CN112869691B - 双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置及检测方法 - Google Patents

双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置及检测方法，结合内窥镜检测、拉曼检测与病理分析，直接检测生物体内组织的拉曼光谱，通过光谱信息基于人工智能方法进行无创式病理分析，代替传统的有创病理检查。通过构造信号增强装置，增强测得到的拉曼光谱信号，有效实现体内组织无损病理分析。使用两种不同波长的激光检测同一部位的组织信号，通过两组信号求差值，消除荧光影响，提升拉曼内窥镜的测量信噪比。设计自聚焦结构内窥镜头，通过内置支撑脚，在不增加内窥镜镜头直径的基础上实现内窥镜自聚焦及变焦，在获得更稳定清晰的光谱结果基础上，实现样品的三维扫描病理检测。通过人工智能病理分析方法，有效实现了无创式病理检测。

Description

双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置及检测方法
技术领域
本发明涉及拉曼测量技术领域，特别涉及一种双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置及检测方法。
背景技术
癌症已经成为了严重威胁中国人群生命健康的主要公共卫生问题之一，近几年来我国的癌症发病率和死亡率持续上升，而癌症生存率与发达国家相比有着很大差距。出现以上情况的主要原因之一就是早期癌症的诊断率低。目前对于胃癌、食道癌、鼻咽癌等癌症，最主要的诊断方法是内窥镜诊断和对体内取出的病变组织进行病理活检，但其本身存在许多局限性，在早期癌症诊断方面局限性更加明显。内窥镜检测系统主要是传统白光反射纤维内窥镜，医生通过肉眼观察组织形态来判别是否病变，这强烈依赖于医生的个人经验；对于早期癌症，其病变区域的形态与正常组织的差别不大，肉眼难于区分，这就容易造成漏诊、误诊。病理活检是一种有创性诊断，必要时需要多次取样加以证实，并且活检操作过程复杂、耗时长，不能实时报告诊断结果，这都增加了患者的痛苦，存在一定风险。
拉曼光谱被称为物质的“指纹谱”，能够从分子水平上鉴别不同物质，从拉曼光谱中可以获得物质的分子结构、含量、官能团等信息。利用拉曼光谱进行细胞和分子水平上的疾病诊断是生物医学领域的热门话题，拉曼光谱不需要复杂的取样、制样过程，生物组织中含有的大量水分对光谱的干扰很小，而对生物大分子的变化十分敏感，通过后续的光谱分析手段可以实时得到诊断结果。已有研究表明，通过分析生物样品拉曼特征峰的峰位、峰强等信息，即可对比分辨出正常细胞与癌细胞；进一步的，通过观察相应拉曼峰峰强比的变化，可以对癌症进行分期诊断。结合拉曼光谱与内窥镜技术，可以同时确定是否癌变以及癌变位置，通过拉曼扫描技术可以进一步确定癌变区域；以及光谱活检技术未来可以代替病理活检，缩小内窥镜尺寸。结合内窥镜的拉曼病理分析方法是一种无损、原位、实时、灵敏的新型癌症诊断手段，具有很高的临床应用价值。
现有研究中，已有的有关拉曼光谱与内窥镜结合的相关研究中都是通过光纤拉曼与内窥镜结合实现原位实时拉曼光谱测量，并未考虑到体内环境对拉曼光谱信号的复杂影响，缺乏可靠的高精度的拉曼散射信号测量方法，并且缺乏基于拉曼光谱信号的可行的病理分析方法，尚无法真正实现无创式病理检测。有研究对拉曼内窥镜进行了进一步改进，但生物组织在实际测量中，存在非常明显的荧光信号，严重影响了拉曼光谱的测量信噪比和峰位、峰强拟合精度。同时，样品自身的拉曼信号强度较弱，增长积分时间可以一定程度上提高测量信号的强度，但如果一味增长拉曼积分时间，检测时间变长，无疑会增加病人的痛苦。在拉曼测量领域中，表面增强拉曼方法和针尖增强拉曼方法均可有效提高待测量样品的拉曼信号强度，但这一技术尚未被应用至拉曼内窥镜测量领域。
另一方面，现有研究未考虑在活体组织内的聚焦问题，而聚焦效果会直接影响拉曼的测量精度。现有内窥镜往往采用辅助聚焦环帮助聚焦，但一方面套用聚焦环会导致内窥镜镜头直径增加，增加病人使用中的不适感，另一方面，聚焦环在操作中可能掉落，增加了使用风险，亟需设计一体化的自聚焦装置。同时，一些方法设计的内窥镜结构并不能和临床现有的内窥镜耦合，甚至可能增加内窥镜尺寸，在实际应用中可能增加患者痛苦，且很难得到可有效使用的拉曼光谱，难以实现病理诊断。此外，尚未提出实现三维扫描病理分析的拉曼方法，病灶的范围及影响深度难以确定。
综上，现有的拉曼内窥镜测量方法，尚无法测量得到消除荧光影响的、有更好信号强度的拉曼光谱。同时，现有的拉曼内窥镜装置尚无法实现镜头的一体化自聚焦及变焦的三维扫描拉曼测量。此外，在获得高质量的拉曼光谱后，尚缺乏可靠的病理分析判据提炼方法和光谱信息比对方法，进而真正实现对组织的病理检测。因此，亟需开发可获得增强型拉曼光谱信号、消除荧光影响且具有自聚焦及变焦功能的拉曼内窥式无创病理检测方法及相应装置。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本发明的一个目的在于提出一种双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置，该装置可以实现增强型拉曼光谱信号、消除荧光影响且具有自聚焦及变焦功能的拉曼内窥镜测量，以满足医学、生物学等领域的活体原位测量需求。
本发明的另一个目的在于提出一种双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测方法。
为达到上述目的，本发明一方面实施例提出了一种双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置，包括：
光源模块，所述光源模块包括发出白光的白光光源、发出第一波长激光的第一激光光源、发出第二波长激光的第二激光光源；
成像模块，所述成像模块包括内窥镜镜头、光纤束、图像传感器、光栅和信号采集系统；
所述内窥镜镜头包括物镜、信号增强装置和多个可伸缩支撑脚；所述物镜用于将所述光源模块发出的光聚焦于待测样品表面，并收集反射光或散射光信号；所述信号增强装置用于增强所述待测样品的拉曼光谱信号；可伸缩支撑脚用于实现所述内窥镜镜头自聚焦及变焦；
所述光纤束包括光源光纤束和收集光纤束，所述光源光纤束一端为可切换接口，分别连接所述白光光源、所述第一激光光源和所述第二激光光源，另一端连接至所述内窥镜镜头的物镜；所述收集光纤束一端连接至所述内窥镜镜头的物镜部分，另一端为可切换接口，分别连接所述图像传感器和所述光栅；
所述图像传感器用于接收反射光信号，得到所述待测样品表面的光学显微镜图像；
所述光栅前放置组合滤波片，所述光栅用于接收散射光信号，所述光栅后连接所述信号采集系统，用于接收所述待测样品的拉曼光谱信号；
光谱分析模块，用于对探测得到的拉曼光谱信号进行分析处理，并消除拉曼光谱信号中的荧光影响；
人工智能病理分析模块，用于将消除荧光后的拉曼光谱信号与不同病理条件的光谱特征判据进行比较，根据比较结果对所述待测样品进行判断。
另外，根据本发明上述实施例的双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置还可以具有以下附加的技术特征：
进一步地，在发明的一个实施例中，所述组合滤波片包括第一滤波片和第二滤波片，所述第一滤波片用于消除所述第一激光光源激发的瑞利散射，所述第二滤波片用于消除所述第二激光光源激发的瑞利散射，所述组合滤波片包括但不限于截止滤波片和陷波滤波片。
进一步地，在发明的一个实施例中，所述光谱分析模块具体用于，对探测到的拉曼光谱进行标准化处理，对标准化处理后的所述第一激光光源和所述第二激光光源激发的光谱信号求差值，得到消除荧光影响的拉曼光谱信号。
进一步地，在发明的一个实施例中，所述光纤束由插入管包覆，所述内窥镜镜头前包括用于实现内窥镜镜头转向及移动操作的弯曲部。
进一步地，在发明的一个实施例中，所述多个可伸缩支撑脚及所述信号增强装置均为可伸缩部件，伸缩程度可调节，伸缩原理包括但不限于电磁铁通断电、形状记忆合金电加热变温。
进一步地，在发明的一个实施例中，所述信号增强装置利用表面增强方法时，所述信号增强装置为送水喷嘴，打开所述信号增强装置时，送水喷嘴中喷出纳米颗粒至样品表面，以实现表面增强拉曼散射测量，所述纳米颗粒材质包括但不限于金纳米颗粒、银纳米颗粒，所述纳米颗粒尺寸大于15nm；
所述信号增强装置利用针尖增强方法时，所述信号增强装置为增强型探针针尖，增强型探针针尖表面镀有粗糙度小于百纳米的金属，打开所述信号增强装置时，增强型探针伸出并靠近所述待测样品表面，实现针尖增强拉曼散射测量，针尖表面镀层金属包括但不限于金或银。
为达到上述目的，本发明另一方面实施例提出了一种双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测方法，包括以下步骤：
S1，将光纤束连接的内窥镜镜头插入至待测量位置，所述内窥镜镜头上的支撑脚完全伸出抵住所述待测样品表面，实现自聚焦；
S2，通过光源光纤束将白光传导至内窥镜镜头，并聚焦于待测样品表面，通过收集光纤束将反射光导入图像传感器，得到样品的表面光学显微镜图像；
S3，开启信号增强装置，分别将第一波长激光和第二波长激光通过光源光纤束传导至内窥镜镜头，并聚焦于待测样品表面，通过收集光纤束将散射光导入光栅分光，再接入信号采集系统，得到所述第一波长激光所激发的待测样品的第一增强拉曼光谱信号和第一荧光光谱信号，以及第二波长激光所激发的样品的第二增强拉曼光谱信号和第二荧光光谱信号，将两组表面增强光谱信号标准化后求差值，得到无荧光影响的拉曼光谱信号；
S4，将无荧光影响的拉曼光谱信号与不同病理条件的光谱特征判据进行比较，根据比较结果判断所述待测样品是否病变，病变种类以及病变程度。
另外，根据本发明上述实施例的双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测方法还可以具有以下附加的技术特征：
进一步地，在发明的一个实施例中，还包括：
S5，缩短支撑脚伸出长度，使内窥镜镜头相比自聚焦位置更接近样品表面，通过内窥镜镜头的第一波长激光和第二波长激光将聚焦于待测样品内部，重复步骤S3及步骤S4，进行沿样品深度方向的扫描检测，所述样品深度方向垂直于样品表面；
S6，通过控制弯曲部移动内窥镜镜头，改变光斑在样品平面上的位置，重复步骤S3及步骤S4，进行样品平面内的扫描检测，所述样品平面平行于样品表面。
进一步地，在发明的一个实施例中，对荧光强度标准化处理包括但不限于选取光谱中信号最强位置归一化、根据激发激光功率密度修正信号强度和选取荧光包络线最强位置归一化。
进一步地，在发明的一个实施例中，将消除荧光后的拉曼光谱信号与不同病理条件的光谱特征判据进行比较，所述光谱特征判据包括但不限于，基于增加或减少的拉曼特征峰进行病理分析，基于拉曼特征峰峰强、半高宽、峰面积进行病理分析，基于多组特征峰峰强比、峰面积比进行病理分析，基于多组特征峰峰强比及峰位信息的主成分分析进行病理分析。
本发明实施例的双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置及检测方法，具体以下有益效果：
1、通过双波长测量光谱信号再求差值，可以有效的消除拉曼内窥镜测量得到的光谱信号中的荧光干扰，在生物材料体内原位检测中有极大的应用价值；
2、使用信号增强装置，通过表面增强或针尖增强方法，可以显著提升拉曼光谱信号强度，并提高特征峰的分辨率，可以更快更有效的获得拉曼信息，以用组织作病理检测；
3、使用本发明提出的自聚焦镜头设计，可以在不增加内窥镜镜头尺寸的前提下，实现稳定的内窥镜自聚焦及变焦测量，提升信号的稳定性，并实现三维扫描病理检测；
4、采用人工智能病理分析方法，可以获得不同病理条件的光谱特征判据，进而实现准确可靠的无创式组织病理诊断。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明一个实施例的双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置结构示意图；
图2为根据本发明一个实施例的内窥镜镜头剖面设计示意图：(a)信号增强装置与可伸缩支撑脚均收缩示意图，(b)可伸缩支撑脚伸出示意图，(c)信号增强装置伸出示意图；
图3为根据本发明一个实施例的物镜变焦方法示意图；
图4为根据本发明一个实施例的组合滤波片切换方式示意图：(a)使用对应波长λ1的滤波片，(b)使用对应波长λ2的滤波片；
图5为根据本发明一个实施例的内窥镜镜头结构设计示意图，(a)结合现有商用内窥镜可使用的结构设计，(b)小尺寸内窥镜结构设计；
图6为根据本发明一个实施例的双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测方法流程图；
图7为根据本发明一个实施例的采用信号增强装置和不采用信号增强装置测量得到的鸭食管表面拉曼光谱信号对比示意图；
图8为根据本发明一个实施例的双波长消除荧光影响方法示意图：(a)为两种波长激光直接激发得到的光谱示意图，(b)为标准化并平移处理后的信号示意图，(c)为消除荧光影响后的拉曼光谱示意图；
图9为根据本发明一个实施例的人工智能病理分析方法的原理示意图：(a)为早期癌症组织与正常组织的拉曼光谱信号对比，(b)早期癌症组织与正常组织的光谱特征判据比较。
附图标记：λ1-第1台激光器产生的激光波长；λ2-第2台激光器产生的激光波长；000-待测样品；100-白光光源；101-波长为λ1的激光光源1；102-波长为λ2的激光光源2；201-光源光纤束；201-1-光源光纤束可切换转接头；202-收集光纤束；202-1-收集光纤束可切换转接头；203-弯曲部；300-内窥镜镜头；301-物镜；302-信号增强装置；303-可伸缩支撑脚；304-钳道出口；400-图像传感器；500-组合滤光片；501-对应波长λ1激光的截止滤光片/陷波滤光片；502-对应波长λ2激光的截止滤光片/陷波滤光片；600-光栅；601-信号采集系统；700-光谱分析模块；800-人工智能病理分析模块。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
经过研究发现，生物组织在实际测量中，存在非常明显的荧光信号，严重影响了拉曼光谱的测量信噪比和峰位、峰强拟合精度，且其信号较弱，需要采用有效信号增强方法，以获得高质量的光谱信息，进而实现体内原位无损病理检测。然而，现有的拉曼内窥镜测量方法，尚无法测量得到消除荧光影响的、有更好信号强度的拉曼光谱，以实现有效的病理诊断。同时，现有的拉曼内窥镜装置尚无法实现镜头的一体化自聚焦。此外，现有研究中缺乏可靠的拉曼光谱病理诊断判据和数据处理方法。因此，亟需开发可获得增强型拉曼光谱信号、消除荧光影响且具有自聚焦功能的拉曼内窥式病理检测方法及相应装置。
下面参照附图描述根据本发明实施例提出的双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置及检测方法。
首先将参照附图描述根据本发明实施例提出的双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置。
图1为根据本发明一个实施例的双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置结构示意图。
如图1所示，该双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置包括：光源模块、成像模块、光谱分析模块及人工智能病理分析模块。
光源模块包括发出白光的白光光源、发出第一波长激光λ1的第一激光光源1、发出第二波长激光λ2的第二激光光源2，波长λ1不等于波长λ2。
成像模块包括内窥镜镜头300、光纤束(光源光纤束201和收集光纤束202)、弯曲部203、图像传感器400、光栅600和信号采集系统601。
如图2所示，展示了内窥镜镜头的结构，内窥镜镜头包括物镜301、信号增强装置302和多个可伸缩支撑脚303；物镜301用于将光源模块发出的光聚焦于待测样品表面，并收集反射光或散射光信号。
信号增强装置302用于增强待测样品的拉曼光谱信号。可伸缩支撑脚303用于实现内窥镜镜头自聚焦及变焦，具体地，三个可伸缩支撑脚同时完全伸出时组成的平面，即为内窥镜物镜焦平面，因此，当三个可伸缩支撑脚完全伸出抵住待测样品后，样品平面即与物镜焦平面重合，内窥镜镜头即可实现自聚焦；在完成自聚焦测量后，缩短可伸缩支撑脚的伸出长度，则此时，内窥镜镜头相比自聚焦位置更接近样品表面，物镜焦点进入样本内部，改变可伸缩支撑脚的伸出长度，即可实现变焦，进而实现沿样品深度方向的扫描检测，变焦过程如图3所示。
具体地，内窥镜镜头中的信号增强装置302，包括但不限于实现表面增强方法的装置和实现针尖增强方法的装置；选用表面增强方法时，信号增强装置为送水喷嘴，打开信号增强装置时，送水喷嘴中喷出纳米颗粒至样品表面，以实现表面增强拉曼散射测量，纳米颗粒材质包括但不限于金纳米颗粒、银纳米颗粒，纳米颗粒尺寸大于15nm；选用针尖增强方法时，信号增强装置为增强型探针针尖，增强型探针针尖表面镀有粗糙度小于百纳米的金属，将探针靠近样品表面，即可实现针尖增强拉曼散射测量，针尖表面镀层金属包括但不限于金或银。
内窥镜镜头中的信号增强装置302和三个可伸缩支撑脚303均为可伸缩部件，伸缩原理包括但不限于电磁铁通断电、形状记忆合金电加热变温等；具体地，选择电磁铁通断电方法时，电磁铁与弹簧、及可伸缩部件一体化连接，可伸缩部件靠近电磁铁一侧为可磁化金属，给电磁铁通预设最大电流Imax时，电磁铁吸引可磁化金属，弹簧压缩至最短，则可伸缩部件缩至最短，完全进入内窥镜镜头内部；自聚焦测量时，完全断电，电磁铁失去磁力，弹簧恢复原状，可伸缩部件完全伸出至内窥镜镜头外部，样品平面即与物镜焦平面重合，实现自聚焦；需要变焦测量时，通小于预设最大电流Imax的电流I，电磁铁吸引可磁化金属，弹簧一定程度上压缩，但由于电流小于预设最大电流，可伸缩部件仍伸出至内窥镜镜头外部，但伸出部分长度与自聚焦状态相比缩短，通过改变电流I，即可实现变焦；选择形状记忆合金电加热变温方法时，可伸缩部件由形状记忆合金制造，常温下，形状记忆合金收缩至最短，处在内窥镜镜头内部，需要自聚焦时，通过电阻丝电加热至预设最大温度Tmax，形状记忆合金恢复预设最长形状完全伸出至内窥镜镜头外部；需要变焦时，改变电阻丝加热功率，形状记忆合金温度T降低至小于预设最大温度Tmax但大于常温，则可伸缩部件仍伸出至内窥镜镜头外部，但伸出部分长度与自聚焦状态相比缩短，通过改变记忆合金温度T，即可实现变焦。
光纤束包括光源光纤束201和收集光纤束202，光源光纤束201一端为可切换接口201-1，分别连接白光光源100、第一激光光源101和第二激光光源202，另一端连接至内窥镜镜头300的物镜301。
收集光纤束202一端连接至内窥镜镜头300的物镜301部分，另一端为可切换接口202-1，此接口一头连接图像传感器400，另一头经由组合滤光片500抵达光栅600。
光纤束201和202均由插入管包覆，在内窥镜镜头前增加弯曲部203，以实现内窥镜镜头的转向及移动操作，通过控制弯曲部移动内窥镜镜头，可以改变聚焦后的光斑在样品平面上的位置，所述样品平面平行于样品表面。
具体地，在自聚焦或变焦后，焦点深度确定，通过弯曲部，可以使内窥镜镜头沿样品表面移动，从而使得聚焦后的光斑在平行于样品表面的焦平面内移动，这一焦平面即为样品平面；通过控制弯曲部，即可改变光斑在样品平面上的位置。
图像传感器400与白光光源100匹配使用，用于接收反射光信号，得到待测样品表面的光学显微镜图像。
光栅600与激光光源101和102匹配使用，光栅前放置组合滤波片500，光栅用于接收散射光信号，光栅后连接信号采集系统，用于接收待测样品的拉曼光谱信号。
组合滤波片500包括第一滤波片501和第二滤波片502，其可通过机械部件切换，切换示意图如图3所示，第一滤波片501用以消除波长为λ1的激光光源101激发的瑞利散射，第二滤波片502用以消除波长为λ2的激光光源102激发的瑞利散射，滤波片的类型包括但不限于截止滤波片或陷波滤波片。需要说明的是，切换滤波片501和502的方法包括但不限于图4给出的切换示意方式。
光谱分析模块，用于对探测得到的拉曼光谱信号进行分析处理，并消除拉曼光谱信号中的荧光影响。
具体地，将直接测量得到的波长λ1的激光激发的光谱信号和波长λ2的激光激发的光谱信号分别记为f1(ω1)和f2(ω2)；对数据做标准化处理，再将波长λ2的激光激发的混合光谱信号f2(ω2)平移处理为f2(ω2-1/λ1+1/λ2)；将标准化处理的f1(ω1)与标准化处理的f2(ω2-1/λ1+1/λ2)求差的结果，可以看出，此时取正峰拟合，即可得到待测样品由波长为λ1的激光激发的无荧光影响的拉曼光谱R1(ω1)，取负峰拟合，即可得到待测样品由波长为λ2的激光激发的无荧光影响的拉曼光谱R2(ω2-1/λ1+1/λ2)。此方法具有非常显著的消除荧光影响的效果。
对荧光强度标准化处理方法，包括但不限于：选取光谱中信号最强位置归一化；根据激发激光功率密度修正信号强度；选取荧光包络线最强位置归一化等。具体地处理方法在检测方法部分进行详细描述，装置部分不进行赘述。
人工智能病理分析模块，用于将消除荧光后的拉曼光谱信号与不同病理条件的光谱特征判据进行比较，根据比较结果对待测样品进行判断。
可以理解的是，人工智能病理分析模块用于实现病理检测，捕捉测量得到消除荧光影响的拉曼光谱信号光谱特征判据，并与人工智能方法得到不同病理条件的光谱特征判据比较，进而判断组织是否病变，并判断病变种类及程度。
其中，光谱特征判据的获得方法，是通过人工智能方法学习已知的不同病理条件下的拉曼光谱信息，采用包括但不限于主成分分析等方式，总结不同病理的光谱特征判据。
光谱特征判据，包括但不限于：基于增加或减少的拉曼特征峰进行病理分析，基于拉曼特征峰峰强、半高宽、峰强比进行病理分析，基于多组特征峰峰强比、峰面积比进行病理分析，基于多组特征峰峰强比及峰位信息的主成分分析进行病理分析等。
考虑到与现有商用内窥镜的结合方法，在本发明的实施例中，可结合现有的商用内窥镜结构使用(详见实施例一)；考虑到内窥镜的进一步发展，通过拉曼内窥检测即可判断病理状态，避免不必要的活检取样，也可设计出不需要钳道的直径明显减小的内窥镜镜头(详见实施例二)，有很高的实际应用价值。
实施例一
此实施例中，内窥镜镜头300的结构如图5(a)所示，包括物镜301，信号增强装置302，可伸缩支撑脚303和钳道出口304。在现有的商用内窥镜结构中，物镜301和钳道出口304为固有结构，可伸缩支撑脚303可通过简单改造嵌入内窥镜镜头，在必要条件下，也可通过现有辅助聚焦环替代。只需将设计的信号增强装置302通过钳道出口304引至内窥镜镜头，即可基于本发明提出的方法，实现双波长增强型自聚焦拉曼内窥镜测量。
则此时，测量流程为：
1)将光纤束连接的内窥镜镜头300插入至待测量位置000，内窥镜镜头上的三个支撑脚303(或辅助聚焦环)完全伸出抵住待测样品表面000，内窥镜镜头300即可实现对样品表面的自动聚焦。
2)打开白光光源100，调整可切换借口201-1接通白光，白光通过光源光纤束201传导至内窥镜镜头300，并聚焦于待测样品表面000，调整可切换借口202-1接通图像传感器400，通过收集光纤束202将反射光导入图像传感器400，即可得到样品的表面光学显微镜图像，实现内窥镜功能。
3)进行增强型拉曼光谱测量，这一步骤又可细分为：
3-1)从钳道304放入信号增强装置302，以实现增强型拉曼光谱测量。
3-2)开启波长为λ1的激光光源101，调整可切换借口201-1接通激光光源101，将波长为λ1的激光通过光源光纤束201传导至内窥镜镜头300，并聚焦于待测样品表面，通过收集光纤束202，经由可切换借口202-1将散射光导经滤光片501，再经光栅600分光，接入信号采集系统601，即可测量得到波长为λ1的激光所激发的样品的混合光谱信号f1(ω1)。其中，ω1为测量得到的光谱相比于1/λ1偏移的波数。
3-3)开启波长为λ2的激光光源102，调整可切换借口201-1接通激光光源102，将波长为λ1的激光通过光源光纤束201传导至内窥镜镜头300，并聚焦于待测样品表面，通过收集光纤束202，经由可切换借口202-1将散射光导经滤光片502，再经光栅600分光，接入信号采集系统601，即可测量得到波长为λ2的激光所激发的样品的混合光谱信号f2(ω2)。其中，ω2为测量得到的光谱相比于1/λ2偏移的波数。
3-4)使用光谱分析模块700用于对探测的拉曼光谱进行分析处理，对两组表面增强光谱信号标准化后求差值，即可获得无荧光影响的拉曼光谱信号。
4)使用人工智能病理分析模块800分析所测量组织的拉曼光谱信号，捕捉光谱特征判据并与已知判据比较，判断是否存在病变及病变程度，完成病理检测。
5)缩短支撑脚303的伸出长度，改变焦点沿样品深度方向的位置，重复步骤3)及步骤4)，实现沿样品深度方向的扫描病理检测；
6)通过控制弯曲部203，移动内窥镜镜头，改变光斑在样品平面上的聚焦位置，重复步骤3)及步骤4)，实现对样品平面内的扫描检测。
实施例二
此实施例中，内窥镜镜头300的结构如图5(b)所示，包括物镜301，信号增强装置302，可伸缩支撑脚303。由于不需要通过取样活检判断病理信息，针对初查的病人，可以不使用具有钳道的内窥镜镜头，与图5(a)对比容易发现，在其他部件尺寸一致时，实施例二设计的内窥镜直径与现有商用内窥镜直径相比可大幅缩小，显著减小被检查患者的痛苦。
则此时的测量流程与实施例一相比，仅需将测量流程3-1)替换为：
3-1)开启信号增强装置302，以实现增强型拉曼光谱测量。具体开启方式包括但不限于电磁铁通断电控制、形状记忆合金电加热变温控制等。
本发明结合了内窥镜检测与拉曼检测，可以直接检测生物体内组织的拉曼光谱，且通过表面增强或针尖增强方法构造信号增强装置，显著增强了测量得到的拉曼光谱信号，进而有效实现体内组织无损病理分析。针对生物组织测量信号存在荧光干扰的问题，使用两种不同波长的激光检测同一部位的组织信号，由于不同波长激光激发的拉曼光谱波长不同，但荧光光谱的波长相同，通过两组信号求差值，即可消除荧光影响，进一步提升拉曼内窥镜的测量信噪比。针对高倍物镜镜头下内窥镜聚焦困难的问题，设计了自聚焦结构内窥镜头，通过内置支撑脚，可以在不增加内窥镜镜头直径的基础上，实现内窥镜自聚焦，进而获得更稳定清晰的光谱结果。且避免了传统的辅助聚焦环掉落的风险。进一步地，提出了人工智能病理分析方法，给出了获得判据与处理光谱数据的方法，有效实现了无创式病理检测。考虑到与现有商用内窥镜的结合方法，上述装置可在现有的商用内窥镜结构下结合信号增强装置配件使用(详见实施例一)；考虑到内窥镜的进一步发展，通过拉曼内窥检测即可判断病理状态，避免不必要的活检取样，也可设计出不需要钳道的直径明显减小的内窥镜镜头(详见实施例二)，有很高的实际应用价值。综上，有效结合了拉曼测量、内窥镜检测与病理分析，且提出了有效增强信号、消除荧光及自动聚焦的方法，在不增加内窥镜尺寸、甚至缩小内窥镜尺寸的前提下，实现体内原位无损伤病理诊断，在医疗检测领域有广泛的应用前景。
本发明不仅局限于上述具体实施方式，本发明中提出的基于双波长消除荧光影响的增强型原位拉曼光谱测量原理可广泛应用于本领域及与之相关的其它领域，可以采用其它多种具体实施方式实施本发明。例如，基于以上方法，通过调整收集光纤束布局进一步增强拉曼信号收集效率等。
其次参照附图描述根据本发明实施例提出的双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测方法。
图6为根据发明一个实施例的双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测方法流程图。
如图6所示，该双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测方法包括以下步骤：
S1，将光纤束连接的内窥镜镜头插入至待测量位置，内窥镜镜头上的支撑脚完全伸出抵住待测样品表面，实现自聚焦。
结合图2所示，301为物镜，302为信号增强装置，303为可伸缩支撑脚，物镜后连接光源光纤束201和收集光纤束202，光源光纤束用于将白光或激光传导至内窥镜镜头中的物镜，物镜用于将光源光纤束导入的光线聚焦于待测样品表面并收集反射光或散射光信号，收集光纤束可以将通过物镜收集的反射光信号或散射光信号传输至光栅或图像传感器。
内窥镜镜头装有三个可伸缩支撑脚，三个支撑脚完全伸出后的支点所组成的平面即为物镜301的焦平面。具体地，在内窥镜镜头抵达待测表面开始测量前，和内窥镜镜头离开待测表面测量结束后，三个可伸缩支撑脚均收于内窥镜镜头内，保证镜头无突出尖锐部分，以避免突出部分对内窥镜镜头插入过程和取出过程产生干扰，则内窥镜镜头如图2(a)所示；在内窥镜镜头抵达待测表面后，启动可伸缩支撑脚使其完全伸出，伸缩原理包括但不限于电磁铁通断电、形状记忆合金电加热变温等，则内窥镜镜头如图2(b)所示，此时，使用三个完全伸出的可伸缩支撑脚抵住样品表面，样品表面000与物镜301的焦平面重合，内窥镜镜头即可实现自动聚焦。
图2的示意图中，可伸缩支撑脚的伸缩由电磁铁通断电实现，图2(a)中，电磁铁通预设最大电流Imax时，吸引支撑脚后端的可磁化金属，弹簧压缩至最短，则可伸缩支撑脚缩至最短，完全进入内窥镜镜头内部；图2(b)中，首次测量需自聚焦时，电磁铁断电时失去磁力，弹簧恢复原状，可伸缩支撑脚伸出至内窥镜镜头外部，用以抵住测量平面，样品平面即与物镜焦平面重合，实现自聚焦。需要说明的是，实施例中，可伸缩支撑脚的实现方式仅为一种可能的示意，其还可以通过记忆合金、或可固定机械锁扣等方式，实现稳固的伸缩，以上所有方法仅为自聚焦的实施方式差异，但都包括在本发明的自聚焦方法的设计内。
S2，通过光源光纤束将白光传导至内窥镜镜头，并聚焦于待测样品表面，通过收集光纤束将反射光导入图像传感器，得到样品的表面光学显微镜图像，实现内窥镜功能。
在使用白光时，此拉曼内窥镜可表现为正常内窥镜的功能，用以检测待测组织的表面形貌信息。
S3，开启信号增强装置，分别将第一波长激光和第二波长激光通过光源光纤束传导至内窥镜镜头，并聚焦于待测样品表面，通过收集光纤束将散射光导入光栅分光，再接入信号采集系统，得到第一波长激光所激发的待测样品的第一增强拉曼光谱信号和第一荧光光谱信号，以及第二波长激光所激发的样品的第二增强拉曼光谱信号和第二荧光光谱信号，将两组表面增强光谱信号标准化后求差值，得到无荧光影响的拉曼光谱信号。
进一步地，S3进一步包括：
S31，启动信号增强装置，以实现增强型拉曼光谱测量。
如装置部分描述，信号增强装置，包括但不限于实现表面增强方法的装置和实现针尖增强方法的装置：具体地，选用表面增强方法时，信号增强装置为送水喷嘴，打开信号增强装置时，送水喷嘴中喷出纳米颗粒至样品表面，以实现表面增强拉曼散射测量，纳米颗粒材质包括但不限于金纳米颗粒、银纳米颗粒，纳米颗粒尺寸大于15nm；选用针尖增强方法时，信号增强装置为增强型探针针尖，增强型探针针尖表面镀有粗糙度小于百纳米的金属，将探针靠近样品表面，即可实现针尖增强拉曼散射测量，针尖表面金属包括但不限于金或银。
信号增强装置为可伸缩部件，具体地，在内窥镜镜头抵达待测表面开始测量前，和内窥镜镜头离开待测表面测量结束后，信号增强装置可收于内窥镜镜头内，保证镜头无突出尖锐部分，以避免突出部分对内窥镜镜头插入过程和取出过程产生干扰；在内窥镜镜头抵达待测表面后，启动信号增强装置，则信号增强装置可完全伸出，伸缩原理包括但不限于电磁铁通断电、形状记忆合金电加热变温等。
图2(b)和图2(c)给出了信号增强装置的伸缩示意图，在此实施例中，选取信号增强装置为增强型探针针尖，增强型探针针尖表面镀有粗糙度小于百纳米的金颗粒，将探针靠近样品表面，即可实现针尖增强拉曼散射测量；选用伸缩原理为形状记忆合金加热变温原理，具体地，增强型探针整体由形状记忆合金制造，仅在探针尖端镀有粗糙度小于100nm的金纳米颗粒，常温下，形状记忆合金收缩至最短，处在内窥镜镜头内部，需要伸出时，将形状记忆合金通过电阻丝电加热至预设最大温度Tmax，形状记忆合金恢复预设最长形状完全伸出至内窥镜镜头外部，以实现针尖增强拉曼光谱测量。
图7给出了采用信号增强装置和不采用信号增强装置测量得到的鸭食管表面拉曼光谱信号的对比示意图。可以看出，在使用信号增强装置后，同样测量时间和激光光强下，增强拉曼信号的特征峰强度显著优于未增强拉曼信号，这对缩短内窥镜检测时间，提高体内组织拉曼光谱信号测量精度，进而提高拉曼病理分析准确度有着非常重要的意义。
S32，开启波长为λ1的激光器，测量样品表面增强光谱信号。
具体地，将波长为λ1的激光通过光源光纤束传导至内窥镜镜头，并聚焦于待测样品表面，通过收集光纤束将散射光导入光栅分光，再接入信号采集系统，即可测量得到波长为λ1的激光所激发的样品的增强拉曼光谱信号R1(ω1)和荧光光谱信号F1(ω1)，将这一混合信号记录为f1(ω1)。其中，ω1为测量得到的光谱相比于1/λ1偏移的波数。
S33，开启波长为λ2的激光器，测量样品表面增强光谱信号。
具体地，波长λ2不等于波长λ1，将波长为λ2的激光通过光源光纤束传导至内窥镜镜头，并聚焦于待测样品表面，通过收集光纤束将散射光导入光栅分光，再接入信号采集系统，即可测量得到波长为λ2的激光所激发的样品的增强拉曼光谱信号R2(ω2)和混合的荧光光谱信号F2(ω2)，将这一混合信号记录为f2(ω2)，其中，ω2为测量得到的光谱相比于1/λ2偏移的波数，则ω2＝ω1+1/λ1-1/λ2。
S34，两组表面增强光谱信号标准化后求差值，即可获得无荧光影响的拉曼光谱信号。
具体地，由于不同波长激发的荧光光谱绝对波长相同，则在对荧光强度标准化处理后，F1(ω1)＝F2(ω2-1/λ1+1/λ2)，将标准化处理的f1(ω1)与标准化处理的f2(ω2-1/λ1+1/λ2)求差，即可消除荧光影响，得到R1(ω1)-R2(ω2-1/λ1+1/λ2)，此时取正峰拟合，即可得到待测样品由波长为λ1的激光激发的无荧光影响的拉曼光谱R1(ω1)，取负峰拟合，即可得到待测样品由波长为λ2的激光激发的无荧光影响的拉曼光谱R2(ω2-1/λ1+1/λ2)。
对荧光强度标准化处理方法，包括但不限于：选取光谱中信号最强位置归一化；根据激发激光功率密度修正信号强度；选取荧光包络线最强位置归一化等。
这一处理过程如图8所示。图8(a)为直接测量得到的波长λ1的激光激发的光谱信号和波长λ2的激光激发的光谱信号；图8(b)为标准化并平移后的数据，标准化方法选用以荧光包络线最强位置为基准归一化的方法，波长λ2的激光激发的混合光谱信号f2(ω2)平移处理为f2(ω2-1/λ1+1/λ2)＝f2(ω1)；图8(c)为将标准化处理的f1(ω1)与标准化处理的f2(ω2-1/λ1+1/λ2)求差的结果，可以看出，此时取正峰拟合，即可得到待测样品由波长为λ1的激光激发的无荧光影响的拉曼光谱R1(ω1)，取负峰拟合，即可得到待测样品由波长为λ2的激光激发的无荧光影响的拉曼光谱R2(ω2-1/λ1+1/λ2)。此方法具有非常显著的消除荧光影响的效果。
S4，将无荧光影响的拉曼光谱信号与不同病理条件的光谱特征判据进行比较，根据比较结果对待测样品进行判断，判断所测量区域组织是否发生病变，并判断病变种类及程度。
具体地，人工智能病理分析方法，是通过人工智能方法学习已知的不同病理条件下的拉曼光谱信息，总结不同病理的光谱特征判据，并与测量得到的拉曼光谱信息比较，进而判断组织是否病变，及判断病变种类、程度的方法。
光谱特征判据，包括但不限于：基于增加或减少的拉曼特征峰进行病理分析，基于拉曼特征峰峰强、半高宽、峰面积进行病理分析，基于多组特征峰峰强比、峰面积比进行病理分析，基于多组特征峰峰强比及峰位信息的主成分分析进行病理分析等。
人工智能病理分析方法的原理如图9所示。图9(a)给出了早期癌症组织与正常组织的拉曼光谱信号对比，通过人工智能方法大量处理前期癌变/正常数据，即可获得此类早期癌症与正常组织存在显著差别的光谱特征判据，判据差异如图9(b)所示，其中，P(ω1/ω2)代表两个相应位置的特征峰峰强比，A(ω1-ω2)代表两个波数之间的面积积分。则针对已测量得到的拉曼光谱，只需通过人工智能病理分析程序，捕捉光谱特征判据信息，并与已有判据比较，即可确定待测组织是否发生癌变。
S5，缩短支撑脚303的伸出长度，使内窥镜镜头相比自聚焦位置更接近样品表面，沿深度方向改变焦点位置，重复步骤S3及步骤S4，实现沿样品深度方向的扫描病理检测。
具体地，所述样品深度方向垂直于样品表面，如图3所示，在完成自聚焦测量后，缩短可伸缩支撑脚的伸出长度，则此时，物镜焦点进入样本内部，改变可伸缩支撑脚的伸出长度，即可实现变焦，重复步骤S3和S4，即可实现沿样品深度方向的扫描检测。
采用电磁铁通断电控制可伸缩支撑脚时，需要变焦测量时，通小于预设最大电流Imax的电流I，电磁铁吸引可磁化金属，弹簧一定程度上压缩，但由于电流小于预设最大电流，可伸缩部件仍伸出至内窥镜镜头外部，但伸出部分长度与自聚焦状态相比缩短，通过改变电流I，即可实现变焦；
选择形状记忆合金电加热变温方法时，需要变焦测量时，改变电阻丝加热功率，形状记忆合金温度T降低至小于预设最大温度Tmax但大于常温，则可伸缩部件仍伸出至内窥镜镜头外部，但伸出部分长度与自聚焦状态相比缩短，通过改变记忆合金温度T，即可实现变焦。
S6，通过控制弯曲部203移动内窥镜镜头，改变光斑在样品平面上的位置，重复步骤S3及步骤S4，实现对样品平面内的扫描检测。
具体地，在焦点深度确定后，通过弯曲部，可以使内窥镜镜头沿样品表面移动，从而使得聚焦后的光斑在平行于样品表面的焦平面内移动，这一焦平面即为样品平面；通过控制弯曲部，即可改变光斑在样品平面上的位置，重复步骤S3和S4，即可实现对样品平面内的扫描检测。
结合步骤S5和S6，即可实现对样品的三维扫描检测，三维检测可用于确定病灶大小及影响深度，判断病变影响范围，对后续治疗有关键作用。
需要说明的是，前述对装置实施例的解释说明也适用于该实施例的方法，此处不再赘述。
根据本发明实施例提出的双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测方法，通过表面增强或针尖增强方法，显著增强了测量得到的拉曼光谱信号；针对生物组织测量信号存在荧光干扰的问题，使用两种波长不同的激光检测同一部位的组织信号，由于不同波长激光激发的拉曼光谱波长不同，但荧光光谱的波长相同，通过两组信号求差值，即可消除荧光影响；针对内窥镜聚焦困难的问题，设计了自聚焦结构内窥镜头，通过内置支撑脚，可以在不增加内窥镜镜头直径的基础上，实现内窥镜自聚焦及变焦，进而获得更稳定清晰的光谱结果，并实现对病灶的三维扫描检测。本发明有效结合了拉曼测量与内窥镜检测，且提出了增强信号、消除荧光及自动聚焦的方法，可在不增加内窥镜尺寸的前提下，实现体内原位无损伤病理诊断，在医疗检测领域有广泛的应用前景。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种双波长增强型拉曼内窥式无创病理检测装置，其特征在于，包括：
光源模块，所述光源模块包括发出白光的白光光源、发出第一波长激光的第一激光光源、发出第二波长激光的第二激光光源；
成像模块，所述成像模块包括内窥镜镜头、光纤束、图像传感器、光栅和信号采集系统；
所述内窥镜镜头包括物镜、信号增强装置和至少三个可伸缩支撑脚；所述物镜用于将所述光源模块发出的光聚焦于待测样品，并收集反射光或散射光信号；所述信号增强装置用于增强所述待测样品的拉曼光谱信号；所述可伸缩支撑脚用于实现所述内窥镜镜头自聚焦及变焦，至少三个所述可伸缩支撑脚同时完全伸出至内窥镜镜头外部时组成的平面为内窥镜物镜焦平面，当至少三个所述可伸缩支撑脚完全伸出抵住所述待测样品后，待测样品表面与所述内窥镜物镜焦平面重合，所述内窥镜镜头实现自聚焦，在完成自聚焦测量后，缩短所述可伸缩支撑脚的伸出长度，使所述内窥镜镜头相比自聚焦位置更接近所述待测样品表面，物镜焦点进入所述待测样品内部，改变所述可伸缩支撑脚的伸出长度，实现变焦，实现沿所述待测样品深度方向的扫描检测；
所述光纤束包括光源光纤束和收集光纤束，所述光源光纤束一端为第一可切换接口，分别连接所述白光光源、所述第一激光光源和所述第二激光光源，另一端连接至所述内窥镜镜头的物镜；所述收集光纤束一端连接至所述内窥镜镜头的物镜，另一端为第二可切换接口，分别连接所述图像传感器和所述光栅；
所述图像传感器用于接收反射光信号，得到所述待测样品表面的光学显微镜图像；
所述光栅前放置组合滤波片，所述光栅用于接收散射光信号，所述光栅后连接所述信号采集系统，用于接收所述待测样品的拉曼光谱信号；
光谱分析模块，用于对探测得到的拉曼光谱信号进行分析处理，并消除拉曼光谱信号中的荧光影响；
人工智能病理分析模块，用于将消除荧光后的拉曼光谱信号与不同病理条件的光谱特征判据进行比较，根据比较结果对所述待测样品进行判断。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述组合滤波片包括第一滤波片和第二滤波片，所述第一滤波片用于消除所述第一激光光源激发的瑞利散射，所述第二滤波片用于消除所述第二激光光源激发的瑞利散射，所述组合滤波片包括但不限于截止滤波片和陷波滤波片。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述光谱分析模块具体用于，对探测到的拉曼光谱进行标准化处理，对标准化处理后的所述第一激光光源和所述第二激光光源激发的光谱信号求差值，得到消除荧光影响的拉曼光谱信号。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，至少三个所述可伸缩支撑脚及所述信号增强装置均为可伸缩部件，伸缩程度可调节，伸缩原理包括但不限于电磁铁通断电、形状记忆合金电加热变温。
5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述信号增强装置利用表面增强方法时，所述信号增强装置为送水喷嘴，打开所述信号增强装置时，送水喷嘴中喷出纳米颗粒至所述待测样品表面，以实现表面增强拉曼散射测量，所述纳米颗粒材质包括但不限于金纳米颗粒、银纳米颗粒，所述纳米颗粒尺寸大于15nm。
6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述信号增强装置利用针尖增强方法时，所述信号增强装置为增强型探针针尖，增强型探针针尖表面镀有粗糙度小于百纳米的金属，打开所述信号增强装置时，增强型探针伸出并靠近所述待测样品表面，实现针尖增强拉曼散射测量，针尖表面镀层金属包括但不限于金或银。
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