CN112961920A - 一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法及产品 - Google Patents

一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法及产品 Download PDF

Info

Publication number
CN112961920A
CN112961920A CN202110312744.7A CN202110312744A CN112961920A CN 112961920 A CN112961920 A CN 112961920A CN 202110312744 A CN202110312744 A CN 202110312744A CN 112961920 A CN112961920 A CN 112961920A
Authority
CN
China
Prior art keywords
immune checkpoint
dna
checkpoint inhibitor
hepatobiliary
predicting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110312744.7A
Other languages
English (en)
Inventor
张恒辉
赵海涛
胡莹
杨旭
杨可言
龙俊宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhenhe Beijing Biotechnology Co ltd
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Original Assignee
Zhenhe Beijing Biotechnology Co ltd
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhenhe Beijing Biotechnology Co ltd, Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences filed Critical Zhenhe Beijing Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110312744.7A priority Critical patent/CN112961920A/zh
Publication of CN112961920A publication Critical patent/CN112961920A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法及产品，所述方法具体步骤如下：S1，采集肝胆肿瘤患者外周血样本，分别提取血浆游离DNA及血细胞DNA；S2，采用血浆游离DNA和血细胞DNA构建基因文库；S3，利用靶向序列捕获探针与目标区域特异性杂交，从基因文库中捕获并富集靶向目标基因；靶向基因包括CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF，S4，分别获得血浆游离DNA和血细胞DNA靶向测序数据；S5，结合靶向测序数据，分析血浆游离DNA靶向测序数据中靶向基因的拷贝数变异；S6，预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂治疗联合靶向治疗疗效。

Description

一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效 的方法及产品
技术领域
本发明属于生物医药类，具体的，提供一种基于外周血游离DNA的基因拷贝数变异预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂(PD-1/PD-L1抑制剂)联合靶向治疗疗效的检测方法。
背景技术
肝胆肿瘤是一系列恶性肿瘤的统称，包括：肝癌(肝细胞癌，HCC)、胆道癌(包括肝内和肝外胆管癌，CCA)和胆囊癌(GBC)等。2018年，全球每年约有84万新发病例和78万例死亡。是全球第六大最长被诊断的癌症和第四大癌症死因。
今年来，随着免疫治疗的发展，免疫检查点抑制剂(ICI)和靶向治疗等单一药物治疗已显示出对晚期肝胆癌症的显著疗效。并且，有临床试验结果显示免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗法在晚期肝癌患者中取得了较好的疗效。IMbrave150是一项全球性III期、多中心、开放性研究，旨在评估既往未接受过系统治疗的不能切除的肝细胞癌(HCC)患者，与标准疗法索拉菲尼(Sorafenib)单药治疗相比，免疫治疗联合靶向治疗-阿特珠单抗联合贝伐珠单抗(Atezolizumab+Bevacizumab)显著改善了患者的总生存期(OS)(中位总生存期：NE vs 13.2月)和无进展生存期(PFS)(中位无进展生存期：6.8vs 4.3月)，展现出显著的临床获益。近期，有Ib期研究发现仑伐替尼联合免疫检查点抑制剂(Lenvatinib+ICI)对与不可切除的肝细胞癌(HCC)患者具有较好的客观缓解率(ORR)和无进展生存期(PFS)。在晚期胆道癌(BTC)中，也有类似研究显示，仑伐替尼联合免疫检查点抑制剂(Lenvatinib+ICI)同样安全有效。
在免疫治疗取得发展的同时，既往研究也显示只有一部分患者能从免疫检查点抑制剂中获益，而目前尚无确切的生物标志物可预测肝胆肿瘤对免疫检查点抑制剂联合靶向治疗的疗效。因此亟需有效的生物标志物以预测免疫治疗的疗效，筛选获益人群。
发明内容
1.发明目的
本发明的目的之一提供一种基于外周血游离DNA基因CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF的拷贝数变异，计算得到的用于预测肝胆肿瘤联合免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的生物标志物即CNV风险评分，从而准确预测预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效；
本发明的目的之二是提供一种用于预测肝胆肿瘤免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效，包括PD-1抑制剂联合仑伐替尼联合治疗，以及PD-1/PD-L1抑制剂联合靶向治疗药物的治疗方案。
2.技术方案
基于上述技术问题，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法，基于肝胆肿瘤患者外周血cfDNA中CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF拷贝数变异计算得到的CNV风险评分，利用CNV风险评分预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效。
作为本发明更进一步的改进，具体步骤如下：
S1，采集肝胆肿瘤患者外周血样本，分别提取血浆游离DNA及血细胞DNA；
S2，分别采用血浆游离DNA和血细胞DNA构建基因文库；
S3，利用靶向序列捕获探针与目标区域特异性杂交，从基因文库中捕获并富集靶向目标基因；
S4，分别获得血浆游离DNA和血细胞DNA靶向测序数据；
S5，结合血细胞DNA靶向测序数据，分析血浆游离DNA靶向测序数据中靶向基因的拷贝数变异；
S6，根据上述基因的拷贝数变异预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效。
作为本发明更进一步的改进，步骤S6中获得的拷贝数变异后，进行以下步骤：
A)根据以下公式计算得到CNV风险评分：
CNV＝(-1.4267831)*CALR+0.5515164*STAT3+1.5124620*IDH2+1.5372432*ETV6+4.1835445*IGF1R+(-1.3164812)*NR4A3+1.1780366*NF2+1.5359307*CTCF；其中，CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF分别代表相应基因的拷贝数变异值。
B)根据CNV风险评分值预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效。
作为本发明更进一步的改进，所述治疗疗效包括肝胆肿瘤免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效。
作为本发明更进一步的改进，所述免疫检查点为PD-1/PD-L1。
作为本发明更进一步的改进，步骤B)利用时间依赖的受试者工作曲线对肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂治疗疗效进行评价，选取最优界值点为A，≥A的肿瘤患者为高风险患者，<A的肿瘤患者为低风险患者。
其中，在肝胆肿瘤患者中，得出的CNV风险评分根据预设值分为低的肿瘤患者，更有可能从免疫检查点抑制剂联合靶向治疗中获益。
作为本发明更进一步的改进，所述最优界值点为15.68。≥15.68的肿瘤患者为高风险患者，<15.68的肿瘤患者为低风险患者。
作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法的标志物，所述标志物为CNV风险评分，
CNV＝(-1.4267831)*CALR+0.5515164*STAT3+1.5124620*IDH2+1.5372432*ETV6+4.1835445*IGF1R+(-1.3164812)*NR4A3+1.1780366*NF2+1.5359307*CTCF；其中，CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF分别代表相应基因的拷贝数变异值。
作为本发明更进一步的改进，所述方法具体包括以下步骤：
(1)采集肝胆肿瘤患者外周血样本，提取血浆游离DNA(cfDNA)、血细胞DNA；
(2)采用cfDNA和血细胞DNA构建基因文库；
(3)利用捕获探针与目标区域特异性杂交，从基因文库中捕获并富集目标基因；
(4)利用高通量测序仪测序，获得cfDNA和血细胞DNA靶向测序数据；
(5)结合血细胞DNA靶向测序数据，分析cfDNA靶向测序数据中8个基因的拷贝数(包括：CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF)；
(6)根据公式计算得到拷贝数变异风险评分；
CNV＝(-1.4267831)*CALR+0.5515164*STAT3+1.5124620*IDH2+1.5372432*ETV6+4.1835445*IGF1R+(-1.3164812)*NR4A3+1.1780366*NF2+1.5359307*CTCF；
(7)将患者的拷贝数变异风险评分根据预设值划分为高、低两组，预测晚期肝胆肿瘤患者PD-1单抗联合仑伐替尼联合治疗和以免疫检查点抑制剂(PD-1/PD-L1抑制剂)为基础的联合其它靶向治疗的疗效。对所构建的模型的预测能力进行评价。
作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种基于所述的预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法的产品，所述产品包括血浆游离DNA提取试剂或试剂盒、血细胞DNA提取试剂或试剂盒、DNA含量测定试剂盒、DNA文库构建试剂盒及探针捕获杂交试剂盒。
作为本发明更进一步的改进，所述产品包括试剂盒及基因芯片。
作为本发明更进一步的改进，所述血浆游离DNA试剂盒包括MagMAXTM Cell-FreeDNA Isolation Kit、血液基因组提取试剂盒、Qubit DNA HS试剂盒、KAPA Hyper Prep Kit及NimbleGen SeqCap EZ Library SR试剂盒。
作为本发明更进一步的改进，步骤(4)中采用双端或单端模式进行测序。
本发明提供的技术方案可应用于患有肝胆肿瘤的患者。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明的一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法，基于以cfDNA中的特定基因的CNV风险评分作为生物标志物预测抗靶向治疗联合免疫检查点抑制剂联合靶向治疗效果所具有的优点包括无创检测、测序费用低、节省探针，更适用于临床试剂盒开发，具有广阔的应用前景。
(2)本发明的一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法，对cfDNA中的CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF此8种基因的拷贝数变异组合与预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效之间进行的关联分析，可以为肝胆肿瘤患者的癌症患者的免疫治疗联合靶向治疗疗效及预后评价提供有效的标志物，该方法简单、快速，便于推广应用。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明的整体实验流程图；
图2为根据本发明实施例使用43例接受PD-1抑制剂联合仑伐替尼治疗的肝胆肿瘤患者建立CNV风险评分预测模型；图A为30例训练集肝胆肿瘤患者，使用时间依赖的受试者工作曲线(Time-dependentROC)计算曲线下面积(AUC)；图B为13例验证集肝胆肿瘤患者，使用时间依赖的受试者工作曲线(Time-dependentROC)计算曲线下面积(AUC)。
图3为根据本发明实施例的43例接受PD-1抑制剂联合仑伐替尼联合治疗的肝胆肿瘤患者的生存曲线示意图。图A为接受PD-1抑制剂联合仑伐替尼联合治疗肝胆肿瘤患者，根据CNV风险评分高、低分组的无进展生存率(PFS、Progression-free survival)KM生存分析曲线的示意图；B为接受PD-1抑制剂联合仑伐替尼联合治疗的肝胆肿瘤患者，根据CNV风险评分高、低分组的总生存率(OS、Overall survival)KM生存分析曲线的示意图；
图4为根据本发明实施例的43例接受PD-1抑制剂联合仑伐替尼联合治疗的肝胆肿瘤患者的CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF此8个基因，与其组成的CNV风险评分，使用时间依赖的受试者工作曲线(Time-dependentROC)计算曲线下面积(AUC)，评估9个指标在预测总生存期中的预测能力；
图5为根据本发明实施例的108例接受PD-1/PD-L1抑制剂联合靶向治疗的肝胆肿瘤患者的生存曲线示意图。图A为接受PD-1/PD-L1抑制剂联合靶向治疗的肝胆肿瘤患者，根据CNV风险评分高、低分组的无进展生存率(PFS、Progression-free survival)KM生存分析曲线的示意图；图B为接受PD-1/PD-L1抑制剂联合靶向治疗的肝胆肿瘤患者，根据CNV风险评分高、低分组的总生存率(OS、Overall survival)KM生存分析曲线的示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步描述，使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
任何方法或过程权利要求中所述的任何步骤可以以任何顺序执行，并且不限于权利要求中提出的顺序。
以下是对本文中涉及的术语解释：
如本文所用，术语“游离DNA”、“cfDNA”含义相同，互换使用，都是指血浆游离DNA。
如本文所用，DNA片段的拷贝数变异(CNV)是一种常见的基因组结构性变异形式，在人群中普遍存在。某些特定基因的CNV被认为可作为肿瘤进展和预后的临床指标，并具有指导肿瘤患者用药的潜力。目前，检测CNV的常用方式主要包括两大类实验方法：低通量分子生物学实验技术，包括：染色体显带、荧光原位杂交技术(FISH)、微滴式数字PCR(ddPCR)等；和高通量二代基因测序技术(NGS)，该技术可以在全基因组范围或者目标基因区间探测DNA片段的CNV。
如本文所用，“CALR”是19号染色体的基因，HGNC编号1455，“NR4A3”是9号染色体的基因，HGNC编号7982、“IDH2”是15号染色体的基因，HGNC编号5383、“IGF1R”15号染色体的基因，HGNC编号5465、“ETV6”是12号染色体的基因，HGNC编号3495、“STAT3”17号染色体的基因，HGNC编号11364、“NF2”是22号染色体的基因HGNC编号7773，“CTCF”是16号染色体的基因，HGNC编号13723。
如本文所用，Qubit DNA HS试剂盒(赛默飞世尔，Q33230)，是一种市售的，基于荧光检测的高灵敏度检测DNA浓度的方法。
如本文所用，LabChip GX Touch HT(珀金埃尔默，CLS138162、CLS760672)，是一种市售的，基于毛细管电泳技术检测样本中DNA片段长度的方法。
如本文所用，术语“靶向治疗”是指在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点设计药物的治疗方式；
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂治疗”是指通过抑制免疫检查点功能，恢复集体抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的治疗方式；
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂联合靶向治疗”是指免疫检查点抑制剂治疗与靶向治疗联合的治疗方案；
如本文所用，术语“单端模式测序”是指仅对文库DNA分子一条单链进行测序；术语“双端模式测序”是指对同一文库DNA分子互补的两条单链分别进行测序。
如本文所用，术语“时间依赖受试者特征工作曲线”、“Time-dependent ROC”含义相同，互换使用，都是指在一个二分类模型中，用于评价或比较诊断性实验的效果；
术语“曲线下面积”、“AUC”含义相同，互换使用，都是指时间依赖受试者特征工作曲线的曲线下面积，AUC的取值范围在0.0-1.0之间，AUC越接近1.0，检测方法真实性越高。
如本文所用，“总生存率KM生存分析曲线”是指使用Kaplan-Meier法绘制生存概率与时间的关系图，并使用log-rank检验比较两组的总生存率是否具有显著差异。
实施例1
本实施例基于43例肝胆肿瘤接受PD-1抑制剂联合仑伐替尼治疗的患者建立CNV风险评分预测治疗疗效，流程图如图1所示。
一、实验步骤如下：
1、采集43例肝胆肿瘤患者的用药前基线全血样本，采用两步离心法分离的到血细胞样本和血浆样本。
2、游离DNA(cfDNA)及血细胞DNA提取：
使用43例肝胆肿瘤患者血浆用本，采用MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit(赛默飞世尔，A29319)对血浆中的cfDNA进行提取。采用血液基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP348)对血细胞中的DNA进行提取。使用Qubit DNA HS试剂盒(赛默飞世尔，Q33230)对cfDNA及血细胞DNA的含量进行测定，使用LabChip GX Touch HT(铂金埃尔莫，CLS138162、CLS760672)检测对cfDNA及血细胞DNA进行质控。cfDNA提取总量应>＝5ng，血细胞DNA应>＝50g。
3、文库制备：
使用非接触式超声破碎仪(Covaris，M220)对提取得到的血细胞DNA进行片段化，利用超声打断原理，将血细胞DNA打断为150-200bp的片段。
使用KAPA Hyper Prep Kit(罗氏，KK8504)进行文库构建：包括末端修复、接头连接、文库富集步骤。所构建文库使用Agencourt AMpure XP磁珠(贝克曼库尔特，A63882)纯化后，使用Qubit DNA HS试剂盒(赛默飞世尔，Q33230)以及LabChip GX Touch HT(珀金埃尔默，CLS138162、CLS760672)进行浓度检测和质控。文库总量应>＝500ng。
4、探针捕获杂交：
使用NimbleGen SeqCap EZ Library SR试剂盒(罗氏，06776345001)进行文库捕获。后续用Agencourt AMPure XP磁珠纯化(贝克曼库尔特，A63882)，使用Qubit DNA HS试剂盒(赛默飞世尔，Q33230)以及LabChip GX Touch HT(珀金埃尔默，CLS138162、CLS760672)进行浓度测定。
5、高通量测序：使用Novaseq 6000(因美纳)测序仪，以双端模式进行测序。
二、测序数据分析：
1.对测序得到的cfDNA和血细胞DNA的Panel测序数据，根据标准分析流程，可采用BWA软件(版本号：v0.7.17)按照人类基因组(hg19)进行序列比对，采用Picard toolkit(版本号：v2.1.0)和GATK分析工具(版本号：v 3.7)对BAM文件进行去重和组装。使用血细胞DNA测序样本作为阴性对照，使用cnvkit软件(版本号：v0.9.2)从匹配的患者cfDNA样本中计算得到拷贝数信息。
2.将43例患者的拷贝数结果随机按照7：3拆分为30人的训练集和13人的验证集。使用LASSO-COX回归的方法经过十次交叉验证，筛选出与患者总生存期相关的8个基因，分别为CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF，并使用其回归系数作为每个基因拷贝数计算权重，得到CNV风险评分的计算公式如下：
CNV风险评分
＝(-1.4267831)*CALR+0.5515164*STAT3+1.5124620*IDH2+1.5372432*ETV6+4.1835445*IGF1R+(-1.3164812)*NR4A3+1.1780366*NF2+1.5359307*CTCF，其中，CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF分别代表相应基因的拷贝数变异值。
3.根据上述公式计算训练集中30例患者的CNV风险评分的值，并利用时间依赖的受试者工作曲线(Time-dependent ROC)对模型预测能力进行评价。
三、结果部分：
共检测了43例肝胆肿瘤患者的用药前基线样本进行分析。根据公式计算训练集和验证集中患者的CNV风险评分的值。时间依赖受试者特征工作曲线结果显示CNV风险评分在训练集和验证集中评价效果较为一致，对PD-1抑制剂联合仑伐替尼治疗的疗效均有较高预测能力(如图2所示)。
利用时间依赖的受试者工作曲线(Time-dependentROC)选取最优界值点为15.68，将患者划分为高风险(>＝15.68)和低风险(<15.68)。
模型预测的低风险患者相较于高风险患者更可能从PD-1抑制剂联合仑伐替尼治疗中获益。如图3所示，CNV风险评分为低风险的患者在KM生存曲线分析中，无论是中位无进展生存期还是中位总生存期均显著高于高风险的患者。
实施例2
基于43例肝胆肿瘤接受PD-1抑制剂联合仑伐替尼治疗的患者比较CNV风险评分与单基因预测治疗疗效的能力
一、实验步骤如下：
1、采集43例肝胆肿瘤患者的用药前基线全血样本，采用两步离心法分离的到血细胞样本和血浆样本。
2、游离DNA(cfDNA)及血细胞DNA提取：
使用43例肝胆肿瘤患者血浆用本，采用MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit(赛默飞世尔，A29319)对血浆中的cfDNA进行提取。采用血液基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP348)对血细胞中的DNA进行提取。使用Qubit DNA HS试剂盒(赛默飞世尔，Q33230)对cfDNA及血细胞DNA的含量进行测定，使用LabChip GX Touch HT(铂金埃尔莫，CLS138162、CLS760672)检测对cfDNA及血细胞DNA进行质控。cfDNA提取总量应>＝5ng，血细胞DNA应>＝50g。
3、文库制备：
使用非接触式超声破碎仪(Covaris，M220)对提取得到的血细胞DNA进行片段化，利用超声打断原理，将血细胞DNA打断为150-200bp的片段。
使用KAPA Hyper Prep Kit(罗氏，KK8504)进行文库构建：包括末端修复、接头连接、文库富集步骤。所构建文库使用Agencourt AMpure XP磁珠(贝克曼库尔特，A63882)纯化后，使用Qubit DNA HS试剂盒(赛默飞世尔，Q33230)以及LabChip GX Touch HT(珀金埃尔默，CLS138162、CLS760672)进行浓度检测和质控。文库总量应>＝500ng。
4、探针捕获杂交：
使用NimbleGen SeqCap EZ Library SR试剂盒(罗氏，06776345001)进行文库捕获。后续用Agencourt AMPure XP磁珠纯化(贝克曼库尔特，A63882)，使用Qubit DNA HS试剂盒(赛默飞世尔，Q33230)以及LabChip GX Touch HT(珀金埃尔默，CLS138162、CLS760672)进行浓度测定。
5、高通量测序：使用Novaseq 6000(因美纳)测序仪，以双端模式进行测序。
二、测序数据分析：
1.对测序得到的cfDNA和血细胞DNA的Panel测序数据，根据标准分析流程，可采用BWA软件(版本号：v0.7.17)按照人类基因组(hg19)进行序列比对，采用Picard toolkit(版本号：v2.1.0)和GATK分析工具(版本号：v 3.7)对BAM文件进行去重和组装。使用血细胞DNA测序样本作为阴性对照，使用cnvkit软件(版本号：v0.9.2)从匹配的患者cfDNA样本中计算得到8个基因的拷贝数信息。
2.按照公式计算得到CNV风险评分，计算公式如下：
CNV风险评分
＝(-1.4267831)*CALR+0.5515164*STAT3+1.5124620*IDH2+1.5372432*ETV6+4.1835445*IGF1R+(-1.3164812)*NR4A3+1.1780366*NF2+1.5359307*CTCF，其中，CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF分别代表相应基因的拷贝数变异值。
3.根据上述公式计算43例患者的CNV风险评分的值，并利用时间依赖的受试者工作曲线(Time-dependent ROC)对CNV风险评分及CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF单基因拷贝数预测总生存期能力进行评价。
三、结果部分：
对检测了的43例肝胆肿瘤患者的用药前基线样本结果进行分析。根据公式分别计算患者CNV风险评分的值。
如图4所示，与CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF中任意单个基因的拷贝数预测PD-1抑制剂联合仑伐替尼治疗的肝胆肿瘤患者的总生存期相比，CNV风险评分的时间依赖的受试者工作曲线曲线下面积(AUC)更高(AUC＝0.8550896)。显示CNV风险评分预测PD-1抑制剂联合仑伐替尼治疗的肝胆肿瘤患者的总生存期能力优于单个基因拷贝数的预测能力。
实施例3
采用基于外周血游离DNA检测的CNV风险评分预测108例肝胆肿瘤患者接受免疫检查点抑制剂(PD-1/PD-L1抑制剂)联合靶向治疗的疗效
一、实验：
1.采集108例接受免疫检查点抑制剂(PD-1/PD-L1抑制剂)联合靶向治疗的用药前基线全血样本，采用两步离心法分离的到血细胞样本和血浆样本。
2、游离DNA(cfDNA)及血细胞DNA提取：
使用108例肝胆肿瘤患者血浆用本，采用MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit(赛默飞世尔，A29319)对血浆中的cfDNA进行提取。采用血液基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP348)对血细胞中的DNA进行提取。使用Qubit DNA HS试剂盒(赛默飞世尔，Q33230)对cfDNA及血细胞DNA的含量进行测定，使用LabChip GX Touch HT(铂金埃尔莫，CLS138162、CLS760672)检测对cfDNA及血细胞DNA进行质控。cfDNA提取总量应>＝5ng，血细胞DNA应>＝50g。
3、文库制备：
使用非接触式超声破碎仪(Covaris，M220)对提取得到的血细胞DNA进行片段化，利用超声打断原理，将血细胞DNA打断为150-200bp的片段。
使用KAPA Hyper Prep Kit(罗氏，KK8504)进行文库构建：包括末端修复、接头连接、文库富集步骤。所构建文库使用Agencourt AMpure XP磁珠(贝克曼库尔特，A63882)纯化后，使用Qubit DNA HS试剂盒(赛默飞世尔，Q33230)以及LabChip GX Touch HT(珀金埃尔默，CLS138162、CLS760672)进行浓度检测和质控。文库总量应>＝500ng。
4、探针捕获杂交：
使用NimbleGen SeqCap EZ Library SR试剂盒(罗氏，06776345001)进行文库捕获。后续用Agencourt AMPure XP磁珠纯化(贝克曼库尔特，A63882)，使用Qubit DNA HS试剂盒(赛默飞世尔，Q33230)以及LabChip GX Touch HT(珀金埃尔默，CLS138162、CLS760672)进行浓度测定。
5、高通量测序：使用Novaseq 6000(因美纳)测序仪，以双端模式进行测序。
二、测序数据分析：
1.对测序得到的cfDNA和血细胞DNA的Panel测序数据，根据标准分析流程，可采用BWA软件(版本号：v0.7.17；PMID：19451168)按照人类基因组(hg19，NCBI Build 37.5)进行序列比对，采用Picard toolkit(版本号：v2.1.0)和GATK分析工具(版本号：v 3.7)对BAM文件进行去重和组装。使用血细胞DNA测序样本作为阴性对照，使用cnvkit软件(版本号：v0.9.2；PMID：27100738)从匹配的患者cfDNA样本中计算得到8个基因的拷贝数信息。
2.根据下列公式分别计算108例患者的CNV风险评分的值，具体公式如下：
CNV风险评分
＝(-1.4267831)*CALR+0.5515164*STAT3+1.5124620*IDH2+1.5372432*ETV6+4.1835445*IGF1R+(-1.3164812)*NR4A3+1.1780366*NF2+1.5359307*CTCF，其中，CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF分别代表相应基因的拷贝数变异值。
三、结果部分：
共检测了108例肝胆肿瘤患者的用药前基线样本进行分析。根据公式分别计算患者CNV风险评分的值。
利用实施例1中依据时间依赖的受试者特征工作曲线(Time-dependentROC)选取最优界值点为15.68，将108例患者划分为高风险(>＝15.68)和低风险(<15.68)。
模型预测的低风险患者相较于高风险患者更可能从免疫检查点抑制剂联合靶向治疗中获益。如图5所示，CNV风险评分为低风险的患者在KM生存曲线分析中，无论是中位无进展生存期还是中位总生存期均显著高于高风险的患者。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种基于外周血游离DNA基因拷贝数变异预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法，其特征在于，基于肝胆肿瘤患者外周血游离DNA中基因CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF拷贝数变异计算得到的拷贝数变异风险评分，利用拷贝数变异风险评分预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效。
2.根据权利要求1所述的预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1，采集肝胆肿瘤患者外周血样本，分别提取血浆游离DNA及血细胞DNA；
S2，分别采用血浆游离DNA和血细胞DNA构建基因文库；
S3，利用靶向序列捕获探针与目标区域特异性杂交，从基因文库中捕获并富集靶向目标基因；
S4，分别获得血浆游离DNA和血细胞DNA靶向测序数据；
S5，结合血细胞DNA靶向测序数据，分析血浆游离DNA靶向测序数据中靶向基因的拷贝数变异；
S6，根据上述基因的拷贝数变异预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效。
3.根据权利要求2所述的预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法，其特征在于，步骤S6中获得的拷贝数变异后，进行以下步骤：
A)根据以下公式计算得到CNV风险评分：
CNV＝(-1.4267831)*CALR+0.5515164*STAT3+1.5124620*IDH2+1.5372432*ETV6+4.1835445*IGF1R+(-1.3164812)*NR4A3+1.1780366*NF2+1.5359307*CTCF；其中，CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF分别代表相应基因的拷贝数变异值。
B)根据CNV风险评分值预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效。
4.根据权利要求2或3所述的预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法，其特征在于，步骤S4中，采用双端或单端模式测序获得血浆游离DNA和血细胞DNA靶向测序数据。
5.根据权利要求3所述的预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂为PD-1/PD-L1抑制剂，包括PD-1抑制剂联合仑伐替尼联合治疗，以及PD-1/PD-L1抑制剂联合其他靶向治疗药物的治疗方案。
6.根据权利要求3所述的预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法，其特征在于，步骤B)利用时间依赖的受试者工作曲线对肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂治疗疗效进行评价，选取最优界值点为A，≥A的肿瘤患者为高风险患者，<A的肿瘤患者为低风险患者。
7.一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法的标志物，其特征在于，所述标志物为CNV风险评分，
CNV＝(-1.4267831)*CALR+0.5515164*STAT3+1.5124620*IDH2+1.5372432*ETV6+4.1835445*IGF1R+(-1.3164812)*NR4A3+1.1780366*NF2+1.5359307*CTCF；其中，CALR、NR4A3、IDH2、IGF1R、ETV6、STAT3、NF2和CTCF分别代表相应基因的拷贝数变异值。
8.一种基于权利要求1所述的预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法的产品，其特征在于：所述产品包括血浆游离DNA提取试剂或试剂盒、血细胞DNA提取试剂或试剂盒、DNA含量测定试剂盒、DNA文库构建试剂盒及探针捕获杂交试剂盒。
9.根据权利要求8所述的预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的产品，其特征在于：所述产品包括试剂盒及目标基因捕获测序。
10.根据权利要求9所述的预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的产品，其特征在于：所述血浆游离DNA试剂盒包括MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit、血液基因组提取试剂盒、Qubit DNA HS试剂盒、KAPA Hyper Prep Kit及NimbleGen SeqCapEZ Library SR试剂盒。
CN202110312744.7A 2021-03-24 2021-03-24 一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法及产品 Pending CN112961920A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110312744.7A CN112961920A (zh) 2021-03-24 2021-03-24 一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法及产品

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110312744.7A CN112961920A (zh) 2021-03-24 2021-03-24 一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法及产品

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112961920A true CN112961920A (zh) 2021-06-15

Family

ID=76278890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110312744.7A Pending CN112961920A (zh) 2021-03-24 2021-03-24 一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法及产品

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112961920A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113981078A (zh) * 2021-09-16 2022-01-28 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) 用于预测晚期食管癌患者抗egfr靶向治疗疗效的生物标志物及疗效预测试剂盒
CN114974420A (zh) * 2021-10-29 2022-08-30 无锡臻和生物科技有限公司 预测胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的标志物及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105506079A (zh) * 2015-12-21 2016-04-20 中山大学附属第一医院 防治IgA肾病的干预靶点及其检测方法
CN109609647A (zh) * 2019-01-25 2019-04-12 臻悦生物科技江苏有限公司 基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测Panel、检测试剂盒及其应用
US20200109204A1 (en) * 2017-06-01 2020-04-09 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor using an anti-pd-1 antibody

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105506079A (zh) * 2015-12-21 2016-04-20 中山大学附属第一医院 防治IgA肾病的干预靶点及其检测方法
US20200109204A1 (en) * 2017-06-01 2020-04-09 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor using an anti-pd-1 antibody
CN109609647A (zh) * 2019-01-25 2019-04-12 臻悦生物科技江苏有限公司 基于二代测序的用于泛癌种靶向、化疗及免疫用药的检测Panel、检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L. BASSAGANYAS等: "Copy-Number Alteration Burden Differentially Impacts Immune Profiles and Molecular Features of Hepatocellular Carcinoma", 《CLIN CANCER RES》 *
X. YANG等: "Cell-free DNA copy number variations predict efficacy of immune checkpoint inhibitor-based cancers", 《JOURNAL FOR IMMUNOTHERAPY OF CANCER》 *
杨洋等: "肝细胞癌免疫治疗疗效预测与评价", 《中国普外基础与临床杂志》 *
王锋等: "仑伐替尼联合免疫检查点抑制剂治疗恶性肿瘤协同效应的机制研究进展", 《临床肿瘤学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113981078A (zh) * 2021-09-16 2022-01-28 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) 用于预测晚期食管癌患者抗egfr靶向治疗疗效的生物标志物及疗效预测试剂盒
CN113981078B (zh) * 2021-09-16 2023-11-24 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) 用于预测晚期食管癌患者抗egfr靶向治疗疗效的生物标志物及疗效预测试剂盒
CN114974420A (zh) * 2021-10-29 2022-08-30 无锡臻和生物科技有限公司 预测胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的标志物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Clinical significance and inflammatory landscapes of a novel recurrence-associated immune signature in early-stage lung adenocarcinoma
AU2015249113B2 (en) Lung cancer biomarkers and uses thereof
Sivendran et al. Dissection of immune gene networks in primary melanoma tumors critical for antitumor surveillance of patients with stage II–III resectable disease
Liu et al. Blood-based liquid biopsy: Insights into early detection and clinical management of lung cancer
CN109478231A (zh) 帮助区别良性和恶性放射线照相明显肺结节的方法和组合物
CN112614546B (zh) 一种用于预测肝细胞癌免疫治疗疗效的模型及其构建方法
US20220328129A1 (en) Multi-omic assessment
KR20140082840A (ko) 폐암 바이오마커 및 그것의 용도
Pass et al. Biomarkers and molecular testing for early detection, diagnosis, and therapeutic prediction of lung cancer
CN115410713A (zh) 一种基于免疫相关基因的肝细胞癌预后风险预测模型构建
CN112961920A (zh) 一种预测肝胆肿瘤患者免疫检查点抑制剂联合靶向治疗疗效的方法及产品
Lin et al. Evolutionary route of nasopharyngeal carcinoma metastasis and its clinical significance
CN115478092A (zh) 用于预测乳腺癌免疫治疗效果的模型
Yin et al. Immune-related lncRNA signature for predicting the immune landscape of head and neck squamous cell carcinoma
Wang et al. Current and emerging applications of liquid biopsy in pan-cancer
Yang et al. Multi-dimensional characterization of immunological profiles in small cell lung cancer uncovers clinically relevant immune subtypes with distinct prognoses and therapeutic vulnerabilities
CN112908406A (zh) Pink1作为诊断标志物在构建肺鳞癌预后预测模型中的应用
US20230223111A1 (en) Multi-omic assessment
Shen et al. Predicting response and toxicity to immune checkpoint inhibitors in lung cancer using antibodies to frameshift neoantigens
Li et al. Comprehensive analysis of candidate diagnostic and prognostic biomarkers associated with lung adenocarcinoma
GB2607436A (en) Multi-omic assessment
CN117396983A (zh) 多组学评估
WO2021129976A1 (en) Method for diagnosing cutaneous t-cell lymphoma diseases
Zhou et al. Characterization of immunogenic cell death regulators predicts survival and immunotherapy response in lung adenocarcinoma
Rocha Martins et al. Linking tumor immune infiltrate and systemic immune mediators to treatment response and prognosis in advanced cervical cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination