CN112979746A - 一种蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置，属于活性蛋白分离提取技术。采用膜滤和电渗析耦合而成的分离装置进行蛋清稀释液中溶菌酶、卵白蛋白和卵转铁蛋白的同步分离与浓缩。该蛋清中活性蛋白同步分离装置可包含多个基本工作单元，每个基本工作单元为含有卵白蛋白回收室、料液室和溶菌酶回收室的三隔室结构。本发明所提供的活性蛋白同步分离方法与装置，缩短了蛋清中溶菌酶、卵白蛋白和卵转铁蛋白三种主要活性蛋白分离提取的工艺流程，避免了多步盐析法对化学试剂的大量消耗而引起的二次污染，也有效减轻了压力驱动膜过程的膜污染问题，便于工业放大，显著提高了活性蛋白的纯度、收率。

Description

一种蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置

技术领域

本发明属于活性蛋白分离提取技术领域，尤其是涉及一种蛋清中卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶三种主要活性蛋白的同步分离方法与装置。

背景技术

我国是世界上最大的禽蛋生产国，2019年中国国民经济和社会发展统计公报数据显示我国禽蛋产量3309万吨，占世界总产量的43％。虽然我国禽蛋资源丰富，但禽蛋加工尚处于起步阶段，禽蛋的附加值较低，在蛋品深加工和生产利用方面有着相当大的缺口与不足，与国外诸多发达国家有着显著差距。蛋清中的蛋白质含量约占11-13％，是一种理想且优质的蛋白质资源。蛋清中含有40多种蛋白质，其中卵白蛋白占总蛋白含量54-69％，卵转铁蛋白占12-13％，溶菌酶占3.4-3.5％。含量较多的卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶均具有生理活性，在人类健康、疾病的预防和治疗、生理调节和提升机体免疫力方面潜力巨大。因此，蛋清中活性蛋白的分离纯化已成为当今食品领域的研究热点之一。

用于活性蛋白分离纯化的方法主要有沉淀法、色谱法、离子交换法和膜分离等。其中沉淀法虽可大量分离蛋白，但产品需多次盐析、盐溶才能获得高纯度产品，易造成蛋白质的变性失活；色谱法虽得到的活性蛋白产品纯度高，且能较好的保留其生物活性，但耗时长、费用高、色谱柱易堵塞，分离规模和产能极其有限；离子交换法则需使用不同浓度氯化钠磷酸缓冲液多次洗脱，洗脱程序十分复杂，收率有限。膜分离是一种高效的分离提纯技术，但用于蛋白分离时，易形成膜面吸附或膜孔堵塞的污染，且用于分子量比较接近的蛋白分离时，选择性较低，而限制了其使用。最主要的是，目前已报道的方法大多是针对其中一种活性蛋白的分离，对于蛋清中主要活性蛋白的同步分离方法还鲜有涉及。

发明专利公开CN 107253990 A描述了“一种共分离制备鸡蛋清溶菌酶与活性蛋白的方法”。该方法采用聚乙二醇沉淀+硫酸铵盐析+两步超滤的方法从蛋清中分离溶菌酶、卵白蛋白和卵转铁蛋白。该方法条件温和，可以较好的保持溶菌酶的活性，但只能得到卵白蛋白和卵转铁蛋白为主的活性蛋白混合物，且需两步超滤，分离过程较为繁琐。发明专利公开CN 109609480 A则描述了“一种鸡蛋清中蛋白质的提取方法”。该方法采用多次盐析沉淀结合树脂吸附的方法从蛋清中分离出卵黏蛋白、卵转铁蛋白、卵白蛋白、卵抑制剂、卵类黏蛋白以及溶菌酶共六种蛋白，该方法虽能最大限度地提高蛋品加工的附加值，但每步需加入不同的化学药剂、严格的调整和控制pH，且活性蛋白的收率有限。因此，迫切需要建立一种操作简便、高效、易于工业放大的快速、同步分离蛋清中溶菌酶、卵白蛋白和卵转铁蛋白三种主要活性蛋白的技术，对提高国民健康水平，助推禽蛋产业经济发展，助推健康中国战略实施均具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便高效、易于工业放大的蛋清中卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶等三种活性蛋白同步快速分离方法与装置。鉴于蛋清中主要活性蛋白如卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶的分子量和荷电性等理化性质存在着较为显著的差异，在外加电场作用下，三种活性蛋白的电迁移行为亦有较大不同，本发明通过在常规电渗析膜堆的阴、阳离子交换膜中间有针对性地设置2张理化性质不同的多孔滤膜，构建一种将电渗析与膜滤过程内在耦合而成的新型装置用于蛋清中卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶三种活性蛋白的同步分离。利用多孔滤膜的孔径筛分和荷电大分子的电泳迁移等双重作用，实现蛋清稀释液中卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶的同步、快速分离。该分离方法与普通的超滤或微滤过程相比，不使用压力作为驱动力，显著减小了导致膜面非选择性滤饼层形成的压缩力，从而降低了膜污染的风险；更重要的是，该方法利用多孔超滤膜的孔径筛分和电迁移的双重选择作用来实现蛋白的分离，具有高选择；且在外加电场驱动力的作用下，大分子荷电蛋白透过多孔滤膜的速度相应增加，使其通量得以提高，从而使蛋清中卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶的分离过程能够高效、稳定地运行。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

一种蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置，首先将收集的新鲜蛋清进行稀释、离心沉淀、pH调节等预处理获得低粘度的蛋清稀释液，然后采用由电渗析和膜滤过程内在耦合而成的分离装置对低粘度蛋清稀释液中的活性蛋白进行同步分离和浓缩。其中所用分离装置包括膜堆、电极装置、和夹紧装置三部分。夹紧装置由两块夹紧板、拉紧的螺栓与螺母组成在两张夹紧板的内侧分别是阴、阳电极室与电极板组成的阴、阳电极装置在中空支撑边框板的中空腔体内是膜堆。膜堆的基本单元为膜对，每个膜对从阳极侧到阴极侧依次由阳离子交换膜、卵白蛋白回收室隔板、多孔滤膜1、料液室隔板、多孔滤膜2、溶菌酶回收室隔板各一张组成的包含有卵白蛋白回收室、料液室和溶菌酶回收室三隔室结构。

与传统的电渗析膜堆结构所不同的是,本发明所提供的是在电渗析器膜对阴阳离子交换膜之间有针对性的设置两张理化性质不同的多孔滤膜，从而将电渗析和膜滤过程有机结合起来的一种新型膜分离技术。其中多孔滤膜作为两液流的接触界面，提供传质的场所，垂直于液流方向的电场力是待分离活性物质如卵白蛋白和溶菌酶迁移的唯一驱动力。经过预处理获得的主要含有溶菌酶、卵白蛋白和卵转铁蛋白的蛋清稀释液作为原料液泵入料液室，在直流电场的驱动和多孔滤膜的选择性分离作用下，料液室中荷负电的卵白蛋白，将透过位于左侧的多孔滤膜1向阳极方向迁移进入卵白蛋白回收室；料液室中荷正电的溶菌酶，将透过位于右侧的多孔滤膜2向阴极方向迁移进入溶菌酶回收室；而料液室中不荷电的卵转铁蛋白则随着液流被带出料液室，从而实现三种蛋白的同步分离。卵白蛋白回收室、溶菌酶回收室中的溶液经过多次全部或部分循环，其溶菌酶和卵白蛋白的浓度不断增加，从而实现蛋清稀释液中卵白蛋白、溶菌酶和卵转铁蛋白的同步分离与浓缩。

上述的一种蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置，具有以下特征:

(1)可根据蛋清中待分离活性蛋白的理化性质和电迁移行为，在电渗析器的每个膜对的阴阳离子交换膜之间设置两张理化性质不同的多孔滤膜,构成含有卵白蛋白回收室、料液室和和溶菌酶回收室的三隔室膜堆基本工作单元。

(2)所用上述两张多孔滤膜为孔径不同的两张多孔滤膜，其中靠近阳极侧的多孔滤膜的截留分子量为50000-100000；而靠近阴极侧的多孔滤膜的截留分子量为20000-50000。

(3)所用上述一种蛋清中活性蛋白同步分离的装置中，两张多孔滤膜的朝向不同，其中靠近阳极侧的多孔滤膜1的活性分离层朝向阴极，而靠近阴极侧的多孔滤膜的活性分离层朝向阳极。

(4)所用上述一种蛋清中活性蛋白同步分离的装置中，膜堆的基本工作单元包括卵白蛋白回收室、料液室和溶菌酶回收室，且三者的厚度均为0.5-3.0mm。

本发明中，在阴阳极室的内侧均设有极室保护室，其中阳极保护室的设置可以防止阳极反应产物之一H⁺离子向与其相邻的第一个卵白蛋白回收室的迁移扩散而维持回收室中卵白蛋白的稳定存在；而阴极保护室的设置，则能够阻止阴极反应产物之一OH^-离子向靠近阴极侧的最后一个溶菌酶回收室的迁移，以维持溶菌酶回收室中溶菌酶的稳定存在。

本发明中，电极水为单独配制的5.0-20.0g/L的Na₂SO₄溶液，以保持阴、阳极室的良好导电性。电极水从阳极侧进入，由阴极侧排出，进入外部极水罐，在排除电极反应产生的气体后可循环使用。正常运行过程中，因电极反应，导致阳极室水流呈酸性，阴极室水流则为碱性。而本发明中电极水由阳极室导入阴极室，因中和作用可有效地减少阴极室中OH^-离子和阳极室中H⁺离子的积累，从而减轻阴极室电极反应产物对相邻隔室的影响。卵白蛋白回收液、溶菌酶回收液及蛋清稀释液均采取全循环或部分循环的方式运行，以实现蛋清稀释液中卵白蛋白、溶菌酶和卵转铁蛋白的同步快速分离与浓缩，大大缩短了工艺流程和操作周期。

本发明中，可通过采用不同面积规格的卵白蛋白回收室隔板、料液室和溶菌酶回收室隔板，以及增加或减少分离装置中卵白蛋白回收室、料液室和溶菌酶回收室所构成的基本工作单元的数目，即可处理不同规模的蛋清稀释液，便于工业放大。

本发明所述的一种蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置，其运行过程具备如下效果：

(1)利用电渗析与膜滤内在耦合而成的新型分离装置实现了蛋清中卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶三种活性蛋白的同步分离与浓缩，该发明有效缩短了蛋清中活性蛋白提取的工艺流程，三种蛋白的同步提取大大提高了蛋品加工的附加值，具有显著的经济效益和社会效益。

(2)该方法利用多孔超滤膜的孔径筛分和电迁移的双重选择作用来实现蛋清中活性蛋白的分离，具有更高的选择性。

(3)可通过采用不同面积规格的隔板或通过基本工作单元数目的增减来改变单个装置的处理量，易于工业放大，操作简便。

(4)该分离方法与普通的超滤过程相比，不使用压力作为驱动力，显著减小了导致膜面非选择性滤饼层形成的压缩力，从而降低了超滤膜污染的风险；且在外加电场驱动力的作用下，大分子荷电蛋白透过多孔滤膜的速度相应增加，使其通量得以提高，从而使蛋清中卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶的分离过程能够高效、稳定地运行。

(5)与现有活性蛋白分离常用的盐析法相比，无需额外引入化学试剂，有效保持蛋白活性的同时保证了活性蛋白产品用于食品或医药领域的纯度和安全性。

附图说明

图1为本发明所提供的一种蛋清中活性蛋白同步分离装置内部构造中，基本工作单元的活性蛋白同步分离示意图；

图2为发明所提供的一种蛋清中活性蛋白同步分离装置内部构造示意图；

图3为本发明所提供的一种实施例装置的具体工艺流程图。

以上图中：

1-多孔滤膜1；2-多孔滤膜2；3-阳离子交换膜；4-阴离子交换膜；5-料液室；6-卵白蛋白回收室；7-溶菌酶回收室；8-卵转铁蛋白；9-荷负电的卵白蛋白；10-荷正电的溶菌酶；11-料液室入口溶液；12-卵白蛋白回收室入口溶液；13-溶菌酶回收室入口溶液；14-阳极；15-阴极；16-阳极室；17-阳极保护室；18-阴极室；19-阴极保护室；20-基本工作单元；21-阳极室进水；22-阳极室出水；23-阴极室进水；24-阴极室出水；25-料液室出口溶液；26-卵白蛋白回收室出口溶液；27-溶菌酶回收室出口溶液；28-蛋清中活性蛋白同步分离装置；29-电源；30-极水循环罐；31-截止阀；32-极水循环泵；33-压力表；34-转子流量计；35-卵白蛋白回收液循环罐；36-卵白蛋白回收液循环泵；37-在线酸度计；38-料液循环罐；39-料液循环泵；40-溶菌酶回收液循环罐；41-溶菌酶回收液循环泵。

具体实施方式

为便于本领域技术人员理解本发明方案，现结合说明书附图及实施例对本发明技术方案作进一步具体说明。

根据图1及图2，每个膜堆基本工作单元包括有,卵白蛋白回收室、料液室和溶菌酶回收室等三个隔室。经过去粘和pH调节等预处后的蛋清稀释液进入料液室，在外加电场的作用下，料液室中荷负电的卵白蛋白透过多孔滤膜1向其左侧相邻的卵白蛋白回收室中迁移；料液室中荷正电的溶菌酶透过多孔滤膜2向其右侧相邻的溶菌酶回收室中迁移；而料液室中的不荷电的大分子卵转铁蛋白则由于多孔滤膜1和2的筛分作用而被截留在料液室中。在进料液、卵白蛋白回收液和溶菌酶回收液均采用循环运行的工艺条件下，蛋清稀释液中的卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶三种活性蛋白实现同步的分离与高倍数浓缩。

料液室中设置的多孔滤膜1的截留分子量为50000-100000，这使得蛋清稀释液中的荷负电的卵白蛋白能够在电场作用下顺利透过多孔滤膜1进入左侧相邻的卵白蛋白回收室；料液室中设置的多孔滤膜2的截留分子量则为20000-50000，这使得蛋清稀释液中的荷正电的溶菌酶能够在电场作用下顺利透过多孔滤膜2进入右侧相邻的溶菌酶回收室，而料液室中与溶菌酶共存的卵白蛋白和卵转铁蛋白则由于多孔滤膜2的筛分作用及外加电场的作用,不能进入右侧相邻的溶菌酶回收室；蛋清稀释液中大分子卵转铁蛋白由于不荷电而保留在中间的料液室中，从而实现蛋清稀释液中溶菌酶、卵白蛋白和卵转铁蛋白三种重要活性蛋白的同步高效、快速分离与浓缩。

根据图3所提供的工艺流程，经过稀释、离心沉淀、pH调节等预处理而得到的蛋清稀释液作为料液室入口溶液11由料液循环罐38经料液循环泵39进入蛋清中活性蛋白同步分离装置28，自下而上流经料液室5后，再回到料液循环罐38进行循环，从而使蛋清稀释液中的卵白蛋白和溶菌酶分别不断地迁移进入左侧相邻的卵白蛋白回收室6和右侧相邻的溶菌酶回收室7中。卵白蛋白回收室入口溶液12经卵白蛋白回收液循环泵36泵入蛋清中活性蛋白同步分离装置28后自下而上流经卵白蛋白回收室6后，再回到卵白蛋白回收液循环罐35进行循环，从而不断吸收来自蛋清稀释液中的卵白蛋白，以实现卵白蛋白的高倍数浓缩。溶菌酶回收室入口溶液13经溶菌酶回收液循环泵41蛋清中活性蛋白同步分离装置28后自下而上流经溶菌酶回收室7后，再回到溶菌酶回收液循环罐40进行循环，从而不断吸收来自蛋清稀释液中的溶菌酶，以实现溶菌酶的高倍数浓缩。阳极室进水21自极水循环罐30经极水循环泵32，自下而上进入阳极室16和阳极保护室17，阳极室出水22经外部极水管路自下而上进入阴极保护室18和阴极室19，阴极室出水24回到极水循环罐30排出气体后作为阳极室进水21循环进入阳极室16和阳极保护室17。

实施例1

该实施例中，新鲜鸡蛋洗净去壳，利用分蛋器分离蛋清和蛋黄，收集蛋清。取新鲜蛋清200mL，加入1800mL含0.9％NaCl的磷酸盐缓冲液对新鲜蛋清进行稀释，缓慢磁力搅拌15min，以6000r/min的转速下离心25min，去除大分子黏性蛋白和其他杂质沉淀，获得上清液即为蛋清稀释液。用1.0M的HCI和NaOH调节蛋清稀释液的pH至6.8。然后进入由膜滤和电渗析内在耦合而成的分离装置对蛋清稀释液中的卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶等三种活性蛋白进行分离和浓缩。

其中蛋清中活性蛋白同步分离装置为一级一段结构，含两个基本工作单元，用于分离经去粘和和pH调等预处理过的蛋清稀释液中的卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶等活性蛋白。料液室、卵白蛋白回收室、溶菌酶回收室、阴、阳极室保护室及阴、阳极室隔板规格均为100mm×300mm×0.9mm。所用离子交换膜为异相离子交换膜，由浙江千秋环保水处理有限公司生产。所用多孔滤膜均由安得膜分离技术工程有限公司提供，其中多孔滤膜1为截留分子量为100000的聚偏氟乙烯超滤膜，而多孔滤膜2为截留分子量为30000的聚醚砜超滤膜。

料液循环罐38中为新鲜蛋清经稀释、离心沉淀、pH值调节为6.8后的蛋清稀释液；卵白蛋白回收液循环罐35中的初始溶液为2000mg/L的NaCl溶液；溶菌酶回收液循环罐40中的初始溶液亦为2000mg/L的NaCl溶液；电极水为15.0g/L的Na₂SO₄溶液。进料液、卵白蛋白回收液、溶菌酶回收液和电极液的流量分别为12.0、12.0、12.0和15.0L/h，且均采用闭路循环。膜堆工作电压为8V，运行5.0h后，蛋清中卵白蛋白回收率可达28.8％，纯度可达82％；溶菌酶的回收率可达48.3％，纯度可达98.0％；卵转铁蛋白的回收率可达78.3％，纯度可达48.8％。进料液、卵白蛋白回收液和溶菌酶回收液的pH值均采用在线酸度计37进行监测，卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶的含量和纯度采用高效液相色谱法测定。

实施例2

该实施例中，蛋清中活性蛋白同步分离装置采用一级一段结构，含两个基本工作单元，用于经过与实施例1相同的预处理后得到的蛋清稀释上清液中的卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶等活性蛋白的分离。所用料液室隔板、卵白蛋白回收室隔板和溶菌酶回收室隔板均与实施例1相同，所用离子交换膜为异相离子交换膜，由浙江千秋环保水处理有限公司生产。所用多孔滤膜均由安得膜分离技术工程有限公司提供，其中多孔滤膜1为截留分子量为50000的聚醚砜超滤膜，多孔滤膜2为截留分子量为20000的聚醚砜超滤膜。

极水循环罐30、料液循环罐38、卵白蛋白回收液循环罐35、溶菌酶回收液循环罐40中的初始溶液组成和浓度均与实施例1相同。进料液、卵白蛋白回收液和溶菌酶回收液的pH值均采用在线酸度计37进行监测，卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶的含量和纯度采用高效液相色谱法测定。进料液、卵白蛋白回收液、溶菌酶回收液和电极液的流量分别为10.0、10.0、10.0和15.0L/h。膜堆工作电压为8V，运行5.0h后，蛋清中卵白蛋白回收率可达48.5％，纯度可达92％；溶菌酶的回收率可达28.6％，纯度可达98％；卵转铁蛋白的回收率可达91.8％，纯度可达62.0％。通过扫描电镜观测，多孔滤膜1和2以及阴阳离子交换膜表面均无明显污染。

实施例表明,利用本发明所提供的蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置，能够简便而有效地从蛋清中分离提取卵白蛋白、溶菌酶和卵转铁蛋白。该新型分离技术可以实现蛋清中三种重要活性蛋白的快速同步分离，大幅度缩短活性蛋白分离提取的工艺流程，显著提高所获得的蛋白的纯度和安全性，降低蛋白分离系统的投资和运行成本，在活性蛋白质的分离、提纯等领域均具有重要应用价值。

Claims (5)

1.一种蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置，通过在电渗析器膜对的阴阳离子交换膜之间有选择性地设置两张不同的多孔滤膜，从而将电渗析和膜滤过程耦合于一体，利用多孔滤膜的筛分和荷电蛋白的电泳迁移的双重作用来实现蛋清中卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶三种活性蛋白的同步分离，其特征在于，膜堆的每个基本工作单元包括依次排列的卵白蛋白回收室、料液室和溶菌酶回收室。

2.根据权利要求1所述的一种蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置，其特征还在于膜堆的每个基本工作单元中所用的多孔滤膜为截留分子量不同的2张多孔滤膜，其中靠近阳极侧的多孔滤膜的截留分子量为50000-100000，靠近阴极侧的多孔滤膜的截留分子量为20000-50000。

3.根据权利要求1所述的一种蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置，其特征还在于靠近阳极侧的多孔滤膜的表面活性分离层朝向阴极,而靠近阴极侧的多孔滤膜的活性表面分离层朝向阳极。

4.根据权利要求1所述的一种蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置，其特征还在于所用多孔滤膜的材质可为纤维素类、聚砜类、聚酞胺类、聚烯烃类、含氟类等有机高分子材料,也可为陶瓷、金属、分子筛等无机材料。

5.根据权利要求1所述的一种蛋清中活性蛋白同步分离的方法与装置，其特征还在于所用处理装置膜堆的每个基本工作中抗生素回收室、料液室和溶菌酶回收室的厚度均为0.5-3.0mm。

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