CN113143911A

CN113143911A - 原花青素在制备单增李斯特菌分选酶抑制剂中的应用

Info

Publication number: CN113143911A
Application number: CN202110454798.7A
Authority: CN
Inventors: 王建锋; 张思琪; 周永林; 沈雪; 王琳; 冯海华; 邓旭明; 邓彦宏
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2021-04-26
Filing date: 2021-04-26
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明涉及原花青素在制备单增李斯特菌分选酶抑制剂中的应用，通过SrtA肽酶活性抑制试验、药物细胞毒性实验和生物被膜形成抑制实验验证原花青素能够有效抑制SrtA催化活性并对单增李斯特菌致病力有一定的抑制作用，通过建立小鼠单增李斯特菌全身感染模型证明原花青素能够对单增李斯特菌造成的感染有良好的治疗效果。

Description

原花青素在制备单增李斯特菌分选酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及原花青素在抑制单增李斯特菌分选酶催化活性及制备李斯特菌感染药物中的应用，属于医学制药技术领域。

背景技术

单核细胞增生性李斯特菌简称单增李斯特菌，是一种重要的食源性人兽共患革兰氏阳性机会致病菌。单增李斯特菌感染可引起动物的菌血症、流产、死胎、脑膜炎以及心内膜炎等致死性感染，并且具有致死率高的特点，尤其是对免疫力低下的个体，死亡率可高达30％左右，可给家畜养殖业造成重大经济损失。分选酶A(SrtA)是一种半胱氨酸转肽酶，几乎存在于所有低GC含量的革兰氏阳性菌中，主要作用是识别表面蛋白的LPTXG保守基序并将表面蛋白锚定到细菌的细胞壁上。SrtA能够介导多种毒力蛋白锚定到细菌的细胞壁，对多种病原菌的致病性有着不可或缺的作用，如金黄色葡萄球菌、猪链球菌、肺炎链球菌及单增李斯特菌等。SrtA在单增李斯特菌感染中对病原菌的致病力起着非常重要的作用，是单增李斯特菌抗感染药物研发的重要潜在靶标。

抗毒力药物主要是作用于病原菌的毒力因子(抑制功能或表达)，减弱病原菌毒力，促进宿主天然免疫系统对病原菌的清除。目前，以SrtA为靶标抗毒力药物的发现主依赖于合成的小分子化合物和天然产物等，如根皮素、黄芩素。原花青素，是植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，具有强抗氧化、消除自由基的作用，可有效消除超氧阴离子自由基和羟基自由基，也参与磷酸、花生四烯酸的代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤；是强有力的

金属螯合剂，可螯合金属离子，在体内形成惰性化合物；保护和稳定维生素c，有助于维生素c的吸收和利用。原花青素分布广泛，存在于许多植物的皮、壳、籽、核、花、叶中，葡萄籽中原花青素含量最高，种类丰富。目前，国内外未见原花青素通过抑制单增李斯特菌分选酶催化活性来抵抗李斯特菌感染的报道。

发明内容

本发明所述原花青素CAS登录号为4852-22-6，分子式为C₃₀H₁₂O₆，分子量为468.42。

原花青素的化学结构式如下：

本研究以SrtA为抗感染药物研究的靶标在天然化合物中进行抑制剂的筛选并验证其对单增李斯特菌致病力的抑制作用，该抑制剂可抑制SrtA催化活性从而抵抗单增李斯特菌感染。本研究通过SrtA肽酶活性抑制试验、药物细胞毒性实验、生物被膜形成抑制实验和体内动物感染实验验证原花青素对单增李斯特菌致病力的抑制作用，筛选并验证出原花青素可有效抑制SrtA催化活性并对单增李斯特菌造成的感染有良好的治疗效果。

附图说明

图1：原花青素对SrtA肽酶活性的抑制作用；

图2：原花青素对单增李斯特菌生物被膜形成的抑制作用；

图3：原花青素对Caco-2细胞的毒性作用；

图4：原花青素对单增李斯特菌小鼠感染模型的保护作用。

具体实施方式

通过以下实施进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

1.单增李斯特菌分选酶催化活性抑制剂的筛选

本研究通过SrtA肽酶活性抑制试5882验，设计并合成单增李斯特菌SrtA特异切割的荧光修饰底物肽(Dabcyl-QALPNTGEE-Edans)，采用荧光偏振能量转移实验(FRET)进行抑制剂的筛选。SrtA蛋白与不同浓度药物在37℃下于96孔黑板中共孵育30min后，加入荧光修饰底物肽或反应缓冲液，避光孵育1h时应用酶标仪测定荧光值，计算并分析各受试化合物对SrtA蛋白催化活性的影响，结果见附图1。

结论：本研究通过荧光共振能量转移法筛选出原花青素对Srt A肽酶活性的抑制作用。原花青素可剂量依赖性地抑制Srt A的肽酶活性，8μg/ml原花青素的抑制率可达40％以上。

2.水原花青素对单增李斯特菌生物被膜形成的影响

本研究通过向单增李斯特菌生物被膜形成体系中加入不同浓度原花青素并通过结晶紫染色法测定溶解液的吸光度，观察并分析不同浓度原花青素对单增李斯特菌生物被膜形成的影响。取单增李斯特菌野生型菌株BUG1600过夜培养物，OD_600nm处调至0.1，按照比例1：100扩培到24孔板中，1ml/孔，设置每孔药物浓度分别为0、4、16、64μg/ml，再取单增李斯特菌分选酶敲除株BUG1777过夜培养物，同上述方法扩培，使24孔板于30℃、5％CO₂条件下静置培养72h。用移液器轻轻吸走孔中的液体，并用PBS将生物被膜轻轻洗三次。将24孔板置于60℃干燥1h后，每孔加入400μl0.1％结晶紫染色液，静置1h。弃掉结晶紫染色液后，用去离子水将未结合的结晶紫洗去。每孔加入500μl33％冰醋酸，溶解结合的结晶紫，并用酶标仪检测溶解液在570nm波长的吸光度，结果见附图2。

结论：生物被膜结晶紫染色结果显示，随着原花青素浓度逐渐增加，单增李斯特菌生物被膜明显呈递减趋势。

3.原花青素对Caco-2细胞的毒性作用

本研究通过乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测原花青素对Caco-2细胞的毒性作用。将Caco-2细胞接种于96孔微孔板(每孔2×10⁴个细胞)中，37℃过夜。加入不同浓度(4～256μg/ml)的原花青素处理Caco-2细胞5h，并用细胞毒性检测试剂盒在OD_492nm处测定每个样品的吸光度，以添加0.2％Triton-X100和纯DMEM培养基的细胞为阳性对照和阴性对照。最终死亡细胞百分比表示为(样品-阴性对照)/(阳性对照-阴性对照)，计算细胞死亡率，结果见附图3。

结论：通过细胞毒性试验初步评价原花青素的细胞毒性，结果显示原花青素在指定浓度(4～256μg/ml)5h内对Caco-2细胞无明显毒性。

4.原花青素对单增李斯特菌小鼠感染模型的保护作用

(1)小鼠单增李斯特菌全身感染模型的建立：取20只BALB/C小鼠(雌性，约20g)经腹腔注射BUG1600悬液(8×10⁷CFUs/ml，每只小鼠100μl)，另取10只小鼠，经腹腔注射BUG1777悬液(8×10⁷CFUs/ml，每只小鼠100μl)，建立小鼠全身感染模型。

(2)保护率实验：将感染BUG1600的小鼠随机分为2组，每组包括10只小鼠，分为BUG1600对照组(25mg/kg体重)、原花青素组(25mg/kg体重)，最后一组为BUG1777对照组。所有组小鼠均通过灌胃给药，对照组均给5％羧甲基纤维素钠，每12h给药一次。观察小鼠状态并记录死亡时间，结果见附图4。

结论：小鼠腹腔注射7×10⁷CFUs单增李斯特菌BUG1600，BUG1600对照组小鼠在感染后60h、72h、96h的存活率分别为90％、20％和0％，BUG1777对照组小鼠在相同时间的存活率分别为90％、30％和0％，而BUG1600原花青素治疗组小鼠在相同时间的存活率分别为100％、50％和10％。由此可见，原花青素可以延长单增李斯特菌感染小鼠的存活时间，在一定程度上提高感染小鼠的存活率。

Claims

1.原花青素在抑制单增李斯特菌分选酶催化活性及制备李斯特菌感染药物中的应用，其特征在于原花青素对Srt A肽酶活性的抑制作用。

2.如权利要求1所述的原花青素在抑制单增李斯特菌分选酶催化活性及制备李斯特菌感染药物中的应用，其特征在于所述的应用为原花青素在制备用于治疗由单增李斯特菌感染引起的疾病的药物中的应用。