CN1130458C - 一种调控乙型肝炎病毒增强子Ⅱ活性的人类基因hB1F - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用酵母单向杂交筛选技术获得的一种新的人类基因hB1F。它能特异地与乙型肝炎病毒增强子II(ENII)的B1区相互作用，并激活ENII的增强子活性。hB1F的cDNA全长为2482个核苷酸，编码495个氨基酸的蛋白质。它是核受体超家族的一个新成员。hB1F在胰脏和肝脏中富集表达；它在肝癌细胞株HepG2中的表达有别于正常肝脏组织。hB1F基因定位在人第一号染色体q31-32.1区段。

Description

一种调控乙型肝炎病毒增强子II活性的人类基因hB1F

本发明涉及利用酵母单杂交筛选技术获得的人类新基因hB1F，该基因的编码产物与乙型肝炎病毒增强子II特定区域的相互作用，它对增强子II的调控，以及它在人体各组织中的表达和在人类染色体上的定位，以探索乙型肝炎病毒的致病机理、乙型肝炎和肝癌的预防、诊断及治疗的新途径。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种严重危害人类健康的病原体，在世界范围内现已有三亿人口被乙肝病毒所感染。HBV具有嗜肝性，其感染除引起急慢性乙型肝炎和肝硬化外，还与肝癌的发生有密切关系(Tiollais，P.et al.Nature，1985，317：489-495)。HBV的分子生物学，尤其是HBV的基因表达调控的研究，是了解HBV的致病机理和HBV与肝癌的关系的基础，对于乙型肝炎和肝癌的预防、诊断和治疗均有重要的意义。HBV的基因的表达有赖于四个启动子元件(核心抗原启动子Cp、表面抗原启动子Sp1、Sp2及X蛋白启动子Xp)，它们的活性则受到两个增强子元件---ENI和ENII的调控。其中ENII表现出很强的肝细胞专一性，在HBV的基因的表达以及HBV的复制中起重要的调控作用。因此，对ENII的作用机制的探索已经成为乙肝病毒分子生物学研究的一个焦点，而该研究的核心问题则是转录调控因子与ENII的相互作用。过去几年里，人们已经克隆或鉴定了一些与ENII相结合并调控ENII的功能的蛋白质因子(Lopez-Cabrera，M.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990，87：5069-5073；Wang，W.X.，et al.Res.Virol.，1998，149：99-108；Johnson，J.L.，et al.Virology，1995，208，147-158；Li，M.，et al.virology，1995，214：371-378；Guo，W.T.，et al.Mol.Cell.Biol.1993，13：443-448；Raney，A.K.，et al.J.Virol.1997，71：1058-1071)。然而，由于ENII的研究起步较晚，目前还很不深入，因此研究和探索与ENII相互作用的新的转录调控因子对于阐明ENII的机制是十分必要和重要的。本发明所提供的调控ENII的一个新的蛋白质因子hB1F以及它与ENII的相互作用在国内外均未见报道，这将为揭示和阐明HBV的生活机制和致病机理提供重要线索，并有望为乙型肝炎和肝癌的诊断和治疗提供新的设想和方案。

酵母单杂交筛选(one-hybrid screening)是近年来发展起来的利用酵母体系筛选与特定的DNA靶序列相互作用的蛋白因子的一种新方法(Alexandre，C.，et al.Methods，1993，5：147-155；Li，J.J，and I.Herskowitz.Science，262：1870-1874；Wang，M.M.，and R.R.Reed.Nature 1993，364：121-126)。该系统的原理是基于酵母中的一种转录调控因子GAL4蛋白的功能的重建。GAL4分子含有两个相对独立的结构域(Hope，I.A.，and K.Struhl.Cell，1986，46：885-894)，DNA结合结构域(DBD)和转录激活结构域(AD)。其中DBD负责与DNA特异靶序列的结合；而AD负责激活基因转录。在单杂交系统中，特异的DNA靶序列以多拷贝的形式被分别导入报告基因(LacZ和HIS3)的基本启动子的上游，并先后整合入酵母染色体，构建成含双报告基因的稳定的酵母报告株。将与GAL4的AD相融合的cDNA文库转入构建的酵母报告株，如果其中的某cDNA能编码与DNA靶序列结合的DBD，它就能结合到报告基因的上游，其融合的Gal4AD将激活报告基因的表达。通过先后对His表型和LacZ活性的双重筛选，就能直接克隆与靶DNA相结合的蛋白因子的cDNA。

为此，本发明的目的是提供一个与HBV的ENII特异区域相结合的人类基因hB1F的cDNA序列，该基因能与ENII的特定区域(B1区)特异结合并对ENII的功能进行调控，它能在胰脏和肝脏组织中富集的表达，并定位于人第一号染色体q31-32.1区段。

本发明提供一个调控乙肝病毒增强子II的人类新基因hB1F。将靶DNA序列---ENII的特定区域(B1片段)以四个拷贝的形式分别导入报告基因LacZ和HIS3的基本启动子的上游，通过先后整合入酵母染色体，构建得到含双报告基因的酵母报告株。以此筛选与GAL4的AD相融合的正常成年人的肝脏的cDNA文库，获得一个人类新基因hB1F。测定了该cDNA的全序列，由此推导的氨基酸序列分析表明它是核受体超家族的一个新成员。继而进行了hB1F与ENII的B1区域的结合实验和hB1F对ENII增强子功能的调控的分析；并进行了hB1F的染色体定位分析和它在16种正常人组织及肝癌细胞和非肝细胞中的Northern杂交分析。这些为研究乙肝病毒的致病机理和肝癌的发生原理开辟了新的途径。

本发明以ENII的B1片段作为靶DNA分子，利用酵母单杂交系统从正常成年人肝脏的cDNA文库中筛选得到一个双阳性克隆(His+，LacZ+)。测定该阳性克隆的cDNA全序列：其全长为2482bp，包含了完整的蛋白编码区，编码一个由495个氨基酸组成的蛋白质(图1)。经基因数据库检索，hB1F为一种人类新基因。氨基酸序列分析表明，hB1F所编码的蛋白质表现出核受体超家族所共有的结构特征，可分为A-E/F功能结构域(图2和图3)。其中C区(C-region)和E/F区为两个保守的结构域。N端可变区A/B区由32个氨基酸组成。其后是高度保守的C区(又称DNA结合区，DBD)，由两个锌指结构组成。其中位于第一个锌指的P-box为ESCKG，位于第二个锌指的D-box为IENQN。在紧邻DBD的羧端，该蛋白质因子具有核受体FTZ-F1亚家族的一个特征结构---由30个氨基酸组成的结构域FTZ-F1-box。E/F区(又称配基结合区)位于铰链区D区之后，其中包含两个结构相对保守的区域II区(RegionII)和III区(RegionIII)，在E/F区的羧端还有一个较为保守的转录激活区AF-2(AF-2region)。根据这些结构特征，hB1F基因所编码的是归属于核受体超家族的一个新的人类蛋白质因子。

本发明进行了hB1F对乙肝病毒基因转录调控功能的分析。采用电泳迁移率改变实验来研究hB1F编码产物与乙肝病毒增强子ENII的相互作用，结果表明hB1F的体外翻译产物能特异地与ENII的B1区相结合；而当B1区发生突变后，hB1F的体外翻译产物就不再与之结合(图4)。继而用共转染实验分析了该蛋白质因子对ENII的调控作用，结果表明hB1F蛋白因子能以剂量依赖方式激活ENII的增强子活性(图5中的A)，并且这一作用通过hB1F蛋白因子与B1区的相互结合来实现，因为当B1区发生突变后，hB1F蛋白因子就不能激活ENII的活性(图5中的B)。

本发明进行了16种正常人组织mRNA的Northern杂交分析，结果表明hB1F的表达具有组织特异性，它在胰脏组织中的表达最为富集，肝脏组织次之，在肺组织中也有微弱的表达，表达产物的大小均为5.2Kb；在其他十三种组织中均未检测到表达，包括心脏、脑、胎盘、骨骼肌、肾脏(图6)以及脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠和外周血白细胞(图中未示)。同时还比较了hB1F在肝癌细胞HepG2和非肝细胞HeLa中的表达情况，在HepG2细胞中能检测到hB1F的表达，而在HeLa细胞中则不能。并且在HepG2中检测到了两条不同大小的杂交条带，一条为5.2Kb而另一条为3.8Kb(图7)。

本发明还进行了hB1F基因的染色体定位分析，以hB1F为探针，与展层于载玻片上的人淋巴细胞染色体杂交，同时记录同一视野内的FISH信号和DAPI信号，二者对比即可确定hB1F基因定位于人类第1号染色体的q31-32.1的区段(图8)。

本发明的优点：

1.提供一种全新的人类基因hB1F的cDNA序列，它的编码产物能结合于乙型肝炎病毒的重要顺式元件增强子II的特定区域，从而对ENII的增强子活性起到反式激活作用，参与乙肝病毒的基因表达和复制的调节控制。该发明对于了解乙肝病毒的致病机理以及乙型肝炎和肝癌的预防、诊断和治疗均有重要的意义。

2.hB1F基因编码的蛋白产物是归属于核受体超家族的一个新的成员。该家族的成员在生物体的生长、发育、分化和体内平衡保持等多种生理活动中发挥重要的作用，其中已有不少应用于基因工程和制药工业。hB1F也极有希望应用于生产新的基因工程产品。

3.hB1F在正常人组织中的表达具有特异性，仅在胰脏和肝脏中的表达较为富集，在其它组织中表达很少或不表达，显示该基因在这两种组织中具有重要的功能。可应用于作为肝脏或胰脏相关疾病的诊断制剂。

4.hB1F在肝癌细胞株HepG2中的表达情况有别于正常人的肝脏组织，可应用于肝癌的诊断和治疗。

5.本发明已将hB1F基因定位于1号染色体的q31-32.1区段，可进行染色体上基因的连锁分析，应用于疾病的诊断。

本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

附图说明：

图1.人类基因hB1F的cDNA核苷酸序列及由此推出的编码氨基酸序列。

图2.hB1F基因编码产物的氨基酸序列结构特征的分析

图中黑底白字的区域分别表示结构保守区：C区，E/F区的II区，III区和AF-2区。双下划线部分为FTZ-F1-box。单下划线部分为P-box和D-box。

图3.核受体超家族的结构特征示意图。

图4.电泳迁移率改变实验对hB1F的编码产物与ENII的B1区相互作用的分析

图中：1.B1探针自身；2.B1探针加体外翻译负对照；3-11.B1探针加hB1F的体外翻译产物：3.无竞争剂；4.10倍B1竞争；5.40倍B1竞争；6.100倍B1竞争；7.10倍B1m(突变B1)竞争；8.40倍B1m竞争；9.100倍B1m竞争；10.40倍pBS/HaeIII(无关竞争剂)竞争；11.100倍pBS/HaeIII竞争。特异结合条带以箭头S标明。

图5.hB1F对ENII的增强子活性的调控作用的分析

A.hB1F真核表达质粒pCMV-hB1F与报告质粒pBCDcat共转染HeLa细胞。图中：1.未加pCMV-hB1F；2-5.加入不同量的pCMV-hB1F(1μg；2μg；5μg；7.5μg)。

B.hB1F真核表达质粒pCMV-hB1F与含突变B1的报告质粒pB1mCDcat共转染HeLa细胞。图中：1.未加pCMV-hB1F；2-4.加入不同量的pCMV-hB1F(1μg；5μg；10μg)。

图6.以hB1F cDNA为探针，人不同组织mRNA的Northern杂交

图中：1.心脏；2.脑；3.胎盘；4.肺；5.肝脏；6.骨骼肌；7.肾脏；8.胰脏。

图7.以hB1F cDNA为探针，肝癌细胞HepG2和非肝细胞HeLa的总RNA的Northern杂交

图中：1.HepG2；2.HeLa。

图8.hB1F基因在染色体上的定位

图中：A中箭头所指为hB1F在染色体上的荧光定位，B为同一视野下的1号染色体，C为1号染色体的模式图，黑点表示hB1F在1号染色体上的位置。

实施例1酵母单杂交系统筛选与乙肝病毒增强子II(ENII)相互作用的蛋白因子hB1F的cDNA

酵母单向杂交筛选按CLONTECH公司说明书推荐方法进行。化学合成ENII的B1片段(5＇-gatcAACGACCGACCTTGAG-3＇和3＇-TTGCTGGCTGGAACTCctag-5＇，小写字母表示为克隆方便而引入的序列)并退火。将B1片段以四拷贝形式(4×B1)分别克隆入载体6012(CLONTECH公司)的His报告基因的E1b基本启动子的上游和载体pCZ-II(CLONTECH公司)的LacZ报告基因的CYC1基本启动子的上游，先后通过酵母YM4271(CLONTECH公司)染色体的Ura3位点的和His3位点的定点整合，得到同时整合了LacZ和HIS3报告基因的酵母菌株YMB1-HB，在两种报告基因的上游均带有4％B1靶DNA序列。将与GAL4AD融合的正常人肝脏的cDNA文库(CLONTECH公司)转化酵母菌株YMB1-HB。首先进行His表型筛选。文库质粒的营养筛选标记为LEU2，文库中能与B1序列结合的蛋白因子将激活His基因的表达，使细胞能在缺少Leu和His的基本培养基上生长(His+转化子)。为了抑制His表达的背景，在培养基中加入了3-氨基三唑(3-AT)。将转化菌涂于含45mM 3-AT的缺少Leu和His的选择培养基(SD-Leu/-His+45mM 3-AT)平板上，30℃培养4～8天，挑取His+转化子。从＞4×10⁶个转化子(在SD-Leu的平板上检测)中，筛选得到19个His+转化子。将His+转化子转移至Hybond N尼龙膜上(Amersham Pharmacia Biotech)。尼龙膜在液氮中放置30秒后在含有0.8mM的X-gal平板上，30℃培养，测定其β-半乳糖苷酶活性。呈现蓝色的为LacZ+阳性转化子。其中一个转化子表现出很强的β-半乳糖苷酶活性(在X-gal平板上反应1.5小时左右即呈现深蓝色)。将该阳性转化子接种于SD-Leu/His+45mM[3-AT]的液体培养基中培养，按文献(Kaiser，P.，and B.Auer.Biotechniques.1993，14：552)的方法回收质粒DNA，转化大肠杆菌DH5a，再制备质粒DNA。将该质粒重新转入酵母报告株YMB1-HB，证明它确实为His阳性和LacZ阳性的克隆。对它的cDNA插入片段进行限制内切酶图谱分析，根据这些切点进行亚克隆，以双脱氧终止法测定全序列(参见《分子克隆·实验指南》Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniais，T.MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratoy Press，1989)。该cDNA全长为2482bp，包含了完整的蛋白编码区，编码一个由495个氨基酸组成的蛋白质(图1)。在基因文库中检索表明是一个人类新基因，命名为hB1F。hB1F所编码的蛋白质表现出核受体超家族成员共有的结构特征(图2和图3)，归属于核受体超家族的一个新成员。

实施例2 hB1F蛋白产物与ENII的B1区的相互作用的分析

电泳迁移率改变实验(EMSA)：将γ-³²P末端标记的B1探针(0.2～1ng，10,000-20,000cpm)与2μl的hB1F体外翻译产物(采用Promega公司的TNTCoupled Reticulocyte Lysate System得到)，1-2μg非特异竞争剂poly(dI-dC)，10mM Tris-HCl(pH7.5)，90mM NaCl，0.15mM MgCl2，0.2mM EDTA，0.1mM DTT，0.1mM PMSF和5％甘油混合，于25℃反应25分钟，上样于5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，抽干，-70℃放射自显影。在EMSA的竞争实验中，先将不同的竞争剂与体外翻译产物及poly(dI-dC)混合，冰浴静置10分钟，然后加入标记的B1探针。结果如图4所示，B1探针与hB1F体外翻译产物温育，出现一特异的结合条带(条带S)。它能被B1自身竞争，但不能被突变的B1(B1m)或无关竞争剂所竞争，表明B1片段可特异地与体外翻译的hB1F相结合。

实施例3 hB1F蛋白产物对ENII的增强子活性的调控作用的分析

转染质粒的构建：氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告质粒pBCDcat的构建是将PCR扩增的含有ENII的B部分和核心启动子的BCD片段(nt.1686-1878)插入到pBS(+)的XbaI和HindIII位点，然后将CAT报告基因通过HindIII位点插入其下游位置。采用PCR方法(Horton，R.M.Methods in Molecular Biology1993，Vol 15)在B1区引入4个核苷酸的点突变(AAC tAC aGA tCT cGAG)，并以类似的方法构建得到含有B1点突变的报告质粒pB1mCDcat。hB1F表达质粒pCMV-hB1F的构建是将2.5Kb的hB1F的cDNA片段插入到真核表达载体pCMV-poly的CMV启动子的下游。

DNA转染采用磷酸钙共沉淀法，具体步骤包括细胞培养、DNA转染、收获和裂解细胞、CAT反应等均按照Sambrook，J.et al.《分子克隆.实验指南》介绍的方法进行。CAT反应体系中包括1ml ¹⁴C-氯霉素(0.025mCi/ml)，适量细胞抽提液，20μl新鲜配制的乙酰辅酶A(4mM)，用0.25M Tris-HCl(pH7.5)补足到100μl。37℃反应1-2小时，加1ml乙酸乙酯终止反应，充分混匀，将氯霉素及其衍生物抽提至酯相，离心5分钟，取酯相于旋转真空干燥器中抽干。用15-20μl乙酸乙酯溶解样品，点于硅胶板(20×20cm，Amersham)，用氯仿/甲醇(95∶5)层析约1小时，取出晾干，放射自显影，结果如图5中的A和B所示，以pCMV-hB1F与报告质粒pBCDcat共转染无内源hB1F表达的非肝细胞HeLa(见实施例5)，hB1F能够以剂量依赖的方式激活pBCDcat的CAT活性(图5中的A)；当报告质粒中ENII的B1区引入点突变后，hB1F则不再激活pB1mCDcat的CAT活性(图5中的B)。结果表明，hB1F蛋白因子能以剂量依赖方式反式激活ENII的增强子活性，并且这一作用通过hB1F与B1区的结合而实现。

实施例4 hB1F在人正常组织中的表达分析

固定有正常人的16种不同组织的poly(A)⁺RNA的杂交膜(Multiple TissueNorthern Blot I，II，Clontech公司产品)放入杂交管中，加入5ml快速杂交液(Clontech公司)68℃预杂交30分钟，换5ml新鲜杂交液，加入变性的a-³²P随机标记的2.5Kb的hB1FcDNA探针(Prime-a-Gene试剂盒，Promega公司)，68℃杂交1小时。杂交膜用洗涤缓冲液I(0.3M NaCl，0.03M醋酸钠(pH7.0)，0.05％十二烷基磺酸钠)于室温洗两次，每次20分钟；然后用洗涤缓冲液II(15mM NaCl，1.5mM醋酸钠(pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸钠)于50℃洗两次，每次20分钟，至非特异性信号较低。压片，-70℃放射自显影。结果如图6所示，hB1F的表达具有组织特异性，它在胰脏组织中的表达最为富集，肝脏组织次之，在肺组织中也有微弱表达，表达产物的大小为5.2Kb。在其他组织如心脏、脑、胎盘、骨骼肌、肾脏中则未检测到表达。另外，在脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠和外周血白细胞中也不表达(图中未示)。

实施例5 hB1F在肝癌细胞和非肝细胞中的表达分析

采用TRIzol试剂盒(GibcoBRL公司)按照说明书推荐的方法制备肝癌细胞HepG2和人子宫颈癌细胞HeLa的总RNA。20μg总RNA加样于含有甲醛的1％琼脂糖凝胶电泳，转移至Hybond⁺膜(Amersham Pharmacia Biotech)，紫外交联固定。电泳及转膜按Sambrook，J.et al.《分子克隆·实验指南》介绍的方法进行。探针标记及杂交同实施例4。结果如7所示，在肝癌细胞HepG2中能检测到hB1F的表达，而在HeLa细胞中则检测不到。在HepG2中检测到两种不同大小的杂交条带，一条为5.2Kb，与正常肝脏组织中的大小一致；另一条为3.8Kb，它在正常肝脏组织中未检测到。

实施例6 hB1F在染色体上的定位

从人血液中分离淋巴细胞，培养于含10％胎牛血清和PHA的基本培养基(a-MEM)中，68-72小时后用BrdU处理，使细胞同步化。然后以无血清的培养液洗涤细胞3次，再用含胸腺嘧啶的a-MEM培养液培养6小时。收集细胞并涂布于载玻片上，经低渗处理使细胞破裂，固定后于空气中晾干。用RNase处理载有细胞裂解物的载玻片，再用70％甲醛/2×SSC于70℃处理，使染色体DNA变性，然后用乙醇脱水。采用BRL公司的BioNick Labeling Kit以生物素化的dATP标记的hB1F cDNA片段，将标记的探针加入到杂交混合液(包含50％甲醛，10％硫酸葡聚糖和人Cotl DNA)中，75℃变性5分钟。将杂交混合液加到载有变性染色体DNA的载玻片上，37℃保温过夜。杂交后洗去载玻片上的混合液，以酶促反应检测杂交信号，同时记录同一视野中的荧光原位杂交(FISH)信号(图8中的A，箭头所示)和4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色信号(图8中的B)，二者对比即可确定hB1F位于一号染色体的长臂(图8中的B)。基于对10张最好的照片的分析，将hB1F基因定位于1号染色体的长臂q31-32.1区段(图8中的C)。

Claims (1)

1.一种调控乙型肝炎病毒增强子II活性的人类基因hB1F，其特征在于它是核受体超家族中的一个新成员，以下是所述人类基因hB1F的cDNA核苷酸及相应的氨基酸序列：

       TTTTGCTCAATGATTTCTGCTTTAAGCCAAAGAACTGCCTATAATTTCA     49CTAAGAATGTCTTCTAATTCAGATACTGGGGATTTACAAGAGTCTTTAAAGCACGGACTT    109

  M  S  S  N  S  D  T  G  D  L  Q  E  S  L  K  H  G  L       18ACACCTATTGTGTCTCAATTTAAAATGGTGAATTACTCCTATGATGAAGATCTGGAAGAG    169T  P  I  V  S  Q  F  K  M  V  N  Y  S  Y  D  E  D  L  E  E       38CTTTGTCCCGTGTGTGGAGATAAAGTGTCTGGGTACCATTATGGGCTCCTCACCTGTGAA    229L  C  P  V  C  G  D  K  V  S  G  Y  H  Y  G  L  L  T  C  E       58AGCTGCAAGGGATTTTTTAAGCGAACAGTCCAAAATAATAAAAGGTACACATGTATAGAA    289S  C  K  G  F  F  K  R  T  V  Q  N  N  K  R  Y  T  C  I  E       78AACCAGAACTGCCAAATTGACAAAACACAGAGAAAGCGTTGTCCTTACTGTCGTTTTCAA    349N  Q  N  C  Q  I  D  K  T  Q  R  K  R  C  P  Y  C  R  F  Q       98AAATGTCTAAGTGTTGGAATGAAGCTAGAAGCTGTAAGGGCCGACCGAATGCGTGGAGGA    409K  C  L  S  V  G  M  K  L  E  A  V  R  A  D  R  M  R  G  G      118AGGAATAAGTTTGGGCCAATGTACAAGAGAGACAGGGCCCTGAAGCAACAGAAAAAAGCC    469R  N  K  F  G  P  M  Y  K  R  D  R  A  L  K  Q  Q  K  K  A      138CTCATCCGAGCCAATGGACTTAAGCTAGAAGCCATGTCTCAGGTGATCCAAGCTATGCCC    529L  I  R  A  N  G  L  K  L  E  A  M  S  Q  V  I  Q  A  M  P      158TCTGACCTGACCATTTCCTCTGCAATTCAAAACATCCACTCTGCCTCCAAAGGCCTACCT    589S  D  L  T  I  S  S  A  I  Q  N  I  H  S  A  S  K  G  L  P      178CTGAACCATGCTGCCTTGCCTCCTACAGACTATGACAGAAGTCCCTTTGTAACATCCCCC    649L  N  H  A  A  L  P  P  T  D  Y  D  R  S  P  F  V  T  S  P      198ATTAGCATGACAATGCCCCCTCACGGCAGCCTGCAAGGTTACCAAACATATGGCCACTTT    709I  S  M  T  M  P  P  H  G  S  L  Q  G  Y  Q  T  Y  G  H  F      218CCTAGCCGGGCCATCAAGTCTGAGTACCCAGACCCCTATACCAGCTCACCCGAGTCCATA    769P  S  R  A  I  K  S  E  Y  P  D  P  Y  T  S  S  P  E  S  I      238ATGGGCTATTCATATATGGATAGTTACCAGACGAGCTCTCCAGCAAGCATCCCACATCTG    829M  G  Y  S  Y  M  D  S  Y  Q  T  S  S  P  A  S  I  P  H  L      258ATACTGGAACTTTTGAAGTGTGAGCCAGATGAGCCTCAAGTCCAGGCTAAAATCATGGCC    889I  L  E  L  L  K  C  E  P  D  E  P  Q  V  Q  A  K  I  M  A      278

                                                     (后续)TATTTGCAGCAAGAGCAGGCTAACCGAAGCAAGCACGAAAAGCTGAGCACCTTTGGGCTT     949Y  L  Q  Q  E  Q  A  N  R  S  K  H  E  K  L  S  T  F  G  L       298ATGTGCAAAATGGCAGATCAAACTCTCTTCTCCATTGTCGAGTGGGCCAGGAGTAGTATC    1009

  K  M  A  D  Q  T  L  F  S  I  V  E  W  A  R  S  S  I       318TTCTTCAGAGAACTTAAGGTTGATGACCAAATGAAGCTGCTTCAGAACTGCTGGAGTGAG    1069F  F  R  E  L  K  V  D  D  Q  M  K  L  L  Q  N  C  W  S  E       338CTCTTAATCCTCGACCACATTTACCGACAAGTGGTACATGGAAAGGAAGGATCCATCTTC    1129L  L  I  L  D  H  I  Y  R  Q  V  V  H  G  K  E  G  S  I  F       358CTGGTTACTGGGCAACAAGTGGACTATTCCATAATAGCATCACAAGCCGGAGCCACCCTC    1189L  V  T  G  Q  Q  V  D  Y  S  I  I  A  S  Q  A  G  A  T  L       378AACAACCTCATGAGTCATGCACAGGAGTTAGTGGCAAAACTTCGTTCTCTCCAGTTTGAT    1249N  N  L  M  S  H  A  Q  E  L  V  A  K  L  R  S  L  Q  F  D       398CAACGAGAGTTCGTATGTCTGAAATTCTTGGTGCTCTTTAGTTTAGATGTCAAAAACCTT    1309Q  R  E  F  V  C  L  K  F  L  V  L  F  S  L  D  V  K  N  L       418GAAAACTTCCAGCTGGTAGAAGGTGTCCAGGAACAAGTCAATGCCGCCCTGCTGGACTAC    1369E  N  F  Q  L  V  E  G  V  Q  E  Q  V  N  A  A  L  L  D  Y       438ACAATGTGTAACTACCCGCAGCAGACAGAGAAATTTGGACAGCTACTTCTTCGACTACCC    1429T  M  C  N  Y  P  Q  Q  T  E  K  F  G  Q  L  L  L  R  L  P       458GAAATCCGGGCCATCAGTATGCAGGCTGAAGAATACCTCTACTACAAGCACCTGAACGGG    1489E  I  R  A  I  S  M  Q  A  E  E  Y  L  Y  Y  K  H  L  N  G       478GATGTGCCCTATAATAACCTTCTCATTGAAATGTTGCATGCCAAAAGAGCATAAGTTACA    1549D  V  P  Y  N  N  L  L  I  E  M  L  H  A  K  R  A  End           495ACCCCTAGGAGCTCTGCTTTCAAAACAAAAAGAGATTGGGGGAGTGGGGAGGGGGAAGAA    1609GAACAGGAAGAAAAAAAGTACTCTGAACTGCTCCAAGCAACGCTAATTAAAAACTTGCTT    1669TAAAGATATTGAATTTAAAAAGGCATAATAATCAAATACTTAATAGCAAATAAATGATGT    1729ATCAGGGTATTTGTATTGCAAACTGTGAATCAAAGGCTTCACAGCCCCAGAGGATTCCAT    1789ATAAAAGACATTGTAAGGAGTGGATTGAACTCACAGATGGATACCAACACGGTCAGAAGA    1849AAAACGGACAGAACGGTTCTTGTATATTAAACTGATCTCCACTATGAAGAAATTTAGGAA    1909CTAATCTTGTTAATTAGGCTTATACAGCGGGGGATTTGAGCTTACAGGATTCCTCCATGG    1969TAAAGCTGAACTGAAACAATTCTCAAGAATGCATCAGCTGTACCTACAATAGCCCCTCCC    2029TCTTCCTTTGAAGGCCCGAGCACCTCTGCCCTGTGGTCACCGAATCTGTACTAAGGACCT    2089GTGTTCAGCCACACCAGTGGTAGCTCCACCAAATCATGAACAGCCTAATTTGAGTGTCTG    2149TGTCTTAGACCTGCAAACAGCTAATAGGAAATTCTATTAATATGTTAGCTTGCCATTTTA    2209AATATGTTCTGAGGGTTGTTTTGTCTCGTGTTCATGATGTTAAGAAAATGCAGGCAGTAT    2269CCCTCATCTTATGTAAGTGTGAATTAATATTAAGGGAAATGACTACAAACTTTCAAAGCA    2329AATGCTCCATAGCTAAAGCAACTTAGACCTTATTTCTGCTACTGTTGCTGAAATGTGGCT    2389TTGGCATTGTTGGATTTCATAAAAAATTTCTGGCAGGAAGTCTTGTTAGTATACATCAGT    2449CTTTTTCATCATCCAAGTTTGTAGTTCATTTAA                               2482

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