CN113016719B - 一种突触核蛋白病理性快动眼睡眠行为障碍模型的制备法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在非人受试动物中诱导可向帕金森表型转归的快动眼睡眠行为障碍(RBD)表型的方法，该方法包括1)向非人受试动物的单侧或双侧脑桥被盖背外侧下核(SLD)立体定向注射能够诱导突触核蛋白病理变化的物质；2)评估所述非人受试动物的RBD表型的诱导情况；3)在所述RBD动物中评估帕金森表型的诱导情况。本发明还涉及一种突触核蛋白病理性RBD模型的制备方法。本发明提出了通过向SLD核团立体定向注射可诱导突触核蛋白病理的预制纤维体(PFFs),借助于该纤维体“播散‑成核”的病理诱导特性从而构建可向帕金森表型转归的小鼠RBD模型，预期该模型可为未来研究中阐明RBD的病因、发病机制、帕金森转归及研发有效的阻断药物提供重要的动物模型基础。

Description

一种突触核蛋白病理性快动眼睡眠行为障碍模型的制备法
技术领域
本发明涉及医学和生物技术领域。具体而言，本发明涉及基于脑桥被盖背外侧下核(SLD)突触核蛋白病理特征的可向帕金森表型转归的动物快动眼睡眠行为障碍(RBD)模型的制备方法。
背景技术
作为帕金森病重要的运动前症状，快动眼睡眠行为障碍(RBD)最早在运动症状出现前10年即可出现[1]，并且对原发性RBD病人持续随访发现随访10-15年时约有80-90％的病人转化为突触核蛋白病[2]。对原发性RBD病人的神经影像和尸体解剖研究也提示：该阶段病人已有纹状体多巴胺转运体功能降低、中脑黑质多巴胺能神经元丢失、蓝斑下核(subcoeruleus nucleus)MRI-SWI序列低信号及核团内部路易病理形成[3-5]。据此，从临床病理学角度来说：与帕金森病相同，原发性RBD也可归属为突触核蛋白病家族成员[6]。因而，如能在此阶段采取措施积极干预延缓或阻断RBD向帕金森病的转归不仅会对帕金森病的发病具有重要的早期预警意义，也将从根本上改变现有的帕金森病治疗格局。
成功构建能准确反映疾病外在症状表现和内在病理本质的动物模型是对临床疾病开展基础与临床研究的前提。对RBD发病机制的认识和动物模型的构建也经历了一个漫长的过程：20世纪50年代法国科学家Michel Jouvet首次发现电凝破坏脑桥被盖特定区域可诱导实验动物快动眼睡眠期(REM)睡眠期出现极类似于梦境演绎样的行为(dream-enactment behavior)，因而，由此做出“完整的脑桥被盖(intact pontine tegmentum)是REM睡眠发生和其间肌张力松弛状态维持的前提条件”的推测[7]。此后，经过一系列的深入研究，人们对于该“脑桥被盖REM睡眠调节区”的认识不断加深，最终将该目标核团定位于脑桥被盖背外侧下区并命名为：脑桥被盖背外侧下核(SLD)[8-10]。围绕该核团，研究人员先后使用机械破坏[7]、毒素毁损[11]和核团功能性神经元相关受体、转运体基因敲除或沉默[12-15]的手段诱导实验动物出现程度不等的RBD样行为,从而为本发明方案中提出的制备突触核蛋白病理特征性的RBD动物模型提供了技术可行性支持证据。
然而，以上列举的诸多现有RBD建模方案仍有很大的缺陷：1.早期使用的机械毁破坏和后来的神经毒素毁损法会不可避免地波及周边的脑区和核团，引入诸多不可预测的混杂因素，难以做到单一变量化、精准化，也不能体现RBD突触核蛋白病的病理本质；2.新兴的针对REM睡眠调控环路上关键受体、转运体的基因突变或基因沉默策略，虽可选择性地靶向操纵特定区域特定类型的神经元从而实现精准化及微创化，但该造模方法没有突触核蛋白病理因素的参与，也不能体现RBD突触核蛋白病的病理本质；3.上述RBD模型构建方案无论是机械破坏、毒素毁损还是REM环路受体、转运体基因沉默策略无一例外都是在短时间内甚至即时诱导动物出现RBD样行为，因而并不符合RBD这一慢性进行性退变的突触核蛋白病的病理生理特征。
新近出现的预制纤维体(PFFs)被证实在体[16]或离体[17]干预均可诱导内源性ɑ-synuclein单体发生错误折叠、聚集形成寡聚体、原纤维、纤维进而聚合成路易小体和路易突起(Lewy body&neurite)，随细胞裂解释放的纤维被邻近神经元摄取后可诱导同样的病理变化，由此引发类似于朊蛋白样(prion-like)的“成核-播散(seeding-propagation)”反应[18]。据此，我们推测：向实验动物脑桥被盖SLD核团定向注射PFFs后可在局部诱发突触核蛋白病理变化诱导动物出现RBD样行为，借助于PFFs“成核-播散”的朊蛋白样病理传播特性可介导黑质-纹状体系统发生渐进性突触核蛋白病理变化进而模拟出帕金森样表型，由此成功构建以SLD核团突触核蛋白病理为基础可向帕金森表型转归的RBD动物模型。
参考文献
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发明内容
基于RBD发生的睡眠调控环路和PFFs的突触核蛋白病理诱导特性，本发明提出通过向SLD核团立体定向注射具有突触核蛋白病理诱导特性的ɑ-突触核蛋白PFFs,借助于该纤维体“播散-成核”的病理诱导特性从而构建可向帕金森表型转归的小鼠RBD模型，预期该模型将为未来研究中阐明RBD的病因、发病机制、帕金森转归及研发有效的阻断药物提供重要的动物模型基础。
具体地，本发明包括但不限于如下项目所公开的技术方案。
项目1.一种在非人受试动物中诱导可向帕金森表型转归的RBD表型的方法，该方法包括
1)向非人受试动物的单侧或双侧SLD立体定向注射能够诱导突触核蛋白病理变化的物质；
2)评估所述非人受试动物的RBD表型的诱导情况；
3)在所述RBD表型动物中评估帕金森表型的诱导情况。
项目2.项目1所述的方法，其中所述能够诱导突触核蛋白病理变化的物质是预制纤维体(PFFs)，优选ɑ-突触核蛋白寡聚体或多聚体。
项目3.项目1或2所述的方法，其中向非人受试动物的单侧或双侧SLD核团立体定向注射能够诱导突触核蛋白病理变化的物质。
项目4.项目2所述的方法，其中突触核蛋白预制纤维体是人源化或鼠源化α突触核蛋白多聚体。
项目5.项目1-4任一项所述的方法，其中通过视频-多导睡眠记录方法、组织病理学方法、或行为学评估方法评估所述非人受试动物的RBD表型的诱导。
项目6.项目5所述的方法，其中所述组织病理学方法包括对脑桥被盖层面做NeuN、pS129-ɑ-突触核蛋白组织化学染色，并观察各层面SLD核团神经元丢失及病理性ɑ-突触核蛋白聚集情况。
项目7.项目5所述的方法，其中所述行为学评估方法包括帕金森相关的运动表型评估方法，包括转棒实验、悬挂实验。
项目8.项目1-7任一项所述的方法，其中所述非人受试动物包括非人哺乳动物，例如非人灵长类动物，例如啮齿动物，例如猴、马、牛、犬、猫、小鼠、大鼠和猪等。
项目9.一种用于在非人受试动物中诱导可向帕金森表型转归的RBD表型的试剂盒，所述试剂盒包含能够在非人受试动物的SLD核团局部诱导突触核蛋白病理变化的物质。
项目10.项目9所述的试剂盒，其中所述能够诱导突触核蛋白病理变化的物质是预制纤维体(PFFs)，优选ɑ-突触核蛋白寡聚体或多聚体。
项目11.项目9-10任一项所述的试剂盒，其还包含注射工具和/或试剂。
项目12.一种可向帕金森表型转归的RBD动物模型的制备方法，其包括用项目1-8任一项的方法中定义的步骤1)至步骤3)制备诱导了RBD表型的动物模型。
在一些实施方案中，本发明提供本文描述的能够诱导突触核蛋白病理变化的物质是预制纤维体(PFFs)，优选ɑ-突触核蛋白寡聚体或多聚体作为在制备RBD动物模型和/或用于在非人受试动物中诱导RBD表型的试剂盒中的用途。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书。在一些实施方案中，适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与能够诱导突触核蛋白病理变化的物质的神经元的另一种试剂或组合物结合。组合物中至少一种试剂是本文的诱导突触核蛋白病理变化的物质。此外，所述试剂盒可以包含：(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含诱导突触核蛋白病理变化的物质，如预制纤维体(PFFs)，优选ɑ-突触核蛋白寡聚体或多聚体；和(b)其它相关试剂。本发明的试剂盒还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于制备RBD动物模型和/或在非人受试动物的SLD核团局部诱导突触核蛋白病理变化。所述试剂盒还可以包括第二或第三容器，所述第二或第三容器包含缓冲剂，如注射用水，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖溶液，还可以包括其他材料，如其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
附图说明
图1.PFFs制备流程示意图(ɑ-syn:ɑ-突触核蛋白；rpm:每分钟转速)。
图2.PFFs超声前后超微形态对比及纤维长度分布统计图a.超声前；b.超声后。
图3.立体定向注射位点示意图。
图4.PBS和PFFs组小鼠睡眠时相及RBD发作时EEG/EMG波形图(红色箭头示REM期频繁肌电活动)，3m.p.i.:术后3个月。
图5.PBS和PFFs组小鼠SLD核团NeuN和pS129-ɑ-突触核蛋白(pS129-ɑ-synuclein)组织化学染色图及定量分析与对照组小鼠相比，PFFs处理组小鼠SLD核团NeuN阳性神经元计数显著减少(a-c)，pS129-ɑ-突触核蛋白阳性神经元数目显著增加(d-f)，差异具有统计学意义。统计学方法：PBS组vs PFFs组参数比较使用非配对T检验；****p<0.0001。
图6.PBS和PFFs组小鼠的帕金森运动行为学统计分析a.转棒实验；b.悬挂实验；统计学方法：PBS组vs PFFs组参数比较使用非配对T检验；*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。
图7.PBS和PFFs组小鼠黑质致密部(SNc)TH和pS129-ɑ-突触核蛋白(pS129-AS)组织化学染色图及定量分析与对照组小鼠相比，PFFs处理组小鼠黑质致密部TH阳性神经元计数(a,c)和纹状体多巴胺递质浓度进行性减少(e)，pS129-ɑ-突触核蛋白阳性神经元数目显著增加(b,d)，差异具有统计学意义。PBS组vs PFFs组参数比较使用Two-way ANOVA plusTukey’s multiple comparison test；**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001,n.s.,无统计学差异。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明，所描述的各个具体实施方式不是限制性的，并且可以相互组合。
本发明的技术方案可分为五部分：1.PFFs的制备与立体定向注射；2.视频-多导睡眠记录及睡眠数据分析；3.RBD表型的组织病理学验证；4.帕金森表型的行为学评估；5.帕金森表型的生化及组织病理验证。具体分述如下：
1.PFFs的制备与立体定向注射
α突触核蛋白单体在37℃环境下经连续7天涡旋振荡(1000转/分)后超声粉碎，调整浓度至5mg/ml后分装，-80℃冰箱储存；立体定向注射到小鼠双侧SLD核团(800nl/侧)，术后恢复10天继续后续实验。
2.视频-多导睡眠记录及睡眠数据分析
睡眠记录前1周埋置电极，恢复7天后开始视频-多导睡眠记录，持续记录7天后解除设备进行睡眠数据分析，结合同步记录视频观察小鼠在REM睡眠期的肌电及行为变化判读RBD行为。
3.RBD表型的组织病理学验证
在预定时间节点麻醉小鼠，灌流固定后取脑、包埋、切片，挑选脑桥被盖层面做NeuN、pS129-ɑ-突触核蛋白组织化学染色，观察各层面SLD区域神经元丢失及病理性α突触核蛋白聚集情况并进行定量分析。
4.帕金森表型的行为学评估
在预定时间节点对各组小鼠进行帕金森相关的运动及非运动表型评估，具体评估项目包括转棒实验、悬挂实验,评估各组小鼠在帕金森相关运动、情绪及认知行为方面有无变化。
5.帕金森表型的生化及组织病理验证
在预定时间节点麻醉小鼠，灌流固定后取脑、包埋、切片，挑选中脑黑质及纹状体层面做TH、pS129-ɑ-突触核蛋白组织化学染色，观察各组小鼠黑质致密部(SNc)、纹状体层面神经元丢失及病理性ɑ-突触核蛋白聚集情况并进行定量分析。
根据上述规划的技术方案，以下结合附图和具体的实施方案对本发明做进一步的说明：
实验1.PFFs的制备和立体定向注射
1.材料及主要试剂
人源ɑ-突触核蛋白单体(PFFs制备专用)购自美国Proteos公司(货号：RP-003)；PBS(不含钙、镁)购自上海生工(货号：E607009)；BCA蛋白质定量检测试剂盒购自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific，货号：23225)；C57BL/6J小鼠购自中国科学院实验动物资源平台；400目电镜铜网购自中镜科仪；2％磷钨酸负染液购自中镜科仪。
2.实验方法
(1)PFFs制备
吸取人源ɑ-突触核蛋白单体加入1.5ml离心管(冰上操作，目测液体澄清透明)，离心(4℃，12000rpm，5min)后吸取上清，使用BCA法测蛋白浓度并调整浓度至5mg/ml。密封离心管固定于恒温振荡摇床(Thermo Fisher)上，调节温度(37℃)、转速(1000rpm)后开启摇床。连续振荡7天后，关闭摇床，取出离心管(目测液体浑浊)(见图1)。
(2)超声粉碎及分装
离心(4℃，12000rpm，5min)后吸取上清，使用接触式超声粉碎仪(上海左乐仪器)粉碎纤维体，调节功率为10％，工作模式为2s脉冲，开-关，共计100s，冰上操作，超声粉碎后目测液体变澄清。按20ul/管的规格分装纤维体后储存于-80℃冰箱(见图1)。
(3)PFFs电镜形态学验证
分别取适量超声前后的PFFs经PBS稀释(1:20)后，以移液枪缓慢滴加到400目电镜铜网上，自然晾干后滴加2％磷钨酸液(PH 6.5)负染1min后120KV生物型透射(Tecnai)电镜观察纤维形态(见图2)。
(4)立体定向注射
选取8-10周龄C57BL/6J小鼠(18-22g)，随机分为两组：PFFs组及PBS组。异氟烷气麻(2-3％)后固定于立体定向注射仪(瑞沃德生命科技)上，备皮、切开、分离、调标、钻孔后缓慢下针至目标深度，开启微量进样器缓慢泵入PFFs(800nl，10min)至双侧SLD核团(AP/ML/DV：-5.20/±0.75/-4.10mm)(见图3)。对照组注射等量PBS，注射完毕后停针10min后缓慢退针，生物胶封闭颅骨钻孔、缝皮后送回恢复笼，注意术后保温促进苏醒。
2.实验结果
对超声粉碎前后PFFs的电镜超微形态对比可见：前者呈长条纤维缠结状；后者为长短不一的短棒状(见图2)。PFFs和PBS注射入双侧脑桥被盖SLD核团(AP：-5.20mm)(见图3)。
实验2.视频-多导睡眠记录及睡眠数据分析
1.实验材料及仪器设备
骨科胶水、牙科水泥购自上海玉研仪器；排针、排线等电极制备原材料购自铭泰鑫电子；数据采集软件Spike 2购自英国CED公司；睡眠数据解析软件SleepSign购自日本Kissei Comtec公司。
2.实验方法
(1)EEG/EMG记录电极埋置
将待记录PFFs和PBS组小鼠异氟烷气麻(2-3％)后固定于立体定向注射仪(瑞沃德生命科技)上，备皮、切开、分离后分别在右侧额叶(AP/ML:+1.50/-0.80mm)和顶叶皮层(AP/ML:+1.50/-1.00mm)钻孔后埋置EEG记录电极螺丝，深度以紧贴硬脑膜表面为宜，EMG记录电极则插入颈下斜方肌，然后以牙科水泥固定电极于颅骨表面，缝皮后送回恢复笼，注意术后保温促进苏醒。
(2)视频-多导睡眠记录
睡眠记录电极埋置术后恢复7天，将待记录小鼠转移至记录笼连接睡眠记录设备适应3天后开始记录，睡眠记录时开启视频监测系统同步录像记录小鼠在睡眠-觉醒时段内的行为。
(2)睡眠数据及RBD行为分析
睡眠记录结束后导出数据，对照同步记录视频，使用SleepSign软件解析小鼠在清醒(wake,W)、慢波睡眠(slow wave sleep,SWS)及快动眼睡眠(REM,R)状态下的肌电强度变化、有无RBD样行为表现。
3.实验结果
视频-多导睡眠记录分析提示：相比于PBS组小鼠，PFFs注射3个月后(3m.p.i)可诱导小鼠出现REM期肌电活跃(见图4)，同步视频监测发现小鼠在此期表现出频繁的头、四肢及躯干无意识运动。
实验3.RBD表型的组织病理学验证
1.材料及主要试剂
PBS缓冲液(1×)购自上海生工(货号：E607008)；多聚甲醛粉剂购自Sigma-Aldrich(货号：158127)；NeuN一抗购自Abcam公司(货号：ab104224)；pS129-ɑ-突触核蛋白一抗购自Abcam公司(货号：ab51253)；生物素化山羊抗兔二抗购自Vector Laboratories公司(货号：BA-1000)；生物素化马抗小鼠二抗购自Vector Laboratories公司(货号：BA-2000)；DAB组化显色试剂盒套装购自Vector Laboratories公司(货号：SK-4100/PK-6100)；苏木素染液购自Vector Laboratories公司(货号：H-3401)。
2.实验方法
(1)麻醉、灌流、固定、组织切片
PFFs或PBS注射3个月后，给予小鼠过量麻醉药物后经心脏依次泵入4℃PBS缓冲液和4％多聚甲醛固定液，取脑经蔗糖梯度脱水后OCT胶包埋速冻，冰冻切片机(Leica)连续切片。
(2)免疫组化染色
挑选脑桥被盖层面切片，经3％H2O2封闭内源性过氧化物酶后，NeuN和pS129-ɑ-突触核蛋白一抗孵育24h(4℃)，相应生物素化二抗室温孵育2h后以DAB法显色，待目标信号出现后入PBS及时终止反应。显色结束后根据需要进行苏木素细胞核负染。
(3)SLD核团神经元及pS129病理阳性神经元计数
定位脑桥被盖SLD核团分别计数NeuN阳性和pS129-ɑ-突触核蛋白阳性神经元，其中pS129-ɑ-突触核蛋白阳性神经元定义为：苏木素细胞核显色可见前提下，神经元胞体轮廓或突起内出现pS129-ɑ-突触核蛋白阳性显色点。分别计数、统计SLD核团内神经元及pS129病理阳性神经元。
3.实验结果
相较于PBS对照组，PFFs组小鼠SLD核团NeuN阳性神经元计数显著减少(见图5，a-c)；与之相反，该核团pS129-ɑ-突触核蛋白阳性神经元计数显著增加(见图5，d-f)。因此，该发现为PFFs处理后小鼠的RBD样行为提供了组织病理学层面的佐证。
实验4.帕金森表型的行为学评估
1.实验材料及仪器设备
转棒仪购自美国Med-Associates公司；ANY-maze动物行为分析系统购自美国Stoeling公司。
2.实验方法
(1)转棒实验
转棒实验主要用来评估动物四肢的运动协调功能。将小鼠放置在转棒上，转棒初始速度为4rpm，实验开始后转棒将均匀加速至40rpm，历时300s，记录从实验开始到动物跌落的时间。正式开始实验前需对动物进行两天的适应性训练，每只动物每天训练3次，每次5min，次间相隔30min。第三天开始正式实验时，每只动物测试3次，次间相隔30min，3次测试的平均值即为一次测试的实验结果。
(2)悬挂实验
将小鼠放置于饲养笼笼盖上，轻轻晃动使其抓稳后迅速倒置，开始计时，记录其跌落的延迟时间。每只小鼠测试3次，次间相隔15min，3次测试的平均值即为一次测试的实验结果。
3.实验结果
在各行为测试时点(1m.p.i.,3m.p.i.,5m.p.i.&8m.p.i.)，与PBS对照组相比，PFFs处理组小鼠运动功能(转棒实验、悬挂实验)呈渐进性下降趋势(图6)，这与黑质-纹状体系统的进行性退变相一致。
实验5.帕金森表型的组织病理学验证
1.材料及主要试剂
PBS缓冲液(1×)购自上海生工(货号：E607008)；多聚甲醛粉剂购自Sigma-Aldrich(货号：158127)；TH一抗购自Abcam公司(货号：ab137869)；pS129-ɑ-突触核蛋白一抗购自Abcam公司(货号：ab51253)；生物素化山羊抗兔二抗购自Vector Laboratories公司(货号：BA-1000)；DAB组化显色试剂盒套装购自Vector Laboratories公司(货号：SK-4100/PK-6100)；苏木素染液购自Vector Laboratories公司(货号：H-3401)；尼氏染液购自碧云天生物科技公司(货号：C0117)。
2.实验方法
(1)麻醉、灌流、固定、组织切片
在预定时间点(1m.p.i.,3m.p.i.,5m.p.i.&8m.p.i.)，给予小鼠过量麻醉药物后经心脏依次泵入4℃PBS缓冲液和4％多聚甲醛固定液，取脑后经蔗糖梯度脱水后OCT胶包埋速冻，冰冻切片机(Leica)连续切片。
(2)纹状体单胺类递质检测
在预定时间点(1m.p.i.,3m.p.i.,5m.p.i.&8m.p.i.)，给予小鼠过量麻醉药物后经心脏泵入4℃PBS缓冲液后取脑，分离纹状体，称重后加入高氯酸匀浆、离心，取上清后使用高效液相色谱(HPLC)电化学法测量多巴胺(DA)递质浓度。
(3)免疫组化染色
挑选黑质致密部(SNc)，经3％H2O2封闭内源性过氧化物酶后，TH和pS129-ɑ-突触核蛋白一抗孵育24h(4℃)，生物素化山羊抗兔二抗室温孵育2h后以DAB法显色，待目标信号出现后入PBS及时终止反应。显色结束后根据需要进行苏木素或尼氏染液负染。
(4)黑质致密部TH阳性神经元及pS129病理阳性神经元计数
分别计数中脑黑质致密部(SNc)TH阳性和pS129-ɑ-突触核蛋白阳性神经元，其中pS129-ɑ-突触核蛋白阳性神经元定义为：苏木素细胞核显色可见前提下，神经元胞体轮廓或突起内出现pS129-ɑ-突触核蛋白阳性显色点。分别计数并统计各组SNc内TH阳性神经元及pS129病理阳性神经元数目。
3.实验结果
相较于PBS对照组，PFFs组小鼠黑质TH阳性神经元计数(图7,a,c)及纹状体单胺类递质(多巴胺)浓度(图7,e)呈时间依赖性下降；与之相反，中脑黑质pS129-ɑ-突触核蛋白病理阳性神经元计数呈时间依赖性增加(图7,b,d)。

Claims (8)

1.一种在非人受试动物中诱导可向帕金森表型转归的快动眼睡眠行为障碍（RBD）表型的方法，该方法包括
1）向非人受试动物的单侧或双侧脑桥被盖背外侧下核立体定向注射能够诱导突触核蛋白病理变化的物质；
2）评估所述非人受试动物的RBD表型的诱导情况；
3）在所述RBD表型动物中评估帕金森表型的诱导情况，
其中所述能够诱导突触核蛋白病理变化的物质是人源化或鼠源化α突触核蛋白多聚体，其中所述非人受试动物为小鼠或大鼠。
2.权利要求1所述的方法，其中向非人受试动物的双侧脑桥被盖背外侧下核核团立体定向注射能够诱导突触核蛋白病理变化的物质。
3.权利要求1-2任一项所述的方法，其中通过视频-多导睡眠记录方法、组织病理学方法、或行为学评估方法评估所述非人受试动物的RBD表型的诱导。
4.权利要求3所述的方法，其中所述组织病理学方法包括对脑桥被盖层面做NeuN、pS129-ɑ-突触核蛋白组织化学染色，并观察各层面脑桥被盖背外侧下核核团神经元丢失及病理性ɑ-突触核蛋白聚集情况。
5.权利要求3所述的方法，其中所述行为学评估方法包括帕金森相关的运动表型评估方法，包括转棒实验、悬挂实验。
6.一种用于在非人受试动物中诱导可向帕金森表型转归的RBD表型的试剂盒，所述试剂盒包含能够在非人受试动物的脑桥被盖背外侧下核核团局部诱导突触核蛋白病理变化的物质，其中能够在非人受试动物的脑桥被盖背外侧下核核团局部诱导突触核蛋白病理变化的物质是人源化或鼠源化α突触核蛋白多聚体，其中所述非人受试动物为小鼠或大鼠。
7.一种可向帕金森表型转归的RBD动物模型的制备方法，其包括用权利要求1-5任一项的方法中定义的步骤1）至步骤3）制备诱导了RBD表型的动物模型，其中所述动物模型为小鼠或大鼠动物模型。
8.能够在非人受试动物的脑桥被盖背外侧下核核团局部诱导突触核蛋白病理变化的物质在制备可向帕金森表型转归的RBD动物模型中的应用，其中所述能够在非人受试动物的脑桥被盖背外侧下核核团局部诱导突触核蛋白病理变化的物质是人源化或鼠源化α突触核蛋白多聚体，其中所述非人受试动物为小鼠或大鼠。
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