CN113039424A - 提供高重复性的微流体样品制备设备 - Google Patents

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Abstract

公开了一种用于由样品和试剂制备溶液的设备，包括微流体阵列，所述微流体阵列包括样品供应入口(E1)、试剂供应入口(E2)、排放出口(S1)、溶液收集出口(S2)、与所述入口(E1、E2)连接的取样区(ZE)、第一制备腔室(4)和第二制备腔室(6)，所述第一制备腔室和第二制备腔室与所述取样区(ZE)连接且设置在所述取样区(ZE)的两侧，使得从一个制备腔室流向另一个制备腔室的液体流过第一取样区(ZE)，第一制备腔室(4)具有在最小体积和校准体积之间可变的体积。所述设备包括至少在两个所述入口(E1、E2)以及所述溶液收集出口(S2)和所述排放出口(S1)处中断流体流动的阀门。

Description

提供高重复性的微流体样品制备设备
技术领域
本发明涉及一种用于制备溶液(例如，用于分析的生物溶液)的微流体设备，其在所处理的液体体积方面具有高重复性和高准确性。
背景技术
在健康领域，特别是在医学分析领域，为了进行血液学分析，对血液的组成要素(白细胞、红细胞和血小板)进行稀释和/或处理。处理可以包括红细胞的裂解或特定标记。
血液样品的这些处理操作要求所处理的体积具有高准确度(例如，准确地知道稀释后的浓度)以及高重复性。
此外，需要降低微流体设备的生产成本。
存在用于制备血液以对其进行分析的设备，该设备具有高准确性和高重复性，例如，当前的血液学自动机。这些是大型设备。进一步，它们由专业人员使用，并且需要定期维护，这意味着技术人员的介入，这代表着额外的成本。这种维护还包括非工作期间。此外，液体(血液和试剂)的用量可能很大。
文献EP1111281描述了一种包括芯片的生物分析设备，在该芯片中构建了流体网络。也设置了阀门。该回路与确保液体运动和混合的推进气体源连接。该回路包括至少两个通道，每个通道用于测量液体的体积，并且两个通道都连接到一个公共盘管，两种液体都被注入到该公共盘管中以对这两种液体进行混合。一方面，通过空气推进液体的运动，需要对空气-生物液体界面进行管理，这可能很棘手。另一方面，两种体积的液体被填充，然后被移动，稀释的准确性将取决于两种液体在盘管中运动以混合的过程，并且在运动期间，可能存在润湿和去润湿的问题，这很可能导致两种液体中的任一种的部分损失。
此外，需要进行空气吹扫，以避免回路中存在任何其他液体，混合物中会出现气泡并使测量结果失真。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种用于制备溶液的微流体设备，该设备提供至少与现有技术的那些设备相同水平的准确性和可重复性，并且其具有减小的整体尺寸。
溶液可以是液体或气体溶液。
所述溶液由至少一种流体样品和流体试剂制备，所述流体样品包含分散在介质中的颗粒或可溶于介质中的物质。所述流体试剂，例如，用于稀释或用于作用于样品的颗粒，例如，在血液样品的情况下用以进行裂解，或用以标记所述颗粒。
所述颗粒可以是细胞、细胞碎片或微生物、微藻或其碎片。术语“颗粒”也可以指通常在生物方案中实施的微珠，例如，金属微珠、玻璃微珠或有机微珠。它也可以指浸没在液体介质中的不溶性液滴，例如，水包油型乳液中的脂滴。因此，术语“颗粒”既指最初存在于被检样品中的内源性颗粒，也指在分析前加入到样品中的外源性颗粒。可溶性物质可以是离子、分子(蛋白质、代谢物、维生素、激素、辅因子、药物等)或大分子组装体。
液体样品可以是体液，例如但不限于血液、血浆或血清、尿液、淋巴液或脑脊液。例如，在血液样品的情况下，所述颗粒是血液的组成要素。
例如，所述试剂可以是：
在稀释的情况下，缓冲盐水(例如，PBS)或商业稀释试剂(例如，ABX稀释液)；
在裂解的情况下，已知的NH4Cl溶液或市售的商业试剂，例如，
Figure BDA0003055508260000021
等；
在标记的情况下：对于核酸标记，所述试剂可以是噻唑橙(例如，市售的试剂ABX
Figure BDA0003055508260000022
)，标记可以包括染色和免疫标记。
上述目的是通过一种用于制备用于分析的溶液的微流体设备来实现的，该设备包括微流体网络，该微流体网络包括至少一个连接入口，例如，连接至容纳样品的储存器；至少一个连接入口，例如，连接至容纳试剂的储存器；至少一个排放出口；用于待分析溶液的至少一个收集出口；以及具有给定体积的取样区。该设备还包括至少两个制备腔室，与取样区连接并设置在取样区的两侧，使得从一个制备腔室流通到另一个制备腔室的流体在取样区中流通。该设备还包括能够控制回路的不同部分中的流体流通的装置，例如，至少一个该制备腔室是具有在第一零体积和第二给定体积之间的可变体积的腔室。该设备通过控制可变体积腔室的体积来实现控制流体流通的系统和体积控制装置的协作。
借助于本发明，样品部分的体积由取样区限定，然后，被注入到可变体积制备腔室中，而试剂的体积通过补足制备腔室直到其体积达到第二给定体积来限定。因此，稀释比例由取样区和制备腔室的体积决定。
进一步，由于制备腔室的体积随着流体的注入而同时增加，因此，降低了混合物中出现气泡的风险。有利的是，制备腔室的第一体积为零。因此，不需要吹扫。
除了两个制备腔室以外，混合物可以通过取样区从一个腔室转移到另一个腔室，这一方面改善了两种流体的混合，另一方面使得可以收集可能留在取样区中的一定量的第一流体。
这种设计还非常有利地允许在注入样品之前预填充制备腔室之一，这尤其改善了在血液的情况下的混合。
非常有利的是，试剂供应入口在一个制备腔室的方向上位于取样区的上游。因此，在将试剂注入到制备腔室中时，试剂在取样区中流通，并且收集可能已经留在取样区中的样品的至少部分可能的残液。
换句话说，通过填充具有校准体积的至少一个通道来获取等分样品，该样品被转移到腔室，腔室的剩余体积由试剂补足到校准体积。所需溶液的总体积是腔室的校准体积。简化了溶液的产生过程，并且限制了在转移操作期间的流体损失风险。
因此，本发明的一个主题是一种用于由至少一种第一样品和至少一种第一试剂制备至少一种溶液的设备，该设备包括微流体网络，该微流体网络包括用于第一样品的至少一个第一供应入口，用于第一试剂的至少一个第二供应入口，至少一个排放出口，用于待分析溶液的至少一个收集出口，与第一和第二入口连接的第一取样区，至少第一和第二制备腔室，所述至少第一和第二制备腔室与第一取样区连接，并设置在取样区的两侧，使得从一个制备腔室流通到另一个制备腔室的流体在第一取样区中流通，至少第一制备腔室具有在最小体积V0和至少一个校准体积Vc之间的可变体积，所述设备还包括至少位于第一和第二入口以及收集出口和排放出口处的用于允许或中断流体流通的装置。
有利地，第二制备腔室也具有在最小体积V0和至少一个校准体积Vc之间的可变体积。
在一种特别有利的示例性实施方式中，第一和/或第二制备腔室包括超弹性材料的壁，该壁将变形直到所述腔室的体积至少等于Vc。
优选地，用于第一试剂的第二供应入口与取样区连接，使得在将第一试剂注入到第一制备腔室中时，第一试剂流过取样区。
根据附加特征，该设备包括位于第一制备腔室入口处的用于允许或中断流体流通的装置。
根据附加特征，该设备包括用于第二试剂的至少一个附加供应入口、第二取样区，以及第三和第四制备腔室，以及位于第三制备腔室的入口处用于允许或中断流体流通的装置，其中，所述第三和第四制备腔室与取样区连接并设置在第二取样区两侧，使得从一个制备腔室流通到另一个制备腔室的流体在第二取样区中流通，至少第三制备腔室具有在最小体积V0’和至少一个校准体积Vc’之间的可变体积，第二取样区与用于第一样品的第一供应入口连接，使得在填充第一取样区时，第二取样区也被填充。
该制备设备可以包括在收集出口上游的用于回路冲洗流体的至少一个供应入口和/或用于产生具有校准体积的气泡的装置。
本发明的另一主题是一种组件，该组件包括至少一个根据本发明的制备设备和支撑件，该支撑件包括至少样品储存器、至少试剂储存器、配置为驱动用于启动用于允许或中断流体流通的装置的装置的控制装置、用于改变至少第一制备腔室的体积的装置、以及与所述收集出口连接的分析装置。
优选地，控制装置配置为通过取样区在第一制备腔室和第二制备腔室之间转移溶液。
在一个有利的实施例中，控制装置配置为在注入由所述取样区测量的一定体积的样品之前，将第一量的试剂注入到所述第一制备腔室中。
分析装置可以允许对溶液中包含的要素进行定量化和/或定性化。
本发明的另一个主题是一种用于制备溶液的方法，该方法使用根据本发明的制备设备实施，包括：
a)取样阶段，在该取样阶段期间，用样品填充取样区，
b)将在取样区中容纳的体积Ve的样品注入到第一制备腔室中的阶段，
c)将一定体积的试剂注入第一制备腔室中，直到第一制备腔室的体积达到校准体积Vc的阶段，
d)在第一和第二制备腔室之间转移溶液，以便混合溶液并收集取样区中的样品残液。
有利地，注入阶段c)通过第一取样区进行。
优选地，制备方法包括在注入校准体积的样品之前，将一定量的试剂注入到第一腔室中的步骤。
本发明的另一个主题是一种用于分析溶液的方法，该方法使用根据本发明的组件实施，包括：制备溶液和通过收集出口将溶液从制备腔室之一转移到分析装置。
附图说明
基于以下描述和附图，将更好地理解本发明，其中：
图1是用于制备溶液的设备的一个实施例的示意图，
图2A和图2B是可变形制备腔室的一个实施例的示意图，该可变形制备腔室可以在两种状态下在图1的设备中实施，一种状态具有零体积，另一种状态具有最大体积，
图3A和图3B是可以在图1的设备中实施的阀门的一个实施例的示意图，
图4A是由图1的制备设备的回路和芯片支撑件形成的完整流体回路的一个实施例的示意图，
图4B和图4C是芯片支撑件上的制备设备的制备腔室、用于控制该腔室的气动回路和处于两种不同状态的控制单元的示意图，
图5A至图5D是图4的回路在不同操作步骤期间的示意图，
图5A’至图5E’是图4的回路用于使溶液级联稀释N倍的示意图，
图6是用于制备溶液的设备的另一个实施例的示意图，
图7是用于由同一样品制备两种不同溶液的设备的另一个示例性实施例的示意图，
图8是借助于本发明的设备获得的两个血液样品(血液1和血液2；10次测量)中，以106/μL计红细胞数量的测量值的图示，
图9A是针对37个人类血液样品，在根据本发明的制备设备获得的溶液的无透镜成像进行的计数和通过ABX Pentra DX120血液学自动机进行的计数之间，利用PassingBablock方法的相关性分析的图示，
图9B是图9A的计数测量值作为Bland-Altman差异的图示，
图10是图1的制备设备的实际示例性实施方式的分解图。
具体实施方式
在以下描述中，所实施的流体是液体。该描述也适用于气态流体。
在图1中，可以看到根据一个示例性实施方式的用于制备用于分析的液体溶液的设备D1的示意图。
该制备包括：例如，样品的稀释、部分样品组分的处理，例如，在血液的情况下的裂解，或者用试剂标记全血的等分样品。例如，对如此制备的溶液进行分析可以包括对血液中的组成要素进行计数，或者在红细胞裂解后测量可溶性物质，例如，血红蛋白。
优选地，该制备设备被设计为流体芯片，用于与芯片支撑件配合，确保芯片的气动激活。
制备设备用于制备包含给定体积的样品(例如，血液)和给定体积的试剂的溶液。
制备设备D1包括流体回路，该流体回路包括样品供应入口E1、试剂供应入口E2、排放出口S1(例如，其与废料箱连接)，以及用于收集制备的溶液(例如，其用于分析)的收集出口S2。
流体回路还包括主通道2、第一制备腔室4和第二制备腔室6。第一制备腔室4和第二制备腔室6设置在主通道2的两侧，并且经由主通道2彼此连接。
样品供应入口E1经由第一副通道8连接到主通道2，并且排放出口S1经由第二副通道10连接到主通道2。第一副通道8在第一连接点12连接到主通道2，并且第二副通道10在第二连接点14连接到主通道2。在第一连接点12和第二连接点14之间限定的主通道2的部分形成取样区ZE。取样区具有对应于参与制备样品的样品量的校准体积Ve。对于具有恒定横截面积的主通道，因此，Ve由连接点12和连接点14之间的主通道的横截面积和连接点12和连接点14之间的通道长度来限定。
要采集的样品体积很小。通过使用固定体积的取样区，可以精确地测量该小体积。
从下面的描述中可以看出，取样区还具有促进一定量的样品和试剂混合的功能。有利的是，形成取样区ZE的主通道2的部分中的至少一部分，优选地，形成取样区的主通道的整个部分，具有改善混合的几何形状。例如，它具有盘管形状或本领域技术人员熟知的任何其他形状，例如，分离和聚集流体的三维通道。此外，例如，盘管形状使得设备被制造得更加紧凑。
在一个示例性实施方式中，选择用于取样区的通道具有比其他通道更大的横截面积，以便具有更大的样品体积，同时限制总尺寸。
在所示的实施例中，非常有利的是，在相对于第一制备腔室4的取样区ZE的上游，试剂供应入口E2通过第三副通道16连接到主通道2，使得来自于试剂供应入口E2的试剂，在进入第一制备腔室4之前在取样区中流通。
入口E1和E2直接与取样区连接，也就是说，通过这些入口注入的液体，直接进入包括取样区的主通道2。
在本申请中，“直接与取样区连接”是指入口和取样区之间的通道长度最小，也就是说，最多在入口和取样区之间没有设置腔室或接头。这个定义适用于被描述为直接与取样腔室连接的任何其他入口或出口以及设备的任何元件。
在所示的实施例中，收集出口S2通过第四副通道18和位于第一制备腔室4和第一连接点12之间的连接点20连接到主通道2。
提供例如阀门的装置，以在操作期间隔离流体回路的不同部分。
在所示的实施例中，阀门V1设置在第一副通道8中，阀门V2设置在第二副通道10中，阀门V3设置在第三副通道16中，阀门V4设置在第四副通道18中，阀门V5设置在第一制备腔室4和连接点20之间。应该注意的是，阀门V5可以省略，如后面将看到的，阀门V5在用试剂预填充制备腔室4的情况下特别有利。也可以在第二制备腔室6的入口处设置阀门。
第一制备腔室4是具有可变体积的腔室，该体积在等于或接近于零的体积V0和校准体积Vc之间变化。优选地，如下所述，控制第一腔室4的体积可以例如确保体积V0为零。
第一制备腔室4包括至少一个可变形或可移动的壁。第一腔室4的体积是至少部分地由可移动或可变形的壁限定的体积。
校准体积Vc是待分析溶液的体积，该总体积与取样区ZE的体积、所需稀释比例或样品量与试剂量的比例一起进行限定。
体积Vc等于第一腔室的最大体积Vmax，提高了设备的准确性和稳健性。
由于要加入到体积Ve的样品中的试剂体积很大，所以由实施可变体积腔室，特别是具有用于校准试剂体积的可变形壁的可变体积腔室所导致的不准确性可以忽略不计。
控制腔室4膨胀的装置被配置成将腔室的扩张设定为Vc。
例如，第一腔室4是活塞腔室，例如，注射器。有利的是，第一制备腔室4包括弹性可变形材料制成的壁，优选由超弹性材料制成。
“超弹性材料”是指该材料具有能够从第一面积可逆地变化到第二面积的表面，第二面积等于第一面积的5倍或者甚至10倍或者甚至50倍。
第一腔室体积的变化是通过气动驱动实现的。控制气动驱动以使膜变形，从而使其达到体积Vc。
优选地，第一腔室4具有便于使可变形的壁压靠在腔室的不可变形的壁上的形状，例如，它具有圆柱形或球形帽或卵形部分形状。然而，由于膜的超弹性性能，腔室可以具有不太易于适应的形状，例如，平行六面体金字塔形状，具有由从腔室壁突出的元件形成的支柱。
所谓的“不可变形的壁”相对于超弹性的膜是不可变形的，并且在实施的压力水平下是不可变形的。所使用的压力例如在+/-几十毫巴和几巴之间，典型地在+/-500毫巴之间，例如，等于250毫巴或450毫巴，这使得可变形的壁能够更快地变形。
在一个非常有利的实施例中，第一腔室4包括形成在腔室的一个或多个壁中的凹槽，该一个或多个壁不同于可变形的壁，当对腔室灌注时允许气泡排出，从而控制进入腔室的液体体积尽可能接近于预期体积。
在图2A和图2B中，可以看到具有可变形壁的腔室的一个实施例。
制备腔室4被限定在两个刚性板22、24之间。板22包括设置在板22的表面中的空腔26，并且板24包括至少一个通道28，该通道28形成在板24的表面中，板24的该表面面向包括空腔26的板22的表面。超弹性材料的膜30被张紧在空腔26上并封闭空腔。压力入口29形成在支撑板22中并通向空腔。在非工作(resting)状态下，膜30或多或少地压靠在板24上，并且腔室的体积等于V0(图2A)。优选地，在非工作状态下或至少在取样步骤之前，通过压力入口29施加压力，以确保膜30压靠在板24上，并且V0＝0。
当空腔26中产生吸力时，膜30朝向空腔26变形，直到它压靠在空腔26的壁上，在这种状态下，腔室的体积达到最大(图2B)。膜的超弹性性能使这种压靠成为可能。在这种配置中，腔室可以被填充。
或者，可变形的壁可以通过例如集成到膜中的压电装置或电磁装置变形。
阀门可以是任何类型的。有利的是，它们是气动驱动的，并且还包括超弹性的膜。
在图3A和图3B中，可以看到这种阀门的一个实施例。膜32被张紧在连接到压力源的空腔34上。空腔34形成于支撑件(例如，板22)中，而另一个支撑件(例如，板24)搁置在膜上。板24包括由通道部分36形成的不连续通道，该通道部分36形成于与膜32接触的支撑件24的表面中。通道部分通过空腔连接。优选地，通过入口37施加压力，以确保膜压靠在板24上，并且阀门关闭，然后通道之间的流通被中断(图3A)。通过入口37在空腔34中产生负压，膜32变形并且允许两个通道部分36之间的流通(图3B)。流体流通用箭头表示。优选地，膜32和膜30由相同的超弹性材料膜形成。或者，机械手指可以作用于膜上。
或者，板24包括一个连续的通道，并且膜被压入通道的底部。
或者，可以实施压电或电磁驱动阀门。
阀门的驱动会产生无意义(empty)的流体移动空间。为了限制对样品和试剂之间的体积比例的准确性的影响，阀门优选具有小的体积，例如，比制备腔室的体积小100倍。阀门可以是常开或常闭的。
第二制备腔室6也具有可变的体积。上述第一制备腔室的不同替代方案适用于第二制备腔室，例如，圆柱形或球形帽形、排水槽等。
两个可变体积腔室的实施允许流体通过取样区在两个腔室之间容易地转移，并且从取样区ZE收集全部样品。
有利的是，第二制备腔室6的体积大于或等于第一制备腔室的体积。优选地，腔室4和腔室6这两个腔室具有相同的校准体积Vc，其有利地等于腔室的最大体积。
或者，第二制备腔室具有不同于第一制备腔室4的体积，其可以具有小于第一制备腔室4的体积。将在下面解释，第二腔室6设置为其可以被完全排空。
在图4A中，可以看到由制备设备D1的回路和芯片支撑件Sc形成的完整流体回路的示意图。
芯片支撑件确保样品供应入口E1与容纳样品的储存器R1的连接，试剂供应入口E2与容纳试剂的储存器R2的连接，出口S1与废料区P的连接，出口S2与待分析溶液的分析区ZA的连接。分析区包括用于检测和定量样品中形成的或最初存在的可溶性物质的装置。该装置可以实施电学、光学或电化学测量。例如，分析区包括用于计数/定量要素的光学装置和/或用于确定不同类型的要素的装置。例如，它可以是流式细胞仪和/或库尔特计数器类型的阻抗测量装置和/或成像类型的光学测量装置和/或比色分析装置。
或者，分析区ZA被集成到制备设备中。
芯片支撑件还确保对阀门和可变体积腔室的控制。进一步，芯片支撑件包括用于控制阀门和可变体积腔室的电路。
芯片支撑件还包括连接到第一制备腔室或第一和第二制备腔室，并连接到压力源D的气动回路。压力源D包括过压源Ds或负压源Dd。在一个有利的替代方式中，储存器R1和储存器R2处于大气压下。
支撑芯片和设备之间的密封，例如，通过密封件来实现。
芯片支撑件包括根据预定方案控制各种阀门和腔室的电子单元。
在图4B和图4C中，可以看到芯片支撑件Sc上的第一制备腔室4的示意图，该芯片支撑件Sc包括由控制单元UC(例如，计算机)控制的气动回路Sp。气动回路Sp包括例如将腔室4的空腔连接到压力源D的三通阀门EV。三通阀门允许腔室4的空腔连接到过压源Ds或负压源Dd。
在图4B中，在制备阶段之前，控制单元UC控制阀门EV，使得阀门EV将腔室4的空腔连接到过压源，从而确保腔室体积V0＝0。
在制备阶段，控制单元UC控制阀门EV，使得其将腔室连接到负压源，从而增加腔室的体积并抽吸样品。通过控制阀门EV，腔室的体积交替地增加和减少，尤其是允许腔室4和腔室6之间的往复运动。
应当理解的是，芯片支撑件Sc包括几个阀门，用于向不同制备腔室的空腔受控地供应过压或负压，例如，与制备腔室同样数量的阀门，每个制备腔室被单独地控制。
现将参考图5A至图5D来描述制备设备D1的操作的一个实施例。
有利地，最初至少切换控制第一腔室4的空腔中的压力的阀门，使得将过压施加于腔室4的空腔中，使得腔室4的体积为V0＝0。
执行取样阶段。打开阀门V1和阀门V2，启动与出口S1连接的负压源，从储存器R1中抽取样品。启动负压源直到样品充满第一副通道8，以及连接点12和连接点14之间的取样区ZE。优选地，启动负压源直到样品充满整个第二副通道10或其一部分，以确保取样区ZE被均匀地充满样品。
例如，负压源是时间控制的。已经校准负压源的启动时间。事先已经进行了测试，以确定填充满所需的时间，并采取了预防措施。或者，可以考虑视觉控制，例如在血液的情况下。
取样区ZE中的样品量是体积为Ve的等分样品。
该设备处于图5A所示的状态。
接下来，进行注入试剂阶段。再次关闭阀门V1和阀门V2。然后，打开阀门V5和阀门V3。切换阀门EV，将负压源连接到第一腔室4的空腔，这导致第一制备腔室4的体积增加。例如，在具有超弹性壁的腔室中，膜变形，腔室的体积增加，在回路中产生负压，容纳在取样区中的样品被吸入第一制备腔室4，使得容纳在储存器R2中的试剂被吸入。在等分样品被吸入后，试剂流通进入取样区ZE，这有利地允许留在主通道中的一定量的样品例如被收集。由于制备腔室的体积随着注入的液体而增加，出现气泡的风险大大降低。
负压源和第一腔室4的空腔之间的连接时间足够长，以确保腔室体积达到Vc。
具有体积Vc的第一腔室容纳有体积Ve的样品和体积Vc-Ve的试剂。第一制备腔室6在填充结束时完全充满，允许体积Vc-Ve的试剂被校准。因此，由于体积Ve和Vc被校准，样品体积与试剂体积的比例是准确已知的。例如，在稀释的情况下，样品中要素的稀释比例和浓度是准确已知的。进一步，对于每次新的制备操作，获得相同的体积比例。因此，该设备具有非常稳健的操作。
该设备处于图5B所示的状态。
在一个有利的操作中，发生溶液的混合阶段。例如，溶液在两个制备腔室4和6之间流通。
为此，切换阀门EV以向第一腔室4的空腔供应过压，导致腔室4中的压力降低，同时通过向腔室6的空腔供应负压来增加第二腔室6的体积。然后，溶液从第一腔室4排出，并被吸入第二腔室中。在两个腔室之间转移的过程中，溶液流通进入主通道2，从而进入取样区ZE。
要注意的是，在混合物从腔室4转移到腔室6之前，取样区充满了试剂。该体积Ve的试剂将被加入到腔室4中存在的体积Vc-Ve的试剂中，并且将被考虑到稀释计算或反应观察中。在腔室之间的转移阶段结束时，获得的溶液具有Vc+Ve的体积。获得的稀释比例为Ve/(Ve+Vc)。
通过切换气动阀门，交替地增加和减少两个腔室4、6的体积，溶液在取样区ZE中往复运动。这些往复运动具有改善两种液体之间混合的优点，尤其是当取样区具有盘管形状或促进混合的另一种形状时，例如，促进诸如裂解的反应。此外，它们允许收集任何可能残留在取样区中的残留样品和分析物。因此，可以减少样品损失，并且制备可以非常精确。
体积Vc的溶液的全部或部分可以转移到第二腔室6中，一部分溶液可以保留在取样区中。优选地，较大体积的溶液在取样区ZE中流通以收集样品残留物。例如，体积Vc的溶液的全部在两个制备腔室4、6之间流通。
往复运动次数的选择取决于所涉及的液体、Vc和Ve的相对体积、反应类型、是否稀释、裂解、标记等。
该设备处于图5C所示的状态。
最后，溶液返回到第一制备腔室4，然后移送入分析区ZA。为此，打开阀门V4和阀门V5，溶液例如被抽吸通过出口S2。
该设备处于图5D所示的状态。
在最后阶段过程中，通过在出口S1处抽吸到废料区，回路被清空和/或冲洗以备进一步的制备和分析。
通过将用于测量样品体积的固定体积的取样区和用于测量试剂体积的可变体积的制备腔室相结合，制成了具有相对简单的设计并提供非常好的准确性的设备。
两个可变体积腔室可以由单个控制操作或两个不同的控制操作控制。
或者，第二腔室6可以具有小于第一腔室4的体积Vc的最大体积，然后仅转移第一腔室4的体积Vc的一部分。
在非常有利的操作模式中，在注入样品(例如，血液)之前，第一制备腔室已经部分地填充有试剂，这促进了混合物的均匀化和混合物内的反应(如果有的话)，并避免了样品损失和由此导致的准确性损失。
例如，在取样阶段之前，提供第一制备腔室4的预填充阶段，用一定量的试剂进行预填充。为此，只打开阀门V3和V5，负压源导致超弹性壁变形，然后试剂被抽吸通过主通道。注入到第一腔室4中的试剂的量小于Vc-Ve，使得全部等分样品然后可以被注入到第一腔室4中。
然后关闭阀门V3和V5，可以开始取样阶段。阀门V5设置在第一腔室4和连接点12之间，并且在取样阶段关闭，以避免当样品被吸入取样区ZE中时，容纳在第一制备腔室4中的试剂也被吸入。
在腔室4和腔室6都是可变体积腔室的情况下，两个腔室可以互换，并且阀门的驱动和负压源的控制使得等分样品首先注入到腔室6中。
在另一个示例性实施方式中，供应入口E1和供应入口E2互换。在这种情况下，在注入试剂时，它不会流通进入取样区。有利的是，溶液在两个制备腔室之间的取样区中流通以收集样品。
优选地，第一副通道8和第四副通道18在不同的点处连接到主通道2，以减少在收集用于分析的溶液时，第一副通道8中容纳的样品被吸入的风险。优选地，第四副通道18连接到最靠近第一制备腔室4的主通道。
有利地，出口S2直接连接到取样区，这允许用于将溶液转移到检测装置的副通道18被冲洗。
在稀释循环期间，样品流过取样区ZE并交替填充制备腔室4和制备腔室6而在通道2中流通。在这些不同的步骤中，由于交叉点20，通道18可能被样品污染，例如，通过扩散效应、通过阀门的微渗漏等。
通过将出口S2直接与取样区ZE连接，可以应用利用试剂的以下冲洗方案。该方案包括通过关闭阀门V5来保持在制备腔室4中制备的溶液，然后通过打开阀门V3和阀门V4，试剂流向S2来冲洗通道8。然后清洗副通道18。
在所示的实施例中，非常有利的是，出口S1直接与取样区ZE连接。在填充取样区ZE时，打开阀门V1和阀门V2，样品从储存器R1流通至连接到废料箱的出口S1，并且填充取样区ZE，而不流通通过制备腔室。因此，无需在制备步骤(稀释、裂解……)之前，通过储存器R2中容纳的试剂清洗腔室，以避免样品体积误差。制备方法是简化、快捷的。
举例来说，校准体积Vc是几十微升(μL)到几百微升(μL)。
在图6中，可以看到特别有利的制备设备的另一个实施例。
制备设备D2与制备设备D1的不同之处在于，它包括用不同于试剂的清洗/冲洗液体来清洗/冲洗回路的装置。
将再次使用与设备D1相同的附图标记来指代具有相同功能的元件。
设备D2包括主通道2、供应入口E1、供应入口E2、排放出口S1、收集出口S2、两个制备腔室4和6。和设备D1中相同，阀门V1、阀门V2、阀门V3和阀门V4也设置在回路中。如上所述，阀门V5也被提供，至少用于试剂的预填充阶段。
设备D2还包括用于清洗液体的第三供应入口E3，其连接到与副通道8和副通道16连接的副通道，其中，该副通道8和副通道16分别连接到入口E1和入口E2。入口E3将连接到清洗液体储存器R3。入口E3还包括三通阀门V10，用于将储存器R3连接到第一副通道8或第三副通道16。
或者，全部或部分的三通阀门由与T型接头通道串联的双通阀门代替。
清洗液体用于清洁整个回路以及分析腔室，以便再次用于另一分析。
进一步，该设备还包括用于在通向出口S2的第四副通道18中产生具有校准体积的气泡的装置38。装置38包括副通道40，该副通道40通过连接点42连接到阀门V4和出口S2之间的第四副通道18，副通道40设置有连接到气体源(例如，空气)的气体供应入口E4、可变体积腔室44、入口E4和腔室44之间的阀门V6，以及腔室44和连接点42之间的阀门V8。
腔室44用于产生具有校准体积的气泡。它例如具有与第一腔室4相似的结构，它包括例如至少一个具有超弹性性能的弹性可变形的壁。或者，腔室44包括注射器或活塞。
气泡的体积例如为30μL至60μL，例如为分析区ZA体积的2至4倍。
例如，在溶液被移送到出口S2之前，产生一个校准过的气泡。气泡和溶液通过废料箱的负压和/或向腔室中的膜施加压力而被吸入。气泡的存在避免了在溶液转移到分析区ZA的过程中稀释该溶液。
结合设备D1描述的出口S2直接与取样区ZE连接的优势也存在于设备D2中。可以提供冲洗液体用于冲洗。
根据本发明的设备的优点在于，它允许制备具有不同溶液比例的溶液。因此，该设备相对灵活，适应性强。
根据操作的一个实施例，以所需的稀释比例直接制备溶液。
本发明通过避免时间校准而具有稳健的操作，事实上，时间校准取决于许多参数，因此不是非常稳健。
有利的是，根据操作的另一个实施例，在几个步骤中获得所需的稀释比例的溶液。
操作步骤如图5A’至图5E’所示。
步骤5A’至步骤5C’分别与步骤5A至步骤5C相同。在步骤5C’结束时，已经以由取样区的体积Ve和制备腔室的体积Vc设定的第一稀释比例制备第一溶液So1。第一溶液So1在腔室4中。通过将溶液So1移送到废料箱中来清空腔室4(图5D’)。在该步骤结束时，取样区ZE充满了溶液So1。因此，已经采集了体积为Ve的So1溶液。然后，可以再次实施步骤5B’(箭头N)，通过经由E2注入稀释剂，这驱动体积Ve的第一溶液So1进入腔室4。并且重复步骤5C’。已经制备了具有新的稀释比例的溶液So2。
然后，要么通过执行步骤5D’，然后执行步骤5B’进行新的稀释，要么经由S2将So2转移到分析区。
最终溶液的稀释比例是连续获得的溶液的稀释比例的乘积。如果制备腔室在每个稀释步骤中变形为Vc，则所有稀释步骤的稀释比例相同，例如，稀释比例等于T，n个稀释步骤后，最终稀释比例等于Tn。例如，如果每个步骤的稀释比例为10％，有可能连续获得1％、0.1％等的稀释比例。在每个稀释步骤中，连续获得的溶液So1、So2……可以移送到出口S1以进行排放，也可以移送到出口S2以进行分析。
或者，可以考虑通过修改制备腔室的校准体积Vc来改变两个稀释阶段之间的稀释比例。
这种进行连续稀释的可能性特别有意义，并且在许多生物测试中是需要的，并且用现有技术的系统准确地对微流体进行上述连续稀释是复杂的。
在需要高稀释比例的情况下，可以实施连续稀释用于大量的计数对象。在现有技术的设备中，由于必须控制大的体积比，因此获得高稀释比例会引起尺寸问题。例如，0.1％的稀释比例可能会使尺寸变得复杂。借助于本发明的样品制备设备，可以进行稀释比例为10％的三次连续稀释或稀释比例为(0.1％)1/2的两次稀释，这些连续稀释实现了更小的体积比。
进一步，执行连续稀释提供了测量或检查稀释比例的值的可能性。例如，假设C0为初始条件，R为流体系统的已知或未知的比例。第一周期测量浓度C1，第二周期测量浓度C2。确切的比值是R＝C1/C2。然后可以用C0＝C1×R＝C1 2/C2反推算出初始浓度。
因此，可以限定R的值，而不必一开始就精确地知道Vc和/或Ve。此外，由于可以确定每台设备的稀释比例，因此，可以放宽对一个芯片相对于另一芯片或一组实验相对于另一组实验的再现性的技术限制。
在图7中，可以看到用于由同一样品制备两种不同溶液的制备设备的另一个示例性实施方式。
制备设备D3结合了两个稀释模块M1和M2。每个模块M1，M2包括由几个通道形成的流体回路。例如，模块M1用于进行稀释，模块M2用于进行裂解。
每个模块M1，M2分别包括各自的制备腔室104，108和204，208，以及各自的取样区ZE1和ZE2。
样品供应入口E1’是两个模块共用的。分析出口S2’和通向废料箱的出口S1’也是两个模块共用的。
每个模块M1、M2包括用于试剂R1、R2的供应入口E102、E202。
在不同的通道中还提供了阀门V1’、V2’、V3’、V3”、V4’、V4”、V5’、V6’、V8’、V9’。
两个回路连接在一起，以便在取样阶段，经由模块M1的取样区ZE1将来自入口E1’的样品供应给模块M2的取样区ZE2。
分析出口S2’连接到第一制备腔室104、204的出口。
用于试剂R1的供应入口E102经由副通道Ca1连接到模块M1的主通道。
设备D3还包括用于清洗液体R3的第三供应入口E3’，该第三供应入口E3’连接到与模块M1连接的副通道Ca1，并经由模块M1连接到模块M2。入口E3’将连接到清洗液体储存器。
在该设备中，试剂R1用于模块M1中的稀释且用于灌注/冲洗芯片。加入试剂R3用于清洗，并通过第三入口E3’注入。副通道Ca1有利地允许盘管和腔室共享入口。
阀门V10.1’、V10.2’允许入口E3’连接到模块M1和模块M2中的一个和/或两个，并允许冲洗液体在模块M1和模块M2的不同通道中流通。
在本实施例中，阀门V10.3’设置在第三入口E3’和出口S1’之间的通道Ca2中，用于使用试剂R2冲洗试剂R3和R2之间的接触区，以避免在试剂R3与样品(例如，血液)不相容的情况下被试剂R3污染。
在本实施例中，设备D3还包括用于在回路中形成气泡的腔室44，其连接在出口S2’，类似于图6中的设备D2。气泡具有与设备D2中相同的功能。
模块M1有利地包括在将试剂入口E102连接到取样区ZE1的通道上的预填充腔室PC1。
模块M2有利地包括在将试剂入口E202连接到取样区ZE2的通道上的预填充腔室PC2。
预填充腔室PC1和PC2也是可变体积的腔室，允许通过抽吸来填充它们。
预填充腔室允许注入到腔室104和204中的试剂的体积被校准，以便具有更受控的混合和/或反应。预填充腔室可以在上述所有制备设备中实施。它们通常适用于根据本发明的任何设备。它们可以设置在与每个入口相关的阀门下游的样品入口处。进一步，全部或部分的样品供应入口配备有这种预填充腔室。
现在将描述设备D3的操作实施例。在这个实施例中，试剂在样品之前被注入到腔室104、腔室204中。
最初，所考虑的状态是所有阀门都是关闭的。
首先，通过预填充腔室PC1和PC2，在腔室104和204中进行预填充试剂的步骤。
为此，打开阀门V3’和V3”，启动预填充腔室以吸入试剂R1和R2，即，它们的体积增加。
关闭阀门V3’和V3”。
然后打开阀门V6’和V5’，将预填充腔室PC1和PC2中容纳的体积量的试剂R1和R2转移到腔室104和204。
然后关闭所有阀门，开始注入血液。
在取样阶段，只打开阀门V1’、V8’和V9，样品填充取样区ZE1、ZE2。该阶段持续时长为校准时间。
然后关闭阀门V1’、V8’和V9。然后开始注入剩余试剂的步骤，其中打开阀门V3’、V3”、V5’和V6’。将每个等分样品及其试剂注入到它们的制备腔室104、204。关闭阀门V3’、V3”。
然后将混合物从腔室104、204移入腔室108、208中，并进行往复运动以改善混合。
如上所述，M1模块用于进行稀释，M2模块用于进行裂解。可以考虑通过在两个腔室204和206之间转移试剂R2和血液来继续在模块M2中混合它们，同时分析在模块M1中获得的混合物。
或者，可以考虑在腔室104、204中储存现成的溶液，然后将它们移送到出口S2’以在区ZA中进行分析。在该最后一步中，移送两种溶液以连续的方式进行。
优选地，采用用于制备待分析溶液的试剂进行冲洗。在对模块M1中制备的溶液进行分析之前，用试剂R1冲洗区ZA，在对模块M2中制备的溶液进行分析之前，用试剂R2冲洗分析区。
例如，在分析结束时，用试剂R3冲洗两个模块。
在两种溶液通过之间，用来自E3’的冲洗液体进行冲洗步骤。
注入和混合两种溶液的步骤可以同时进行。
应当理解的是，可以实施两个以上的模块。
在另一个实施例中，该设备包括用于两种不同样品的至少两个供应入口和用于不同试剂的一个或多个供应入口。
应当理解的是，所有的配置都是可考虑的，例如，可以考虑由样品和试剂制备第一溶液，然后由该第一溶液的样品制备针对另一反应的第二溶液。
作为非限制性示例，该制备设备可以具有以下尺寸：
该设备基本上具有信用卡的尺寸，例如，边长在5cm到10cm之间。
其厚度为1毫米(mm)至几毫米(mm)，例如，3mm。
取样区外的主通道和副通道的横截面为正方形或矩形，边长为几百微米(μm)，例如，300μm×300μm。
取样区的横截面为正方形或矩形，边长为几百微米(μm)，例如，700μm×300μm。
制备腔室的最大体积在1微升(μL)至几百微升(μL)的数量级，例如，200μL。例如，它们具有球形或圆柱帽形，例如，高度为3mm，直径为5mm至10mm。
具有上述尺寸的通道和腔室，例如通过压印、模制或机械加工制成。
使用微电子学中使用的结构化技术，可以制造尺寸比上述尺寸小10至100倍的通道和腔室。
现在将描述表明根据本发明的制备设备的稳健性和可靠性的测试。
为了进行无透镜成像计数，通过使用红细胞球化试剂，用诸如设备D2的设备进行二次稀释，获得稀释比例为0.16％(1/600)的血液。这种计数例如在文献FR3060746中有描述。
该设备包括一个10μL的校准盘管和体积为235μL的制备腔室，用于获得4％(1/24.5)的稀释比例，经过二次稀释后，可获得0.16％(1/600)的所需稀释比例。
在图8中，可以看到使用同一微流体设备进行十次连续测量的两个血液样品Sg1和Sg2的每微升样品中红细胞GR的数量。
关于Sg1和Sg2，获得的变异系数分别为1.1％和0.9％。结果，制备设备在制备可重复性和计数方面具有高性能。
在图9A中，可以看到，针对37个人类血液样品，在从根据本发明的制备设备获得的溶液中进行的无透镜成像计数C1(纵坐标轴)和借助于现有技术的ABX Pentra 120DX血液学自动机进行的计数C2(横坐标轴)之间，使用Passing Bablock方法的相关性图。在横坐标和纵坐标中，这是以106/μL计的红细胞数量。
在图9B中，这是将对应于图9A中的测量值的计数测量值表示为Bland-Altman差异的曲线图。在纵坐标轴上表示差值δ，在横坐标轴上表示通过现有技术的ABX Pentra DX120血液学自动机获得的测量值。注意到的是两种方法在统计上是等效的。
现在将描述用于制造本申请的制备设备的方法的实施例。
在图10中，可以看到通过叠加具有例如信用卡尺寸的元件获得的制备设备的实施例的分解图。
该设备包括：
第一板P1，称为流体板，包括结构化面，通道在该结构化面中形成，并且液体在该结构化面中流通，
第二板P2，由超弹性材料或膜制成，覆盖设置有通道的所述面，
第三板P3，称为气动板，其中制成阀门的空腔和制备腔室的空腔，其中当施加负压时，膜将受到挤压，以便在阀门的情况下使液体通过或填充制备腔室。将空腔连接到压力源的气动寻址通道也在板P3中形成，
第四板P4，关闭腔室的空腔。
需要注意的是，阀门的空腔通常不会穿过板P3。
板P1、P3和P4优选由聚合物材料制成，例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PPMA)、有机玻璃和非常有利的环烯烃共聚物(COC)。COC具有耐溶剂和冲洗产品的优势。或者，它们由玻璃或硅制成。这些板可以通过压印、模制或机械加工来进行结构化。
例如，板P1、P3和P4的厚度在几十微米(μm)到几毫米(mm)之间，通常为3mm。
例如，板P4的厚度例如为0.5mm。
气动板P3的厚度例如为3mm。
流体板P1的厚度例如为3mm。
板P2由一种具有很高弹性变形能力的材料制成。例如，该板由Smooth On公司生产的称为
Figure BDA0003055508260000201
的硅树脂材料制成。这种材料的延伸率为800％。例如，板P2由离心旋涂法制成。
在可用于制造板P2的材料中，尤其有来自硅树脂家族的弹性体，例如，MQs(甲基聚硅氧烷)、VMQs(乙烯基-甲基聚硅氧烷)、PVMQs(苯基-乙烯基-甲基聚硅氧烷)或热塑性弹性体(TPE)，例如，TPE-S、TPS、TPE-E、TPC。
例如，板P2的厚度在50μm到200μm之间。板P2提供了液体和气体之间的隔离，因此，板材料适于所使用的支撑液体，并且具有低的气体渗透性。
在所示的实施例中，为了将板P1、P2和P3固定在一起，在第一板P1和第二板P2之间，以及在第二板P2和第三板P3之间提供双面粘合层48。粘合层在薄膜被驱动的区域被切割，即，在阀门和制备腔室处。例如，切割是通过切割机、激光或水射流进行的。该切割步骤发生在将薄膜放在其中一个板上之前。
然后，将一个粘合层48对准并层压在气动板P3的面向第二板P2的表面上。将另一个粘合层48对准并层压在流体板P1的结构化面上。然后将第二板P2层压在两个板P1和P3中的一个上，然后压靠在另一个芯片上。
在另一个示例性实施方式中，两个板P1和P2以及膜46都通过机械方式连接，例如，通过机械夹紧。
或者，可以用O2等离子体粘合或通过粘合剂成形的粘合来代替双面粘合材料层的粘合，例如，通过丝网印刷。
还或者，可以组合通过粘合的各种固定模式和/或通过机械方式的固定模式。
根据本发明的制备设备特别适用于医学应用，例如，血液和生物流体分析。它还可以应用于其他领域，例如，废水和/或水道中污染物的分析领域。
考虑到将制备设备制成优选由聚合物制成的小芯片的形式，可以考虑制造一次性设备，这在医学领域中特别有意义，以避免两次分析之间的污染。

Claims (15)

1.一种用于由至少一种第一样品和至少一种第一试剂制备具有校准体积Vc的至少一种溶液的设备，所述设备包括微流体网络，所述微流体网络包括用于第一样品的至少一个第一供应入口(E1)、用于第一试剂的至少一个第二供应入口(E2)、至少一个排放出口(S1)、用于待分析溶液的至少一个收集出口(S2)、与所述第一入口(E1)和第二入口(E2)直接连接的具有校准体积Ve的第一取样区(ZE)、至少第一制备腔室(4)和第二制备腔室(6)，所述至少第一制备腔室(4)和第二制备腔室(6)与所述第一取样区连接并设置所述取样区的两侧，使得从一个制备腔室流通到另一个制备腔室的流体在所述第一取样区(ZE)中流通，所述第一制备腔室(4)具有在最小体积V0和所述校准体积Vc之间的可变体积，所述第二制备腔室(6)具有可变体积，所述设备还包括至少在所述第一入口和第二入口以及在所述收集出口(S2)和排放出口(S1)处用于允许或中断流体流通的装置。
2.根据权利要求1所述的制备设备，其中，所述第一制备腔室(2)和所述第二制备腔室(4)包括超弹性材料的壁。
3.根据权利要求1或2所述的制备设备，其中，用于所述第一试剂的所述第二供应入口(E2)与所述取样区(ZE)连接，使得在将所述第一试剂注入到所述第一制备腔室(4)中时，所述第一试剂流过所述取样区(ZE)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备设备，包括位于所述第一制备腔室(4)的入口处的用于允许或中断流体流通的装置。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备设备，包括用于第二试剂的至少一个附加供应入口、第二取样区、第三制备腔室和第四制备腔室，以及位于所述第三制备腔室的入口处的用于允许或中断流体流通的装置，其中，所述第三制备腔室和第四制备腔室与所述取样区连接并设置在所述第二取样区的两侧，使得从一个制备腔室流通到另一个制备腔室的流体在所述第二取样区中流通，至少所述第三制备腔室具有在最小体积V0’和至少一个校准体积Vc’之间的可变体积，所述第二取样区与用于第一样品的所述第一供应入口连接，使得在填充所述第一取样区时，所述第二取样区也被填充。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制备设备，包括在所述收集出口(E2)的上游的用于回路冲洗流体的至少一个供应入口和/或用于产生具有校准体积的气泡的装置。
7.根据前述权利要求中任一项所述的制备设备，其中，所述收集出口直接与所述取样区连接，以允许液体在所述取样区和所述收集出口之间的通道中流通。
8.一种包括至少一个根据前述权利要求任一项所述的制备设备和支撑件的组件，所述支撑件包括至少所述样品储存器、至少所述试剂储存器、配置为驱动用于启动用于允许或中断流体流通的装置的装置的控制装置、用于改变所述第一制备腔室的体积和所述第二制备腔室的体积的装置，以及与所述收集出口连接的分析装置。
9.根据权利要求8所述的组件，其中，所述控制装置配置为通过所述取样区在所述第一制备腔室和所述第二制备腔室之间转移所述溶液。
10.根据权利要求8或9所述的组件，其中，所述控制装置配置为在注入由所述取样区测量的一定体积(Ve)的样品之前，将第一量的试剂注入到所述第一制备腔室中。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的组件，其中，所述分析装置允许对包含在所述溶液中的要素进行定量化和/或定性化。
12.一种用于制备溶液的方法，所述方法使用权利要求1至7中任一项所述的制备设备实施，所述方法包括：
a)取样阶段，在该阶段期间，用所述样品填充所述取样区，
b)将在所述取样区中容纳的体积Ve的样品注入所述第一制备腔室中的阶段，
c)将一定体积的试剂注入所述制备腔室，直到所述第一制备腔室的体积达到所述校准体积Vc的阶段，
d)在所述第一制备腔室和所述第二制备腔室之间转移所述溶液，以便混合所述溶液并收集所述取样区中的样品残液。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述注入阶段c)通过所述第一取样区进行。
14.根据权利要求12或13所述的制备方法，包括在注入所述校准体积的样品之前，将一定量的试剂注入到所述第一腔室中的步骤。
15.一种用于分析溶液的方法，所述方法使用权利要求12至14中任一项所述的组件实施，所述方法包括制备所述溶液，和通过所述收集出口(S2)将所述溶液从制备腔室之一转移到所述分析装置。
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