CN112978901A - 原位培养管道生物膜的反应器及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种原位培养管道生物膜的反应器及其方法，巧妙利用三重溢流，使插入的管道内壁可以形成瀑布状的环形水膜(非满管流)，此时较低的剪切力和较为充分的氧气，有利于反应初期生物膜的定殖和好氧菌的快速增殖；通过增大潜水泵输入流量，管内的水流状态，将从层流变为湍流，并逐渐趋于满管流。此时剪切力增大，有利于筛选粘附力较强的成膜细菌，并最终生成稳定的管壁生物膜。该装置为全自动循环反应体系，制作成本低、养膜周期短、易操作易维护、效率高，尤其对生物膜的原位培养提供了一种新的思路。

Description

原位培养管道生物膜的反应器及其方法

技术领域

本发明涉及管道生物膜反应器领域，更具体地，本发明涉及一种在贫营养水环境介质(如自来水管道)中原位培养和筛选生物膜的反应器和方法。

背景技术

生物膜广泛存在于自然界中，是微生物在恶劣环境条件下生存的一种重要形式。生物膜可能是有益的，例如污水处理厂利用生物膜法处理生活废水；它们也可能会产生负面影响，特别是在工业环境或医疗设备，以及给水管网中形成时，可能威胁生产安全和人体健康。因此，研究生物膜的形成和消除对许多学科和工程应用十分重要。

目前，实验室层面培养和研究生物膜，主要通过生物膜反应器实现。常见的生物膜反应器，包括(如表1所示)：微量滴定板(Microtiter plates)，卡尔加里反应器(Calgarydevice)、生物膜微珠试验反应器(The Biofilm Ring Test)、罗宾斯和改良罗宾斯反应器(Robbins Device and Modified Robbins)、滴流式生物膜反应器(Drip Flow BiofilmReactor)、旋转式生物膜反应器(Rotary Biofilm Devices)、流动室(Flow Chamber)和微流体反应器(Microfluidic devices)。

表1常见的生物膜反应器

总体而言，目前常见的生物膜反应器中，微量滴定板、卡尔加里反应器和生物膜微珠试验反应器往往受限于研究生物膜形成的某个阶段或只适用于短期实验。而罗宾斯反应器和改良罗宾斯反应器、滴流生物膜反应器和旋转式生物膜反应器均采用可拆卸试片的方式进行设计，可用于观察生物膜生长的整个生命周期。但这些装置存在结构复杂、价格昂贵、操作难度较大，部分装置与真实管道流体动力学条件差距较大、频繁拆装试片容易导致半开放系统被非目标菌污染的问题。流动室反应器和微流体反应器应用了原位培养、在线观察的设计思路，但产生生物膜量很少，只适用于微观研究，并且采样不便，需要额外的昂贵设备且维护较为复杂。

参考文献

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发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种原位培养管道生物膜的反应器及其方法，解决现有技术中生物膜的反应器装置存在结构复杂、价格昂贵、操作难度较大，部分装置与真实管道流体动力学条件差距较大、频繁拆装试片容易导致半开放系统被非目标菌污染的问题。

本发明的技术方案为：

一种原位培养管道生物膜的反应器，所述反应器主体为两个上下叠放的圆柱筒，上层圆柱筒有一个截面圆心处打孔的顶盖，打孔处刚好允许回流管路进入；连接上下圆柱筒的中间层为经过打孔处理的隔板，隔板上的孔洞允许管道刚好穿过并被固定住；隔板上分别固定有六个小圆柱和1个中央大圆柱；6个小圆柱的底面圆心分别与隔板的6个孔洞截面圆心重合，中央大圆柱的底面圆心与上层圆筒的底面圆心重合；上层圆筒的高度高于中央大圆柱的高度，中央大圆柱的高度高于6个小圆柱的高度，小圆柱的高度高于设置于小圆柱内管道的高度；下层圆筒内安装有一台调节流量的潜水泵，把下层圆筒内的液体通过回流管路泵回上层圆筒的中央大圆柱中。

所述6个小圆柱高度一致，与中央大圆柱的距离一致。

所述管道为DN32管道。

一种原位培养管道生物膜的方法，包括以下步骤：

(1)利用权利要求1所述原位培养管道生物膜的反应器，将培养基加入反应装置的下层圆筒，加入自来水，水位没过潜水泵；

(2)开启潜水泵，反应溶液先经过潜水泵，输送到上层圆筒的中央大圆柱，水满后液体从中央大圆柱溢流出来，进入上层圆筒，后又溢流进入6个小圆柱，最后再溢流进入小圆柱内竖放的管道，在管道内壁形成空心的贴壁水流，并从孔洞通过重力自流，进入下层圆筒中，如此循环往复；

(3)定期更换自来水和培养基；

(4)管道内壁逐渐产生生物膜并趋于稳定，最终内壁定殖生物膜的管子成形；

(5)应用这根管子在反应器里面，模拟流水动态场景，研究外加污染物、微生物种群的变化；或者，单独用作微生物的容器；更换新管道，继续产出新的“包含原位生物膜”的管道。

所述步骤(2)设定时间间隔交替开关潜水泵。

所述步骤(3)定期更换自来水和培养基具体操作方法为：前1星期，每隔1天换1次液体培养基；第2个星期，每隔3天换1培养基；两个星期以后，同样每隔3天换一次培养基，但培养基营养逐次减半；1个月后，每隔3天只需要更换自来水，不需要添加任何营养。

所述步骤(3)换水时，利用虹吸管排空水溶液。

该反应器放置于暗箱中避光，或者外壁包裹锡箔纸。

本发明有益效果：

本发明结构简单而有效，不需要制作复杂的试片，可在普通管道原位培养生物膜，节省管路，实现泵系统节能。本发明巧妙利用三重溢流，使插入的管道内壁可以形成瀑布状的环形水膜(非满管流)，此时较低的剪切力和较为充分的氧气，有利于反应初期生物膜的定殖和好氧菌的快速增殖；通过增大潜水泵输入流量，管内的水流状态，将从层流变为湍流，并逐渐趋于满管流。此时剪切力增大，有利于筛选粘附力较强的成膜细菌，并最终生成稳定的管壁生物膜。该装置为全自动循环反应体系，制作成本低、养膜周期短、易操作、效率高，尤其对生物膜的原位培养提供了一种新的思路。

本发明不同于上述背景技术介绍中的所有反应器，不需要制作试片，可直接在管道中原位培养生物膜，且所用管道仅为市售普通管道(可使用不同材质)，除截取相应长度外，不需做额外复杂的特殊处理。

本发明不同于通常的半开放系统。一般情况下，两个反应罐之间需要来回两条管路，即两套泵系统，且需要单独配备曝气装置。而本发明通过两个反应罐叠放、隔板打孔插管的方式直接连通，使管道本身充当了输出管路；液体可通过重力自流自上而下，达到泵系统节能。此外，由于整个反应系统中，只有下层圆筒内的一台潜水泵，其输入和输出的流量始终相等，不必考虑两套泵系统流量平衡的问题。其上层圆筒水位，可通过潜水泵输出功率调节，始终处于形成瀑布流的临界值状态；而在下层圆筒中，可通过计算起始加水量，使其水位始终维持在三分之二处；即下层圆筒上方仍有三分之一的空间(含有空气)，当上层水流通过管道流下，形成水柱并灌入下层圆筒时，自然完成了曝气的工序。

本发明巧妙利用了三重溢流的水流过程。液体从下层圆筒，通过潜水泵经过回流管路，进入中央大圆柱。当中央大圆柱水位达到上限之后，液体便会从中央大圆柱从内壁往外壁溢流进入上层圆筒(第一次溢流，即图3过程①)。当上层圆筒水位高过小圆柱高度时，液体便会从小圆柱外壁往内壁溢流(第二次溢流，即图3过程②)。当小圆柱内水位高过内插的管道高度时，液体便会从管道外壁往内壁溢流(第三次溢流，即图3过程③)。多重溢流具有增加水力停留时间，沉淀杂质的作用。

此外，中央大圆柱还兼具缓冲和调节水质的功能，可以直接往中央大圆柱加药(或添加营养物质)，通过回流管路的循环来水，可自然混匀后稳定溢流，无需搅拌装置。中央大圆柱和6个小圆柱的相对位置经过特别设计，当来水流量设置较小时，水流遵循上述三重溢流的过程，管道内壁形成薄层水膜；当来水流量设置较大时，中央大圆柱将形成喷泉状的水柱，辐射半径覆盖6个小圆柱，使得内插管道内趋于满管流。

6个小圆柱为反应器的固定部分，高度严格一致，与中央大圆柱的距离严格一致，使得进入小圆柱的流量和流态始终保持一致，从而避免出现水流只从部分管道流走或各个管道流量不均匀的问题。这样设计的目的是为了降低对反应器的维护要求：因为管道每隔一段时间之后需要更换，在裁切管道时，即使管道的切口和高度不是严格一致的，也不会影响通过每根管道的总流量。

本发明一种原位培养管道生物膜的反应器，使其可以实现常见生物膜反应器的效用，包括但不限于：生物膜形成能力的筛选、抗生物膜化合物试验、生物膜最低抑菌浓度测试(如抗生素)、生物膜胞外分子的检测、生物膜的可视化和定量，且可以不间断地维持生物膜持续生长数周或更长时间。与此同时，该反应器可应用于生物膜生长的各个阶段；可稳定产生大量生物膜；反应器通过巧妙设计简化管路结构，达到泵系统节能、维护方便、造价低廉的目的。

附图说明

图1为本发明反应器的立体图；

图2为本发明反应器的立体分解图；

图3为本发明反应器的主视图；

图4为本发明反应器的俯视图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，对本发明的技术方案作进一步详细说明。

1.主要结构

如图1-图4所示，本发明的反应器包括1个上层圆柱筒1-1、1个下层圆柱筒1-2、1条回流管路1-3、1个顶盖2-1、1个中间隔板2-2、6个隔板孔洞2-3、6个小圆柱2-4、1个中央大圆柱2-5、1台潜水泵2-6、6根管道3-1。

2.各部分的关系和作用

反应器主体为两个上下叠放的圆柱筒(1-1和1-2)。上层圆柱筒1-1有一个截面圆心处打孔的顶盖2-1，打孔处可刚好允许管路1-3进入。连接上下两部分的中间层为经过打孔处理的隔板2-2，该孔洞2-3可以允许水管3-1刚好穿过并被固定住。隔板上分别固定了6个小圆柱2-4，1个中央大圆柱2-5。6个小圆柱2-4的底面圆心分别与隔板的6个孔洞2-3截面圆心重合，中央大圆柱2-5的底面圆心与上层圆筒1-1的底面圆心重合。上层圆筒1-1的高度大于中央大圆柱2-5的高度，大于6个小圆柱2-4的高度。下层圆筒1-2内安装了一台可以调节流量的潜水泵2-6，可以把下层圆筒1-2内的液体通过管路1-3泵回上层圆筒1-1的中央大圆柱2-5中。液体从中央大圆柱2-5溢流出来，进入上层大桶1-1，后又溢流进入6个小圆柱2-4，最后再溢流进入小圆柱内竖放的管道3-1，在管道内壁形成空心的贴壁水流(形如“瀑布流”)，并从孔洞2-3通过重力自流，进入下层圆筒1-2中，如此循环往复。

原位培养管道生物膜的反应器制作步骤和运行方法

1.准备：2个大小一致的大圆筒1-1和1-2(可自定义材质)、1个中央大圆柱2-5、6个小圆柱2-4(只需满足大圆筒的高度大于中央大圆柱的高度，大于6个小圆柱的高度，尺寸可以调整)、3个直径略大于圆筒直径的圆盘(2-1、2-2和下层圆筒底盘)、1台可定时、可控制流量的潜水泵2-6、1根水泵软管1-3。

2.加工：1个圆盘截面圆心处打孔，孔径与水泵软管1-3直径一致，作为顶盖2-1；1个圆盘打6孔(如2-3)，孔径略大于管道3-1外径，作为隔板2-2。

3.固定：①将中央大圆柱2-5、6个小圆柱2-4、上层圆筒1-1依次固定在中间隔板2-2上。其中，上层圆筒1-1、中央大圆柱2-5的底面圆心与中间隔板截面圆心重合；6个小圆柱2-4底面圆心与6孔各自截面圆心重合。②将下层圆筒固定在底盘上。③固定后做防水处理。

4.安装：①裁切好的管道可竖直安装在6个孔洞内，孔洞直径略大于管道直径，但可以卡住管道，并堵住管道与孔洞之间的缝隙。②安装潜水泵和回流管路。

5.运行：管道原位快速挂膜方法。

1)根据表2，配制1L的R2A液体培养基，加入反应装置的下层圆筒。

2)打开自来水龙头，保持流水5分钟后，向下层圆筒加入20L的自来水(即培养基：自来水＝1:20)，此时水位自然没过潜水泵。

3)开启潜水泵并设置循环定时。水流将按图3箭头所示方向，在上下层反应器内循环，即反应溶液先经过潜水泵，输送到上层圆筒的中央大圆柱，水满后溢流(图3过程①)到上层圆筒内；当水位达到6个小圆柱的高度之后，又溢流到小圆柱之内(图3过程②)；最后，水流达到竖插的DN32管道高度，从管道外壁溢流到管道内壁(图3过程③)，形成贴壁瀑布状水膜，经过中间隔板进入下层圆筒，周而复始。

4)潜水泵开启，则持续给管道内壁提供水力冲刷；并且水流通过重力自流从上层圆筒进入下层圆筒，不需要额外的输送装置、管路以及曝气装置，就可以自然对水体完成曝气。

5)潜水泵停止，水力冲刷和曝气停止。交替开关泵，通过合理的时间间隔，一方面让能够延长电机的寿命，另一方面，水力冲刷和曝气停止作为存在的“选择压力”，可以促进生物膜在管子内壁的定殖。

6)该反应本质上也是一个间歇式反应器，前1星期，每隔1天换1次液体培养基；第2个星期，每隔3天换1培养基；两个星期以后，同样每隔3天换一次培养基，但培养基营养逐次减半；1个月后，每隔3天只需要更换自来水，不需要添加任何营养。这一步操作是在逐步驯化管道生物膜，使生物膜适应贫营养的真实自来水环境。

7)换水时，利用虹吸管排空水溶液。

8)该反应器需放置于暗箱中(避光)，或者给有机玻璃外壁包裹锡箔纸；启动后1星期左右，能肉眼可见桶内及管道外壁出现零星松散的生物膜；2星期后，生物膜增多，水体逐渐浑浊；取下管道，可见内壁贴有生物膜；1个月后，生物膜趋于稳定，内壁定殖生物膜的管子就成形了。

9)之后便可以使用这根管子在反应器里面，模拟流水动态场景，研究外加污染物、微生物种群的变化；或者，单独用作微生物的容器；更换新管道，继续产出新的“包含原位生物膜”的管道。

10)反应器支持使用不同材质，不同尺寸、长度的管道(高度低于小圆柱即可)，完全根据实验需求量身定做。

表2 R2A液体培养基配方表

本发明并不局限于实施例中所描述的技术，它的描述是说明性的，并非限制性的。本发明的权限由权利要求所限定，基于本技术领域人员依据本发明所能够变化、重组等方法得到的与本发明相关的技术，都在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种原位培养管道生物膜的反应器，其特征在于，所述反应器主体为两个上下叠放的圆柱筒，上层圆柱筒有一个截面圆心处打孔的顶盖，打孔处刚好允许回流管路进入；连接上下圆柱筒的中间层为经过打孔处理的隔板，隔板上的孔洞允许管道刚好穿过并被固定住；隔板上分别固定有六个小圆柱和1个中央大圆柱；6个小圆柱的底面圆心分别与隔板的6个孔洞截面圆心重合，中央大圆柱的底面圆心与上层圆筒的底面圆心重合；上层圆筒的高度高于中央大圆柱的高度，中央大圆柱的高度高于6个小圆柱的高度，小圆柱的高度高于设置于小圆柱内管道的高度；下层圆筒内安装有一台调节流量的潜水泵，把下层圆筒内的液体通过回流管路泵回上层圆筒的中央大圆柱中。

2.根据权利要求1所述原位培养管道生物膜的反应器，其特征在于，所述6个小圆柱高度一致，与中央大圆柱的距离一致。

3.根据权利要求1所述原位培养管道生物膜的反应器，其特征在于，所述管道为DN32管道。

4.一种原位培养管道生物膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用权利要求1所述原位培养管道生物膜的反应器，将培养基加入反应装置的下层圆筒，加入自来水，水位没过潜水泵；

(2)开启潜水泵，反应溶液先经过潜水泵，输送到上层圆筒的中央大圆柱，水满后液体从中央大圆柱溢流出来，进入上层圆筒，后又溢流进入6个小圆柱，最后再溢流进入小圆柱内竖放的管道，在管道内壁形成空心的贴壁水流，并从孔洞通过重力自流，进入下层圆筒中，如此循环往复；

(3)定期更换自来水和培养基；

(4)管道内壁逐渐产生生物膜并趋于稳定，最终内壁定殖生物膜的管子成形；

(5)应用这根管子在反应器里面，模拟流水动态场景，研究外加污染物、微生物种群的变化；或者，单独用作微生物的容器；更换新管道，继续产出新的“包含原位生物膜”的管道。

5.根据权利要求4所述的原位培养管道生物膜的方法，其特征在于，所述步骤(2)设定时间间隔交替开关潜水泵。

6.根据权利要求4所述的原位培养管道生物膜的方法，其特征在于，所述步骤(3)定期更换自来水和培养基具体操作方法为：前1星期，每隔1天换1次液体培养基；第2个星期，每隔3天换1培养基；两个星期以后，同样每隔3天换一次培养基，但培养基营养逐次减半；1个月后，每隔3天只需要更换自来水，不需要添加任何营养。

7.根据权利要求4所述的原位培养管道生物膜的方法，其特征在于，所述步骤(3)换水时，利用虹吸管排空水溶液。

8.根据权利要求4所述的原位培养管道生物膜的方法，其特征在于，该反应器放置于暗箱中避光，或者外壁包裹锡箔纸。

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