CN112843031A - 普萘洛尔在促进成骨分化和早期种植体骨整合中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物医药技术领域,为解决目前普萘洛尔在骨代谢中的影响以及其调控机制没有研究,普萘洛尔在骨代谢中无法得到很好的应用,提供一种普萘洛尔在促进成骨分化和早期种植体骨整合中的应用。普萘洛尔在促进成骨细胞OBs增殖,抑制骨髓间充质干细胞MSCs的增殖,增强OBs和MSCs的成骨分化,增强种植体的骨整合中的应用。普萘洛尔有效促进种植体在体内的骨整合,促进OBs增殖,抑制MSCs增殖,增强OBs和MSCs的成骨分化。普萘洛尔提高BMP2、RunX2、COL‑1和OCN在组织和细胞中的mRNA和蛋白表达,降低β2‑AR的表达。为普萘洛尔的应用和调节机制提供了新的见解。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及普萘洛尔在促进成骨分化和早期种植体骨整合中的应用。
背景技术
骨组织的缺陷和畸形,影响患者的日常沟通,甚至影响患者的正常功能。一些严重病例的后果会导致患者的精神障碍。以前的治疗选择包括骨移植(自体或异体骨移植),以及骨替代材料的应用。不幸的是,这些方法也会产生额外的问题,即排斥反应、高手术成本、有限的骨源、严重的创伤和复杂的手术,难以在临床应用中推广。骨新陈代谢形成由骨形成和骨吸收两个基本过程组成,导致骨形成和骨量减少,而β受体阻滞剂普萘洛尔的应用产生相反的效果。
由于交感神经对骨重塑和骨愈合的影响是复杂和广泛的,其机制尚不清楚。然而,交感神经阻滞剂普萘洛尔对骨代谢的影响主要处于动物实验阶段。很少有报道表明普萘洛尔对成骨细胞(OB)增殖和破骨细胞(OC)骨吸收的影响及其机制。
来自骨髓间充质干细胞(BMSCs)的OB在骨形成过程中是必不可少的,它在骨形成过程中产生骨基质,并释放多种生物活性物质来调节和控制自身和OC的功能。交感神经刺激增加骨吸收,抑制骨形成,其机制与β2-肾上腺素能受体在成骨细胞上的活性密切相关。
文献《Graewin S.J.,Kiely J.M.&Lu D.et al.,"Leptin regulatesgallbladder genes relatedto gallstone pathogenesis in leptin-deficient mice,"J Am Coll Surg,Vol.206,No.3(2008),pp.503-510.》,公开了:通过RT-PCR和Northern印迹杂交技术证实了成骨细胞上存在β2受体,在OB中没有检测到其他亚型的肾上腺素受体。
β2受体阻滞剂是治疗高血压和心血管疾病的常用药物。然而,最近的研究表明,β2受体阻滞剂在骨组织中的影响。在动物实验中,肾上腺素受体激动剂可以促进小鼠的骨吸收。β受体激动剂的系统应用可减少骨形成和骨量,而普萘洛尔作为β受体阻滞剂,则产生相反的效果。尽管如此,普萘洛尔对OB和MSC的影响和调控机制还没有得到充分的探索。
发明内容
本发明为了解决目前普萘洛尔在骨代谢中的影响以及其调控机制没有研究,普萘洛尔在骨代谢中无法得到很好的应用,提供了一种普萘洛尔在促进成骨分化和早期种植体骨整合中的应用。
本发明由如下技术方案实现的:一种普萘洛尔在促进成骨分化和早期种植体骨整合中的应用,所述普萘洛尔在促进成骨细胞OBs增殖,抑制骨髓间充质干细胞MSCs的增殖,增强OBs和MSCs的成骨分化,增强种植体的骨整合中的应用。
进一步的,所述普萘洛尔在提高BMP2、RunX2、COL-1和OCN在组织和细胞中的mRNA和蛋白表达,同时降低β2-AR的表达中的应用。
更进一步的,所述普萘洛尔的浓度为1mg/kg、或10mg/kg。
优选,所述普萘洛尔的浓度为1mg/kg。
本发明探讨了β-AR阻滞剂普萘洛尔对细胞水平动物模型成骨的影响。结果表明,普萘洛尔能促进种植体的骨整合,增强MSCs和OBs的成骨分化。普萘洛尔可促进骨代谢和骨形成,提高其疗效。
本发明表明普萘洛尔可提高BMP2、RunX2、COL-1和OCN在组织和细胞中的表达,同时降低β2-AR的表达。这一结果也为普萘洛尔的调节机制提供了新的思路。
目前关于不同浓度下普萘洛尔对成骨作用的作用及其作用机制的研究仍存在争议。本发明实验说明:中(1mg/kg)、高(10mg/kg)浓度相较于低(0.1mg/kg)浓度下的普萘洛尔对成骨作用的促进作用显著增强(p<0.01),但高浓度组并未表现出比中浓度组更佳的成骨效果(p>0.05)。这能够给临床上药物的应用带来指导作用。
本发明表明,β受体阻滞剂普萘洛尔通过调节成骨相关蛋白BMP2、RunX2、COL-1、OCN和β2-AR的表达,促进OBs和MSCs的成骨分化,增强种植体的骨整合。有望为普萘洛尔的应用和调控机制提供新的见解。
附图说明
图1为普萘洛尔促进种植体的骨整合。图中:A为新西兰兔种植体股骨干骨折模型的制备;B为对照组和普萘洛尔组骨结合的X线检查,分别为0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg;C为QPCR检测各组BMP2、RunX2、COL-1和OCN的表达;D为WB检测各组BMP2、RunX2、COL-1和OCN的表达;#,p<0.05;#,p<0.01;
图2为普萘洛尔抑制MSCs增殖,促进OBs增殖。图中:a为在msc中检测不同处理后荧光检测图;b为在msc中检测不同处理后edu百分比统计图;c为在ob中检测不同处理后荧光检测图;d为在ob中检测不同处理后edu百分比统计图;e为流式检测msc增殖情况图;f为流式检测ob增殖情况图;
图3为普萘洛尔抑制MSCs的迁移,促进OBs的迁移;图中:A、B为细胞划痕试验检测不同浓度普萘洛尔处理后MSC迁移效率,分别在0、24和48h(200×拍摄图像,测量划痕面积,其中:A为200×拍摄图像,B为测量划痕面积统计图;C、D为细胞划痕试验检测不同浓度普萘洛尔处理后OB迁移效率;其中:C为200×拍摄图像,D为测量划痕面积统计图;
图4为普萘洛尔促进MSCs和OBs的成骨分化;图中:A为茜素红染色检测MSC的成骨分化;B为MSC中钙含量的测定;C为MSC中ALP活性的测定;D为茜素红染色测定OB的成骨分化;E为OB中钙的测定;F为OB中ALP活性的测定;
图5为普萘洛尔对成骨相关基因的调控作用;图中:A为免疫荧光检测MSC中BMP2的表达;B为免疫荧光检测MSC中RunX2的表达;C为免疫荧光检测MSC中COL-1的表达;D为免疫荧光检测MSC中OCN的表达;A-D图,从左到右分别是所检测的蛋白、DAPI(染核)、Merge(蛋白和DAPI的合并图);E为免疫荧光检测OB中BMP2的表达;F为免疫荧光检测OB中RunX2的表达;G为免疫荧光检测OB中COL-1的表达;H为免疫荧光检测OB中OCN的表达;放大200×;
图6中:A-D分别是免疫荧光检测BMP2、RUNX2,COL-1,OCN的表达量。E-H为各指标的平均荧光强度统计图。每个指标检测了对照、0.1、1、10μM四个组的表达情况,A-D图,从左到右分别是所检测的蛋白、DAPI(染核)、Merge(蛋白和DAPI的合并图);
图7为qPCR和WB检测MSC和OB中BMP2,RunX2,COL-1,OCN和β2-AR。A,WB检测MSC中BMP2,RunX2,COL-1,OCN和β2-AR蛋白表达量;B,qPCR检测MSC中BMP2,RunX2,COL-1,OCN和β2-AR mRNA表达量;C,WB检测OB中BMP2,RunX2,COL-1,OCN和β2-AR蛋白表达量;D,qPCR检测OB中BMP2,RunX2,COL-1,OCN和β2-AR mRNA表达量。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例;基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
1、种植体骨整合模型的建立
本实验动物严格按照青岛大学附属医院伦理委员会的规定进行。健康雄性新西兰白兔5-6个月,体重约3.5kg,随机分为对照组、低剂量普萘洛尔组(0.1mg/kg)、中剂量普萘洛尔组(1mg/kg)和高剂量普萘洛尔组(10mg/kg)。
普萘洛尔组皮下注射,术前将普萘洛尔靠近手术部位,对照组连续28天给予等量生理盐水。随后在兔胫骨干骺端接受常规手术腔准备,并使用植入机插入直径为3.4mm的纯钛种植体。一个在左后腿,另一个在右后腿,长度分别为8mm。术后第1天至第3天,每组兔皮下注射盐酸丁丙诺啡(0.03mg/kg)和多西环素(3.2mg/kg),术后均愈合良好。植入后皮下注射普萘洛尔28天。在X线检查后,处死各组家兔,取出完整的胫骨组织进行后续实验。
2.骨髓间充质干细胞BMSCs的提取
将两只实验兔脱颈,置于75%酒精中15min。无菌条件下将兔的胫骨和股骨分离,放入PBS溶液中。立即取出结缔组织和骨膜,用无血清DMEM培养液冲洗髓腔,并将其转移至含有15%血清DMEM的离心管中。冲洗至髓腔变白,1000r/min超声振摇5min,弃上清液,加入含15%FBS的H-DMEM制备细胞悬浮液。细胞悬浮液吹匀后种植入培养瓶内,24h后更换新培养液。每2至3天更换新培养液一次。
3.茜素红染色鉴定
体外培养的BMSCs和OBs的完整培养基均含有50nM异丙肾上腺素,用于模拟交感神经的作用。将提取的BMSCs在完整培养基中培养24h后,用含有50nm异丙肾上腺素和普萘洛尔的的成骨分化培养基替换培养7天,随后进行矿化结节染色-茜素红染色。
染色具体步骤如下:丢弃原培养基,用PBS溶液进行三次洗涤,然后用4%多聚甲醛溶液固定20min。最后用PBS溶液冲洗干净,用0.1%茜素红色染料37℃下补充染色30min,然后用自来水冲洗,镜检。
4.碱性磷酸酶(ALP)染色
3周后,将细胞接种到培养皿中,按试剂盒说明书配置所需试剂,倒掉原培养基,用固定培养基固定标本3min;然后将底物溶液加入培养皿中,疏水膜覆盖,37℃烘箱中黑暗孵育15min,然后冲洗干净。最后,加入染料染色3min,自来水冲洗样品,镜检。
5.细胞增殖受EDU的影响
1×107细胞接种于6孔板中培养。细胞培养过夜后,在终浓度为10μM时加入EDU,再孵育2小时,取出培养基;室温下用1ml 4%多聚甲醛的固定液固定细胞15min。取固定培养基后,每井加入洗涤液1ml,每次3-5min,对细胞进行3次洗涤;然后用内源性过氧化物酶阻断液在室温下孵育20分钟,使内源性过氧化物酶失活。然后用洗涤液冲洗细胞3次,每次2分钟。
6.流式细胞术对细胞增殖的影响
密度为1.5×105/mL的细胞接种于直径为35mm的培养皿中1天。在含有0.4%FBS的培养基中同步3天,使大部分细胞进入G0期。加入1.0mg/mL的BrdU储存液,使其终浓度为0.03μg/mL,37℃下孵育40min,弃去培养基。细胞收集到流动管中,1000r/min下离心5min,弃去上清液。每管用1m l4%多聚甲醛固定15min,2000r/min离心10min,弃去上清液。每管加入2mL甘氨酸,水清洗后加入1mL 0.5%的Triton,孵育10min。然后用PBS洗涤3次,每次,1000r/min下离心5min,细胞重新悬浮,用流式细胞仪检测。
7.q PCR检测
用TAKARA试剂盒进行逆转录反应,反应体系为RNA,2.2μg;寡糖T,2μL;dNTP,4μL;5×缓冲液,4μL;反转录酶,1μL;RNA酶抑制剂,0.5μL;RNA酶双蒸水,20μL。反应条件为25℃5min,50℃15min,85℃5min,4℃10min。
按照青岛生物技术公司的QPCR试剂盒的说明书进行QPCR实验。反应体系为正向引物,0.4μL;反向引物,0.4μL;SYBR绿色,10μL;H2O,5.2μL。反应条件为50℃2min,95℃10min,95℃30sec,60℃30sec,循环40次。
使用的引物如下:BMP2-F:5‘-TGGAAGGGCCCATTTAGAG-3’,
BMP2-R:5’-GC TTTT CTCTGTGTGGAGC-3’;
运行X2-F,5‘-TTACCTACACCCC GCCAGTC-3’;
运行X2-R,5‘-TGCTGGTCTGGAAGGGTCC-3’;
科尔-1-f,5‘-ggcttcagtggttggatg-3’,
col-1-r,5’-caccaacagcaccatcgtta-3’;
OCN-f,5’-gctctgtctctctcacaca-3’;
ocn-r,5’-ccctcctgctggacatgaa-3’;
β2-AR-F,5′-GATCAAGCTTATGGGGCAACCCGGGAACGGCAGC-3′,
β2-AR-R,5‘-gatcgtcgaccagcagtagataa gggg attg-3’。
8.westernblot检测蛋白质表达水平
在从肾脏组织中提取总蛋白后,用SDS-PAGE凝胶分离蛋白质,分别孵育抗BMP2、RunX2、COL-1、OCN和β2-AR抗体,并孵育相应的二次抗体。随后通过ECL发光检测蛋白带。使用的抗体如下:BMP2(稀释1:500,BM19970,IGEE,中国),RunX2(稀释1:500,BM16360,IGEE,中国),COL-1(稀释1:500,BM2319,IGEE,中国),OC N(稀释1:500,BM18692,IGEE,中国),β2-AR(稀释1:500,BMP0265,IGEE,中国)和β-肌动蛋白(稀释1:2000,BMC026,IGEE,中国)。HRP山羊抗兔IgG(稀释1:2000,BMS014,IGEE,中国)。
9.免疫荧光检测
将4μm厚度的石蜡切片60℃烘烤2h,脱蜡,用二甲苯和酒精水化。切片置于柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中进行抗原修复,在微波炉中加热20min,保持原状自然冷却至室温。PBS洗涤3次,每次5min。采用5%BSA阻断30min。加入一次抗体,4℃放置过夜。用PBS洗涤3次,复温30min,每次5min。加入相应的二次抗体(,室温孵育1h,用PBS洗涤3次,每次5min。用DAPI在黑暗中孵育5-10min。PBS洗涤3次,每次1min。切片在荧光显微镜下进行阻断,观察,拍照。使用的抗体如下:BMP2(稀释1:100,BM19970,IGEE,中国),RunX2(稀释1:100,BM16360,IGEE,中国),COL-1(稀释1:100,BM2319,IGEE,中国),OC N(稀释1:100,BM18692,IGEE,中国)。HRP山羊抗兔IgG(稀释1:1000,BMS014,IGEE,中国)。
10.统计分析
用SPSS23.0软件对实验数据进行统计分析。测量数据以平均±标准差(x±s)表示,同一组治疗前后采用配对T检验。方差分析进行组间比较。其中P<0.05被认为差异显著,P<0.01被认为差异极显著。
实验结果
1.普萘洛尔可促进种植体的骨整合
在新西兰白兔中建立了种植体骨整合模型,并向家兔注射不同剂量的普萘洛尔(0.1mg/kg,1mg/kg,10mg/kg)。术后14天,用X线检查骨组织与种植体结合和骨组织吸收情况。结果如图1a、b所示,结果表明,种植体与骨组织的联合优于对照组,注射普萘洛尔后,种植体与骨组织的联合效应以与普萘洛尔剂量无关的方式增加。
采集种植体附近的骨组织样品,用qPCR检测BMP2、RunX2、COL-1、OCN和β2-AR的mRNA表达。检测结果如图1c、d,结果表明,普萘洛尔可提高BMP2、RunX2、COL-1和OCN的mRNA表达,降低β2-AR的表达。用westernblot检测BMP2、RunX2、COL-1、OCN和β2-AR的蛋白表达,结果与qPCR一致。
2.普萘洛尔抑制MSCs的增殖,促进OBs的增殖
为阐明普萘洛尔对MSCs和OBs增殖的影响,体外培养MSCs和OBs。在含有异丙肾上腺素的完整培养基条件下,加入不同浓度的普萘洛尔孵育24小时,用EDU染色检测细胞增殖。结果如图2a、b所示,结果表明:在MSCs中,随着普萘洛尔的加入,EDU的阳性率显著下降,10μM普萘洛尔组EDU的阳性率最低,表明普萘洛尔抑制MSCs的增殖。如图2c、d所示,在OBs中,添加普萘洛尔可促进细胞增殖,0.1μM普萘洛尔可显著提高OBs中EDU的阳性率,1μM和10μM普萘洛尔组EDU的阳性率接近。上述结果表明,普萘洛尔抑制MSCs的增殖,促进OBs的增殖。
3.普萘洛尔抑制MSCs的迁移,促进OBs的迁移
然后通过细胞划痕试验检测普萘洛尔对细胞迁移的影响,并分别在24小时和48小时观察划痕愈合情况。试验结果表明,当普萘洛尔加入到含有异丙肾上腺素的完整培养基中时,MSCs在体外培养的MSCs和OBs中的迁移受到抑制。此外,划痕的愈合速度明显慢于对照组,浓度越高,划痕的愈合速度越慢(图3A-3B)。相反,普萘洛尔可以提高OBs中划痕的愈合率,细胞迁移程度高于对照组(图3C-3D)。这些结果提示普萘洛尔抑制MSCs迁移,促进OBs迁移。
4.普萘洛尔促进MSCs和OBs的成骨分化
为了阐明普萘洛尔对MSCs和OBs成骨分化的影响,在体外培养的MSCs和OBs中,将不同浓度的普萘洛尔补充到含有异丙肾上腺素的成骨分化培养基中。诱导7天后,用茜素红染色检测细胞成骨分化。有趣的是,我们发现普萘洛尔可以促进MSCs和OBs的成骨分化,并在诱导后增加细胞内钙结节。普萘洛尔处理细胞的钙含量和ALP活性明显高于对照组(图4A-4F)。
5.普萘洛尔对成骨相关基因的调控作用
接下来,为了阐明普萘洛尔调节MSCs和OBs的成骨机制,我们通过免疫荧光检测了成骨相关基因BMP2、RunX2、COL-1、OCN和β2-AR的表达。结果表明,普萘洛尔可提高BMP2、RunX2、COL-1和OCN的蛋白表达,并以剂量依赖性的方式降低β2-AR的表达(图5A-5H)。的qPCR和westernblot结果与免疫荧光结果一致,表明普萘洛尔可以上调成骨基因的表达,促进MSCs和OB的成骨分化(图6A-6D)。
早期快速骨整合被认为是成功植入的关键,但它受到材料表面本身的生物惯性、高弹性模量和有限的生物效应的限制。因此,如何提高钛种植体的性能,促进和加速骨结合仍是近年来许多学者关注的焦点。虽然钛和钛合金种植体在医学领域取得了巨大的成功,但感染和骨整合不良仍然是种植体手术失败的两个主要原因。除了改善种植体材料外,通过药物辅助方法改善种植体早期骨整合具有很大的潜在价值。
交感神经系统作为人体自主神经系统的一个组成部分,在调节生命活动和身体稳态方面起着至关重要的作用。越来越多的证据表明,交感神经系统参与了骨重塑的过程。骨组织交感神经调节的组织学基础在于其对骨组织和骨细胞的神经支配。相关实验证明了交感神经纤维在骨和骨膜上的存在。现有技术表明:通过组织化学和荧光电镜观察兔骨组织,发现骨内血管表面覆盖着丰富的肾上腺素能神经纤维。成熟大鼠的骨组织中存在交感神经,用免疫组织化学染色观察交感神经中存在NE和神经肽Y。指出了交感神经的分布特征,即交感神经纤维大多位于血液流动丰富的骨髓腔中,而骨膜中的交感神经纤维较少。研究证实,瘦素可以调节骨形成和骨吸收,瘦素的这种作用是通过交感神经实现的。交感神经兴奋时,可促进骨吸收,减少骨形成。这种作用取决于成骨细胞表面的β2-肾上腺素能受体。免疫荧光技术β2受体位于人成骨细胞表面。此外,还发现β2受体激动剂能抑制成骨细胞的增殖。
普萘洛尔被公认为治疗高血压的药物,是治疗心血管疾病的首选药物之一。近年来,普萘洛尔对骨代谢的影响逐渐引起学者们的关注。现有报道表明:普萘洛尔治疗9周的外科骨折大鼠的矿物质沉积和骨形成增加。小剂量普萘洛尔在治疗骨质疏松症方面具有明显的优势。一些流行病学研究还表明,β2-AR阻滞剂是治疗骨质疏松症和骨折的潜在候选药物。
本发明探讨了β-AR阻滞剂普萘洛尔对细胞水平动物模型成骨的影响。结果表明,普萘洛尔能促进种植体的骨整合,增强MSCs和OBs的成骨分化。普萘洛尔可促进骨代谢和骨量,提高其疗效。
本发明表明普萘洛尔可提高BMP2、RunX2、COL-1和OCN在组织和细胞中的表达,同时降低β2-AR的表达。这一结果也为普萘洛尔的调节机制提供了新的思路。
目前关于不同浓度下普萘洛尔对成骨作用的作用及其作用机制的研究仍存在争议。本申请实验说明:中(1mg/kg)、高(10mg/kg)浓度相较于低(0.1mg/kg)浓度下的普萘洛尔对成骨作用的促进作用显著增强(p<0.01),但高浓度组并未表现出比中浓度组更佳的成骨效果(p>0.05)。这能够给临床上药物的应用带来指导作用。
本发明表明,β受体阻滞剂普萘洛尔通过调节成骨相关蛋白BMP2、RunX2、COL-1、OCN和β2-AR的表达,促进OBs和MSCs的成骨分化,增强种植体的骨整合。有望为普萘洛尔的应用和调控机制提供新的见解。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (4)
1.一种普萘洛尔在促进成骨分化和早期种植体骨整合中的应用,其特征在于:所述普萘洛尔在促进成骨细胞OBs增殖,抑制骨髓间充质干细胞MSCs的增殖,增强OBs和MSCs的成骨分化,增强种植体的骨整合中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种普萘洛尔在促进成骨分化和早期种植体骨整合中的应用,其特征在于:所述普萘洛尔在提高BMP2、RunX2、COL-1和OCN在组织和细胞中的mRNA和蛋白表达,同时降低β2-AR的表达中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的一种普萘洛尔在促进成骨分化和早期种植体骨整合中的应用,其特征在于:所述普萘洛尔的浓度为1mg/kg、或10mg/kg。
4.根据权利要求3所述的一种普萘洛尔在促进成骨分化和早期种植体骨整合中的应用,其特征在于:所述普萘洛尔的浓度为1mg/kg。
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