 630

<210> 4

<211> 627

<212> DNA

<213> ERG20A99W, N127W

<400> 4

agggcgaggg caggtaggaa gaatagtaag cagtcttgaa agtaactatg aaggagtgct 60

tctttaggga gaacttactc aagtcgactt tgtcttcagg tgcagtgatt aagtccatca 120

attggcccaa ttcggtttgg aaggtgactt catggaacaa ttcggtgata tctatgtagt 180

atttttcgtt tctgaagtga gatttcaaaa gcttgtagat agcagcctct aacatgaatg 240

cgtcccagat ggcaatttcc ccaacttcag gaaccttgta ccaacatggt tggcctcttc 300

tggtaatgga cttgtccatc atatcatccc agaccaagaa gtaagcctgc aacaactcaa 360

tgcaccaacc tagaatagca accttttcgt attcttcttg ccccaattgt tcaacggtct 420

tgttggagag aatagcatac gtgtccacaa cggacaaacc tctatttaac ttaccgcctg 480

gagtgttgta gttcaatgag tgggcatacc agtcacatgc ttccttaggc ataccgtaag 540

ccaaaagcga tgcgttcaat tcctctacta atttagggaa aacgttcaag aatctctctc 600

tcctaatttc ttttttggaa gccatga 627

<210> 5

<211> 1129

<212> DNA

<213> CDC19R91I

<400> 5

aacggttgtt gctggttctg acttgagaga cctccatcat tggtaccatc ggtccaaaga 60

ccaacaaccc agaaaccttg gttgctttga gaaaggctgg tttgaacatt gtccgtatga 120

acttctctca cggttcttac gaataccaca agtctgtcat tgacaacgcc agaaagtccg 180

aagaattgta cccaggtaga ccattggcca ttgctttgga caccaagggt ccagaaatca 240

taactggtac caccaccaac gatgttgact acccaatccc accaaaccac gaaatgatct 300

tcaccaccga tgacaagtac gctaaggctt gtgacgacaa gatcatgtac gttgactaca 360

agaacatcac caaggtcatc tccgctggta gaatcatcta cgttgatgat ggtgttttgt 420

ctttccaagt tttggaagtc gttgacgaca agactttgaa ggtcaaggct ttgaacgccg 480

gtaagatctg ttcccacaag ggtgtcaact taccaggtac cgatgtcgat ttgccagctt 540

tgtctgaaaa ggacaaggaa gatttgagat tcggtgtcaa gaacggtgtc cacatggtct 600

tcgcttcttt catcagaacc gccaacgatg ttttgaccat cagagaagtc ttgggtgaac 660

aaggtaagga cgtcaagatc attgtcaaga ttgaaaacca acaaggtgtt aacaacttcg 720

acgaaatctt gaaggtcact gacggtgtta tggttgccag aggtgacttg ggtattgaaa 780

tcccagcccc agaagtcttg gctgtccaaa agaaattgat tgctaagtct aacttggctg 840

gtaagccagt tatctgtgct acccaaatgt tggaatccat gacttacaac ccaagaccaa 900

ccagagctga agtttccgat gtcggtaacg ctatcttgga tggtgctgac tgtgttatgt 960

tgtctggtga aaccgccaag ggtaactacc caatcaacgc cgttaccact atggctgaaa 1020

ccgctgtcat tgctgacagc tatcgcttac ttgcaaacta cgatgacatg agaaactgta 1080

ctcaaagcac tcacacgaaa ccgtcgctgc ctccgctgtc gctgctgat 1129

<210> 6

<211> 1114

<212> DNA

<213> CDC19R91I

<400> 6

tacgtttgtt tgctggtttc tgacttgaga agacctccat cattggtacc atcggtccaa 60

agaccaacaa cccagaaacc ttggttgctt tgagaaaggc tggtttgaac attgtccgta 120

tgaacttctc tcacggttct tacgaatacc acaagtctgt cattgacaac gccagaaagt 180

ccgaagaatt gtacccaggt agaccattgg ccattgcttt ggacaccaag ggtccagaaa 240

tcataactgg taccaccacc aacgatgttg actacccaat cccaccaaac cacgaaatga 300

tcttcaccac cgatgacaag tacgctaagg cttgtgacga caagatcatg tacgttgact 360

acaagaacat caccaaggtc atctccgctg gtagaatcat ctacgttgat gatggtgttt 420

tgtctttcca agttttggaa gtcgttgacg acaagacttt gaaggtcaag gctttgaacg 480

ccggtaagat ctgttcccac aagggtgtca acttaccagg taccgatgtc gatttgccag 540

ctttgtctga aaaggacaag gaagatttga gattcggtgt caagaacggt gtccacatgg 600

tcttcgcttc tttcatcaga accgccaacg atgttttgac catcagagaa gtcttgggtg 660

aacaaggtaa ggacgtcaag atcattgtca agattgaaaa ccaacaaggt gttaacaact 720

tcgacgaaat cttgaaggtc actgacggtg ttatggttgc cagaggtgac ttgggtattg 780

aaatcccagc cccagaagtc ttggctgtcc aaaagaaatt gattgctaag tctaacttgg 840

ctggtaagcc agttatctgt gctacccaga tgttggaatc catgacttac aacccaagac 900

caaccagagc tgaagtttcc gatgtcggta acgctatctt ggatggtgct gactgtgtta 960

tgttgtctgg tgaaaccggc gaggggtaac tacccaatca acgccgtacc actatggctg 1020

aaaccgctgt catggctgac agctatcgct tacttgccaa actacgatga catgaaaact 1080

gtactccaaa ggcgagcctc caccaacgaa agcg 1114

<210> 7

<211> 1100

<212> DNA

<213> CDC19R369A

<400> 7

aggggaagca cgggcttgaa ccttggatgg aaacgtaagt gtcacccttc ttcaagatac 60

cgaattcctt agccttttca ataccgaagt tgatacgggc ttcaacatca tcagtccagt 120

cagagacagg ttccttttcg aaaacgaatg ggaagacacc tctgtacaag tgagagaatc 180

tagcagctct tgggcatctg gtaaccaaga tgattggaca gtttggtctg tacttggaaa 240

ccaatcttgg ggtggtaccg gaagtggaca agacaatgat agccttggcc ttttgttcga 300

aaacagcagc gacagcggag gcagcgacgg tttcggtggt ggaggttggc tttggagtac 360

agtttgccat gtcatcgtag tttggcaagt aagcgatagc ttgttcagca atgacagcgg 420

tttcagccat agtggtaacg gcgttgattg ggtagttacc cttggcggtt tcaccagaca 480

acataacaca gtcagcacca tccaagatag cgttaccgac atcggaaact tcagctctgg 540

ttggtcttgg gttgtaagtc atggattcca acatttgggt agcacagata actggcttac 600

cagccaagtt agacttagca atcaatttct tttggacagc caagacttct ggggctggga 660

tttcaatacc caagtcacct ctggcaacca taacaccgtc agtgaccttc aagatttcgt 720

cgaagttgtt aacaccttgt tggttttcaa tcttgacaat gatcttgacg tccttacctt 780

gttcacccaa gacttctctg atggtcaaaa acatcgttgg cggttctgat gaaagaagcg 840

aagaccatgt ggacaccgtt cttgacaccg aatctcaaat cttccttgtc cttttcagac 900

aaagctggca aatcgacatc ggtacctggt aagttgacac cccttgtggg aacagatctt 960

accggcgttc aaaggccttg accttcaaag tccttgtcgt cacgacttcc aagactagga 1020

aggacaaaac accatcatca cgtagatgat tctacagcgg agatgacctt gggtgatgtt 1080

ctttgtagtc acgtacatga 1100

<210> 8

<211> 1184

<212> DNA

<213> CDC19R369A

<400> 8

cgggaagtac ggtcatgaac ttggatggaa acgtaagtgt cacccttctt caagataccg 60

aattccttag ccttttcaat accgaagttg atacgggctt caacatcatc agtccagtca 120

gagacaggtt ccttttcgaa aacgaatggg aagacacctc tgtacaagtg agagaatcta 180

gcagctcttg ggcatctggt aaccaagatg attggacagt ttggtctgta cttggaaacc 240

aatcttgggg tggtaccgga agtggacaag acaatgatag ccttggcctt ttgttcgaaa 300

acagcagcga cagcggaggc agcgacggtt tcggtggtgg aggttggctt tggagtacag 360

tttgccatgt catcgtagtt tggcaagtaa gcgatagctt gttcagcaat gacagcggtt 420

tcagccatag tggtaacggc gttgattggg tagttaccct tggcggtttc accagacaac 480

ataacacagt cagcaccatc caagatagcg ttaccgacat cggaaacttc agctctggtt 540

ggtcttgggt tgtaagtcat ggattccaac atttgggtag cacagataac tggcttacca 600

gccaagttag acttagcaat caatttcttt tggacagcca agacttctgg ggctgggatt 660

tcaataccca agtcacctct ggcaaccata acaccgtcag tgaccttcaa gatttcgtcg 720

aagttgttag caccttgttg gttttcaatc ttgacaatga tcttgacgtc cttaccttgg 780

gcacccaaga cttctctgat gggtcgaaac gtcgttggcg gttctgatga aagaagcgaa 840

gaccatggtg gacgccggtc ttggacacgc ggatctcaaa gtgtgtcctt gtcctttttc 900

agacgaaggg tgggcggatc ggacgagcgg gtgacctggt agtggtgagg gcggcggtgt 960

gggagacggg atgcttacgg agggttgcaa agccggggag cgtgggcaat gcgtggggcg 1020

gccgcctacg ttcgacggac gtgtggaagg gaggaagcga cgatcgatca acgtgaggat 1080

gagtgcatgc gcaggcgtaa atcacggatg gggtggtggt catgaggccc gaggatacgg 1140

actggagtgt ggggggagga gcctctgagg gaggaggtag gagg 1184

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> Cas9-kanMX-F

<400> 9

ccataaactc cgtgcaccag gttcctgtgt tagctcgaga gtggatctga tatcaccta 59

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> Cas9-kanMX-R

<400> 10

gtcaaatcga aggctaagtt ggtacccgag gtacgcaaat taaagccttc gagc 54

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> JDF-R

<400> 11

gggcaatcag gtgcgacaat c 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> JDF-F

<400> 12

cgacaccacc atagacagaa ag 22

<210> 13

<211> 103

<212> DNA

<213> gRNA-kanMX-1L

<400> 13

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc tctttccaga 60

cttgttcaac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aag 103

<210> 14

<211> 103

<212> DNA

<213> gRNA-kanMX-2L

<400> 14

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc tacccatggt 60

tgtttatgtt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aag 103

<210> 15

<211> 103

<212> DNA

<213> gRNA-amdSYM-1L

<400> 15

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc tgctgacttg 60

gtttctaagt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aag 103

<210> 16

<211> 103

<212> DNA

<213> gRNA-amdSYM-2L

<400> 16

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc cgtcaatcgt 60

atgtgaatgc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aag 103

<210> 17

<211> 103

<212> DNA

<213> gRNA-His3-1L

<400> 17

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc attgcgatct 60

ctttaaaggg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aag 103

<210> 18

<211> 59

<212> DNA

<213> P10

<400> 18

gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatc 59

<210> 19

<211> 59

<212> DNA

<213> P11

<400> 19

gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgc 59

Claims (2)

1.一种菌株基因突变方法，其特征在于，采用基因突变表达盒进行基因突变；

所述基因突变表达盒包括必需基因、同源臂和筛选标记；

所述同源臂包括上游同源臂和下游同源臂；

所述上游同源臂和下游同源臂分别为所述必需基因两端的同源序列；

所述筛选标记至少包括筛选标记A和筛选标记B；

所述基因突变表达盒至少包括三个模块：

模块一包括：上游同源臂和筛选标记A-1；

模块二包括：筛选标记A-2、启动子、必需基因、终止子和筛选标记B-1；

模块三包括：筛选标记B-2和下游同源臂；

所述筛选标记A-1和所述筛选标记A-2通过将所述筛选标记A截断得到，所述筛选标记A-1和所述筛选标记A-2之间具有50-1000 bp的同源序列；

所述筛选标记B-1和所述筛选标记B-2通过将所述筛选标记B截断得到，所述筛选标记B-1和所述筛选标记B-2之间具有50-1000 bp的同源序列；

所述方法至少包括：

在酿酒酵母菌株中转入Cas9基因，得到携带Cas9基因的菌株；

将所述基因突变表达盒转入携带Cas9基因的菌株，进行菌株表达，得到突变工程菌株；

所述方法还包括删除所述突变工程菌株携带的筛选标记，具体为：

转入gRNA表达质粒，利用所述Cas9基因和所述gRNA表达质粒组成的CRISPR/Cas9系统和同源重组删除筛选标记。

2.权利要求1所述的菌株基因突变方法的应用，其特征在于，用于酿酒酵母体内多片段定点整合。

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