CN113150994A - 一种用于烈性噬菌体的低温保藏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于烈性噬菌体的低温保藏方法，属于病原菌种保藏技术领域。包括如下步骤：将烈性噬菌体的悬液与保藏液混合均匀后，在‑196℃～4℃下进行保藏，其中，保藏液包括培养基以及低温保护剂，培养基为液体LB培养基或液体SM培养基，低温保护剂为甘油或二甲基亚砜。因为在液体LB培养基或液体SM培养基上添加甘油或二甲基亚砜，从而形成复配后的保存液，并在不同温度下进行保藏，所以延长了噬菌体的保藏时间，提高了噬菌体的存活率和活性。
Description
技术领域
本发明涉及病原菌种保藏技术领域，具体涉及一种用于烈性噬菌体的低温保藏方法。
背景技术
随着分子生物学的发展，作为重要生物资源，微生物病原菌种保藏技术的价值逐渐得到人们的关注。相对于容易污染微生物的传代法和容易失活的干燥法，低温保藏作为一种便宜、简单、省时的方法，已广泛应用于微生物的保藏中。但关于只含有一种核酸和蛋白质外壳的结构简单的非细胞结构生物体——病毒，低温保藏的现有研究较少且不深入，尤其对于噬菌体研究更少。
一般噬菌体在4℃冰箱保藏，但不能长期，需要半年传代增殖一次；-20℃作为冰晶快速生长区间温度，噬菌体长期保藏和日常检测取用都容易受到低温下的冰晶损伤，从而降低噬菌体的存活率和活性；-80℃冰箱以及-196℃虽然可以长期保藏，但有的实验室缺少实验条件，且日常检测取用冻融步骤繁琐。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种用于烈性噬菌体的低温保藏方法。
本发明提供了一种用于烈性噬菌体的低温保藏方法，具有这样的特征，包括如下步骤：将烈性噬菌体的悬液与保藏液混合均匀后，在-196℃～4℃下进行保藏，其中，保藏液包括培养基以及低温保护剂，培养基为液体LB培养基或液体SM培养基，低温保护剂为甘油或二甲基亚砜。
在本发明提供的用于烈性噬菌体的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，培养基与低温保护剂的体积比为1：(0.5-2)。
在本发明提供的用于烈性噬菌体的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，保藏液中甘油的体积百分比为10％～30％。
在本发明提供的用于烈性噬菌体的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，保藏液中二甲基亚砜的体积百分比为5％～10％。
在本发明提供的用于烈性噬菌体的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，保藏液的制备方法如下：步骤1，配制培养基；步骤2，将低温保护剂与培养基混合后，定容、灭菌，得混合液；以及步骤3，将混合液用培养基稀释后，即得保藏液。
在本发明提供的用于烈性噬菌体的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，保藏液为甘油-LB保藏液，甘油-LB保藏液由甘油及液体LB培养基组成，甘油与液体LB培养基的体积比为(0.1-0.3)：(0.7-0.9)。
在本发明提供的用于烈性噬菌体的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，保藏液为甘油-SM保藏液时，甘油-SM保藏液由甘油及液体SM培养基组成，甘油与液体SM培养基的体积比为(0.1-0.3)：(0.7-0.9)。
在本发明提供的用于烈性噬菌体的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，保藏液为二甲基亚砜-LB保藏液时，二甲基亚砜-LB保藏液由二甲基亚砜及液体LB培养基组成，二甲基亚砜与液体LB培养基的体积比为(0.05-0.1)：(0.9-0.95)。
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在本发明提供的用于烈性噬菌体的低温保藏方法中，还具有这样的特征：其中，烈性噬菌体为霍乱噬菌体。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的用于烈性噬菌体的低温保藏方法，包括如下步骤：将烈性噬菌体的悬液与保藏液混合均匀后，在-196℃～4℃下进行保藏，其中，保藏液包括培养基以及低温保护剂，培养基为液体LB培养基或液体SM培养基，低温保护剂为甘油或二甲基亚砜。因为在液体LB培养基或液体SM培养基上添加甘油或二甲基亚砜，从而形成复配后的保存液，并在一定温度下进行保藏，所以延长了噬菌体的保藏时间，提高了噬菌体的存活率和活性。
附图说明
图1是本发明的测试例1中噬菌体保藏20周的存活率的测试结果图；
图2是本发明的测试例1中噬菌体反复冻融(取用)13次的存活率的测试结果图；
图3是本发明的测试例2中4℃下保存20周对噬菌体存活率的测试结果图；
图4是本发明的测试例2中-20℃下保存20周对噬菌体存活率的测试结果图；
图5是本发明的测试例2中-80℃下保存20周对噬菌体存活率的测试结果图；
图6是本发明的测试例2中-196℃下保存20周对噬菌体存活率的测试结果图；
图7是本发明的测试例3中4℃下短期内反复冻融13次的噬菌体存活率的测试结果图；
图8是本发明的测试例3中-20℃下短期内反复冻融13次的噬菌体存活率的测试结果图；
图9是本发明的测试例3中-80℃下短期内反复冻融13次的噬菌体存活率的测试结果图；
图10是本发明的测试例3中-196℃下短期内反复冻融13次的噬菌体存活率的测试结果图；
图11是本发明的测试例4中在4℃保藏对噬菌体存活率的影响测试结果图；
图12是本发明的测试例4中在-20℃下保藏对噬菌体存活率的测试结果图；
图13是本发明的测试例4中在-80℃下保藏对噬菌体存活率的测试结果图；
图14是本发明的测试例4中在-196℃下保藏对噬菌体存活率的测试结果图；
图15是本发明的测试例5中保藏20周后的噬菌体的微观形态图；
图16是本发明的测试例5中保藏20周后的噬菌体表观形态图；
图17是本发明的测试例6中在4℃反复取用多次，低温保护剂对噬菌体存活率的测试结果图；
图18是本发明的测试例6中在-20℃反复取用多次，低温保护剂对噬菌体存活率的测试结果图；
图19是本发明的测试例6中在-80℃反复取用多次，低温保护剂对噬菌体存活率的测试结果图；
图20是本发明的测试例6中在-196℃反复取用多次，低温保护剂对噬菌体存活率的测试结果图；
图21为本发明的测试例7中在液体培养基上添加低温保护剂后的OD图；以及
图22是本发明的测试例7中添加不同低温保护剂反复冻融(取用)13次后，不同温度保藏的VP3经传代再培养测定的滴度图。
上述图例中，D代表DMSO，G代表甘油，L代表液体LB培养基，S代表液体SM培养基，F代表反复冻融的保藏方式。
图1-10中，所有数据采用Origin 2018作图，SPSS 24统计分析软件进行差异显著性分析，P值<0.05表示显著差异。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明用于烈性噬菌体的低温保藏方法作具体阐述。
下述实施例中采用由中国疾病预防控制中心提供的霍乱弧菌N16961、霍乱噬菌体VP3(下述简称噬菌体)为研究对象。
下述实施例中培养基的制备方法如下：
液体LB培养基包括如下成分：
体积质量分数为1％(w/v)的NaCl，1％(w/v)的胰蛋白胨，0.5％(w/v)的酵母提取物。
液体LB培养基的制备方法如下：
用电子天平分别称量NaCl 8g、胰蛋白胨8g、酵母提取物4g置于1L的锥形瓶中，加蒸馏水定容于800mL，121.1℃高温高压20min灭菌，冷却后4℃放置保存以备用。
液体SM培养基包括如下成分：
体积质量分数为0.58％(w/v)的NaCl，0.2％(w/v)的MgSO4·7H2O，5％(v/v)1mol/LpH7.5的Tris.HCl，0.01％(v/v)明胶。
液体SM培养基的制备方法如下：
电子天平分别称量NaCl 4.64g、MgSO4·7H2O 1.6g置于1L锥形瓶中，再用移液枪吸取浓度为10M的NaOH，调pH至7.5的1M Tris.HCL缓冲液40mL、2％明胶溶液(2g明胶溶于终体积为100mL的蒸馏水中，121.1℃高温高压20min灭菌)4mL于带盖实验玻璃瓶中，然后加蒸馏水定容于800mL，121.1℃高温高压20min灭菌，冷却后4℃放置保存以备用。
下述实施例中4种保存液的制备方法如下：
1.甘油-LB保藏液的制备方法
具体步骤如下：
步骤1，取上述配制好的液体LB培养基于1L的锥形瓶中；
步骤2，用移液枪分别吸取80mL、160mL、240mL甘油加入到1L锥形瓶中，然后加蒸馏水定容于800mL，经121℃高温高压15min灭菌，分别配置体积百分比为10％(v/v)、20％(v/v)、30％(v/v)的甘油-LB保藏液。
2.甘油-SM保藏液的制备方法
具体步骤如下：
步骤1，取上述配制好的液体SM培养基于1L锥形瓶中；
步骤2，用移液枪分别移取80mL、160mL、240mL甘油于1L锥形瓶中，然后加蒸馏水定容于800mL，经121℃高温高压15min灭菌，分别配置体积百分比为10％(v/v)、20％(v/v)、30％(v/v)甘油-SM保藏液。
3.DMSO-LB保藏液的制备方法
具体步骤如下：
步骤1，取上述配制好的液体LB培养基于1L的锥形瓶中；
步骤2，用移液枪分别吸取40mL、56mL、80mL的DMSO(经孔径为0.22μm的滤膜进行过滤灭菌)于1L锥形瓶中，然后加蒸馏水定容于800mL，经121℃高温高压15min灭菌，分别配置体积百分比为5％(v/v)、7％(v/v)、10％(v/v)的DMSO-LB保藏液。
4.DMSO-SM保藏液的制备方法
具体步骤如下：
步骤1，取上述配制好的液体SM培养基于1L锥形瓶中；
步骤2，用移液枪分别移取DMSO(经孔径为0.22μm的滤膜进行过滤灭菌)40mL、56mL、80mL于锥形瓶，然后加蒸馏水定容于800mL，经121℃高温高压15min灭菌，分别配置体积百分比为5％(v/v)、7％(v/v)、10％(v/v)DMSO-SM保藏液。
下述实施例中，噬菌体的悬液的制备方法如下：
用接种环挑取少量霍乱弧菌，采用三区划线法涂布在固体LB平板上，放于培养箱，37℃过夜培养后，从固体LB平板上挑取霍乱弧菌单菌落接种于液体LB培养基中，以180r/min～220r/min的转速、37℃的温度，摇床过夜培养。按照噬菌体和宿主菌的最佳感染指数转接至新的液体LB培养基中，摇床培养至生长对数期，离心，取上清液，即可得到保藏在液体LB培养基中浓度约为108PFU/mL的霍乱噬菌体的悬液。
<实施例1>
一种用于烈性噬菌体的低温保藏方法
具体保藏方法如下：
按照保藏液中低温保护剂体积百分比的不同，分别将不同体积百分比的甘油或DMSO与液体LB培养基或液体SM培养基两两复配，从而得到12种复配后的保藏液，将得到如表1所示的12种复配后的保藏液、单一的液体LB培养基、液体SM培养基分别与浓度约为108PFU/mL噬菌体的悬液以1:1等体积混合后于冻存管中，震荡均匀后分别直接放在4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱以及-196℃液氮罐中进行保藏。
表1 12种复配保藏液的成分
<测试例1>
噬菌体在不同温度下的存活率测试
测试方法：将噬菌体的悬液分别与液体LB培养基和液体SM培养基等体积混合后，保藏20周及反复冻融(取用)13次后进行存活率测试。解冻方式是在37℃水浴复温进行，升温平均速率为25℃/min。
测试结果如图1-2所示。
图1是噬菌体保藏20周的存活率的结果图；图2是噬菌体反复冻融(取用)13次的存活率的结果图。
由图1可知，对于不同低温环境保藏的噬菌体VP3保藏20周来说，液体LB保藏噬菌体在4℃冰箱、-80℃冰箱和-196℃液氮罐的存活率无显著性差异，分别为56.16％、68.98％、53.36％，上述三个保藏温度与-20℃冰箱保藏的噬菌体存在显著性差异，存活率低至23.89％；液体SM培养基保藏噬菌体在超低温(-80℃冰箱和-196℃液氮罐)的存活率无显著性差异，分别为49.16％、54.21％，-20℃冰箱保藏的噬菌体存活率差异性最明显，存活率仅为5.25％。采用长期保藏的方式，在-196℃环境中，保存液对噬菌体的保藏效果无明显影响，-80℃和4℃的液体LB培养基保藏效果明显优于SM保存液，-20℃对噬菌体的保藏效果最差，但保存液对该温度下存在显著性影响。
由图2可知，不同低温环境保藏的噬菌体经反复冻融13次后，液体LB保藏噬菌体在超低温(-80℃冰箱和-196℃液氮罐)的存活率无显著性差异，存活率高达50％以上，而4℃冰箱和-20℃冰箱的存活率差异性不明显，分别为17.48％、21.54％；液体SM培养基保藏噬菌体在4℃和-196℃的存活率有较小的差异，在-20℃的存活率最低0.39％。采用反复冻融的方式，保存液在4℃对噬菌体的保藏效果无明显影响，其它低温下，保存液对噬菌体的保藏效果影响存在显著性差异。
<测试例2>
测试方法：将实施例1中的12种保藏液、液体LB培养基和液体SM培养基分别在4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱以及-196℃液氮罐中保藏20周后取出，进行存活率测试。解冻方式是37℃水浴复温，升温平均速率为25℃/min。
测试结果如图3-6所示。
(1)4℃下，保存20周对噬菌体存活率的影响测试
图3是4℃下保存20周对噬菌体存活率的影响测试结果图。
由图3可知，除了在液体LB培养基中添加30％(v/v)甘油的存活率与液体LB无显著性差异，分别为52.35％和56.16％，添加其它低温保护剂与未添加的液体LB培养基存在显著性差异，且效果比较差，且高浓度的DMSO对噬菌体保藏的负影响显著，可能因为10％DMSO的S＝O强烈的夺氢能力破坏蛋白质结构中α-螺旋的氢键，暴露噬菌体蛋白质外壳的疏水基团，疏水基团聚集形成紧密的球状，导致蛋白质变性，也可能是与蛋白质的巯基基团作用使蛋白质变性，低浓度的甘油对噬菌体保藏的负影响更为显著；甘油对SM液保藏VP3无显著性影响，DMSO存在显著性负影响。这说明在4℃长期保藏噬菌体，添加单一DMSO或甘油的保护效果不理想，可能是因为在4℃长期保藏的噬菌体结构较稳定且无冰晶损伤，低温保护剂无法体现抑制冰晶降低低温损伤、保护结构的优势。
(2)-20℃下，保存20周对噬菌体存活率的影响测试
图4是-20℃下保存20周对噬菌体存活率的影响测试结果图。
由图4可知，长期保藏噬菌体的存活率添加低温保护剂后有所提高，10％～30％不同浓度的甘油对液体LB保藏VP320周的保护作用无显著性差异，10％(v/v)DMSO比7％和5％更利于噬菌体的存活，存活率可提升至38.81％；低温保护剂的种类和浓度对SM保藏噬菌体的影响不显著，存活率可提升至33.33％～48.20％，其中30％(v/v)甘油对VP3的保护最为显著。
(3)-80℃下，保存20周对噬菌体存活率的影响测试
图5是-80℃下保存20周对噬菌体存活率的影响测试结果图。
由图5可知，-80℃长期LB保藏VP3，5％(v/v)DMSO将VP3的存活率提升至76.54％，经单因素分析后，从统计学角度，认为5％DMSO与液体LB保藏VP3(存活率为68.99％)无显著性差异。
(4)-196℃下，保存20周对噬菌体存活率的影响测试
图6是在-196℃下保存20周对噬菌体存活率的影响测试结果图。
由图6可知，甘油对-196℃长期LB保藏VP3无显著性影响，单一DMSO和甘油对SM液保藏噬菌体不存在显著性影响。
<测试例3>
噬菌体在不同温度下反复冻融13次后存活率测试
测试方法：将实施例1中的12种保藏液、液体LB培养基和液体SM培养基在4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱以及-196℃液氮罐中反复冻融13次后，进行存活率测试。解冻方式是37℃水浴复温，升温平均速率为25℃/min。
测试结果如图7-10所示。
(1)噬菌体在4℃下反复冻融13次的存活率测试
图7是短期内反复冻融13次的噬菌体存活率测试结果图。
由图7可知，甘油对噬菌体保藏有显著性保护，且30％(v/v)甘油的保护效果最好，30G-L和30G-S分别可达到46.10％和36.63％，可能因为4℃低温和37℃中高温的反复刺激，使噬菌体结构变得脆弱，蛋白质外壳与水的结合能力减弱，甘油结合噬菌体蛋白外壳的亲油基团(氨基酸的羧基,或R基)从而一定程度上保护了其结构。
(1)噬菌体在-20℃下反复冻融13次
图8是短期内反复冻融13次的噬菌体存活率结果图。
由图8可知，甘油对反复冻融13次的LB保藏噬菌体的保护效果最为明显，且随着浓度的增加，存活率可高达61.82％；甘油和DMSO对反复冻融13次的SM保藏噬菌体都存在显著性保护效果，其中5％(v/v)DMSO保藏VP3的存活率最高，为31.86％，其它低温保护剂之间对噬菌体的存活不存在显著性差异。因此，在-20℃，长期保藏添加甘油的保护效果较好，考虑到经济性，10％的甘油即可；短期反复冻融噬菌体，液体LB添加30％(v/v)的甘油、SM液添加5％(v/v)DMSO的保护效果较好。
(2)噬菌体在-80℃下反复冻融13次
图9是噬菌体在-80℃下反复冻融13次的存活率测试结果图。
由图9可知，除了液体SM培养基添加5％DMSO保藏噬菌体存活率可由9.4％提高至11.6％，其它低温保护剂对噬菌体的存活率并未提升。可能是噬菌体在超低温下自身产生“自我保护”的应激性。
(3)噬菌体在-196℃下反复冻融13次
图10是噬菌体在-196℃下反复冻融13次的存活率测试结果图。
由图10可知，甘油对-196℃短期反复冻融SM保藏VP3存在影响，存活率可由24.24％提升至36.13％～37.78％。因此，在超低温下保藏噬菌体不适合添加5％～10％(v/v)DMSO和10％～20％(v/v)甘油，可能因为噬菌体对超低温的应激性加强，二十面体结构自发“抱团”影响了尾部的吸附功能，DMSO和甘油对噬菌体的低温保护使其长期处在“抱团”结构导致蛋白质外壳变性，在复温后不能恢复原有的二十面体结构，从而使滴度下降严重。
<测试例4>
保藏时间对噬菌体保藏效果的影响测试
测试方法：将实施例1中液体LB培养基、保藏液4、保藏液5、保藏液6、保藏液1、保藏液2、保藏液3分别在4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱以及-196℃液氮罐中保藏20周后，进行存活率测试；
将实施例1中液体SM培养基、保藏液10、保藏液11、保藏液12、保藏液7、保藏液8、保藏液9分别在4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱以及-196℃液氮罐中保藏20周后，进行存活率测试。解冻方式是37℃水浴复温，升温平均速率为25℃/min。测试结果如图11-14及表2-9所示。
(1)添加低温保护剂后，在4℃保藏20周对噬菌体存活率的影响
图11是在添加低温保护剂后，在4℃保藏对噬菌体存活率的影响测试结果图。
图11(a)为在液体LB培养基的基础上添加不同浓度的低温保护剂，图11(b)在液体SM培养基基础上添加不同浓度的低温保护剂。
由图11(a)可知，噬菌体存活率变化趋势基本一致，但是添加低温保护剂的液体LB保存液保藏噬菌体VP3的存活率发生骤降的时间点提前，尤其是添加了10％(v/v)DMSO和10％(v/v)甘油，噬菌体的存活率比仅液体LB培养基保藏的存活率低了近25％，添加30％(v/v)甘油保藏在12周后的存活率会略高于未添加低温保护剂，并不存在显著性差异。即在4℃长期保藏的方式下，液体LB培养基添加低温保护剂DMSO和甘油对VP3保藏影响不显著或者呈现负影响。
由图11(b)可知，添加30％甘油的含明胶的SM液延长至6周后发生噬菌体大量死亡，且死亡趋势较为缓慢，但与20周后其他保存液的存活率差异不明显，添加20％(v/v)甘油在前12周的噬菌体存活率略高于仅含明胶的SM液的，10％(v/v)甘油提前了噬菌体存活率骤降的时间点，但20周后，20％(v/v)和10％(v/v)甘油对噬菌体保藏基本无影响，DMSO在4℃对噬菌体的保藏呈现负影响，显著降低了VP3的存活率，其中低浓度(5％)的DMSO对VP3存活率的负影响小于中高浓度(7％、10％)的。因此，在4℃短期反复取用的处理方式下，含明胶的SM液添加30％(v/v)甘油保藏噬菌体的效果较好，添加20％(v/v)甘油在三个月呈现保护效果，添加DMSO为体现对噬菌体存在保护的现象。
由图11可知，添加低温保护剂对4℃保藏VP3的存活率未体现显著的保护效果，随着保藏时间的延长，噬菌体存活呈现下降趋势，保藏12周后下降趋势减缓，但低温保护剂的种类和浓度对4℃保藏噬菌体的整体规律不明显。
(2)添加低温保护剂后，在-20℃下保藏20周对噬菌体存活率的影响。
图12是添加低温保护剂后，在-20℃下保藏对噬菌体存活率的影响测试结果图。
图12(a)为在液体LB培养基的基础上添加不同浓度的低温保护剂，图12(b)表示在液体SM培养基基础上添加不同浓度的低温保护剂。
在图12(a)中，各浓度低温保护剂的保护效果的如下：20％甘油＞30％甘油＞10％甘油＞10％DMSO＞7％DMSO＞5％DMSO＞SM，添加20％(v/v)甘油不仅延长了噬菌体高滴度保藏时间，还延缓了存活率降低幅度，5个月仍能保持56.87％的存活率；DMSO对-20℃保藏噬菌体的保护效果随浓度的增加而提高，10％(v/v)DMSO保藏11周和16周左右的存活率分别高于30％(v/v)和20％(v/v)甘油，但之后的保护效果低于甘油。
在图12(b)中，8周前5％(v/v)DMSO对噬菌体的保藏呈现负影响，8～20周的存活率下降平稳缓慢，且高于SM保藏，可能该浓度的DMSO随着保藏时间的延长，它的保护作用越明显，20％(v/v)和30％(v/v)甘油对SM液长期保藏噬菌体无显著性差异，基于节约成本，添加20％甘油改良液体SM培养基更利于噬菌体的长期保藏。
从图12(a)、(b)整体分析可得，添加低温保护剂对-20℃保藏VP3的存活率体现明显的保护效果，保藏一段时间后，噬菌体死亡率增加幅度减缓。添加10％～30％甘油优于添加5％～10％DMSO的保护效果。
(3)添加低温保护剂后，在-80℃、-196℃下保藏20周后对噬菌体存活率的影响。
图13是添加低温保护剂后在-80℃下对噬菌体存活率的影响结果图；图14是添加低温保护剂后在-196℃下对噬菌体存活率的影响结果图。
图13和图14分别为添加低温保护剂后，在-80℃和-196℃保藏时间对噬菌体存活率的影响。其中(a)表示在液体LB培养基的基础上添加不同浓度的低温保护剂，(b)表示在液体SM培养基基础上添加不同浓度的低温保护剂。
由图13和图14可知，长期保藏噬菌体，以单一DMSO和甘油作为低温保护剂的VP3存活率低至10％及以下，一方面可能因为实验的保藏时间最长仅20周，探究添加低温保护剂后保藏时间对噬菌体存活率的影响的时间不充分；另一方面可能因为超低温保藏噬菌体选择单一DMSO和甘油不合适，可以考虑其它低温保护剂。
表2噬菌体在4℃-LB下保藏20周的存活率平均值
由表2可知，噬菌体存活率变化趋势基本一致，但是添加低温保护剂的液体LB保存液保藏噬菌体VP3的存活率发生骤降的时间点提前，尤其是添加了10％(v/v)DMSO和10％(v/v)甘油，噬菌体的存活率比仅液体LB培养基保藏的存活率低了近25％，添加30％(v/v)甘油保藏在12周后的存活率会略高于未添加低温保护剂，并不存在显著性差异。即在4℃长期保藏的方式下，液体LB培养基添加低温保护剂DMSO和甘油对VP3保藏影响不显著或者呈现负影响。
表3噬菌体在4℃-SM下保藏20周的存活率平均值
由表3可知，添加30％甘油的含明胶的SM液延长至6周后发生噬菌体大量死亡，且死亡趋势较为缓慢，但与20周后其他保存液的存活率差异不明显，添加20％(v/v)甘油在前12周的噬菌体存活率略高于仅含明胶的SM液的，10％(v/v)甘油提前了噬菌体存活率骤降的时间点，但20周后，20％(v/v)和10％(v/v)甘油对噬菌体保藏基本无影响，DMSO在4℃对噬菌体的保藏呈现负影响，显著降低了VP3的存活率，其中低浓度(5％)的DMSO对VP3存活率的负影响小于中高浓度(7％、10％)的DMSO。
由表2和表3可知，在4℃短期反复复温的处理方式下，含明胶的SM液添加30％(v/v)甘油保藏噬菌体的效果较好，添加20％(v/v)甘油在三个月呈现保护效果，添加DMSO未体现对噬菌体存在保护的现象。
表4噬菌体在-20℃-LB下保藏20周的存活率平均值
由表4可知，各浓度低温保护剂的保护效果的如下：20％甘油＞30％甘油＞10％甘油＞10％DMSO＞7％DMSO＞5％DMSO＞SM，添加20％(v/v)甘油不仅延长了噬菌体高滴度保藏时间，还延缓了存活率降低幅度，5个月后仍能保持56.87％的存活率；DMSO对-20℃保藏噬菌体的保护效果随浓度的增加而提高，10％(v/v)DMSO保藏11周和16周左右的存活率分别高于30％(v/v)和20％(v/v)甘油，但之后的保护效果低于甘油。
表5噬菌体在-20℃-SM下保藏20周的存活率平均值
由表5可知，8周前添加5％(v/v)DMSO对噬菌体的保藏呈现负影响，8～20周的存活率下降平稳缓慢，且高于SM保藏，可能该浓度的DMSO随着保藏时间的延长，它的保护作用越明显，20％(v/v)和30％(v/v)甘油对SM液长期保藏噬菌体无显著性差异，基于节约成本，添加20％甘油改良含明胶的SM保存液更利于噬菌体的长期保藏。
由表4和表5可知，添加低温保护剂对-20℃保藏VP3的存活率体现明显的保护效果，保藏一段时间后，噬菌体死亡率增加幅度减缓。添加10％～30％甘油优于添加5％～10％DMSO的保护效果。
表6噬菌体在-80℃-LB下保藏20周的存活率平均值
表7噬菌体在-80℃-SM下保藏20周的存活率平均值
表8噬菌体在-196℃-LB下保藏20周的存活率平均值
表9噬菌体在-196℃-SM下保藏20周的存活率平均值
由表6-表9可知，超低温下长期保藏噬菌体，以单一DMSO和甘油作为低温保护剂的VP3存活率低至10％及以下，一方面研究添加低温保护剂后保藏时间对噬菌体存活率的影响的时间不充分；另一方面可能因为超低温保藏噬菌体选择单一DMSO和甘油不合适，可以考虑其它低温保护剂。
由表2-9可知，在噬菌体的培养过程中，由于培养基中有些成分的禁锢作用，使噬菌体不能完全释放出来，所以使噬菌体的存活率并未随着时间的增加，存活率呈递减的趋势。
<测试例5>
透射电镜测试
测试方法：选择LVEM5低压透射电子显微镜观察样本为-80℃添加7％(v/v)DMSO的SM保存液来观察长期保藏噬菌体的形态，从而评估现有保藏方式对噬菌体形态的影响，以及保藏效果最好的温度-80℃，为了控制单一变量选择-80℃-SM保藏的噬菌体进行观察。
测试结果如图15所示。
图15是保藏20周后的噬菌体微观形态图。其中，(a)为新鲜噬菌体VP3在透射电镜LVEM5标尺50nm的电镜图象；(b)-80℃-SM保藏噬菌体VP3在透射电镜LVEM5标尺200nm的电镜图象；(c)-80℃-7D-S保藏噬菌体VP3在透射电镜LVEM5标尺200nm的电镜图象。
在图15(a)中，噬菌体VP3吸附于宿主菌N16961上，游离的VP3无序分布于视野当中；在图15(b)中，VP3呈有序排列，线性头尾结合，头部由二十面体变为梭形，尾丝蛋白部分缺失；在图15(c)中，VP3的线性排列更明显，头部蛋白偏圆，失去尾丝蛋白的圆形头部的数量增多。可能因为超低温环境使噬菌体自发对烈性环境的应激性，尾部蛋白收缩，影响了其对宿主菌的侵染能力，但是每个噬菌体的应激程度有区别，添加低温保护剂后，应激程度较大的VP3在经过低温保护剂的结合后，加剧了蛋白质的变性，从而导致噬菌体的侵染性更低，滴度下降更明显。
图16是保藏20周后的噬菌体表观形态图。
图16(a)为液体LB保藏新鲜噬菌体VO3双层琼脂平板培养4h后形成的噬菌斑。图16(b)为-20℃-LB保藏20周噬菌体VP3培养4h形成的噬菌斑。
由图16(a)可知，透光观察到，在稀释度10-7观察到噬菌斑大而圆，且数量多；在图16(b)中可知，在稀释度为10-3观察到噬菌斑小而细，数量减少。这说明了低温环境可能影响噬菌体的尾丝蛋白，使得侵染性发生变化，导致噬菌斑的表观形态发生较大的变化。
<测试例6>
低温保护剂随反复冻融(取用)次数对噬菌体存活率的影响测试
测试方法：将实施例1中液体LB培养基、保藏液4、保藏液5、保藏液6、保藏液1、保藏液2、保藏液3分别在4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱以及-196℃液氮罐中反复冻融13次后，进行存活率测试。解冻方式是37℃水浴复温，升温平均速率为25℃/min。
将实施例1中液体SM培养基、保藏液10、保藏液11、保藏液12、保藏液7、保藏液8、保藏液9分别在4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱以及-196℃液氮罐中反复冻融13次后，进行存活率测试。
测试结果如图17-20及表10-17所示。
(1)在4℃反复取用多次，低温保护剂对噬菌体存活率的影响测试。
图17是在4℃反复取用多次，低温保护剂对噬菌体存活率的影响测试结果图。
图17(a)为在液体LB培养基的基础上添加低温保护剂的存活率-取用次数的拟合曲线，图17(b)为在液体SM培养基的基础上添加低温保护剂的存活率-取用次数的拟合曲线。
在图17(a)中，30％(v/v)甘油保藏的噬菌体在反复取用7次后仍能保持87.77％的较高存活率，而仅液体LB保藏的VP3在反复取用第3次的存活率已降至85.44％，且次数增加至13次后，30％(v/v)甘油保藏的噬菌体滴度优于为添加低温保护剂，与其存在显著性差异，说明30％(v/v)甘油4℃保藏噬菌体可以增加取用的次数保持较高滴度；10％(v/v)DMSO保藏噬菌体不仅减少了高滴度取用次数，还加速了VP3存活率的降低；反复取用5次以内，低温保护剂可以提高噬菌体的存活率约72.16％～93.09％。
在图17(b)中，30％(v/v)甘油保藏VP3在第6次取用时存活率约为75.74％，也可以增加反复取用的次数，除了添加5％(v/v)DMSO，添加其它低温保护剂的SM液保藏都能在取用5次保持高于未添加的存活率，约为62.77％～91.46％。因此，由结果分析，单一DMSO和甘油可以增加取用次数，但随着次数的增加，噬菌体的滴度仍在降低。这可能因为低温保护剂可以减缓反复冷热温度对噬菌体的刺激，但不能抑制。
(2)在-20℃反复取用多次，低温保护剂对噬菌体存活率的影响测试。
图18是在-20℃反复取用多次，低温保护剂对噬菌体存活率的影响测试结果图。其中图18(a)展现了在液体LB培养基的基础上添加低温保护剂的存活率-取用次数的拟合曲线，图18(b)展现了在液体SM培养基的基础上添加低温保护剂的存活率-取用次数的拟合曲线。
由图18(a)可知，甘油和DMSO保持明显增加了可反复冻融的次数，20％(v/v)和30％(v/v)甘油在反复冻融9次仍能保持85％的存活率。
由图18(b)可知，DMSO在反复冻融6次以内的存活率可以保持80％以上。两种保存液的优势低温保护剂不同，可能是因为保存液的成分，液体LB作为培养基，富含各种氨基酸等营养物质，甘油抑制冰晶形成的同时，培养基内的营养物质可以修复和补充噬菌体蛋白质外壳的结构损伤，因此其保护效果也比SM液好。
(2)在-80℃和-196℃反复取用多次，低温保护剂对噬菌体存活率的影响测试。
图19是在-80℃下反复取用多次后，低温保护剂对噬菌体存活率的影响测试结果图；图20为在-196℃下反复取用多次后，低温保护剂对噬菌体存活率的影响测试结果图。
在图19和图20中，其中(a)展现了在液体LB培养基的基础上添加低温保护剂的存活率-取用次数的拟合曲线，其中(b)展现了在液体SM培养基的基础上添加低温保护剂的存活率-取用次数的拟合曲线。
由图19-图20可知，甘油和DMSO对反复冻融噬菌体呈现负影，这可能是因为超低温环境中，噬菌体对劣性环境的应激程度大于超低温的冰晶损伤程度，低温保护剂的保护作用不明显甚至可能加剧其应激性。
表10噬菌体在4℃-LB下反复取用13次的存活率平均值
由表10可知，30％(v/v)甘油保藏的噬菌体在反复复温7次后仍能保持87.77％的较高存活率，而仅液体LB保藏的VP3在反复复温第3次的存活率已降至85.44％，且次数增加至13次后，30％(v/v)甘油保藏的噬菌体滴度优于为添加低温保护剂，与其存在显著性差异，说明30％(v/v)甘油4℃保藏噬菌体可以增加取用的次数保持较高滴度；10％(v/v)DMSO保藏噬菌体不仅减少了高滴度取用次数，还加速了VP3存活率的降低；反复复温5次以内，低温保护剂可以提高噬菌体的存活率约72.16％～93.09％。
表11噬菌体在4℃-SM下反复取用13次的存活率平均值
由表11可知，30％(v/v)甘油保藏VP3在第6次取用时存活率约为75.74％，也可以增加反复复温的次数，除了添加5％(v/v)DMSO，添加其它低温保护剂的SM液保藏都能在取用5次保持高于未添加的存活率，约为62.77％～91.46％。
由表10和表11可知，单一DMSO和甘油可以增加取用次数，但随着次数的增加，噬菌体的滴度仍在降低。
表12噬菌体在-20℃-LB下反复取用13次的存活率平均值
由表12可知，20％(v/v)和30％(v/v)甘油在反复复温9次仍能保持85％的存活率。
表13噬菌体在-20℃-SM下反复取用13次的存活率平均值
由表13可知，DMSO在反复复温6次以内的存活率可以保持80％以上。
由表12和表13可知，虽然两种保存液的优势低温保护剂不同，但甘油和DMSO保持明显增加了可反复复温的次数
表14噬菌体在-80℃-LB下反复取用13次的存活率平均值
表15噬菌体在-80℃-SM下反复取用13次的存活率平均值
表16噬菌体在-196℃-LB下反复取用13次的存活率平均值
表17噬菌体在-196℃-SM下反复取用13次的存活率平均值
表14-17属于在超低温下，添加低温保护剂对噬菌体反复冻融的存活率影响。甘油和DMSO对反复冻融噬菌体呈现负影，这可能是因为超低温环境中，噬菌体对劣性环境的应激程度大于超低温的冰晶损伤程度，低温保护剂的保护作用不明显甚至可能加剧其应激性。
由表10-17可知，对噬菌体进行多次冻融可以起到崩解组织块，破坏细胞结构的作用，使更多的噬菌体释放出来，从而提高了噬菌体的存活率，使噬菌体的存活率大于或等于1。
<测试例7>
低温保护剂随反复冻融(取用)次数对噬菌体侵染性的影响测试
测试方法：将各浓度低温保护剂的噬菌体液各取200μL，在全自动微生物生长趋势分析仪得到VP3和N16961共培养的OD600-培养时间曲线图。
测试结果如图表18及图21-22所示。
表18反复冻融8次，-196℃保藏VP3的平均存活率
由表18可知，噬菌体在反复冻融8次，-196℃下保藏后，并在含液体LB培养基的保存液中，添加10％(v/v)甘油的存活率最高可达59.38％，高于不添加低温保护剂的液体LB培养基的存活率59.38％；在含液体SM培养基的保存液中，添加10％(v/v)甘油的存活率最高可达81.29％，高于不添加低温保护剂的液体SM培养基的存活率35.15％，综上可知，在含液体LB培养基或含液体SM培养基的保存液中，添加低温保护剂为10％(v/v)甘油可以提高噬菌体的存活率。
图21为在液体培养基上添加低温保护剂后的OD图。
在图21中，其中(a)为在液体LB培养基的基础上添加低温保护剂，(b)为在液体SM培养基的基础上添加低温保护剂，观察经-196℃低温处理和各低温保护剂处理与以最佳侵染指数的新鲜VP3和N16961共培养的对比，VP3的侵染性有所下降。
在图21中，S表示噬菌体，J表示霍乱弧菌，100：1是噬菌体对宿主菌的最佳侵染指数，也即噬菌体与霍乱弧菌的浓度比为100：1。
除了添加30％(v/v)甘油，其它低温保护剂均由于VP3的侵染性降低，缩短了迟缓期，而添加30％(v/v)甘油的迟缓期延长，且OD600减少。
在图21(b)中，添加5％(v/v)和7％(v/v)的DMSO可知，反复冻融8次，-196℃保藏VP3的滴度最低，因此，培养时间在25h后N16961有不同程度的生长，低滴度的VP3侵染性也较低。
图22是添加不同低温保护剂反复冻融(取用)13次后，不同温度保藏的VP3经传代再培养测定的滴度图。
由图22可知，低温保护剂对保藏温度和保存液有不同的传代影响。保藏在液体LB培养基的VP3在4℃添加7％(v/v)DMSO和20％(v/v)甘油的传代滴度最高，在-20℃添加甘油的传代滴度较高，且随着甘油浓度的增加，传代滴度越高，在-80℃仅在添加30％(v/v)甘油的传代最低，在-196℃添加7％(v/v)DMSO和30％(v/v)甘油的传代滴度较高；保藏在液体SM培养基的VP3在4℃添加低温保护剂影响传代，在-20℃添加7％(v/v)DMSO和甘油有较好的传代质量，在-80℃添加30％(v/v)甘油传代滴度最高，在-196℃添加10％(v/v)甘油有较好的传代质量。
实施例的作用与效果
根据本实施例所涉及的用于烈性噬菌体的低温保藏方法，包括如下步骤：将烈性噬菌体的悬液与保藏液混合均匀后，在-196℃～4℃下进行保藏，其中，保藏液包括培养基以及低温保护剂，培养基为液体LB培养基或液体SM培养基，低温保护剂为甘油或二甲基亚砜。因为在液体LB培养基或液体SM培养基上添加甘油或二甲基亚砜，从而形成复配后的保存液，并在一定温度下进行保藏，所以延长了噬菌体的保藏时间，提高了噬菌体的存活率和活性。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于烈性噬菌体的低温保藏方法，其特征在于，包括如下步骤：
将烈性噬菌体的悬液与保藏液混合均匀后，在-196℃～4℃下进行保藏，
其中，所述保藏液包括培养基以及低温保护剂，
所述培养基为液体LB培养基或液体SM培养基，
所述低温保护剂为甘油或二甲基亚砜。
2.根据权利要求1所述的用于烈性噬菌体的低温保藏方法，其特征在于：
其中，所述培养基与所述低温保护剂的体积比为1：(0.5-2)。
3.根据权利要求1所述的用于烈性噬菌体的低温保藏方法，其特征在于：
其中，所述保藏液中所述甘油的体积百分比为10％～30％。
4.根据权利要求1所述的用于烈性噬菌体的低温保藏方法，其特征在于：
其中，所述保藏液中所述二甲基亚砜的体积百分比为5％～10％。
5.根据权利要求1所述的用于烈性噬菌体的低温保藏方法，其特征在于：
其中，所述保藏液的制备方法如下：
步骤1，配制所述培养基；
步骤2，将所述低温保护剂与所述培养基混合后，定容、灭菌，得混合液；以及
步骤3，将所述混合液用所述培养基稀释后，即得所述保藏液。
6.根据权利要求5所述的用于烈性噬菌体的低温保藏方法，其特征在于：
其中，所述保藏液为甘油-LB保藏液，
所述甘油-LB保藏液由所述甘油及所述液体LB培养基组成，所述甘油与所述液体LB培养基的体积比为(0.1-0.3)：(0.7-0.9)。
7.根据权利要求5所述的用于烈性噬菌体的低温保藏方法，其特征在于：
其中，所述保藏液为甘油-SM保藏液，
所述甘油-SM保藏液由所述甘油及所述液体SM培养基组成，所述甘油与所述液体SM培养基的体积比为(0.1-0.3)：(0.7-0.9)。
8.根据权利要求5所述的用于烈性噬菌体的低温保藏方法，其特征在于：
其中，所述保藏液为二甲基亚砜-LB保藏液，
所述二甲基亚砜-LB保藏液由所述二甲基亚砜及所述液体LB培养基组成，所述二甲基亚砜与所述液体LB培养基的体积比为(0.05-0.1)：(0.9-0.95)。
9.根据权利要求5所述的用于烈性噬菌体的低温保藏方法，其特征在于：
其中，所述保藏液为二甲基亚砜-SM保藏液时，
所述二甲基亚砜-SM保藏液由所述二甲基亚砜及所述液体SM培养基组成，所述二甲基亚砜与所述液体SM培养基的体积比为(0.05-0.1)：(0.9-0.95)。
10.根据权利要求1所述的用于烈性噬菌体的低温保藏方法，其特征在于：
其中，所述烈性噬菌体为霍乱噬菌体。
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