CN113061564A - 一种使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法 - Google Patents
一种使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，通过将裂殖壶菌在逐渐增加木糖与葡萄糖的比例的驯化培养基中进行驯化培养得使得裂殖壶菌可以在富含木糖培养基中进行正常生长代谢且生产脂质化合物。本发明提供的方法，增加了裂殖壶菌可利用的底物种类，有助于后面裂殖壶菌对木制纤维素的高效利用，此外本发明的驯化方法目的性强，效率高，使得裂殖壶菌不仅可以在富含木糖的培养基上进行正常的生长代谢，而且可以保证裂殖壶菌的生物量、总油脂、DHA等指标，该方法有利于加强对廉价原材料木质纤维素的高效利用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法。
背景技术
由于化石原料的大量使用，能源短缺与环境污染的现象越来越严重。这使可再生能源受到越来越多的关注。木质纤维素是地球上最广泛存在的生物质，主要存在于农业副产品、城市固体废物、低投入能源作物和森林残留物中，占全球生物质总量的一半。木质纤维素主要由木质素，纤维素和半纤维素组成，经酸碱预处理和酶水解后可以产生一些糖类，其中约38％-50％为葡萄糖，23％-32％为木糖。由此可见，木糖是木质纤维素水解后的第二大糖源，要想能高效充分的利用木质纤维素，就必须能高效利用木糖。
裂殖壶菌是一种异养，油质的海洋生物，具有巨大的脂质化合物物生产潜力。裂殖壶菌积累的油脂中，有50％左右为二十二碳六烯酸(DHA)组分，因此是目前世界公认的最适合量产DHA油脂的微生物。目前裂殖壶菌主要以葡萄糖为碳源生产脂质化合物，导致微生物油脂的生产成本较高。研究表明，以葡萄糖作为碳源生产油脂的成本占整个生产过程总成本的80％。因此为了降低微生物油脂的生产成本，使其更具有市场竞争优势和可推广性，急需寻找廉价原料代替葡萄糖，以便使得微生物油脂具有更好的应用价值。专利CN201510001843.8通过开发一种甘蔗糖蜜的前处理工艺及发酵生产工艺，得到符合裂殖壶菌发酵生产DHA的廉价原材料——糖蜜处理液；专利CN201410119673.9公开了一种利用葡萄糖和甘油为混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法，发明结果表明混合碳源发酵不仅提高了底物利用率，又提高了DHA的发酵水平，有利于促进裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化发展，此外有文献报道以甘油为碳源培养裂殖壶菌时，有利于提高油脂中DHA的含量(AmbExpress,2018,8(1):7.)。然而，目前尚且没有报道描述裂殖壶菌在以木糖为主要碳源下的生长能力。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，不仅增加了裂殖壶菌可利用底物的种类，而且可以使廉价的可再生的原材料木质纤维素可以被更加高效转变为高附加值产品。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，将裂殖壶菌在含木糖的驯化培养基中进行驯化培养最终得使得裂殖壶菌可以在富含木糖培养基中进行正常生长代谢且生产脂质化合物。
其中，通过在驯化培养基中逐渐增加木糖与葡萄糖的比例使得裂殖壶菌可以在富含木糖培养基中进行正常生长代谢且生产脂质化合物。
进一步地，通过在驯化培养基中逐渐增加木糖与葡萄糖的质量比，从等比例按质量分数4.5-5％增加到86-90％。
作为优选，通过在驯化培养基中逐渐增加木糖与葡萄糖的质量比例从1:1按质量分数5％增加到18:2。
进一步地，所述的使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，具体包括如下步骤：
(1)将冻存的裂殖壶菌菌种接入以葡萄糖为主要碳源的培养基中进行活化培养，然后转接2～3代培养形成裂殖壶菌种子液；
(2)将裂殖壶菌种子液接种含木糖和葡萄糖的混合培养基中进行第一梯度驯化培养；
(3)当第一梯度的驯化培养基中菌株浓度以正常生长速度生长到OD600为12～18，将第一梯度形成的种子液接入木糖含量增加第二梯度的驯化培养基中继续进行驯化培养，直至菌株可以以正常生长速度生长到OD600为12～18(即对数生长期左右)；
(4)依次重复步骤(3)进行梯度驯化培养，每个梯度均培养到菌株可以以正常生长速度生长到OD600为12～18接种到下一梯度培养，依次培养到木糖与葡萄糖的比例为86-90％的第九梯度；
(5)将步骤(4)驯化后的菌种接种在富含木糖的培养基中进行发酵培养，对发酵后的脂质化合物进行含量及成分的测定。
其中，步骤(2)中将步骤(1)所得种子液接种到以30～60g/L的木糖及其与葡萄糖的质量比为1：1的第一梯度的驯化培养基中，控制菌液的初始浓度OD600为0.2～0.3，于28℃～30℃、170～220rpm的条件下培养至0D600为12～18后，仍然控制起始接种OD600为0.2～0.3在第一梯度驯化进行传代，直至菌株的生长速度与在以葡萄糖为碳源的培养基中生长速度一致后，生长到OD600为12～18，再按相同的条件接种到步骤(3)中的第二梯度驯化培养基继续驯化。
所述菌株浓度以正常生长速度生长到OD600为12～18是指菌株的生长速度与在以葡萄糖为碳源的培养基中生长速度一致后，生长到OD600为12～18，其中以葡萄糖为碳源的培养基是指将梯度驯化培养基中的木糖替换成葡萄糖。
其中，步骤(4)中以质量分数4.5-5％含量逐渐增大木糖的比例依次接种到第九梯度的驯化培养基中，第九培养基中木糖与葡萄糖的比例86-90％。
作为优选，步骤(4)中以质量分数5％含量逐渐增大木糖的比例依次接种到第九梯度的驯化培养基中，第九培养基中木糖与葡萄糖的比例18:2。
其中，步骤(5)驯化后的菌种接种在富含木糖的培养基中进行摇瓶发酵培养，最后通过酶解及萃取的方法提取油脂，通过气相色谱观察油脂的产量及组成成份。
作为优选，各个梯度培养基中除不同比例的木糖与葡萄糖还包括酵母膏10～15g/L、硫酸钠10～15g/L、硫酸镁3～5g/L、硫酸铵5～10g/L、氯化钾1～2g/L、氯化钙0.1～0.2g/L、硫酸钾0.5～1g/L、磷酸二氢钾1～3g/L、谷氨酸钠8～12g/L，七水合硫酸锌1～5mg/L、六水合氯化钴0.01～0.1mg/L、五水合硫酸铜2～6mg/L、六水合硫酸镍1～2mg/L、七水合硫酸铁8～15mg/L、泛酸钙2～4mg/L、四水合氯化锰3～5mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B19.5 mg/L、维生素B12 0.15mg/L。
作为优选，步骤(5)所述富含木糖的培养基包括木糖30～60g/L、酵母膏10～15g/L、苹果酸5～10g/L、玉米浆10～15g/L、硫酸钠10～15g/L、硫酸镁3～5g/L、硫酸铵5～10g/L、氯化钾1～2g/L、氯化钙0.1～0.2g/L、硫酸钾0.5～1g/L、磷酸二氢钾1～3g/L、谷氨酸钠8～12g/L，七水合硫酸锌1～5mg/L、六水合氯化钴0.01～0.1mg/L、五水合硫酸铜2～6mg/L、六水合硫酸镍1～2mg/L、七水合硫酸铁8～15mg/L、泛酸钙2～4mg/L、四水合氯化锰3～5mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B19.5 mg/L、维生素B12 0.15mg/L。
适应进化，又称定向进化、实验室进化或驯化，是目前备受欢迎的菌种改良技术，能够使菌株在较短的时间内有效地改变菌株的某些表型或生理特性(如菌体生长速度，底物消耗速度，耐受高温高低pH值以及不同有机溶剂等)，并且基本不会影响除目的表型外的其他优良性状。本发明通过基因组对比，发现裂殖壶菌中存在完整的木糖代谢途径。然后在同时以葡萄糖和木糖为主要碳源的培养基中对裂殖壶菌进行培养，通过用液相检测培养液中糖成份变化(如图1，2，3，其中图1和2是以实施例中1中的种子液接种到10g/L葡萄糖+50g/L木糖为碳源的发酵培养基(其余原料同实施例1)中在28℃，200rpm的摇床中进行摇瓶发酵培养)，根据液相结果发现在24h时葡萄糖被用光，木糖含量无明显变化，但有少量木糖代谢途径的下游产物木糖醇或木酮糖产生(由于木糖醇和木酮糖的出峰时间完全一致，所以不能通过液相区分两种化合物)，通过液相结果可以得出，裂殖壶菌不能利用木糖进行正常的生长代谢。但在24h时检测到了木糖代谢途径的下游产物的微量存在，表明裂殖壶菌存在利用木糖进行正常生长代谢且生产脂质化合物的潜力。因此本发明采用驯化的方法通过在特定比例和梯度富含木糖的驯化培养基中对裂殖壶菌进行驯化培养，从而达到使裂殖壶菌可以很好的在富含木糖的培养基中正常生长且生产脂质化合物的目的。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供了一种使裂殖壶菌在富含木糖培养基中进行正常生长代谢的方法，增加了裂殖壶菌可利用的底物种类，有助于后面裂殖壶菌对木制纤维素的高效利用，本发明的驯化方法目的性强，效率高，使得裂殖壶菌不仅可以在富含木糖的培养基上进行正常的生长代谢，而且可以保证裂殖壶菌的生物量、总油脂含量及油脂成份等指标不发生明显变化。
(2)本发明通过液体培养基传代驯化培养方法，使得裂殖壶菌能在富含木糖培养基中进行正常生长代谢，生产脂质化合物，也可以实现同时达到了筛选在富含木糖培养基中生产脂质化合物菌株的目的。
(3)本发明所使用的驯化方法也为其它菌种增加可利用底物种类提供了借鉴意义。
附图说明
图1为以10g/L葡萄糖+50g/L木糖为碳源培养裂殖壶菌0h的培养液色谱图；
图2为以10g/L葡萄糖+50g/L木糖为碳源培养裂殖壶菌24h的培养液色谱图；
图3为图1和图2的两个色谱图叠加比较；
图4为实施例1中每一梯度在由生长速度慢长到生长速度正常所经需要的传代次数。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
本发明使用的菌种为裂殖壶菌ATCC-20888(购买自美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)为野生型裂殖壶菌，甘油管中保存。本发明也可以使用其他任何野生型的裂殖壶菌效果基本一致。
种子培养基：葡萄糖30～70g/L、酵母膏10～15g/L、硫酸钠10～15g/L、硫酸镁3～5g/L、硫酸铵5～10g/L、氯化钾1～2g/L、氯化钙0.1～0.2g/L、硫酸钾0.5～1g/L、磷酸二氢钾1～3g/L、谷氨酸钠8～12g/L、七水合硫酸锌1～5mg/L、六水合氯化钴0.01～0.1mg/L、五水合硫酸铜2～6mg/L、六水合硫酸镍1～2mg/L、七水合硫酸铁8～15mg/L、泛酸钙2～4mg/L、四水合氯化锰3～5mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B19.5 mg/L、维生素B12 0.15mg/L。
其中，在进行每一个实施例中具体培养基配制的时候，可以任选一个浓度进行试验的配置。
驯化培养基：酵母膏10～15g/L、硫酸钠10～15g/L、硫酸镁3～5g/L、硫酸铵5～10g/L、氯化钾1～2g/L、氯化钙0.1～0.2g/L、硫酸钾0.5～1g/L、磷酸二氢钾1～3g/L、谷氨酸钠8～12g/L，七水合硫酸锌1～5mg/L、六水合氯化钴0.01～0.1mg/L、五水合硫酸铜2～6mg/L、六水合硫酸镍1～2mg/L、七水合硫酸铁8～15mg/L、泛酸钙2～4mg/L、四水合氯化锰3～5mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B19.5 mg/L、维生素B12 0.15mg/L、不同浓度的葡萄糖及木糖。
其中，在进行每一个实施例中具体培养基配制的时候，选定与本实施例驯化培养基一致的配方，但需要修改其中葡萄糖的浓度及添加额外浓度的木糖。
发酵培养基：木糖30～60g/L、酵母膏10～15g/L、苹果酸5～10g/L、玉米浆10～15g/L、硫酸钠10～15g/L、硫酸镁3～5g/L、硫酸铵5～10g/L、氯化钾1～2g/L、氯化钙0.1～0.2g/L、硫酸钾0.5～1g/L、磷酸二氢钾1～3g/L、谷氨酸钠8～12g/L，七水合硫酸锌1～5mg/L、六水合氯化钴0.01～0.1mg/L、五水合硫酸铜2～6mg/L、六水合硫酸镍1～2mg/L、七水合硫酸铁8～15mg/L、泛酸钙2～4mg/L、四水合氯化锰3～5mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B19.5 mg/L、维生素B12 0.15mg/L。
其中，在进行每一个实施例中具体培养基配制的时候，可以任选一个浓度进行试验的配置。
实施例1
培养基：
种子培养基：葡萄糖50g/L、酵母膏15g/L、硫酸钠13g/L、硫酸镁4g/L、硫酸铵8g/L、氯化钾2g/L、氯化钙0.2g/L、硫酸钾0.8g/L、磷酸二氢钾2g/L、谷氨酸钠9g/L、七水合硫酸锌4mg/L、六水合氯化钴0.06mg/L、五水合硫酸铜5mg/L、六水合硫酸镍2mg/L、七水合硫酸铁9mg/L、泛酸钙3mg/L、四水合氯化锰4mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B19.5 mg/L、维生素B12 0.15mg/L。
驯化培养基：酵母膏15g/L、硫酸钠13g/L、硫酸镁4g/L、硫酸铵8g/L、氯化钾2g/L、氯化钙0.2g/L、硫酸钾0.8g/L、磷酸二氢钾2g/L、谷氨酸钠9g/L、七水合硫酸锌4mg/L、六水合氯化钴0.06mg/L、五水合硫酸铜5mg/L、六水合硫酸镍2mg/L、七水合硫酸铁9mg/L、泛酸钙3mg/L、四水合氯化锰4mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B19.5 mg/L、维生素B120.15mg/L、不同浓度的葡萄糖及木糖。
其中第一梯度驯化培养基中：木糖30g/L，葡萄糖30g/L。
其中第二梯度驯化培养基中：木糖33g/L，葡萄糖27g/L。
其中第三梯度驯化培养基中：木糖36g/L，葡萄糖24g/L。
其中第四梯度驯化培养基中：木糖39g/L，葡萄糖21g/L。
其中第五梯度驯化培养基中：木糖42g/L，葡萄糖18g/L。
其中第六梯度驯化培养基中：木糖45g/L，葡萄糖15g/L。
其中第七梯度驯化培养基中：木糖48g/L，葡萄糖12g/L。
其中第八梯度驯化培养基中：木糖51g/L，葡萄糖9g/L。
其中第九梯度驯化培养基中：木糖54g/L，葡萄糖6g/L。
发酵培养基：木糖60g/L、酵母膏15g/L、苹果酸10g/L、玉米浆15g/L、硫酸钠13g/L、硫酸镁4g/L、硫酸铵8g/L、氯化钾2g/L、氯化钙0.2g/L、硫酸钾0.8g/L、磷酸二氢钾2g/L、谷氨酸钠9g/L、七水合硫酸锌4mg/L、六水合氯化钴0.06mg/L、五水合硫酸铜5mg/L、六水合硫酸镍2mg/L、七水合硫酸铁9mg/L、泛酸钙3mg/L、四水合氯化锰4mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B19.5mg/L、维生素B12 0.15mg/L。
利用木糖和葡萄糖作为主要碳源对裂殖壶菌进行驯化的具体步骤：
1、从甘油管将-80℃冻存的不能利用木糖进行正常生长代谢的原始菌株接种于装有100m L种子培养基的500mL三角瓶中，28℃、200rpm培养24h，然后将活化的菌株以以体积比1％的接种量按相同的条件转接于液体培养基继续培养，连续转接两次得到形态良好活力良好的种子液；
2、将种子液按OD600约为0.2～0.3的接种量接入装有第一梯度驯化培养基量为100mL/500mL的三角瓶中在28℃、200rpm下进行驯化培养，观察培养过程中裂殖壶菌的生长形态、活力及培养基中木糖和葡萄糖含量的变化，当OD600到达15时，控制菌液的初始浓度OD600为0.2～0.3继续在第一梯度驯化培养中传代，直至菌株的生长速度变正常后培养到D600到达15，再以相同的接种量接种到第二梯度驯化培养基中按相同的方法继续驯化培养；
3、按步骤2的方法进行梯度驯化培养，每个梯度均培养到菌株可以以正常生长速度生长到OD600为15接种到下一梯度培养，直到接种到第九梯度培养基中，直到菌株的生长速度变正常后培养到D600到达15，将第九梯度驯化培养基中驯化后的菌种以10％(V/V)的接种量接种在富含木糖的培养基中在28℃，200rpm的摇床中进行摇瓶发酵培养120h，发酵结束后通过酶解及萃取的方法提取油脂，通过气相色谱观察油脂的产量及组成成份。
图4是在含木糖培养基中驯化裂殖壶菌的曲线图，经过9个梯度的连续驯化培养,逐渐增加裂殖壶菌对木糖的利用,直至达到裂殖壶菌在富含木糖的培养基中进行正常生长代谢并生产脂质化合物。
油脂提取及检测的具体方法如下。
1、将发酵液的pH调为10～12加入发酵液体积比为0.5％的溶壁酶，于50℃酶解90min，使菌体完全破碎；
2、按照和发酵液体积比1:1的比例加入无水乙醇，使蛋白沉淀下来；再加入适量正己烷，充分摇匀，静置分层，取上层有机相置于干燥的磨口锥形瓶中，用正己烷重复萃取3～5次，直至上层有机相呈无色透明；
3、对所得液体进行旋蒸萃取，旋蒸前对瓶体进行称重，50℃进行旋蒸直至不再有正己烷液体滴落；将旋蒸后装有油脂烧瓶的置于烘箱干燥至恒重，称重计算油脂含量；
4、对所得到的油脂进行甲酯化(为上气相色谱测油脂成份做准备)：加1ml的氢氧化钾甲醇溶液到1.5ml离心管，加20μl油脂(第3步恒重后的液体)于其中混匀，然后将其转入到20ml的容量瓶中，再加2ml氢氧化钾甲醇溶液于容量瓶中，混匀后65℃水浴17min，冷却至室温；加2ml三氟化硼乙醚(三氟化硼：乙醚＝3:7)，混匀后65℃水浴7min；再加2ml饱和氯化钾摇匀，加3ml正己烷(色谱级)，静置置分层；
5、将液体倒入小离心管中取上层正己烷相过微孔膜去杂质，制样后用气相色谱进行检验，计算油脂和DHA含量。
气相色谱检验方法：参照陈丽珠的《流加培养裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸检验方法》中二十二碳六烯酸的检测方法的色谱条件：选取毛细管色谱柱(60m X 0.32nm X15um)。采用程序升温：初始温度200℃,保持2min,然后按10℃/min升到240℃,保持40min.柱圧200kPa,迸祥口温度250℃,柆測器温度28 0℃.用内标法定量，内标为二十烷酸。
生物量的测定测的具体方法如下：
参考文献“使用稀禾定驯化提高裂殖壶菌的生长和DHA积累”：取3mL刚发酵完成的的发酵液，10000r/min离心5min，弃上清液后，用p H 6.5的PBS溶液洗涤2次,置于-80℃冰箱中冻结细胞,然后用冷冻干燥机冻干至恒重，最后称量计算。
结果表明：
原始未经驯化的裂殖壶菌菌株不能在以木糖为主要碳源的发酵培养基中进行正常生长代谢。通过实施例1液体培养基传代驯化方法得到的驯化菌株可以在富含木糖的培养基中进行正常的生长代谢。通过在28℃，200rpm条件下进行发酵培养，5天达最大生物量81.4g/L，总油脂含量为39.2g/L，DHA占总脂肪酸37.1％，其结果如表1所示。
表1原始菌株与驯化菌株发酵结果对比
由表1可知，原始菌种在不能在本发明实施例1以木糖为主要碳源的发酵培养基中进行正常生长代谢，将本发明实施例1发酵培养基中的木糖替换成等量的葡萄糖，原始菌种在葡萄糖发酵培养基上发酵良好，而本发明实施例1驯化菌株可以在木糖发酵培养基生长，各指标基本可以达到葡萄糖发酵培养基中发酵，同时驯化菌株仍然可以在葡萄糖发酵培养基上发酵良好生长，各指标与原始菌种保持一致。
此外，本发明的方法中木糖的初始浓度以及木糖的梯度增加浓度非常重要。选择的初始葡萄糖浓度太高对菌株没有驯化作用，太低会给菌株造成太大的压力使菌株在初始培养基中无法生长，设置的梯度木糖糖浓度是逐渐缓慢变化的，使菌在慢慢增加的压力中被改变，木糖增加浓度太高或者太快会给菌株的压力猛然加大，导致菌株无法接受，太低无法实现循环；本发明结合对裂殖壶菌的生长特性长期研究发现，通过特定起始木糖浓度的梯度驯化培养基，经过特定浓度的梯度增加浓度，最终通过8次梯度增加(每次5％)最终实现裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物。
实施例2
实施例2与实施例1方法相同，不同之处在于：控制菌液的初始浓度OD600为0.2～0.3，于30℃、170rpm的条件下培养当第一梯度的驯化培养基中菌株浓度以正常生长速度生长到OD600为12，将第一梯度形成的种子液接入木糖含量增加第二梯度的驯化培养基中继续进行驯化培养，直至菌株可以以正常生长速度生长到OD600为12；依次重复步骤(3)进行梯度驯化培养，每个梯度均培养到菌株可以以正常生长速度生长到OD600为12接种到下一梯度培养，依次培养到木糖与葡萄糖的比例为18:2的第九梯度，直到菌株的生长速度变正常后培养到D600到达12；将驯化后的菌种接种在富含木糖的培养基中进行发酵培养，28℃，200rpm的摇床中进行摇瓶发酵培养120h。
实施例3
实施例3与实施例1方法相同，不同之处在于：控制菌液的初始浓度OD600为0.2～0.3，于28℃、220rpm的条件下培养当第一梯度的驯化培养基中菌株浓度以正常生长速度生长到OD600为18，将第一梯度形成的种子液接入木糖含量增加第二梯度的驯化培养基中继续进行驯化培养，直至菌株可以以正常生长速度生长到OD600为18；依次重复步骤(3)进行梯度驯化培养，每个梯度均培养到菌株可以以正常生长速度生长到OD600为18接种到下一梯度培养，依次培养到木糖与葡萄糖的比例为18:2的第九梯度，直到菌株的生长速度变正常后培养到D600到达18；将驯化后的菌种接种在富含木糖的培养基中进行发酵培养，28℃，200rpm的摇床中进行摇瓶发酵培养120h。
Claims (9)
1.一种使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，其特征在于，将裂殖壶菌在含木糖的驯化培养基中进行驯化培养使得裂殖壶菌可以在富含木糖培养基中进行正常生长代谢且生产脂质化合物。
2.根据权利要求1所述的使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，其特征在于，通过在驯化培养基中逐渐增加木糖与葡萄糖的比例使得裂殖壶菌可以在富含木糖培养基中进行正常生长代谢且生产脂质化合物。
3.根据权利要求1或2所述的使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，其特征在于，通过在驯化培养基中逐渐增加木糖与葡萄糖的质量比，优选从等比例按质量分数4.5-5％增加到86-90％。
4.根据权利要求1或2所述的使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)将冻存的裂殖壶菌菌种接入以葡萄糖为主要碳源的培养基中进行活化培养，然后转接2～3代培养形成裂殖壶菌种子液；
(2)将裂殖壶菌种子液接种含木糖和葡萄糖的混合培养基中进行第一梯度驯化培养，所述第一梯度的驯化培养基中木糖与葡萄糖的质量比为等比例；
(3)当第一梯度的驯化培养基中菌株浓度以正常生长速度生长到OD600为12～18，将第一梯度形成的种子液接入木糖含量增加第二梯度的驯化培养基中继续进行驯化培养，直至菌株可以以正常生长速度生长到OD600为12～18；
(4)依次重复步骤(3)进行梯度驯化培养，每个梯度均培养到菌株可以以正常生长速度生长到OD600为12～18接种到下一梯度培养，依次培养到木糖与葡萄糖的比例为86-90％的第九梯度；
(5)将步骤(4)驯化后的菌种接种在富含木糖的培养基中进行发酵培养，对发酵后的脂质化合物进行含量及成分的测定。
5.根据权利要求4所述的使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，其特征在于，步骤(2)中将步骤(1)所得种子液接种到以30～60g/L的木糖及其与葡萄糖的等质量比的第一梯度的驯化培养基中，控制菌液的初始浓度OD600为0.2～0.3，于28℃～30℃、170～220rpm的条件下培养至0D600为12～18，仍然控制起始接种OD600为0.2～0.3在第一梯度驯化进行传代，直至菌株的生长速度与在以葡萄糖为碳源的培养基中生长速度一致后，生长到OD600为12～18，再按相同的条件接种到步骤(3)中的第二梯度驯化培养基继续驯化。
6.根据权利要求4所述的使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，其特征在于，步骤(4)中以质量分数4.5-5％含量逐渐增大木糖的比例依次接种到第九梯度的驯化培养基中，第九梯度培养基中木糖与葡萄糖的质量比例86-90％。
7.根据权利要求4所述的使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，其特征在于，步骤(5)驯化后的菌种接种在富含木糖的培养基中进行摇瓶发酵培养，最后通过酶解及萃取的方法提取油脂，通过气相色谱观察油脂的产量及组成成份。
8.根据权利要求4所述的使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，其特征在于，各个梯度培养基中除不同比例的木糖与葡萄糖还包括酵母膏10～15g/L、硫酸钠10～15g/L、硫酸镁3～5g/L、硫酸铵5～10g/L、氯化钾1～2g/L、氯化钙0.1～0.2g/L、硫酸钾0.5～1g/L、磷酸二氢钾1～3g/L、谷氨酸钠8～12g/L，七水合硫酸锌1～5mg/L、六水合氯化钴0.01～0.1mg/L、五水合硫酸铜2～6mg/L、六水合硫酸镍1～2mg/L、七水合硫酸铁8～15mg/L、泛酸钙2～4mg/L、四水合氯化锰3～5mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B19.5 mg/L、维生素B12 0.15mg/L。
9.根据权利要求4所述的使裂殖壶菌在富含木糖培养基中正常生长且生产脂质化合物的方法，其特征在于，步骤(5)所述富含木糖的培养基包括木糖30～60g/L、酵母膏10～15g/L、苹果酸5～10g/L、玉米浆10～15g/L、硫酸钠10～15g/L、硫酸镁3～5g/L、硫酸铵5～10g/L、氯化钾1～2g/L、氯化钙0.1～0.2g/L、硫酸钾0.5～1g/L、磷酸二氢钾1～3g/L、谷氨酸钠8～12g/L，七水合硫酸锌1～5mg/L、六水合氯化钴0.01～0.1mg/L、五水合硫酸铜2～6mg/L、六水合硫酸镍1～2mg/L、七水合硫酸铁8～15mg/L、泛酸钙2～4mg/L、四水合氯化锰3～5mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B19.5 mg/L、维生素B12 0.15mg/L。
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| CN115873657A (zh) * | 2023-02-16 | 2023-03-31 | 南京师范大学 | 一种无需使用有机溶剂的裂殖壶菌脂质提取方法和应用 |
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| CN102888348A (zh) * | 2012-07-12 | 2013-01-23 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种裂殖壶菌及利用其高密度发酵生产dha油脂的方法 |
| CN109913513A (zh) * | 2018-11-29 | 2019-06-21 | 厦门大学 | 一种驯化裂殖壶菌产油脂的方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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