CN112899229A - 用于增加癌细胞药物敏感性的生物材料及其应用和细胞培养器皿 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于增加癌细胞药物敏感性的生物材料，包括第一胶体颗粒、第二胶体颗粒和界面活性剂，所述生物材料为一微纳米颗粒结构涂层，所述第一胶体颗粒与所述第二胶体颗粒的粒径尺寸比值大于2，所述第一胶体颗粒均匀有序分布在所述微纳米颗粒结构涂层中，围绕每个所述第一胶体颗粒周围均匀分布有多个所述第二胶体颗粒。该生物材料可以有效提升癌细胞对癌症药物的敏感性，从而有利于在低用量药物的作用下，实现对癌细胞的高效杀伤，减轻药物对正常细胞的损伤及其带来的副作用。本发明还提供了一种细胞培养器皿及其应用。

Description

用于增加癌细胞药物敏感性的生物材料及其应用和细胞培养 器皿
技术领域
本发明涉及生物医学材料领域，具体涉及一种用于增加癌细胞药物敏感性的生物材料及其应用和细胞培养器皿。
背景技术
癌症是目前医学上的一个难题，也是严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。现阶段对于癌症的治疗仍然存在各种弊端，比如手术摘除肿瘤病灶存在着清除肿瘤不彻底、易转移及易复发的缺点，因此会使用化学药物来辅助治疗，然而随着治疗时间的推移，癌细胞对化学药物会产生一定的耐药性使得疗效大打折扣。此外，传统的放疗(放射治疗)和化疗方法均存在杀伤癌细胞的同时对正常细胞也会有所损害的问题，这也导致患者会出现不同程度的副作用，如恶心、呕吐、脱发等，并没有获得有效治疗。
因此，提升癌细胞对药物的敏感性与了解其内部机制，并在提高药物疗效的同时降低药物的用量，藉以减轻化学药物带来的副作用，是提高实体癌患者生存率以及生存质量的重要手段。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种用于增加癌细胞药物敏感性的生物材料及其应用和细胞培养器皿。该生物材料可以有效提升癌细胞对癌症药物的敏感性，从而有利于在低用量药物的作用下，实现对癌细胞的高效杀伤，减轻药物对正常细胞的损伤及其带来的副作用。
第一方面，本发明提供了一种用于增加癌细胞药物敏感性的生物材料，包括第一胶体颗粒、第二胶体颗粒和界面活性剂，所述生物材料为一微纳米颗粒结构涂层，所述第一胶体颗粒与所述第二胶体颗粒的粒径尺寸比值大于2，所述第一胶体颗粒均匀有序分布在所述微纳米颗粒结构涂层中，围绕每个所述第一胶体颗粒周围均匀分布有多个所述第二胶体颗粒；所述第一胶体颗粒包括SiO2胶体颗粒、ZnO胶体颗粒、TiO2胶体颗粒、MnO2胶体颗粒、Fe2O3胶体颗粒、Ta2O5胶体颗粒、CuO胶体颗粒、Al2O3胶体颗粒、Ag2O胶体颗粒、PMMA胶体颗粒和PS胶体颗粒中的至少一种，所述第二胶体颗粒包括PMMA胶体颗粒、PS胶体颗粒、PLGA胶体颗粒、PCL胶体颗粒、PDMS胶体颗粒和PNIPAM胶体颗粒中的至少一种。
本发明中，所述生物材料可以铺设在具有至少一表面结构的物体上，所述物体的材质可以为无机材料或为有机材料。可选地，所述无机材料可以但不限于为二氧化硅或二氧化钛；所述有机材料可以为有机聚合物。例如，所述有机聚合物可以但不限于为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸羟基乙酸或聚己内酯。所述具有至少一表面结构的物体可以但不限于为平板或为各种类型的器皿。
可选地，所述第一胶体颗粒表面修饰有第一官能基团，所述第一官能基团包括羟基、醛基、羧基、硫基和胺基中的至少一种；所述第二胶体颗粒表面修饰有第二官能基团，所述第二官能基团包括羟基、醛基、羧基、硫基和胺基中的至少一种。
本发明一实施方式中，所述第一官能基团为羟基，或为醛基，或为羧基，或为硫基，或为胺基；所述第二官能基团为羟基，或为醛基，或为羧基，或为硫基或为胺基。本发明中所述第一胶体或所述第二胶体表面修饰的第一官能基团或第二官能基团一方面能影响其与接触物体表面之间的固定强度；另一方面，所述第一官能基团或第二官能基团还可以对应改变第一胶体或所述第二胶体表面电荷，影响细胞贴附，以及调节第一胶体或所述第二胶体的分布间距。
可选地，所述第一胶体颗粒与所述第二胶体颗粒的粒径尺寸比值大于或等于5。
可选地，所述第一胶体颗粒的粒径尺寸为0.5μm-10μm，所述第一胶体颗粒与所述第二胶体颗粒的粒径尺寸比例为(2-100):1。
可选地，所述第一胶体颗粒的粒径尺寸为1μm-8μm。
可选地，所述第一胶体颗粒的粒径尺寸为1μm-5μm。
本发明一实施方式中，所述第一胶体颗粒的粒径尺寸为0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm。
可选地，所述第二胶体颗粒的粒径尺寸为0.05μm-0.8μm。
可选地，所述第二胶体颗粒的粒径尺寸为0.05μm-0.7μm。
可选地，所述第二胶体颗粒的粒径尺寸为0.1μm-0.7μm。
本发明一实施方式中，所述第二胶体颗粒的粒径尺寸为0.05μm，或为0.1μm，或为0.2μm，或为0.3μm，或为0.4μm，或为0.5μm，或为0.5μm，或为0.7μm，或为0.8μm。
本发明中，当所述生物材料设置在一平面结构的物体上时，有具有不同粒径尺寸的第一胶体颗粒和第二胶体颗粒，因此，所述生物材料整体呈现出具有规律的、凹凸型微纳米结构涂层。
可选地，任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距为0.1μm-5μm。本发明中，所述任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距是指相邻两个所述第一胶体颗粒的外表面之间的最短距离。
可选地，任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距为0.15μm-5μm。
可选地，任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距为0.15μm-3μm。
可选地，任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距为0.5μm-1.5μm。
本发明一具体实施方式中，任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距可以但不限于为0.1μm，或为0.15μm，或为0.2μm，或为0.5μm，或为0.6μm，或为0.8μm，或为1μm，或为1.5μm，或为2μm，或为2.5μm，或为3μm，或为4μm，或为5μm。
可选地，所述界面活性剂在所述生物材料中的质量分数为0.0001％-1％。
可选地，所述界面活性剂在所述生物材料中的质量分数为0.001％-0.1％。
可选地，所述界面活性剂在所述生物材料中的质量分数为0.001％-0.01％。
本发明一具体实施方式中，所述界面活性剂在所述生物材料中的质量分数可以但不限于为0.0001％，或为0.0005％，或为0.001％，或为0.01％，或为0.005％，或为0.008％，或为0.01％，或为0.05％，或为0.08％，或为0.1％，或为0.5％，或为1％。
本发明中，任意相邻两个所述第二胶体颗粒之间的间距很小，可以近似认为其相互接触。
可选地，任意相邻两个所述第二胶体颗粒之间的间距为1-200nm。
进一步地，可选地，任意相邻两个所述第二胶体颗粒之间的间距为10-100nm。
本发明中，所述第二胶体颗粒围绕所述第一胶体颗粒紧密排布，所述第二胶体颗粒和所述第一胶体颗粒的间距为10-200nm。
进一步地，可选地，所述第二胶体颗粒和所述第一胶体颗粒的间距为10-100nm。
本发明中，所述界面活性剂包括阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。本发明所述界面活性剂可以用于进一步调节第一胶体颗粒和第二胶体颗粒表面的电荷分布量，从而使所述生物材料中任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距，以及第二胶体颗粒之间的间距在一定范围内，并形成相应结构的生物材料；所述生物材料具有增强癌细胞对抗癌药物敏感性的作用。
本发明中，所述生物材料具有增强癌细胞对抗癌药物敏感性的作用，当将癌细胞放置在含有所述生物材料的材料表面上培养时，所述癌细胞对抗癌药物的敏感性会增加，有利于与抗癌药物协同，高效抑制癌细胞的增殖。
第二方面，本发明还提供了一种细胞培养器皿，包括培养器皿本体和设置在所述培养器皿本体至少一个表面上的生物材料，所述生物材料如本发明第一方面所述。
可选地，当使用所述细胞培养器皿培养癌细胞，所述癌细胞附着在所述生物材料上时，所述生物材料能用于改变细胞的贴附形态和增强所述癌细胞对抗癌药物的敏感性。
进一步地，当使用所述细胞培养器皿培养癌细胞，所述癌细胞附着在所述生物材料上时，所述生物材料能用于增强所述癌细胞对抗癌药物的敏感性。
可选地，所述抗癌药物选自紫杉醇(paclitaxel)、顺铂(cisplatin)、吉西他滨(Gemcitabine)和长春瑞滨(vinorelbine)中的至少一种。
可选地，所述癌细胞选自人非小细胞肺癌细胞、人卵巢癌细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、人喉癌细胞、人结直肠癌细胞和人黑色素瘤细胞中的至少一种。
进一步地，可选地，所述癌细胞选自人非小细胞肺癌细胞或人卵巢癌细胞。
可选地，单位面积所述培养器皿本体的所述表面上，所述第一胶体颗粒和所述第二胶体颗粒的覆盖率之和为80-99％；其中，所述第一胶体颗粒与所述第二胶体颗粒的覆盖率之比为(0.2-20)：1。
本发明中，单位面积所述培养器皿本体的所述表面上，所述第一胶体颗粒和所述第二胶体颗粒的覆盖率分别指：单位面积的所述培养器皿本体的所述表面上，所述第一胶体颗粒或第二胶体颗粒在所述表面单位面积上的正投影面积的占比。
本发明中，所述培养器皿本体的材质可以为玻璃或有机聚合物。本发明以具体实施方式中，所述培养器皿本体的材质为玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸羟基乙酸或聚己内酯。
本发明中，所述培养器皿本体的形状、尺寸可以根据实际的需求进行调整，此处不做具体限定。
例如，所述培养器皿本体可以为各种容器或平板。例如，所述培养器皿本体可以但不限于为塑胶板、塑胶盒、玻璃片或玻璃盒。
本发明一实施方式中，所述培养器皿本体可以为培养板本体或培养瓶本体。当所述培养器皿本体为培养板本体时，所述培养板本体包括至少一个培养孔；所述生物材料设置在所述培养孔的底部表面。当所述培养器皿本体为培养瓶本体时，所述生物材料设置在所述培养瓶本体中底部表面和/或侧部表面。
本发明一具体实施方式中，所述培养板本体由盖板和底板组成，其中，所述底板上设置有至少一个培养孔，所述生物材料设置在所述培养孔的底部表面。例如，所述培养板本体可以选自常规的单孔盘、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板和96孔板中的至少一种。
本发明另一具体实施方式中，所述培养瓶本体由瓶盖和瓶体组成，其中，所述瓶体设有一瓶口，所述瓶口设置有外螺纹，所述瓶盖设置有内螺纹，所述瓶盖螺纹套装于所述瓶口；所述瓶盖顶部设有透气膜。所述瓶体至少设有相对平行的两个侧面，以便用于平放及多个所述培养瓶本体的叠放，所述生物材料所设置的所述表面为所述用于平放的侧面。当所述瓶体平放时，装有不少于1/4所述瓶体容积液体的所述瓶体不会出现所述液体漏出。
由于现在的抗癌药物普遍具有广谱杀伤性，在抑制癌细胞增殖或损伤癌细胞的同时，也会作用于正常细胞，给肿瘤患者带来严重的副反应。而在本发明所述细胞培养器皿中培养的癌细胞，当癌细胞附着在所述细胞培养器皿的生物材料上时，其对抗癌药物的敏感性会明显增加，在被更少剂量抗癌药物作用下就会呈现显著的增殖速度减慢、甚至出现大批量死亡。因此，本发明所述细胞培养器皿一方面有利于进一步研究癌细胞对抗癌药物的敏感性增加的作用机制；另一方面可以作为一种精准筛选高效抗癌药物的工具，使用低剂量的抗癌药物进行试验，可以大大降低抗癌药物筛选的成本。
本发明中，所述细胞培养器皿的制备方法可以但不限于包括以下步骤：
(1)提供培养器皿本体；
(2)分别配制第一胶体颗粒溶液和第二胶体颗粒溶液，然后按预设比例混合形成混合溶液，并添加适量界面活性剂，混合均匀后，将所述混合溶液加入至培养器皿本体的一表面上，且至少覆盖所述表面；静置干燥直至所述混合溶液的溶剂蒸发完，然后加入有机溶剂，于90-95℃下加热，待所述有机溶剂挥发后，形成固定在所述培养器皿本体的一表面上的生物材料；
其中，所述第一胶体颗粒包括SiO2胶体颗粒、ZnO胶体颗粒、TiO2胶体颗粒、MnO2胶体颗粒、Fe2O3胶体颗粒、Ta2O5胶体颗粒、CuO胶体颗粒、Al2O3胶体颗粒、Ag2O胶体颗粒、PMMA胶体颗粒和PS胶体颗粒中的至少一种，所述第二胶体颗粒包括PMMA胶体颗粒、PS胶体颗粒、PLGA胶体颗粒、PCL胶体颗粒、PDMS胶体颗粒和PNIPAM胶体颗粒中的至少一种。
可选地，所述第一胶体颗粒的粒径尺寸为0.5μm-10μm，所述第一胶体颗粒与所述第二胶体颗粒的粒径尺寸比例为(2-100):1
可选地，所述有机溶剂包括体积为1:(1-10)比例的乙醇和甲苯。
本发明一具体实施方式中，所述有机溶剂包括体积为1:3比例的乙醇和甲苯。
可选地，所述加热温度可以为90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、或95℃。可选地，加热时间为0.5-24h。进一步地，可选地，加热时间可以但不限为1-10h。
本发明所述制备过程中，所述混合溶液中的第一胶体颗粒和第二胶体颗粒通过组成的方式形成所述生物材料，具体包括以下三个阶段：第一阶段，沉降过程，所述第一胶体颗粒和第二胶体颗粒在混合溶液中是一种无序状态，静置后在重力作用下所述第一胶体颗粒先沉降到底部排列，随着混合溶液溶剂的减少，所述第二胶体颗粒与所述第一胶体颗粒接触，在颗粒表面电荷相互作用下，所述第二胶体颗粒有序填充在第一胶体颗粒周围，最后形成生物材料；第二阶段，所述混合溶液完全蒸发后，利用有机溶液使所述由第一胶体颗粒和第二胶体颗粒组成的生物材料更加贴合于所述培养器皿本体的表面；第三阶段，将所述培养器皿本体置于烘箱中加热，冷却后得到所述细胞培养器皿。
本发明中，所述培养器皿本体的表面在铺设生物材料之前还可以进行包被处理。
一实施方式中，可以但不限于使用蛋白质溶液对培养器皿本体的表面进行包被处理具，所述蛋白质溶液包括明胶溶液和/或聚多巴胺溶液。经过包被处理后的培养器皿本体的表面与生物材料的结合力更强。
本发明所述细胞培养器皿的制备方法，工艺简单，成本低，可以用于大规模工业化生产。
第三方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的生物材料在制备用于增强癌细胞对抗癌药物敏感性的生物器皿中的应用。其中，所述生物器皿具有承载并培养细胞的功能。
具体地，所述生物器皿具可以为细胞培养板等。
第四方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的生物材料在制备抗癌药物中的应用。
本发明一具体实施方式中，将所述生物材料与抗癌药物组合并制备一药物组合物，所述药物组合物可以提高实体癌细胞的药物敏感性，降低抗癌药物用量以减少副反应发生。所述药物组合物可以提高实体癌患者生存率以及生存质量。
本发明中，所述的生物材料和/或所述的细胞培养器皿，协同抗癌药物的作用来促进癌细胞死亡的方式还可以用于找出新的癌细胞致死通路。其中，所述生物材料的材料还可以作为辅助治疗肿瘤的药物。例如，未来在手术过后，将具有表面生物材料的材料植入肿瘤病灶附近，配合药物治疗，预期可以抑制残留癌细胞转移或复发，改善患者预后。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
为更清楚地阐述本发明的内容，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
图1为本发明一实施例提供的细胞培养器皿100的结构示意图；
图2为本发明一实施例提供的细胞培养器皿100的截面结构示意图；
图3为本发明一实施例提供的生物材料的局部SEM图；
图4为本发明一实施例的多种生物材料的SEM图；
图5为本发明一实施例提供的不同形貌的生物材料上A549细胞和SKOV3细胞的SEM图；
图6为本发明一实施例提供的不同种形貌的生物材料与顺铂抗癌药物对A549细胞的存活率数据图；
图7为本发明一实施例提供的不同种形貌的生物材料与顺铂抗癌药物对SKOV3细胞的存活率数据图；
图8为本发明一实施例提供的不同种形貌的生物材料与紫杉醇抗癌药物对A549细胞的存活率数据图；
图9为本发明一实施例提供的不同种形貌的生物材料与紫杉醇抗癌药物对SKOV3细胞的存活率数据图；
图10为本发明一实施例提供的不同种形貌的生物材料与吉西他滨抗癌药物对A549细胞的存活率数据图；
图11为本发明一实施例提供的不同种形貌的生物材料与吉西他滨抗癌药物对SKOV3细胞的存活率数据图；
图12为本发明一实施例提供的不同种形貌的生物材料与长春瑞滨抗癌药物对A549细胞的存活率数据图；
图13为本发明一实施例提供的不同种形貌的生物材料与长春瑞滨抗癌药物对SKOV3细胞的存活率数据图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
参见图1和图2，本发明一实施方式中，提供了一种细胞培养器皿100，包括培养器皿本体10和微纳结构涂层20；所述培养器皿本体由盖板11和底板12组成，其中，所述底板12上设置有至少一个培养孔13，所述生物材料20设置在所述培养孔13的底部14表面。
其中，所述生物材料包括第一胶体颗粒、第二胶体颗粒和界面活性剂，所述第一胶体颗粒均匀有序分布在所述底部14表面；其中，底部14表面上，围绕每个所述第一胶体颗粒周围均匀分布有多个所述第二胶体颗粒。参见如图3所示，本发明所述生物材料20包括第一胶体颗粒21、第二胶体颗粒22和界面活性剂(未示出)，其中，多个第二胶体颗粒22围绕每个第一胶体颗粒21周围均匀分布；所述第一胶体颗粒21和所述第二胶体颗粒22均分布在所述培养孔13的底部14表面；所述第一胶体颗粒21与所述第二胶体颗粒22的粒径尺寸比值大于2。其中，所述界面活性剂在所述生物材料中的质量分数为0.0001％-1％。
本发明实施方式中，所述界面活性剂包括阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。例如，所述界面活性剂可以但不限于为十二烷基硫酸钠(SDS)。
本发明实施方式中，所述第一胶体颗粒21包括SiO2胶体颗粒、ZnO胶体颗粒、TiO2胶体颗粒、MnO2胶体颗粒、Fe2O3胶体颗粒、Ta2O5胶体颗粒、CuO胶体颗粒、Al2O3胶体颗粒、Ag2O胶体颗粒、PMMA胶体颗粒和PS胶体颗粒中的至少一种；所述第二胶体颗粒22包括PMMA胶体颗粒、PS胶体颗粒、PLGA胶体颗粒、PCL胶体颗粒、PDMS胶体颗粒和PNIPAM胶体颗粒中的至少一种。
可选地，所述第一胶体颗粒表面修饰有第一官能基团，所述第一官能基团包括羟基、醛基、羧基、硫基和胺基中的至少一种；所述第二胶体颗粒表面修饰有第二官能基团，所述第二官能基团包括羟基、醛基、羧基、硫基和胺基中的至少一种。
本发明一实施方式中，所述第一官能基团为羟基，或为醛基，或为羧基，或为硫基，或为胺基；所述第二官能基团为羟基，或为醛基，或为羧基，或为硫基或为胺基。例如，PS胶体颗粒修饰后羧基后的形成的羧基化聚苯乙烯(PS-COOH)。第二胶体颗粒中，PS胶体颗粒修饰硫基后形成的硫基化聚苯乙烯(PSS)，其中，这里的硫基是指二氧化硫基团。
可选地，当第一胶体颗粒由两种组分组成时，两种组分之间的质量比选自为1:(0.1-10)。当第二胶体颗粒由两种组分组成时，两种组分之间的质量比选自为1:(0.1-10)。
可选地，所述第一胶体颗粒的粒径尺寸为0.5μm-10μm，所述第一胶体颗粒与所述第二胶体颗粒的粒径尺寸比例为(2-100):1。
可选地，所述第一胶体颗粒的粒径尺寸为1μm-8μm。
可选地，所述第一胶体颗粒的粒径尺寸为1μm-5μm。
本发明一实施方式中，所述第一胶体颗粒的粒径尺寸为0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm。
可选地，所述第二胶体颗粒的粒径尺寸为0.05μm-0.8μm。
可选地，所述第二胶体颗粒的粒径尺寸为0.05μm-0.7μm。
可选地，所述第二胶体颗粒的粒径尺寸为0.1μm-0.7μm。
本发明一实施方式中，所述第二胶体颗粒的粒径尺寸为0.05μm，或为0.1μm，或为0.2μm，或为0.3μm，或为0.4μm，或为0.5μm，或为0.5μm，或为0.7μm，或为0.8μm。
本发明实施方式中，所述第一胶体颗粒21与所述第二胶体颗粒22的形状均为球形或近球形。
本发明实施方式中，任意相邻两个所述第一胶体颗21之间的间距为D，参见图3，任意相邻两个所述第一胶体颗粒21之间的间距D是指从一个第一胶体颗粒表面至相邻的另一个第一胶体颗粒表面之间的最近距离，图3中标尺为2μm。
可选地，任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距为0.1μm-5μm。本发明中，所述任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距是指相邻两个所述第一胶体颗粒的外表面之间的最短距离。
可选地，任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距为0.15μm-5μm。
可选地，任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距为0.15μm-3μm。
可选地，任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距为0.5μm-1.5μm。
本发明一具体实施方式中，任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距可以但不限于为0.1μm，或为0.15μm，或为0.2μm，或为0.5μm，或为0.6μm，或为0.8μm，或为1μm，或为1.5μm，或为2μm，或为2.5μm，或为3μm，或为4μm，或为5μm。
可选地，所述界面活性剂在所述生物材料中的质量分数为0.0001％-1％。
可选地，所述界面活性剂在所述生物材料中的质量分数为0.001％-0.1％。
可选地，所述界面活性剂在所述生物材料中的质量分数为0.001％-0.01％。
本发明一具体实施方式中，所述界面活性剂在所述生物材料中的质量分数可以但不限于为0.0001％，或为0.0005％，或为0.001％，或为0.01％，或为0.005％，或为0.008％，或为0.01％，或为0.05％，或为0.08％，或为0.1％，或为0.5％，或为1％。
可选地，任意相邻两个所述第二胶体颗粒之间的间距为1-200nm。
进一步地，可选地，任意相邻两个所述第二胶体颗粒之间的间距为10-100nm。
本发明中，所述第二胶体颗粒围绕所述第一胶体颗粒紧密排布，所述第二胶体颗粒和所述第一胶体颗粒的间距为10-200nm。进一步地，可选地，所述第二胶体颗粒和所述第一胶体颗粒的间距为10-100nm。
本发明实施方式中，所述细胞培养器皿100的培养器皿本体10为细胞培养板本体结构，如六孔板。可选地，培养器皿本体10还可以为单孔盘、12孔板、24孔板、48孔板和96孔板中的至少一种。
本发明实施方式中，所述培养器皿本体的具体尺寸可以根据实际的需求进行调整，此处不做具体限定。
本发明中，所述细胞培养器皿的制备方法包括以下步骤：
S10、提供培养器皿本体；
S20、分别配制第一胶体颗粒溶液和第二胶体颗粒溶液，然后按预设比例混合形成混合溶液，并添加适量界面活性剂，混合均匀后，将所述混合溶液加入至培养器皿本体的一表面上，且至少覆盖所述表面；静置干燥直至所述混合溶液的溶剂蒸发完，然后加入有机溶剂，于90-95℃下加热，待所述有机溶剂挥发后，形成固定在所述培养器皿本体的一表面上的生物材料；
其中，所述第一胶体颗粒包括SiO2胶体颗粒、ZnO胶体颗粒、TiO2胶体颗粒、MnO2胶体颗粒、Fe2O3胶体颗粒、Ta2O5胶体颗粒、CuO胶体颗粒、Al2O3胶体颗粒、Ag2O胶体颗粒、PMMA胶体颗粒和PS胶体颗粒中的至少一种，所述第二胶体颗粒包括PMMA胶体颗粒、PS胶体颗粒、PLGA胶体颗粒、PCL胶体颗粒、PDMS胶体颗粒和PNIPAM胶体颗粒中的至少一种。
可选地，所述有机溶剂包括体积为1:(1-10)比例的乙醇和甲苯。本发明实施方式中，所述有机溶剂包括体积为1:3比例的乙醇和甲苯。
本发明实施方式中，所述制备方法中，制备得到表面上设有生物材料的细胞培养器皿后，可以对所述细胞培养器皿进行清洗和杀菌处理。例如，可以用缓冲液或去离子水进行清洗，通过紫外光照的方式对其进行杀菌处理。经清洗处理后，所述生物材料表面上的界面活性剂可以被大部分清除干净；由于生物材料制作完成后第一胶体颗粒和第二胶体颗粒的位置以相对实现固定，因此，当经清洗处理后，生物材料表面上的界面活性剂大部分被清除干净后不会对其结构稳定性造成影响。
本发明实施方式中，通过改变第一胶体颗粒与第二胶体颗粒的种类、粒径尺寸、体积或质量比例，以及表面修饰的第一或第二官能基团的种类或数目，调节界面活性剂的含量及种类，可以获得多种形貌的生物材料，例如，通过利用扫描电子显微镜(SEM)检测可以获得其具体形貌。上述第一胶体颗粒、第二胶体颗粒、界面活性剂和制备工艺的具体限定与前文的论述一致，本实施方式中不做再次赘述。
下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。
实施例1
基于上述实施例提供的制备方法，分别按照表1所述的第一胶体颗粒、第二胶体颗粒和界面活性剂，在细胞培养板本体的培养孔表面铺设生物材料。
具体制备方法包括：种类提供一细胞培养板本体；分别配制第一胶体颗粒溶液和第二胶体颗粒溶液，然后按预设比例混合形成混合溶液，并添加适量界面活性剂，混合均匀后，将所述混合溶液加入至培养器皿本体的一表面上，且至少覆盖所述表面；静置干燥直至所述混合溶液的溶剂蒸发完，然后加入有机溶剂，于90-95℃下加热，待所述有机溶剂挥发后，形成固定在细胞培养板本体细胞孔底部表面的生物材料，然后经清洗和杀菌处理后，备用，其中当第一胶体颗粒或第二胶体颗粒由多种组分组成时，多种组分的之间的质量比选自为1:1。
表1实施例1-7中的制备生物材料的材料选择
Figure BDA0002303158710000131
基于上述制备得到的实施例1-7获得的细胞培养板，并以没有设置生物材料的细胞培养板设有空白对照组，分别对其进行喷金处理后(如10-15nm金颗粒)，使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)在20keV下分析所述细胞培养板中的生物材料的具体表面结构，结构如图4所示，其中，实施例1中相邻第一胶体颗粒间距为1.3μm，其排布形体为六边形；实施例2中相邻第一胶体颗粒间距为1.3μm，其排布形体为六边形；实施例3中相邻第一胶体颗粒间距为1.7μm，其排布形体为六边形；实施例4中相邻第一胶体颗粒间距为0.7μm，其排布形体为六边形；实施例5中相邻第一胶体颗粒间距为0.8μm，其排布形体为六边形；实施例6中相邻第一胶体颗粒间距为2.0μm，其排布形体为六边形；实施例1中相邻第一胶体颗粒间距为0.3μm，其排布形体为六边形。
效果实施例
1、检测各种颗粒涂层对癌细胞药物敏感性的影响
(1)细胞培养
本发明实施方式中从众多癌细胞系中选取A549细胞(人非小细胞肺癌细胞)和SKOV3细胞(人卵巢癌细胞)培养，所述SKOV3和A549细胞均源自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。采用含10％新生牛血清(可购置于Gibco)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)的DMEM高糖培养液(可购置于Gibco)于37℃、5％CO2及饱和湿度培养箱中培养。细胞密度为80-100％时，使用0.25％胰酶-EDTA消化液消化后，回种1.2×104颗细胞至新的培养皿中传代。
(2)细胞形态检测
随机选取实施例1、实施例4和实施例7的细胞培养板，分别接种2×104个细胞/孔的密度，置于培养箱中孵育24小时后将培养液弃去，用PBS冲洗，使用4％多聚甲醛固定15分钟，再用PBS冲洗。然后进行喷金处理后(如10-15nm金颗粒)，使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)在20keV下分析所述细胞在细胞培养板中的生物材料的具体形态，结构如图5所示。
从图5所示内容可以看出，A549细胞和SKOV3细胞都可以在各个细胞培养板上附着，但细胞型态在不同细胞培养板的不同生物材料上呈现不同样貌，并且与空白对照组相比，本发明实施例所述的生物材料能改变癌细胞的贴附形态。因此，本发明所述生物材料可以用于研究关于细胞移动等细胞行为学研究。
(3)CCK-8法测定细胞存活率
将2×104个细胞/孔的密度的A549与SKOV3细胞系分别随机种于上述实施例1-7提供的细胞培养板中，置于培养箱中孵育过夜后，分别测试不同生物材料与抗癌药物对A549与SKOV3细胞系的影响。其中，抗癌药物选取市面上常用顺铂、紫杉醇、吉西他滨和长春瑞滨；其中，在按梯度浓度加入对应抗癌药物后，于培养箱培养24小时后，弃去原来的培养液，每个孔加入新的培养液200μL和20μL CCK-8试剂，再于培养箱孵育1小时后，用酶标仪于450nm波长处测吸光值，其中TCP是正对照。
参见图6-图13，其中，图6为实施例4和6的生物材料对顺铂影响A549细胞存活率的数据图。将A549细胞种在实施例4和6的不同的生物材料上，添加不同浓度的顺铂后，利用CCK8试剂测定存活率，发现与空白对照组的细胞相比，实施例4和6的生物材料会协同顺铂，伴随浓度梯度增加，大大减少A549细胞存活率，其中实施例4的生物材料效果最为显着。
图7为实施例3、5和7的生物材料对顺铂影响SKOV3细胞存活率的数据图。结果显示，与空白对照组的孔板相比，实施例3、5和7的生物材料会协同顺铂，伴随浓度梯度增加，大大减少SKOV3细胞存活率，其中实施例7的生物材料效果最为显着。
图8为实施例4的生物材料对紫杉醇影响A549细胞存活率的数据图。结果显示，与对照的空白孔板相比，实施例4的生物材料会协同紫杉醇，伴随浓度梯度增加，大大减少A549细胞存活率。
图9为实施例2和7的生物材料对紫杉醇影响SKOV3细胞存活率的数据图。结果显示，与对照的空白孔板相比，实施例2和7的生物材料会协同紫杉醇，伴随浓度梯度增加，大大减少SKOV3细胞存活率。
图10为实施例4的生物材料对吉西他滨影响A549细胞存活率的数据图。结果显示，与对照的空白孔板相比，实施例4的生物材料会协同吉西他滨，伴随浓度梯度增加，大大减少A549细胞存活率。
图11为实施例7的生物材料对吉西他滨影响SKOV3细胞存活率的数据图。结果显示，与对照的空白孔板相比，实施例7的生物材料会协同吉西他滨，伴随浓度梯度增加，大大减少SKOV3细胞存活率。
图12为实施例4的生物材料对长春瑞滨影响A549细胞存活率的数据图。结果显示，与对照的空白孔板相比，实施例4的生物材料会协同长春瑞滨，伴随浓度梯度增加，大大减少A549细胞存活率。
图13为实施例7的生物材料对长春瑞滨影响SKOV3细胞存活率的数据图。结果显示，与对照的空白孔板相比，实施例7的生物材料会协同长春瑞滨，伴随浓度梯度增加，大大减少SKOV3细胞存活率。
通过上述效果实施例的数据显示，本发明中，所述实施例制得的生物材料具有增强癌细胞对抗癌药物敏感性的作用，当将癌细胞放置在含有所述生物材料的材料表面上培养时，所述癌细胞对抗癌药物的敏感性会增加，有利于与抗癌药物协同，高效抑制癌细胞的增殖。
(4)生物材料增加癌细胞对药物敏感性的机制
本实施方式中，细胞培养器皿中的生物材料增加癌细胞对药物敏感性的机制可以为：
试验初步结果显示部分生物材料种类可协同药物的作用来降低癌细胞存活率，降低细胞存活率主要可能透过两种形式，一种为促进细胞凋亡，另一种为促进细胞周期停滞；此两种形式皆可降低癌细胞存活率。
在细胞凋亡的部分，p53基因是一种与肿瘤发生发展相关的抑癌基因，参与细胞生长、分化及死亡的调控，在细胞凋亡过程中起重要作用。肿瘤细胞中多见p53突变或缺失，导致异常细胞的增殖或不能启动凋亡而产生耐药。先前研究也显示突变型p53下调MSP/Mstl基因的表达能引起肿瘤细胞的抗凋亡能力，并使H1299肺癌细胞拥有更强的耐药性。在H1299细胞中引入突变型p53能激活核因子κB2(NF-κB2)途径，使其具有耐药性，说明突变型p53可能通过NF-κB2途径降低肿瘤细胞的药物敏感性。除了p53以外，Bcl2蛋白家族在细胞凋亡中亦扮演重要角色，根据其在细胞凋亡中的作用可分为两类：一类是抗凋亡蛋白，包括Bcl2等成员；另一类是促凋亡蛋白，包括Bax等成员。Bcl2成员间通过组成同源或异源二聚体形成相互制约、影响的网络来调控凋亡。Bcl2过度表达可导致细胞多药耐药。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific protease，Caspase)家族在细胞凋亡过程中扮演重要角色。Caspase能够特异地切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键，是细胞凋亡的主要执行者。一般认为，凋亡通路主要有两条，一条为外在通路，由特异性配体如肿瘤坏死因子、Fas配体、肿瘤坏死因子相关的配体与细胞表面死亡受体结合而激活上游始动子Caspase8和10，活化的始动子随后激活效应子Caspase3。另一条为内在或线粒体介导的通路，其激活主要由细胞色素c介导，负责应答如DNA损伤、组织缺氧等状况。始动子Caspase9的激活活化效应子Caspase3，从而引发一系列细胞凋亡相关事件。
在细胞周期的部分，其与细胞增殖、凋亡、分化和癌变等生理和病理过程密切相关。细胞周期蛋白(cyclin)与肿瘤和病毒感染等病理现象也有密切关系。因为cyclin-cyclin依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)-CDK抑制蛋白(CDK inhibitoryproteins，CKI)网络在细胞周期调控中极具重要性，cyclin及其相关分子为细胞周期调控研究中的热点。细胞周期分为G1，S，G2和M期。G1期是DNA合成前期，S期是DNA合成期，G2期是DNA合成后期，M期指有丝分裂期。在细胞周期中主要有3个检查点(check points)，即G1/S，G2/M和纺锤体装配检查点。这些检查点能够监视细胞周期调控的运作，确保基因准确遗传。细胞周期调控的一系列调节基因组成复杂的网络可精准地调控细胞周期，决定细胞是否继续增生、暂不增生或者永不增生，何时分裂或分化。细胞周期调控因子参与调控细胞增殖、分化、凋亡、黏附和癌变。生长因子与细胞表面的受体结合后，刺激细胞进行增生，启动细胞内fos，jun和myc等立刻早期基因表达。cyclin D1是发现最早也是研究最深入的cyclin。cyclin D1在G1早期表达，是细胞周期启动因子，它也是生长因子感应器。阻断或敲除cyclin D1基因使细胞不能顺利通过G1/S检查点，细胞周期延长，伴随G2和M期阻滞，细胞容易凋亡。cyclin和CDK过表达，CKI表达缺失和检测点异常都可能导致细胞周期不正常而发生癌变。cyclin D1和ras共转染会使胚肾细胞和乳腺纤维母细胞转化。cyclin D1转基因鼠会发生乳腺增生和乳腺癌。cyclin D1与myc协同诱发转基因鼠产生B细胞淋巴瘤。
因此，实验推测生物材料增加癌细胞对药物的敏感性的分子路径为促进凋亡或促进细胞周期停滞亦有可能是同时促进次两种路径。其中可能透过调控促凋亡成员包括Bax，p53及caspases等来调控细胞凋亡；或透过调控cyclin D1及其他细胞周期调控因子的表现来造成细胞周期停滞进而导致细胞凋亡进而增加药物的敏感性。
每一种化疗药物对于肿瘤的作用机制有所不同。因此，生物材料增加癌细胞对于不同药物的敏感性可能通过不同的分子路径。例如顺铂在体内可被水解，形成活泼的带正电的水化分子与鸟嘌呤的7位上的N结合，引起DNA链间或链内交联，从而抑制DNA复制和转录，导致DNA断裂和误码，抑制细胞有丝分裂，作用较强而持久。顺铂抗癌谱较广，为细胞周期性非特异性药物，多用于治疗转移性睾丸癌和卵巢癌，是治疗睾丸肿瘤最有效的药物之一，对膀胱癌、宫颈癌、头颈部癌、骨髓癌、非小细胞肺癌和胃癌也有一定疗效。紫杉醇是细胞周期特异性药物，主要是通过与细胞内微管蛋白结合，抑制正常微管的生理性解聚，促进微管蛋白聚合、微管装配，从而达到阻止癌细胞分裂增殖的目的。吉西他滨(Gemcitabine)为一种新的胞嘧啶核苷衍生物。进入人体内后由脱氧胞嘧啶激酶活化，由胞嘧啶核苷脱氨酶代谢。作用机制为其主要代谢物在细胞内掺入DNA，主要作用于G1/S期。还能抑制核苷酸还原酶，导致细胞内脱氧核苷三磷酸酯减少；且抑制脱氧胞嘧啶脱氨酶减少细胞内代谢物的降解，具有自我增效的作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于增加癌细胞药物敏感性的生物材料，其特征在于，包括第一胶体颗粒、第二胶体颗粒和界面活性剂，所述生物材料为一微纳米颗粒结构涂层，所述第一胶体颗粒与所述第二胶体颗粒的粒径尺寸比值大于2，所述第一胶体颗粒均匀有序分布在所述微纳米颗粒结构涂层中，围绕每个所述第一胶体颗粒周围均匀分布有多个所述第二胶体颗粒；所述第一胶体颗粒包括SiO2胶体颗粒、ZnO胶体颗粒、TiO2胶体颗粒、MnO2胶体颗粒、Fe2O3胶体颗粒、Ta2O5胶体颗粒、CuO胶体颗粒、Al2O3胶体颗粒、Ag2O胶体颗粒、PMMA胶体颗粒和PS胶体颗粒中的至少一种，所述第二胶体颗粒包括PMMA胶体颗粒、PS胶体颗粒、PLGA胶体颗粒、PCL胶体颗粒、PDMS胶体颗粒和PNIPAM胶体颗粒中的至少一种。
2.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述第一胶体颗粒表面修饰有第一官能基团，所述第一官能基团包括羟基、醛基、羧基、硫基和胺基中的至少一种；所述第二胶体颗粒表面修饰有第二官能基团，所述第二官能基团包括羟基、醛基、羧基、硫基和胺基中的至少一种。
3.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述第一胶体颗粒的粒径尺寸为0.5μm-10μm，所述第一胶体颗粒与所述第二胶体颗粒的粒径尺寸比例为(2-100):1；任意相邻两个所述第一胶体颗粒之间的间距为0.1μm-5μm。
4.如权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述界面活性剂在所述生物材料中的质量分数为0.0001％-1％。
5.一种细胞培养器皿，其特征在于，包括培养器皿本体和设置在所述培养器皿本体至少一个表面上的生物材料，所述生物材料如权利要求1-4任意一项所述。
6.如权利要求5所述的细胞培养器皿，其特征在于，当使用所述细胞培养器皿培养癌细胞，所述癌细胞附着在所述生物材料上时，所述生物材料能用于改变细胞的贴附形态和增强所述癌细胞对抗癌药物的敏感性。
7.如权利要求6所述的细胞培养器皿，其特征在于，所述抗癌药物配方选自紫杉醇、顺铂、吉西他滨和长春瑞滨中的至少一种。
8.如权利要求6所述的细胞培养器皿，其特征在于，所述癌细胞选自人非小细胞肺癌细胞、人卵巢癌细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、人喉癌细胞、人结直肠癌细胞和人黑色素瘤细胞中的至少一种。
9.如权利要求1-4中任一项所述的生物材料在制备用于增强癌细胞对抗癌药物敏感性的生物器皿中的应用。
10.如权利要求1-4中任一项所述的生物材料在制备抗癌药物中的应用。
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