CN113109288B - 一种利用太赫兹光谱快速检测自由基的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一种利用太赫兹光谱快速检测自由基的方法，包括以下步骤：将天然水凝胶材料加入沸水中，充分搅拌溶解，得到无色透明的水凝胶溶液A；待溶液温度降至50‑70℃，将该溶液倾入硅胶模具中，静置冷却至室温，得到水凝胶B；脱模取出水凝胶模块C，滴加过氧化氢水溶液和1mL的硫酸亚铁溶液，反应产生液体，利用太赫兹光谱检测反应产物从而确定自由基的浓度。本发明通过太赫兹光谱对水凝胶分解反应前后氢键网络变化的敏锐响应，实现对低浓度(10^‑6mol/L)自由基的检测；通过微电流协同催化水凝胶的分解反应，放大了响应信号，提高自由基的检测极限(10^‑9mol/L)。

Description

一种利用太赫兹光谱快速检测自由基的方法

技术领域

本发明涉及医疗卫生、环境化学、食品检测及公共安全等领域等快速检测领域，尤其涉及一种利用太赫兹光谱快速检测自由基的方法。

背景技术

自由基是指具有不配对电子的原子，原子团，分子或离子，包括氧原子经氧化还原产生的超氧阴离子自由基·O₂ ^-，羟自由基·OH，羧自由基 RCOO·以及一氧化氮自由基NO·等。自由基在生命体正常的新陈代谢中必不可少，如有氧呼吸中传递电子和能量的作用。身体里的自由基还可以帮助免疫系统对付外来的病原体。但是过量自由基对机体有广泛损伤，引发炎症，肿瘤及免疫系统疾病。此外，自由基检测在环境保护，食品加工，公共安全以及医疗卫生也有广泛使用。如：食物存储过程中的脂质氧化产生的脂氧自由基，出现“哈喇”味，影响风味，食用后对健康无益。公共安全中一氧化氮自由基NO·是重要的检测指标，这是因为NO·自由基引发的一系列复杂链式反应产生爆炸，瞬时能量巨大，破坏力极强。对低极限自由基的成功检测，能够有效预防重大恶性事件爆发，保障人们生命财产安全。

自由基反应性强，半衰期短，不易直接测定。目前常用的方法包括：电子自旋共振法，高效液相色谱法，荧光光度法，化学发光法，分光光度法等。这些检测方法多通过某些特定反应物对自由基捕捉，再测定捕捉产物生成量，来间接推断自由基含量。自由基捕捉剂的使用限制了自由基检测的普适性，捕捉剂与自由基的反应效率影响了检测效率，此外高浓度的捕捉剂对捕捉产物信号存在一定的掩盖，对检测灵敏度也有一定影响。目前需要开发出快速高效、检测限低，无需提前标记的自由基检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种快速高效，灵敏度高，无需提前标记的利用太赫兹光谱快速检测自由基的方法。

为了达成上述的目的，本发明提供了一种利用太赫兹光谱快速检测自由基的方法，包括以下步骤：

1)将天然水凝胶材料加入沸水中，充分搅拌溶解，得到无色透明的水凝胶溶液A；

2)待溶液温度降至50-70℃，将该溶液倾入硅胶模具中，静置冷却至室温，得到水凝胶B；上述温度优选为60℃，此时将溶液倒入硅胶模具中，水凝胶溶液还可保持液态，且分散均匀；温度太低将大大降低水凝胶的流动性。

3)脱模取出水凝胶模块C，滴加过氧化氢水溶液和硫酸亚铁溶液，反应产生液体，利用太赫兹光谱检测反应产物。此处水凝胶模块C是检测基质，硫酸亚铁溶液是催化剂，过氧化氢是自由基产生剂。检测环境中的羟基自由基，不用加过氧化氢溶液和硫酸亚铁溶液。

进一步地，其中步骤1)中，所述天然水凝胶材料与沸水的比例为 (0.1-2.0):100，优选为(0.3-0.8):100，在此优选范围内，水凝胶三维网络结构稳定，且能够较灵敏地与低浓度的自由基发生分解反应。

进一步地，其中步骤1)中，所述天然水凝胶材料包括，但不限于，琼脂糖，海藻酸钠，羧甲基纤维素钠以及淀粉。天然水凝胶具有良好的生物兼容性和可降解性，凝胶材料和水分子之间通过链间缠绕、氢键和静电吸引等物理作用将体系分子连接起来。合成水凝胶的性质则相反，体系间分子多是通过共价键、配位键等较强的化学键形成凝胶网络。为提高自由基引发的水凝胶链式分解反应的灵敏度，故选用天然水凝胶作为检测用水凝胶。

进一步地，其中步骤1)中，所述天然水凝胶材料选自琼脂糖，琼脂糖分子在沸水作用下交联成线性大分子，与水溶液互溶，待溶液冷却下来后，线性琼脂分子与水分子相互作用，形成稳定三维网状氢键结构，形成水凝胶固体。该水凝胶接触自由基后，琼脂糖分子间交联键断裂，与环境水之间的氢键体系也破坏，宏观表现为固-液混合状态。琼脂糖水凝胶的制备以及与羟基自由基的反应原理图如图5所示。

水凝胶是一种亲水性很强的三维网络结构凝胶，它在水中迅速溶胀并在此状态下保持大量水分而不溶解。凝胶分子间通过化学键相互交联，并且和水分子通过氢键形成三维网状结构，共同支持水凝胶的立体结构。在此结构中，水分子被包裹在网眼中间，不能自由流动。该水凝胶与自由基等强氧化剂接触后，引发分解反应，导致水凝胶分子的连接键打开，内部氢键网络被破坏，三维结构坍塌。分解反应后的水凝胶的聚集状态由固态变为固液混合状态。

进一步地，其中步骤1)中，所述水凝胶溶液A的浓度为 0.1wt％～2.0wt％，优选为0.3wt％-0.8wt％。在此优选范围内，水凝胶三维网络结构稳定，且能够较灵敏的与低浓度的自由基发生分解反应。

进一步地，其中步骤1)中，所述水凝胶溶液A的浓度为0.3wt％，其具体配制步骤包括：量取100mL的蒸馏水置于250mL烧杯中，加热至沸腾；称量0.3g的琼脂糖，加入沸水中，一边加热一边搅拌；待完全溶解后，得一无色透明的水凝胶溶液A。停止加热，静置降至室温，得一乳白色琼脂糖水凝胶(水凝胶B)。

进一步地，其中在步骤1)之后及步骤2)之前还包括加入导电材料的步骤。这是由于琼脂糖水凝胶不导电，进行微电流辅助反应有一定困难。通过在天然水凝胶中掺杂导电材料，不仅能保持水凝胶形貌，还能增加水凝胶的导电性，以制备导电水凝胶。导电材料包括，但不限于，NaCl(可得到乳白色的具有导电性能的琼脂糖水凝胶)，CaCl₂，石墨烯，碳纳米管或纳米银粒子(可得到灰黑色的具有导电性能的琼脂糖水凝胶)。

进一步地，其中所述导电材料与步骤1)中的水凝胶溶液A的重量比例为(0.01-0.02)：100，优选为0.015:100，此时的水凝胶中完全均匀的分散着导电材料。有利于最大程度的提高水凝胶体系的导电性。导电材料太多或者太少，会影响水凝胶体系的导电能力。

进一步地，其中在加入导电材料得到导电水凝胶模块C后，还包括：在导电水凝胶模块C中插入电催化装置的一对惰性电极，将一对惰性电极分别接入微型直流电，接通电路，开启催化模式。

进一步地，其中所述微型直流电的电压为1.5V～3.0V，优选为2.0V，此时电压强度能够加快羟基自由基的分解反应，对水凝胶模块B的稳定性影响也较小。电能可以通过恒电位仪提供，也通过蓄电池，干电池来提供。通过微电流协同自由基引发的水凝胶分解反应，放大分解反应，提高自由基的检测极限。

进一步地，其中所述电催化装置包括恒压电位仪、滑动变阻器、电流表、一对惰性电极，所述恒压电位仪的正极与滑动变阻器连接，所述滑动变阻器连接有其中一个惰性电极；所述恒压电位仪的负极与电流表连接，所述电流表与另一个惰性电极连接。

进一步地，其中在用于检测时，一对所述惰性电极分别插入所述导电水凝胶模块。

进一步地，其中一对所述惰性电极包括铂-碳电极或铂-铂-电极，但不限于此；铂电极可以为铂网电极、铂丝电极或铂片电极。

进一步地，其中步骤3)中，所述过氧化氢水溶液的浓度为1×10^-6 mol/L-1×10^{- 2}mol/L，此处过氧化氢溶液浓度与产生的羟基自由基浓度相对应，越低越好。不电催的检测极限是1×10^-6mol/L。

进一步地，其中步骤3)中，所述硫酸亚铁溶液的浓度为0.1×10^-2mol/L -1×10^{- 2}mol/L，优选为1×10^-2mol/L，此时的浓度能保证不同浓度过氧化氢溶液产生理论上所产生的自由基的量。

进一步地，其中步骤3)中，所述滴加速率为0.01ml/s-0.1ml/s，优选为 0.05ml/s，此时滴加的反应速率使溶液充分的混合均匀，滴加速率太慢会导致过氧化氢溶液在空气中被氧化分解一部分，从而影响实验的结果。

进一步地，其中步骤3)中，所述反应时间为10min-5h，优选为2h，此时水凝胶与自由基反应充分。

进一步地，其中步骤3)中，所述硫酸亚铁溶液的添加量为0.5-1ml。

进一步地，其中步骤3)中，所述自由基选自超氧阴离子自由基·O₂ ^-、羟自由基·OH、羧自由基RCOO·和一氧化氮自由基NO·中的一种。

进一步地，其中步骤3)中，所述太赫兹(THz)波是指频率在0.1—10THz (波长30μm—3mm)之间的电磁波，波段位于微波和红外之间。THz能够有效激发液态水中分子间氢键的共振，引发瞬态双折射信号，揭示水中介电敏感性分子间动力学信息，所以太赫兹对检测体系中的氢键变化有敏锐响应。由于THz光谱对检测体系内部氢键变化响应敏锐，所以水凝胶凝聚状态的轻微变化，THz即可给出强烈信号。基于此原因，通过太赫兹光谱对水凝胶内部氢键的细微变化，能够快速检测到引发水凝胶分解的自由基信号，快速高效，灵敏度高，且无需提前标记。

本发明中通过Fenton实验产生羟基自由基。比如将不同浓度的1mL H₂O₂溶液与1mL，10mmol/L的FeSO₄溶液混合，可立即产生羟基自由基。羟基自由基的产生的速度与FeSO₄的浓度相关，产生的浓度与H₂O₂的浓度相关。

本发明通过水凝胶的制备与筛选，自由基对水凝胶三维网络结构的破坏(自由基引发水凝胶的链式分解反应从而破坏水凝胶的三维网络结构，太赫兹对水凝胶内部氢键变化的敏锐响应，以及微电流协同催化提高自由基的检测极限)与太赫兹的灵敏响应及微电流协同催化提高自由基检测极限。本发明通过低浓度自由基引发水凝胶等聚合物发生分解反应，破坏水凝胶分子原有的三维网状氢键体系，宏观表现为水凝胶凝聚态由固态变为固液混合状态。

相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：

1、本发明不使用自由基捕捉剂，无需标记，是一种高灵敏度、简便快速的自由基检测方法。

2、本发明利用太赫兹对氢键变化的敏锐响应，实现了低浓度自由基的检测10^{- 6}mol/L。

3、本发明通过微电流协同检测，放大了水凝胶分解反应，加速了氢键变化，提高了自由基的检测极限，可达10^-9mol/L。

附图说明

图1是本发明实施例1中制备水凝胶模块的模具示意图；

图2是本发明实施例1中1×10^-2mol/L—1×10^-6mol/L羟基自由基的太赫兹时域光谱；

图2A为图2中的信号强度随羟基浓度变化的标准曲线；

图3是本发明实施例2中，微电流协同羟基自由基对水凝胶分解反应的太赫兹光谱，其中羟基自由基的浓度为1×10^-7mol/L—1×10^-9mol/L；

图3A为图3中的信号强度随羟基浓度变化的标准曲线；

图4是本发明实施例2中的电催化装置图；

图5是本发明中琼脂糖水凝胶的制备以及与羟基自由基的反应原理图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

以下材料或试剂，如非特别说明，均为购买。

以下结合附图及实施方式进一步说明本发明，应理解为，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：称取0.3g琼脂糖，加入到100ml沸水中，充分搅拌溶解，得一无色透明的水凝胶溶液A。待溶液温度降至60℃，得到乳白色半透明水凝胶B，趁热将溶液倾入标准容量(2g)的硅胶模具(图1，所述硅胶模具包括硅胶基底10以及开设于所述硅胶基底10上的多个模块，所述模块为圆形凹槽20(深度为1cm))中，每块模块中的硅胶质量约为2g，静置冷却至室温，脱模取出水凝胶模块C，置于反应容器中，滴加不同浓度的过氧化氢水溶液和1mL的1×10^-2mol/L的硫酸亚铁溶液，一份为空白对照，其他5组分别为1×10^-2mol/L，1×10^-3mol/L，1×10^-4mol/L，1×10^-5mol/L，1×10^-6 mol/L浓度的过氧化氢水溶液。取1mL上述过氧化氢溶液和1mL 10mmol/L FeSO₄溶液分别滴入固态的水凝胶模块C中，体系中立即产生羟基自由基。羟基自由基即刻引发琼脂糖水凝胶的分解反应，反应一段时间后(反应时间范围在10min-5h，优选为2h，此时水凝胶与自由基反应充分)，水凝胶模块C中有液体出现，用太赫兹光谱检测分解反应产生的液体，见图2。图2 是实施例1中1×10^-2mol/L—1×10^-6mol/L羟基自由基的太赫兹时域光谱。从图2中可以看出，不同浓度的羟基自由基对水凝胶分解反应的程度不同，水凝胶分解的速度不同，产物浓度不同，时域谱图中的信号强度不同，可从时域图谱中进行区分。通过THz光谱检测可以得到与浓度相关的羟基自由基信号，图2A为图2中的信号强度随羟基浓度变化的标准曲线，从图 2A中可以快速推导出环境体系中的羟基自由基浓度。

实施例2：称取0.3g琼脂糖，加入到100ml沸水中，搅拌溶解。一边加热一边搅拌。待完全溶解后，加入NaCl 0.02g，待溶液温度降至60℃，趁热将溶液倾入硅胶模具(图1，所述硅胶模具包括硅胶基底10以及开设于所述硅胶基底10上的多个模块，所述模块为圆形凹槽20(深度为1cm)) 中，每块模块中的硅胶质量约为2g，静置冷却至室温，得到乳白色半透明水凝胶B。脱模取出水凝胶模块C，置于反应容器中，插入图4所示的电催化装置的一对惰性电极4，5，接通电路。配制一系列不同浓度的H₂O₂溶液，分别为1×10^-7mol/L，1×10^-8mol/L，1×10^-9mol/L。取1mL上述过氧化氢溶液和1mL 10mmol/L FeSO₄溶液分别滴入固态的水凝胶模块C中，反应体系中立即产生羟基自由基。羟基自由基即刻引发琼脂糖水凝胶的分解反应，反应进行一段时间，固态水凝胶模块C中有液体出现。用不导电的水凝胶模块C做对比实验，配制1×10^-7mol/L，1×10^-8mol/L，1×10^-9mol/L的过氧化氢溶液。取1mL上述过氧化氢溶液和1mL 10mmol/L FeSO₄溶液分别滴入固态的水凝胶模块C中，反应体系中立即产生羟基自由基。羟基自由基引发琼脂糖水凝胶的分解反应，反应一段时间后，固态水凝胶模块C中有液体出现。通过太赫兹光谱对液体进行检测，见图3。图3是实施例2中，微电流协同羟基自由基对水凝胶分解反应的太赫兹光谱。羟基自由基的浓度为1×10^-7mol/L—1×10^-9mol/L。由图3可以看出，没有微电流协同催化，羟基自由基浓度为1×10^-7mol/L，1×10^-8mol/L，1×10^-9mol/L的样品的太赫兹折射率谱图无法区分，加入微电流协同自由基引发琼脂糖水凝胶的分解反应后，信号被放大，太赫兹折射率谱图可以区分1×10^-7mol/L，1×10^-8 mol/L，1×10^-9mol/L的羟基自由基样品。通过THz光谱检测可以得到与浓度相关的羟基自由基信号，图3A为图3中的信号强度随羟基浓度变化的标准曲线，从图3A中可以快速推导出环境体系中的羟基自由基浓度。

如图4所示，所述电催化装置包括恒压电位仪1、滑动变阻器2、电流表3、第一惰性电极4、第二惰性电极5，所述恒压电位仪1的正极与滑动变阻器2连接，所述滑动变阻器2连接有第一惰性电极4；所述恒压电位仪 1的负极与电流表3连接，所述电流表3与第二惰性电极5连接。在用于检测时，所述第一惰性电极4及第二惰性电极5分别插入导电水凝胶模块6。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种利用太赫兹光谱快速检测自由基的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将天然水凝胶材料加入沸水中，充分搅拌溶解，得到无色透明的水凝胶溶液A；

2）待溶液温度降至50-70℃，将该溶液倾入硅胶模具中，静置冷却至室温，得到水凝胶B；

3）脱模取出水凝胶模块C，滴加过氧化氢水溶液和硫酸亚铁溶液，反应产生液体，利用太赫兹光谱检测该液体中的自由基；

在步骤1）之后及步骤2）之前还包括加入导电材料的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述天然水凝胶材料与沸水的比例为（0.1-2.0）:100。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述天然水凝胶材料包括琼脂糖，海藻酸钠，羧甲基纤维素钠和淀粉中的至少一种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述水凝胶溶液A的浓度为0.1wt%~2.0wt%。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述导电材料包括NaCl、CaCl₂、石墨烯，碳纳米管和纳米银粒子中的至少一种。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述导电材料与步骤1）中的水凝胶溶液A的重量比例为（0.01-0.02）：100。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在加入导电材料得到导电水凝胶模块C后，还包括：在导电水凝胶模块C中插入一对惰性电极，将一对惰性电极分别接入微型直流电，接通电路，开启催化模式。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述惰性电极包括铂电极和碳电极中的至少一种。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微型直流电的电压为1.5V~3.0 V。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述过氧化氢水溶液的浓度为1×10^-6 mol/L-1×10^-2 mol/L；所述硫酸亚铁溶液的浓度为1×10^-2 mol/L；所述自由基选自超氧阴离子自由基·O₂ ^- 、羟自由基·OH、羧自由基RCOO·和一氧化氮自由基NO·中的一种。

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