CN113082011B - C644-0303在制备靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路的药物中的应用 - Google Patents
C644-0303在制备靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出一种C644‑0303在制备靶向抑制Wnt/β‑catenin信号通路的药物中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种新型的能够靶向Wnt/β‑catenin的抑制剂C644‑0303，经实验证明，C644‑0303对人结直肠癌HCT‑116、HT‑29、DLD‑1、LS‑174T有明显的抑制作用，且C644‑0303可抑制体内异种人结直肠癌HCT‑116和HT‑29移植瘤的生长，与Wnt/β‑catenin信号通路息息相关，这为后续新型小分子药物的研发奠定了基础。此外，本发明还基于3D培养方法和转录因子活性微孔板芯片进行了分析，使得检测分析更权威、更直观。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种C644-0303在制备靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路的药物中的应用。
背景技术
结直肠癌是男性和女性中最常见和最致命的癌症之一，55岁以下的成年人每年增加2％。目前，大肠癌的临床治疗主要是手术切除结合传统的放化疗，而靶向治疗相对较少。
Wnt信号通路的结构性激活，与结直肠癌的发生发展密切相关。经典的Wnt信号通路是指β-catenin依赖的Wnt信号通路。在静息状态下，活性β-catenin不会在细胞质中积累，会被复合物磷酸化，并通过泛素化被降解。当分泌的Wnt配体(例如Wnt3a)刺激细胞时，上述复合物失活，β-catenin被活化并入核。β-catenin与T细胞特异性转录因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF)形成活性复合物进一步诱导靶基因(如Cyclin D1、c-Myc和Axin2)转录调控的变化。
在过去的十年中，一些小分子化合物被报道能够下调Wnt信号，目前还没有药物可以用于临床实践。开发针对Wnt通路下游的抑制剂(例如靶向β-catenin或β-catenin/复合物)，使其处于可临床前状态，这将对大多数结直肠癌具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种C644-0303在制备靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路的药物中的应用，该C644-0303可对人结直肠癌有明显的抑制作用，且可抑制体内异种人结直肠癌HCT-116和HT-29移植瘤的生长，这为后续新型小分子药物的研发奠定了基础。
为了达到上述目的，本发明提供了一种C644-0303在制备靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路的药物中的应用。
作为优选，所述C644-0303的化学名称为(2E)-3-[(2-乙基-6-甲基苯基)氨基]-3-[(2-氟苄基)磺酰基]-2-(苯磺酰基)丙烯腈，并具有以下结构式：
上述方案中，所述C644-0303可直接于上海陶素生化科技有限公司购买，其中，化合物C644-0303的编号经由ChemDiv数据库提供。
作为优选，所述C644-0303能够抑制Wnt依赖细胞的生长，所述Wnt依赖细胞选自人结肠癌细胞HCT-116、人结肠癌细胞LS-174T、人结肠癌细胞HT-29和人结肠癌细胞DLD-1中的至少一种。
作为优选，所述C644-0303抑制人结肠癌细胞HCT-116生长的IC50为15.31μM，抑制人结肠癌细胞LS-174T生长的IC50为26.70μM，抑制人结肠癌细胞HT-29生长的IC50为16.91μM，抑制人结肠癌细胞DLD-1生长的IC50为10.51μM。
作为优选，所述C644-0303能够诱导HCT-116细胞凋亡呈剂量依赖性，其中，25μMC644-0303能够诱导3.8％的早期细胞凋亡，6.3％的晚期细胞凋亡；而50μM C644-0303能够诱导19.3％的早期细胞凋亡和37.2％的晚期细胞凋亡。
作为优选，所述抑制Wnt/β-catenin信号通路的药物为治疗结直肠癌的药物。
作为优选，所述C644-0303能够以剂量依赖性方式抑制人结肠癌细胞HCT-116细胞的运动能力，其中，10μM C644-0303已能明显抑制细胞的迁移，20μM时抑制效果更明显。
作为优选，所述C644-0303能够抑制人结肠癌细胞HCT-116和HT-29异种移植瘤的肿瘤体积和肿瘤重量，其中，接种HCT-116细胞的模型在15mg/kgC644-0303给药21天后，小鼠肿瘤体积平均抑制率28.4％和平均肿瘤重量抑制率29.6％；接种HT-29细胞的模型在15mg/kg C644-0303给药25天后，小鼠肿瘤体积平均抑制率23.9％和平均肿瘤重量抑制率35.5％。
本发明还提供了一种组合物，其特征在于，包括上述技术方案所述的具有Wnt/β-catenin信号通路抑制作用的C644-0303及其药学上可接受的盐与抗肿瘤药物、抗菌药物、抗病毒药物、抗寄生虫病药物、中枢神经系统系统药物、抗骨质增生药物、糖尿病药物中的至少一种进行联合应用得到的组合物
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明提供了一种新型的能够靶向Wnt/β-catenin的抑制剂C644-0303，经实验证明，C644-0303对人结直肠癌HCT-116、HT-29、DLD-1、LS-174T有明显的抑制作用，且C644-0303可抑制体内异种人结直肠癌HCT-116和HT-29移植瘤的生长，与Wnt/β-catenin信号通路息息相关，这为后续新型小分子药物的研发奠定了基础。此外，本发明还基于3D培养方法和转录因子活性微孔板芯片进行了分析，使得检测分析更权威、更直观。
附图说明
图1为本发明实施例1中验证C644-0303是Wnt/β-Catenin信号通路的小分子抑制剂示意图；
图2为本发明实施例2中验证C644-0303可抑制多种Wnt依赖细胞的生长示意图；
图3为本发明实施例3中验证C644-0303可对配体依赖的Wnt信号的激活具有抑制作用示意图；
图4为本发明实施例4中验证C644-0303抑制β-catenin活性和内源性Wnt靶基因表达示意图；
图5为本发明实施例5中验证C644-0303可阻滞Wnt依赖性结肠癌细胞的细胞周期并诱导其凋亡示意图；
图6为本发明实施例6中验证C644-0303抑制结肠癌细胞的迁移示意图；
图7为本发明实施例7中验证C644-0303显著抑制TCF/LEF活性示意图；
图8为本发明实施例8中C644-0303抑制结直肠癌细胞球化和生长示意图；
图9为本发明实施例10中验证C644-0303体内实验抑制Wnt依赖性肿瘤的生长的作用示意图；
图10为本发明实施例9中验证C644-0303对人结直肠癌异种移植瘤生长的抑制作用示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用试剂及耗材：
毫克级C644-0303(纯度>95％)由陶素公司提供；荧光素酶底物Steady-Glo购自Promega公司；DMEM(高糖)、RPMI-1640及胎牛血清购自Hyclone Thermo公司；RNA反转录试剂盒购自Invitrogen公司；96孔板购自Corning公司；一抗抗体均购自Cell SignalingTechnology公司；二抗购自爱必信；PVDF膜、ECL显影液购自Millipore公司；Lipo3000试剂购自peprotech公司；二抗(包括HRP羊抗鼠，HRP羊抗兔)购自爱必信；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo公司；SYBR Green PCR mix试剂盒，磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂Cocktail购自Roche公司；细胞周期染色试剂盒购自Lianke Bio公司；eBioscience Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自Invitrogen；TF活化分析板阵列II购自Signosis公司；TRIZOL试剂购自Gibco公司；5蛋白上样缓冲液、氯仿、异丙醇等常规化学试剂，上海生工或者麦克林提供；细胞培养皿及常规实验耗材离心管等由上海生工提供。
下述实施例中在涉及探究C644-0303作为新型Wnt/β-catenin信号通路抑制剂研究时所用的具体方法步骤如下：
S1：细胞培养：小鼠皮下结缔组织细胞LWnt-3A、人胚胎肾细胞HEK293T、人结肠癌细胞HCT-116、HT-29、DLD-1、LS-174T、人非小细胞肺癌NCI-H460和人乳腺癌细胞MCF-7，在37℃，5％CO2条件下培养。DMEM高糖培养基和RPMI-1640培养基包含双抗青霉素链霉素和10％胎牛血清FBS。
S2：蛋白提取：100mm细胞培养皿中将细胞培养至80％的汇合度，用4℃预冷的PBS清洗3次，随后用刮棒刮下细胞后收集好，2,500g离心1min，小心吸走上清使用配制的裂解液(50mMHEPES、pH7.0、250mMNaCl、0.1％NP-40、10％甘油、1mMPMSF、1mMDTT、1RocheCocktail)4℃，30min内裂解细胞，并全部转移到预冷的离心管中，超声30s，4℃下12,000rpm离心10min，取上清。进行BCA蛋白定量，样品加入5蛋白上样缓冲液在100℃下处理8min，随后进行Western-Blot分析。
S3：Western-Blot分析：配制8％～10％SDS-PAGE凝胶，80V，30min，120V1h电泳，完成后将聚丙烯酰胺凝胶浸泡至预冷的转膜缓冲液中，甲醇处理PVDF膜25s，进行三明治转膜，设定恒压90V2h。配制含5％脱脂奶粉的TBST，小心取出转印好的PVDF膜，蛋白面向上，室温封闭1～2h；一抗按说明书比例配制4℃孵育过夜，TBST清洗5次，每次5min；二抗，TBST清洗PVDF膜4次，每次10min。加ECL显影曝光。
S4：RNA提取：6孔板细胞培养至90～100％，弃培养基，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂(Gibco公司)1ml，摇匀，超净台内消化3～5min(待液体变粘稠，细胞脱壁)。依次收集至DEPC处理过的1.5mlEP管中，加新开的氯仿0.2ml，轻摇15s。室温静置2～3min，12,000rpm离心(15min，4℃)。取上清无色水相到新的DEPC处理过的EP管中，加0.5ml新开的异丙醇，室温静置10min，12,000rpm离心(10min，4℃)。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清，用DEPC水新配制的75％乙醇1.0ml洗涤，4℃温度下7,500rpm离心5min。去上清，吸干液体，室温干燥5～10min至管底透明。加入DEPC处理水20～30μl，55～60℃水浴10min溶解总RNA，测OD值。
S5：RT-PCR及荧光定量PCR：根据罗氏逆转录试剂盒进行反转录，取1μg总RNA进行反应。所用PCR引物如下：
β-catenin：正向5’-ACAACTGTTTTGAAAATCCA-3’；
反向5’-CGAGTCATTGCATACTGTCC-3’；
c-Myc：正向5’-GCTGCTTAGACGCTGGATTT-3’；
反向5’-CACCGAGTCGTAGTCGAGGT-3’；
CyclinD1：正向5’-CCATCCAGTGGAGGTTTGTC-3’；
反向5’-AGCGTATCGTAGGAGTGGGA-3’；
Axin2：正向5’-ACTGCCCACACGATAAGGAG-3’；
反向5’-CTGGCTATGTCTTTGGACCA-3’；
β-actin：正向5’-TTCGAAATCTTGCCCTTTGTCCCG-3’；
反向5’-AATTCGGTTGTGAACATCCCGAGC-3’。
所有引物使用58℃作为退火温度，延伸15s。
S6：荧光素酶活性分析：SKA细胞铺于96孔板中，每孔0.8104个细胞，100l体系，待细胞贴壁12h以后，更换含有C644-0303梯度浓度的新鲜培养基处理24h，处理24h后直接于每孔加入20lSteady-Glo稳定型荧光素酶底物，避光放置5min，测定荧光素酶的活性。
S7：细胞活性分析(MTT法)：分别将每孔0.8104个细胞铺于96孔板(100l)，12h后加不同C644-0303浓度，72h后测定，加入20l5mg/mlMTT溶液，培养箱培养3～4h，吸走孔内液体，加入100lDMSO完全溶解结晶，摇床轻晃5min，490nm测定吸光值。
S8：划痕实验：将HCT-116和HT-29细胞接种于6孔板上。当细胞扩散到6孔板上时，用200μl移液管尖划伤细胞表面。然后吸取旧培养基，用无菌PBS清洗细胞表面三次。最后，向每个孔中加入含或不含药物的1％FBS培养基。分别于0h、24h、48h后用蔡司Primovert倒置显微镜观察各组划痕宽度，并用ImageJ软件定量。
S9：流式细胞术检测细胞周期：HCT-116细胞加C644-0303(25M、50M)或加DMSO处理24h。培养细胞于10％FBS的DMEM培养基中，生长至80％汇合度，每个样品收集约106～107个细胞，用预冷的PBS洗涤两次。在预冷的70％乙醇中固定，在涡旋搅拌的同时向细胞沉淀中逐滴加入乙醇，最大限度避免细胞聚集，在恒定涡流下固定细胞，然后在4℃下孵育1h。用PBS洗涤2次，850g离心30s，小心弃去上清液。用核糖核酸酶处理细胞，加入50μlRnase储存液(100μg/mL)，200μlPI储存液(50μg/mL)，室温避光染色30min，流式细胞术测定各组细胞周期的百分率。
S10：流式细胞术检测细胞凋亡：HCT-116细胞加C644-0303(25M、50M)或加DMSO处理48h。贴壁细胞和培养基中的飘浮细胞均低速离心收集，使用预冷的PBS清洗两遍后，再分别加入500μLPBS将细胞重悬。将100μL细胞悬液，、4μL碘化丙啶和4μLAnnexinV-FITC混合到一起，避光反应15min。再分别加入400μLAnnexinV结合缓冲液，静置反应5min。随后尽快流式细胞仪检测。
S11：3D细胞培养模型：在中层嵌套中接种每孔25000个细胞，在顶层中，每孔40000个细胞。6天后，使用冰冷PBS-EDTA缓冲液(5mMEDTA，1mMNaVO4，1.5mMNaFinPBS)从3D培养物中提取细胞。然后用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合的细胞裂解缓冲液裂解细胞，提取蛋白。
S12：转录因子活性微孔板芯片检测：转录因子活性微孔板芯片检测试剂(Signosis，Inc)用于同时监测来自一个样本的96种不同转录因子的活化。用DMSO或C644-0303在20μM下处理HCT-116细胞18h，然后提取核蛋白，并按照制造商的说明进行TF活化试验。
S13：裸鼠移植瘤实验：将HCT-116和HT-29细胞悬浮于无血清培养基(5.0×106个细胞/只)中，皮下接种于6周龄雌性BALB/c-nu/nu小鼠右后侧。将小鼠随机分为两组，当肿瘤达到约100mm3时，用空白组(10％HS15、10％DMSO和80％生理盐水)或C644-030315mg/kg腹腔注射，每天给药并持续25天，每隔3天用游标卡尺测量瘤体的长径和短径，并记录称小鼠体重，观察记录小鼠异常的生理状况。接种HCT-116的给药21天后处死，接种HT29的给药25天后处死,解剖剥离移植瘤，拍照，称重。利用公式V(mm3)＝0.5×a(长径)×b(短径)2计算瘤体体积，绘制移植瘤生长曲线。
S14：免疫组织化学：得到的小鼠肿瘤标本用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋(FFPE)。FFPE切片在二甲苯中脱蜡，并在连续降低浓度的乙醇中再水化。然后将载玻片浸入EDTA抗原回收缓冲液(pH8.0)中并进一步在3％BSA中封闭，然后在4℃下与一级抗体(C-Myc，1:1600；Ki67，1:500)孵育过夜。切片在室温下用二级抗体进一步孵育50分钟。用DAB溶液孵育后，在200倍显微镜(日本尼康)下安装并观察所有载玻片，并用ImageJ拍照分析。
S15：数据计算及处理：实验均经过重复验证，与对照组数据的比值表示荧光素酶活性和细胞活性用。数据之间的显著性使用单因素方差分析比较；使用SPSS19软件计算IC50(EC50)计算，用±SD表示标准差。使用Origin8做柱状图及折线图。
实施例1验证C644-0303是Wnt/β-Catenin信号通路的小分子抑制剂
携带突变型β-catenin(CTNNB1)基因，缺失CK1α的Ser45磷酸化位点，导致活性β-catenin异常高表达。利用典型的Wnt依赖性肿瘤细胞系HCT-116构建了荧光素酶报告系统，筛选得到了C644-0303，利用萤火虫荧光素酶活性分析方法及细胞活性检测分析方法(如上S1、S6和S7方法)，验证并评估C644-0303对Wnt/β-Catenin信号抑制特异性和细胞毒性。
结果发现，C644-0303在0.9375μM、1.875μM、3.75μM、7.5μM、15μM、30μM、60μM范围内呈剂量依赖性方式有效抑制荧光素酶活性(IC50，4.20μM)和细胞活力(IC50，17.69μM)(图1A和1B)。
实施例2验证C644-0303可抑制多种Wnt依赖细胞的生长
为了测试C644-0303对Wnt/β-catenin信号通路的特异性，我选择了6个细胞系(见方法S7)，可分为两组：Wnt依赖细胞(HCT-116，LS-174T，HT-29，DLD-1)和Wnt非依赖细胞(NCI-H460，MCF-7)进行生长抑制试验。
结果发现，C644-0303抑制Wnt依赖性癌细胞系(IC50，5-25μM)的增殖，但对Wnt非依赖性癌细胞系(IC50>100μM)的存活率几乎没有影响，其中，人结肠癌细胞HCT-116生长的IC50为15.31μM，抑制人结肠癌细胞LS-174T生长的IC50为26.70μM，抑制人结肠癌细胞HT-29生长的IC50为16.91μM，抑制人结肠癌细胞DLD-1生长的IC50为10.51μM。如图2所示。
实施例3验证C644-0303可对配体依赖的Wnt信号的激活具有抑制作用
利用Wnt3a条件培养基(Wnt3aCM)诱导HEK293T细胞(见方法S2和S3)发现：C644-0303对配体依赖的Wnt信号β-catenin和下游c-Myc的高表达的激活具有抑制作用，如图3所示。
基于上述实施例1-3说明，C644-0303可选择性抑制Wnt信号传导，但对Wnt非依赖性细胞影响不大。因此，可认为C644-0303是一种潜在的Wnt/β-catenin抑制剂。
实施例4验证C644-0303抑制β-catenin活性和内源性Wnt靶基因表达
为了了解C644-0303对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用，检测了大肠癌细胞中β-catenin及其下游基因的表达水平(见方法S2和S3)。C644-0303处理HCT-116细胞18h后，活化β-catenin水平呈剂量依赖性下降，总β-catenin总蛋白水平没有显著变化(图4A)。活化β-catenin进入细胞核后，与TCF/LEF转录因子家族结合，启动下游靶基因(Axin2、CyclinD1和c-Myc)的转录。
C644-0303在20μM下可显著抑制HCT-116细胞中Wnt靶基因的转录(见方法S5)(图4B/C/D)。Axin2、c-Myc和CyclinD1的蛋白表达水平也随着C644-0303的浓度的升高而剂量依赖的降低(见方法S2和S3)(图4E)。
此外，如图4F所示，C644-0303(20μM)对Wnt信号转导靶基因具有与阳性β-catenin/TCF4拮抗剂LF3(50μM)相当的抑制作用。一致地，在HT-29和DLD-1细胞上观察到类似的结果(图4G)。因此，C644-0303在Wnt依赖的结直肠癌细胞中阻断β-catenin活化和一系列Wnt靶基因表达。
实施例5验证C644-0303可阻滞Wnt依赖性结肠癌细胞的细胞周期并诱导其凋亡
细胞周期调控是控制细胞增殖的关键，而Wnt信号通路与其密切相关，尤其是Wnt途径下游靶点，如参与了细胞周期的相变的cyclind1和c-Myc。上述实验已证实C644-0303下调了CyclinD1和c-Myc的表达，确定了C644-0303诱导的细胞周期阻滞(图5A，方法S9)。C644-0303处理后S期细胞比例下降(对照：41.25％；25μM:36.53％；50μM:30％)。
据报道，Wnt/β-catenin信号通路通过多种机制调节细胞凋亡。接下来，研究了C644-0303对细胞凋亡的影响(图5B，方法S10)。
结果表明，C644-0303诱导HCT-116细胞凋亡呈剂量依赖性。25μMC644-0303可诱导3.8％的早期细胞凋亡(AnnexinV+/PI-)，6.3％的晚期细胞凋亡(AnnexinV+/PI+)，而50μMC644-0303可诱导19.3％的早期细胞凋亡和37.2％的晚期细胞凋亡。因此，C644-0303在体外阻断了Wnt依赖性结肠癌细胞的细胞周期并诱导其凋亡。
实施例6验证C644-0303抑制结肠癌细胞的迁移
由于Wnt信号通路在细胞迁移中起重要作用，因此通过伤口愈合实验评估C644-0303对细胞迁移的影响(方法S8)。与载体相比，C644-0303以剂量依赖性方式显著抑制HCT-116细胞的运动能力(图6A)，其中10μMC644-0303已能明显抑制细胞的迁移，20μM时抑制效果更明显，呈剂量依赖性抑制。软件计算的伤口愈合率，如图6B所示，10μM C644-0303愈合率79.08％，20μM C644-0303愈合率87.59％，客观反映了C644-0303对细胞迁移的抑制作用。
实施例7验证C644-0303显著抑制TCF/LEF活性
为了获得受C644-0303影响的潜在转录因子的概述，测定了同时分析96种不同转录因子的转录因子活化谱(方法S12)。
数据显示，用浓度为20μM的C644-0303处理后，96个转录因子中有20个表现出高抑制活性(截取值：-log2(RLU)>4)(图7A)。其中，细胞核TCF/LEF转录活性下调最为显著。这进一步支持C644-0303是Wnt信号通路抑制剂。
此外，还观察到如MycMax、雄激素受体(AR)、信号转导和转录激活因子5(STAT5)和Ets1等其他肿瘤相关转录因子(图7B)的强烈下调。使用IPA(IngenuityPathwayAnalysis)，总结了重要转录因子与疾病和功能之间的关系(图7C)，C644-0303强烈下调除TCF/LEF外的其他癌症相关转录因子，如STAT5、AR和Myc-Max，这些因子在癌细胞增殖、细胞粘附、凋亡和血管生成等作用中都发挥重要的作用，涉及的肿瘤类型包括前列腺癌、急性淋巴细胞白血病和原发性前列腺癌和转移癌等。大多数转录因子在功能上与肿瘤进展有关。提示C644-0303可能通过抑制Wnt/β-catenin信号外的多种促瘤信号发挥抗肿瘤作用。
实施例8验证C644-0303抑制结直肠癌细胞球化和生长
肿瘤球体可以更好地模拟体内肿瘤细胞的状态，更准确地预测药物的反应。探讨了C644-0303在两种不同的三维(3D)培养体系中的效率(见方法S11)。嵌入式培养系统更真实地还原了3D培养环境，而顶部培养系统更有利于观察和成像，因此，结合这两种培养方法可以更准确地验证C644-0303的效果。
在嵌入式系统中，每孔25000个细胞(24孔板)与C644-0303处理一起均匀地铺于Matrigel中。从培养第3天到第6天，对细胞球体的直径进行跟踪测量，客观地反映了细胞球体的生长过程。培养4天后，可观察到C644-0303抑制HCT-116细胞的球体形成(图8A)。C644-0303处理持续抑制细胞球体的增大(图8B)。同样，在顶部培养系统中，C644-0303处理的HCT-116细胞群稀疏且粒径较小，与对照组形成鲜明对比(图8C)。在顶部培养期间，有或没有C644-0303的球体直径变化如图8D所示。
培养观察后，提取全细胞蛋白并进行定量(见方法S2和S3)。结果进一步支持C644-0303可抑制Wnt依赖性结直肠癌细胞的球体生长(图8E和8F)。活化β-Catenin在3D系统中也被抑制(图8G)。这一结论在三维培养的HT-29细胞系统中也得到了验证(图8H和8I)。
进一步研究发现(见方法S4和S5)，在C644-0303治疗的HCT-116细胞(图8J和8K)中，大肠癌干细胞(CSCs)特征基因(如CD44和LGR5)的mRNA水平也被发现显著降低，表明C644-0303可能对Wnt依赖的CSCs具有抑制作用。
实施例9验证C644-0303对人结直肠癌异种移植瘤生长的抑制作用
进一步在体内检测了C644-0303对HCT-116和HT-29异种移植瘤的抗肿瘤作用(方法S13)。肿瘤体积达到100mm3后，每2天腹腔注射C644-030315mg/kg或DMSO，接种HCT-116细胞的给药21天后处死，接种HT29细胞的给药25天后处死。如图10A-10C所示，与对照组相比，接种HCT-116细胞的模型小鼠肿瘤体积(图10A和10C)平均抑制率28.4％(p＜0.05)和平均肿瘤重量(图10B)抑制率29.6％，接种HT-29细胞的模型小鼠肿瘤体积平均抑制率23.9％(p＜0.05)和平均肿瘤重量抑制率35.5％(p＜0.05)(图10E-G)。
小鼠体重无明显变化，未观察到明显的器官损伤，表明所有治疗均无或低毒(图10D和10H)。
实施例10验证C644-0303体内实验抑制Wnt依赖性肿瘤的生长的作用
为了检测C644-0303对体内肿瘤细胞恶性增殖的影响，对异种移植瘤进行Ki67染色(方法S14)。观察到，在C644-0303治疗的HCT-116和HT-29肿瘤中，与对照组相比，Ki67的表达降低(图9A)。并对Ki67阳性百分率或平均光密度(AOD)进行定量(图9C和9D)。此外，Wnt靶基因c-Myc的阳性细胞百分比被染色(图9B)。
与体外结果一致，用C644-0303治疗的HCT-116异种移植瘤中的c-Myc显著降低(图9E)。在C644-0303处理的HT-29异种移植瘤中也观察到c-Myc阳性细胞百分比的降低(图9F)，以及c-Myc mRNA水平的降低(图9G)。这些结果表明，C644-0303除了对体外观察到的细胞株有生长抑制作用外，在体内也能抑制Wnt依赖性肿瘤的生长。
Claims (6)
1.C644-0303在制备靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路的结直肠癌药物中的应用，其特征在于，所述C644-0303的结构式如下：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述C644-0303能够抑制Wnt依赖细胞的生长，所述Wnt依赖细胞选自人结肠癌细胞HCT-116、人结肠癌细胞LS-174T、人结肠癌细胞HT-29和人结肠癌细胞DLD-1中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述C644-0303抑制人结肠癌细胞HCT-116生长的IC50为15.31μM，抑制人结肠癌细胞LS-174T生长的IC50为26.70μM，抑制人结肠癌细胞HT-29生长的IC50为16.91μM，抑制人结肠癌细胞DLD-1生长的IC50为10.51μM。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述C644-0303能够诱导HCT-116细胞凋亡呈剂量依赖性，其中，25μM C644-0303能够诱导3.8%的早期细胞凋亡，6.3%的晚期细胞凋亡；而50μM C644-0303能够诱导19.3%的早期细胞凋亡和37.2%的晚期细胞凋亡。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述C644-0303能够以剂量依赖性方式抑制人结肠癌细胞HCT-116细胞的运动能力。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述C644-0303能够抑制人结肠癌细胞HCT-116和HT-29异种移植瘤的肿瘤体积和肿瘤重量，其中，接种HCT-116细胞的模型在15mg/kg C644-0303给药21天后，小鼠肿瘤体积平均抑制率28.4%和平均肿瘤重量抑制率29.6%；接种HT-29细胞的模型在15 mg/kg C644-0303给药25天后，小鼠肿瘤体积平均抑制率23.9%和平均肿瘤重量抑制率35.5%。
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