CN112840203A - 用有限体积阵列进行样品细胞表型评估的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的特定实施方案涉及通过记录和解释时间依赖性信号来评估和识别细胞，所述时间依赖性信号由分离的活细胞的独特细胞呼吸和渗透性属性产生。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年6月13日提交的美国临时专利申请序列第62/684736号和2018年10月18日提交的第62/747309号，每一个都通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开一般涉及细胞生物学和微生物学，更具体地涉及用于快速且灵敏地进行细胞表型评估的组合物和方法，以及它们对化合物和/或治疗的表型响应的快速且灵敏的表征。
背景技术
在各种情况下，发现致病细胞(DCC)的量低于常规分析技术的检测限。因此，根据应用，用于识别DCC和表征它们对治疗的响应的方法通常需要靶细胞的增殖和/或靶细胞的分子内容物和/或产物的靶依赖性扩增。
与其他技术相比，由于具有高灵敏度，核酸扩增(例如，基于PCR)测试(NAT)已成为快速病原体识别的优选方法。使用PCR可在数小时内将DNA从单拷贝扩增至数十亿拷贝。
NAT需要复杂的样品工作流程步骤，其通常包括细胞裂解，然后是核酸浓缩步骤，该步骤也从样品中去除PCR抑制剂。细胞裂解造成在核酸提取效率要求的不对称性。例如，与革兰氏阴性细菌相比，分枝杆菌和真菌具有非常厚的细胞壁，因此更难溶解，通常需要机械裂解步骤以有效破坏它们的细胞壁。因此，利用简单化学裂解方法的NAT通常对这些更棘手的病原体缺乏敏感性。此外，细胞裂解试剂可以抑制PCR反应，因为试剂使蛋白质变性，并且PCR利用蛋白质进行扩增反应。因此，细胞裂解需要引入高效洗涤步骤以从提取的核酸中去除裂解试剂。此外，NAT需要昂贵的分析开发方法，因为它们依赖于必须对每个靶特别设计的病原体特异性报告分子(引物和探针)。因此，每个NAT必须包括昂贵的分子研发过程，其涉及引物/探针设计和每个靶的筛选。
包含两个或多于两个靶的NAT(多重)无法准确并精确地同时量化这些靶。这是因为报告分子种类之间相同的非特异性相互作用引起PCR信号输出的变化，并且定量PCR依赖于可重复的反应结果，以将产生的扩增曲线与初始目标浓度相关联。这是明显的限制，因为它限制了使用多重NAT诊断产生大部分感染的身体非无菌感染区域的感染。在身体非无菌区域，人们通常被可以引起感染的相同病原体定植。因为感染是由压垮身体防御的微生物引起的，所以它们将通常产生比共生菌更多的菌落分离株。因此，在非无菌感染位点，临床样品中存在的病原体的数量(病原体负荷)决定细菌种类是引起感染还是“平静地”定殖于该位点。例如，为了明确诊断来自下呼吸系统(例如支气管肺泡灌洗液(BAL))的肺炎感染源，样品中存在的任何细菌的病原体负荷必须超过103CFU/mL才能被认为是感染源。类似地，对于尿液样品，阈值为105CFU/mL。
此外，如果NAT测定包括多于一种目标(多重测定)，需要多于一种报告分子种类(引物和/或探针对)，则不同的靶和/或报告分子种类可以与彼此非特异性相互作用，当报告分子非特异性地对抗其他试剂扩增时，导致假阳性，或当靶扩增反应被与另一种类的非特异性相互作用抑制时，导致假阴性。因此，这限制了在单个NAT内可以识别的靶的数量。这与耐药性问题特别相关，因为在革兰氏阴性细菌和分枝杆菌的情况下，存在许多指示耐药性的突变(每个突变是靶)。NAT只能在一次测试中检测这些突变的一小部分。此外，存在于生物体基因型中的基因可能并不总是呈现表型。因此，基因型信息通常描绘了病原体表型响应的不准确或不完整的图像。例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)通常不表达赋予耐药性的mecA基因。因此，当涉及引起感染的病原体是否对特定药物敏感的临床重要确定时，NAT的临床有效性低，因为这些测试只能检测能够带来抗菌剂耐药性的小部分基因突变并且根本不能解释表观遗传耐药性机制。
还必须使NAT工程化，以检测充分理解的遗传耐药性标记。然而，在由抗菌药物引入的选择性压力下，微生物不断进化出新的耐药性机制。通过依赖随时间改变的信息(基因型)，随着微生物进化出新的耐药性机制，NAT变得更不准确。为了跟上从根本上改变的抗菌剂耐药性局面，必须研究和理解新耐药性机制，并且必须开发新NAT和必须清除进入临床的监管障碍。这昂贵的过程会持续数年。
表型抗菌剂易感性测试(AST)仍然是用于诊断微生物感染的黄金标准，因为它测量了表型微生物对考虑用于治疗的抗菌药物响应，并且因此依赖于直接转化为所需临床反应的功能终点。AST是表型的，包括所有耐药性机制，因此提供了高的临床有效性。
AST实现了最低抑制浓度(MIC)的测定，其对应于明显抑制微生物生长所需的微生物药的最低浓度。因为不同微生物具有不同的固有特征，所述固有特征会影响其针对给定抗菌药物的所观察到的响应，因此仅凭MIC无法告知临床医生病原体对抗生素是否敏感或耐药。例如，苯唑西林的MIC为2μg/mL，表明如果病原体是金黄色葡萄球菌(其因此对苯唑西林治疗有响应)时对苯唑西林的敏感性，和如果病原体是表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(其因此对治疗无响应)时对苯唑西林的耐药性。为了解释任意的AST结果，需要进行病原体身份识别(ID)。
如果多种病原体存在于同样的测试中，则无法准确执行AST，因为物种之间的微生物生长是不可区分的，并且不能具体测量物种的抗生素响应。此外，在抗菌药物的选择性压力下，可以提高资源的竞争，模糊抗菌剂本身的影响。这特别重要，因为大部分细菌感染发生在经常充满细菌的身体区域。对于非无菌位点的感染，识别并分离引起感染的细菌(病原体)是重要的，所述细菌来自“平静地”存在于感染位点的那些(共生菌)。这防止了样品在液体肉汤培养基中的培养，所述液体肉汤培养基使用起来更简单，并且通常会加速微生物的生长。相反，需要定量或半定量培养，其通过将样品以不同浓度铺展在培养皿上来实现，以在板上的某些点上，微生物将在单个物种的独立菌落中生长。平板划线还允许实验室技术人员对以一定浓度存在的视觉上可区分的菌落进行计数，以确定样品中的微生物是否具有侵入性。由不同物种形成的菌落可以在视觉上互相区分并进行计数。实验室技术人员还可以手动提取完全由相同的物种组成的病原体菌落用于进一步测试。因此，定量/半定量培养过程不仅产生随后AST所需的大量细胞，还确保被测试的细菌是同质的并且是引起感染的那些(病原体)。
然而，定量/半定量培养是高度主观并容易出错的，需要高技能技术人员来决定在随后的测试中排除或包括哪个菌落。多种微生物感染特别具有挑战性。通常，其中一种感染病原体是挑剔的生物体(具有复杂的营养需求并一般只生长在特定条件下的生物体)或缓慢生长的生物体，另一种则不是。不挑剔的/生长较快的生物体通常会淹没培养板上的挑剔的/生长较慢的生物体，并隐藏它在样品中的存在。
因为AST需要前期的培养生长步骤，以产生对用于治疗的候选药物进行评估所需的大量细胞，在培养皿上孵育一天至五天可以使微生物群体从患者样品中存在的数量增长到AST所需的数量，这对于有效引导抗生素治疗决策来说是非常慢的，特别是对于严重的细菌感染。
因此，仍然需要用于以快速和/或有效方式识别和表征样品中的细胞的其他方法和装置。
发明内容
可使用可以在一次性测试盒上自动进行和执行的集成工作流和分析实行本文所述的方法和/或装置/系统的某些方面，所述一次性测试盒提供集成测试而无需利用一个或多于一个试剂盒以在分析前进行样品制备。本文所述的组合物和方法解决了与用于评估样品和患者的所得诊断或预后的当前方法相关的各种问题。某些实施方案涉及解释由例如分离细胞的独特细胞代谢、呼吸、生长和/或渗透性属性产生的时间相关信号的方法和研究。如本文所用，代谢是指细胞内的一组维持生命的化学转化或过程。代谢的三个主要目的是将食物/燃料转化为能量以运行细胞过程；将食物/燃料转化为蛋白质、脂类、核酸和一些碳水化合物的结构单元；以及消除含氮废物。本文提及的呼吸是细胞呼吸，在细胞或生物体中发生的一组代谢响应和过程将生物化学能从营养物转移到三磷酸腺苷(ATP)，然后释放废物。
在某些情况下，信号随时间的变化、“形状”或波形改变靶，或者信号随时间的变化、“形状”或波形对靶是独特的，而不是特异性结合用于生成信号存在或不存在结果的报告分子。因此，“系统”就像探针而不是单个报告分子或结合部分。
本文所述的方法产生了代谢、呼吸或反应物/试剂相互作用的概况，所述概况用于通过表征样品的细胞组成来评估样品。具体而言，正如该方法使用哺乳动物或微生物细胞独特的代谢、呼吸、渗透性和/或其他特征来区分不同的细胞种类和微生物种类一样，这些相同的特征可用于确定细胞或微生物是否对特定化合物、细胞毒性化合物或抗菌剂敏感，因为化合物或有效药物会改变细胞代谢、呼吸、渗透性或其他特征。
在某些方面，本发明的方法可以询问化合物或条件与细胞的相互作用，所述细胞是(i)用于确定化合物或条件的毒性的正常细胞，或(ii)用于确定化合物或条件的治疗功效的病原的或疾病相关的细胞。该方法可以解释所有耐药性机制，所述耐药性机质可以赋予特定细胞耐药性。并且因此提供了增强的临床有效性。
当前描述的方法以比其他方法显著更快的周转时间(<4小时至6小时)产生评估结果。速度的提高部分是通过在有限体积中实现快速信号集中来完成，所述有限体积比其他方法通常使用的毫升和微升体积小几个数量级。
在本文所述的方法中，将单个细胞或微生物分离或划分为单独的微滴或体积，使得定量成为简单事项，即对与表明特定细胞或微生物存在的信号相关的那些微滴或体积进行计数。信号随时间的形状或变化(例如，波形)是识别和表征所依赖的特征之一，与用于定量的方法正交——一种不影响另一种。因此，同时完成准确和精确的多重识别和量化。
某些实施方案涉及用于评估样品的方法，其包括：(a)将样品分为两个或多于两个子样品或样品部分，包含对照子样品和至少一个测试样品；(b)将每个子样品或样品部分与一种或多于一种试剂、一种或多于一种反应物、或一种或多于一种试剂和一种或多于一种反应物混合，形成不同的子样品或样品部分混合物；(c)将每个子样品或样品部分混合物分区至多个小体积区室，其中一些小体积区室含有一个细胞或一个细胞聚集体；(d)检测小体积区室的物理或化学特征随时间的变化并生成与每个区室相关的数据；(e)将数据作为输入信息传输到使用机器学习优化的至少一个函数。在特定方面，该方法包括(f)将数据作为输入信息传输到(i)至少一个神经网络和(ii)表征器，形成神经网络输出信息和表征器输出信息；(g)将神经网络输出信息传输到分类器并形成分类器输出信息；和(h)将表征器输出信息和分类器输出信息传输到第二神经网络，所述第二神经网络形成分析输出信息。样品可以是但不限于环境样品或生物样品。在某些方面，生物样品是患者样品。在某些情况下，患者是人类患者。生物样品可以是支气管肺泡灌洗液(BAL)、痰、唾液、尿液、血液、脑脊液、精液、粪便、拭子、刮除物、脓或组织。在某些方面，对照子样品不包含反应物和/或不包含试剂。在某些方面，将一个或多于一个子样品与试剂、反应物、或试剂和反应物混合。反应物可以是但不限于营养混合物、药物或生物制剂。反应物可以是报告分子或信号产生部分，例如荧光试剂或发光试剂。在某些方面，分析输出信息是临床终点的决定。临床终点可以是但不限于患者治疗成效、药物的最小抑制浓度、易感或耐药细胞、或预后。在某些方面，预后可以是或包括住院持续时间或对象的不良事件风险。
某些实施方案涉及用于评估样品的方法，其包括：(a)将样品分为两个或多于两个子样品或样品部分，包含对照子样品和至少一个测试样品；(b)将每个子样品或样品部分与一种或多于一种试剂、一种或多于一种反应物、或一种或多于一种试剂和一种或多于一种反应物混合，形成不同的子样品或样品部分混合物；(c)将每个子样品或样品部分混合物分区至多个小体积区室，其中一些小体积区室含有一个细胞或一个细胞聚集体；(d)检测小体积区室的物理或化学特征随时间的变化以及与每个区室相关的数据；(e)将收集的数据作为输入信息传输到(i)至少一个神经网络和(ii)表征器，形成神经网络输出信息和表征器输出信息；(f)将神经网络输出信息传输到分类器并形成分类器输出信息；和(g)将表征器输出信息、分类器输出信息、社区信息和患者信息传输到第二神经网络，所述第二神经网络形成分析输出信息。该方法还可以包括对照子样品。在某些方面，一个或多于一个子样品与试剂、反应物、或试剂和反应物混合。反应物可以是但不限于营养混合物或药物。试剂可以是但不限于荧光试剂或发光试剂。
某些实施方案涉及用于评估样品的方法，其包括：(a)将样品分为两个或多于两个子样品或样品部分；(b)将每个子样品或样品部分与一种或多于一种试剂和/或一种或多于一种反应物、或一种或多于一种试剂和一种或多于一种反应物混合，形成不同的子样品或样品部分混合物；(c)将每个子样品或样品部分混合物分区至多个小体积区室，其中一些小体积区室含有一个细胞或一个细胞聚集体；(d)监测小体积区室的特征随时间的变化并收集区室的数据；和(e)将收集的数据传输到至少一个神经网络。该方法还可以包括对照子样品。在某些方面，将一个或多于一个子样品与试剂、反应物、或试剂和反应物混合。反应物可以是但不限于营养混合物或药物。试剂可以是但不限于荧光试剂或发光试剂。
在某些方面，表征器可以包括从样品、有限体积、或分区、样品、子样品等的其他组分中收集或观察到的其他物理属性的数据或测量值的特征的各种分析、操作、处理或测定。例如，细胞对特定测试反应物的敏感性可以通过定量分区之间的差异来获得，所述分区包括与反应物接触的细胞和不与反应物接触的那些。这种差异反映在两个分区之间的差异上。与单个波形的分类不相关的任何信息包含在表征器中。表征器(CH)可以包含但不限于两个群体的总体统计数据，例如每个区室的平均强度。在某些情况下，针对测试样品(TS)和对照样品(CS)，N2使用分类器(CL)中的分类的波形和CH中的群体统计数据，以计算临床终点。表征器的输入信息和输出信息的非限制性实例包括但不限于输出信息：(i)分区中所有波形的平均最大信号，(ii)分区中所有波形的曲线下方面积；(iii)分区中所有波形的平均最大导数；(iv)当每个波形跨越分区中所有波形的特定阈值时的平均时间点；(v)一如以上，不同之处在于使用“中位值”而不是“平均值”；(vi)一如以上，不同之处在于使用归一化的波形，其中每个波形除以相同分区内阴性区室(没有细胞的区室)中波形在相同时间点的平均信号。
在某些方面，分类器(CL)基于其类目成员已知的观察结果训练集来识别来自单个区室的波形属于集合类别中的哪一个。输入分类器的信息的实例包括(i)原始波形和/或(ii)维度缩小的波形，除了以上输入的患者信息外，还有社区信息和/或成像数据。本发明的方法与基于监督学习的任意统计分类方法兼容，所述基于监督学习的任意统计分类方法包括神经网络、线性向量量化、线性分类器、支持向量机、二次分类器、决策树、核估计和元算法方法。某些方面使用一个或多于一个神经网络。
致病细胞(DCC)在本文中定义为宿主细胞，例如来自获取样品的宿主的恶性或疾病相关细胞(例如，癌细胞)、或获得性细胞(例如，真菌或细菌)，其包括关于、涉及、表明或指示疾病或病理学的任何微生物区系。这些疾病包括但不限于癌症和感染。
本文使用的术语“样品部分”或“分区”是指样品的一部分。一个样品可以被划分成多个分区或子样品体积。可以在不同或相似条件下分别加工、处理、操作和/或孵育每个分区。
如本文所用，术语“区室”是指流体(例如液体或气体)的体积，其为总体积(例如样品)的分离部分。可以将总体积分区至任何合适数量(例如，102个、103个、104个、105个、106个、107个等)的较小体积或区室。区室可以通过物理屏障或通过物理力(例如，表面张力、疏水排斥等)分开。由较大体积产生的区室可以在尺寸上基本均匀(单分散)或可以具有不均匀的尺寸(多分散)。区室可以通过任何合适的方式产生，包括乳液法、微流体法和微喷射方法。区室的一个实例是微滴。
如本文所用，术语“微滴”是指与其周围环境(例如，气体、液体、表面等)不混溶的小体积的液体。微滴可以存在于表面上，由与其不混溶的流体包封，例如连续相的乳液、气体或其组合。微滴在形状上通常为球形或基本上球形的形状，但可以是非球形的。可以通过沉积在表面上来改变另外的球形或基本上球形的微滴的形状。微滴可以是“简单微滴”或“化合物微滴”，其中一个微滴包封一个或多于一个另外的较小微滴。本文提供的微滴体积和/或一组微滴的平均体积通常小于约1微升，例如微滴体积可为约1μL、0.1μL、10μL、1μL、100nL、10nL、1nL、100fL、10fL、1fL，包括其间的所有值和范围。本文提供的微滴的直径和/或一组微滴的平均直径通常小于约一毫米，例如1mm、100μm、10μm至1μm，包括其间的所有值和范围。微滴可以通过任何合适的技术形成，包括乳化、微流体等，并且可以是单分散的、基本上单分散的(直径或体积相差小于5％)、或多分散的。
在本申请全文讨论本发明的其他实施方案。所讨论关于本发明的一方面的任何实施方案也可以应用于本发明的其他方面，反之亦然。本文描述的每个实施方案应理解为适用于本发明所有方面的本发明的实施方案。预期本文所讨论的任何实施方案可以针对本发明的任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可以用于实现本发明的方法。
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，要素前面不使用数量词可以表示“一个”，但是其也符合“一个或更多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意思。
在本申请中，术语“约”用于表明值包括用于确定值所用的装置或方法的误差的标准差。
在权利要求中使用术语“或”表示“和/或”，除非明确地说明是仅指选择或选择是相互排斥的，尽管公开支持仅指替代选项和“和/或”的定义。
如本说明书和权利要求所使用的，单词“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。
在以下讨论和权利要求中，术语“包括”和“包含”以开放式的方式使用，并且因此应该被解释为表示“包括但不限于......”。而且，术语“耦合”、“连接”或“指向”及其形式旨在表示间接或直接连接。因此，如果第一组分连接或耦合到第二组分，则连接可以通过直接连接或通过其他组分和连接物间接连接。
通过下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点会变得明显。然而，应该理解的是，详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的具体实施方案，但仅以说明的方式给出，因为本详细描述在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
为了更完整地理解本公开及其优点，现在参考以下结合附图的描述，其中：
图1表示用于快速表型诊断和筛选的一般概念。将单个细胞分区，以使得区室中可观察的变化代表所包封的细胞的功能特征。识别功能变化并用于对所包封的细胞进行分类。
图2表示将图1的一般概念并入所描述的方法中。用细胞试剂和细胞反应物使活细胞悬浮。将悬浮液分区至实时可观察的微微量级的区室。将每个区室观察到的变化记录为波形，所述波形可以被分类为关于所包封的细胞的有用信息。
图3示例性地表示将细胞悬浮液或样品分为多个区室。
图4(左)表示随时间采样和记录的可观察的区室信号。空区室将随时间产生可重复的背景信号。具有细胞的区室将产生实时变化，所述实时变化与由空微滴或由具有不同细胞表型的区室产生的变化不同；(右)记录的信号波形被馈送到分类函数中，在这种情况下是神经网络，其基于采样的波形将每个经分区的细胞分类。
图5表示采样和记录来自分区或子样品内的单个区室的表型波形并将所记录的波形馈送到深度神经网络中以进行分类的基本实施方案。底部是上述基本实施方案的示意图。
图6A-6C(6A)是本发明的一个实施方案的示意图，其利用多个分区或子样品的，每个分区或子样品具有其自身的反应物混合物以增加给定样品的表型变化或说明不同细胞类型的营养需要。该实施方案可以不含试剂，如以下更详细描述的；(6B)是与(6A)类似的实施方案的示意图，但是包含细胞试剂；(6C)是具有分区的实施方案的示意图，所述分区共享相同的细胞反应物但包含不同的细胞试剂。
图7A-7C是表明包括覆盖一个或多于一个分区的细胞反应物和细胞试剂的组合的方法示意图。
图8A-8B(8A)示意性地表明图6B的实施方案，其中细胞反应物是不同的营养混合物并且使用了单一细胞试剂；(8B)示意性地表明图7B的实施方案，其中细胞反应物是营养混合物并且细胞试剂是活力染料、荧光底物和发光底物的不同组合。
图9是用于评估细胞反应物在细胞种类上的影响的诊断测试的示意图。测试反应物(TR)仅存在于测试样品(TS)中，在其他方面测试样品与对照样品(CS)分区相同。N1是编码器，其将完整波形压缩成稀疏表示，然后通过CL分类。例如，表征器(CH)包含群体的总体统计数据例如每个区室的平均强度。针对TS和CS，N2使用CL中的分类波形和CH中的群体统计数据，以计算临床终点。
图10是实施方案的示意图，其中图9中的测试反应物是药物。这里N2利用CL中的分类波形和CH中的群体统计数据，以计算与处方药物相关的临床终点，所述处方药物与被测试细胞相互作用。使用机器学习，可以将神经网络训练至任意临床终点。
图11显示可以将对照和测试分区或子样品波形馈送至相同的N1、CH和CL，但将得到的统计数据馈送至预测器神经网络的单独的输入节点，从而允许对CS和TS中存在的变化进行详细比较。
图12是图10所述的多种药物的实施方案的实例示意图。
图13表示使用机器学习来用于优化诊断的方法，所述机器学习使用样品分区统计结合其他实验室结果、患者信息和社区信息，以达到最准确和最全面的诊断和预后。
图14是由照相机成像的微滴单层的图示和微滴单层的俯视图。微滴单层提供良好的热导率和温度控制。
图15表示使用剪切应力以用于微滴生成或使用拉普拉斯压力梯度以用于微滴生成。
图16显示了微滴单层中分离的细菌的可视化。
图17表示具有来自微滴阵列的多个波形的金黄色葡萄球菌(S.aureus)和克雷伯肺炎杆菌(K.Pneumoniae)之间的不同波形特征。波形清晰可辨。
图18显示了代表各种细菌种类的波形。
图19显示使用和不使用抗生素的金黄色葡萄球菌的0小时至2小时的时间推移图像。
图20表示来自病原体识别研究的结果的实例。
图21是80μm微滴的40X显微镜图像，所述微滴最初含有单个的克雷伯肺炎杆菌。在37℃培育超过12小时后，细菌在微滴中的生长几乎完全阻挡了光线透过微滴。
详细说明
以下讨论涉及本发明的各种实施方案。术语“发明”不旨在指代任何特定实施方案或以其他方式限制本公开的范围。尽管这些实施方案中的一个或多于一个可能是优选的，但是所公开的实施方案不应被解释或以其他方式用作限制本公开，包括权利要求的范围。另外，本领域技术人员将理解，以下描述具有广泛的应用，并且任何实施方案的讨论仅意在作为该实施方案的示例，而无意于暗示包括权利要求在内的本公开的范围限于该实施方案。
本发明的某些方面一般涉及用于使用单细胞分析的样品表征的方法。样品表征可以用于诊断环境或疾病状态或用于评估和表征样品中的细胞表型，例如药物敏感性或耐药性。以下章节讨论了用于通过样品或其子样品的区室化(即分区)来产生和分析细胞表型的方法的一般考虑。在某些方面，可以使用神经网络和其他数据分析方法来分析和表征不含试剂的信号、光学信号、发光信号、荧光信号或其他信号。
统计方法包括使用人工智能(AI)。AI可以用于分析和/或比较一个或多于一个样品以确定样品中的一种或多于一种细胞表型。在某些方面，细胞表型可以用于识别、诊断、预测或表征对象或来自对象的样品。可以针对任何临床终点例如患者恢复结果、最小抑制浓度、易感或耐药、预后，如住院时间、患者风险等优化该方法。
快速表型诊断和/或筛分的一般概念包括对单独的细胞或细胞聚集体进行分区，使得区室中可观察的变化表示经分区的细胞或所包封的细胞的功能特征。评估和/或表征细胞功能中的变化，并将该功能变化或表型用于细胞分类。
单细胞分区。由于有限扩散的环境，微微量级(pico-scale)(亚纳升)区室内的分区或包封彻底丰富了反应体积内细胞组分和产物的浓度，从而允许细胞输出比在典型的反应体积内更快地达到可探测的浓度。例如，500微微升反应体积中的单个细胞相当于毫升反应体积中的2百万个细胞。因此，分区允许比在常规体积中更快和更灵敏地观察获得细胞输出信息。
类似地，包封或分区的细胞可以迅速影响微微量级区室内的环境条件。例如，区室的pH的变化或氧化还原电势将由所包封的细胞或子细胞(一个或多于一个细胞分裂的结果)控制。
一些单细胞的微生物不能总是作为单独的细胞而被分离，尤其是细菌如金黄色葡萄球菌，其经常在细胞分裂后以单克隆细胞聚集体或簇的形式存在。事实上，细胞聚集是表型性状，其可用于将聚集的生物体与不聚集的生物体中区分。此外，聚集的细胞不需要在治疗上加以区分，因为它们通常对相同的治疗方法、药物或条件有响应。
实时表型变化。在微微量级体积中，区室中可观察的变化是由细胞表型决定的，细胞表型包括代谢组、转录组、蛋白质组或环境变化，实例包括：
代谢组变化。代谢组包括区室中的完整分子集合，其在活细胞的存在下经历化学转变，包括与细胞一起被分区的细胞试剂，所述试剂包括酶底物。
酶底物包括由区室的蛋白质组或转录组(蛋白质或RNA)中的酶催化或改性的任何物质。底物变化在此不同于蛋白质组和转录组变化，因为它本质上是多维度的。
底物反应速度取决于溶液条件、底物浓度和底物进入酶活性位点的途径。例如，酶底物可能需要渗透细胞壁和/或膜以接触细胞内的酶。因为物种之间的细胞渗透性可能不同，所以在包封不同细胞种类的两个区室中，即使蛋白质组和环境在两个区室中是相同的，底物浓度也会特征性地随时间变化。
最后，虽然代谢组变化通常包括底物变化，但应该清楚的是，底物变化包括不参与细胞代谢途径的酶和试剂，包括引入到经历酶催化的化学转化的区室中的任何试剂。
转录组变化。转录组包括区室中RNA转录物的完整集合，其包括信使RNA(mRNA)和微小RNA(miRNA)。RNA转录物的浓度将根据细胞表型而有所不同，并且可以用于对分区的细胞进行分类。微小RNA通常是分泌型的并且可从细胞外探测，其在微微量级环境中快速浓缩，并且无需可渗透细胞的检测试剂。
蛋白质组变化。蛋白质组包括区室中蛋白质的完整集合。区室的蛋白质组的组合物将在活细胞的存在下根据细胞表型而有所不同。蛋白质组可以包括通过转化、转染和转导导入细胞的外源或异源基因表达的蛋白质。
环境变化。环境变化包括区室温度、pH和氧化还原电势的任何变化。在微微量级体积中，环境变化由细胞和与细胞一起分区的细胞反应物之间的相互作用控制。
分类。单细胞分区确保区室中观察到的表型变化是单细胞种类的特征而不是多个种类的平均值。随后可以使用统计数据分析将这些变化分为有用的信息。本发明的方法与依赖于监督学习和非监督学习的统计方法兼容。
基于监督学习的表型诊断。分类是基于其类目成员已知的观察结果训练集，识别表型观察结果属于类别集合中的哪一个的问题。分类被认为是监督学习的一个实例，其中正确识别的观察结果训练集是可用的。实例是基于在相关条件下使用先前观察结果优化的函数所观察的患者样品的特征，将诊断分配给给定患者。本发明的方法与基于监督学习的任意统计分类方法兼容，所述基于监督学习的任意统计分类方法包括神经网络、线性向量量化、线性分类器、支持向量机、二次分类器、决策树、核估计和元算法方法。某些方面使用一个或多于一个神经网络，
基于非监督学习的表型诊断。当相对分类具有预测价值时，基于非监督学习的统计分析是有用的。例如，如果在单一细胞种类上测试多种药物，每种药物的相对影响可以预测最佳候选药物。
快速表型评估。图2图示了用于快速表型诊断的方法。用细胞试剂和/或细胞反应物使活细胞悬浮。将悬浮液分区到可实时观察的微微量级的区室中。将每个区室观察到的变化记录为波形，所述波形可以分类为关于所包封的细胞的有用信息。术语“细胞试剂”包括用于观察表型变化的物质的任意物质或混合物。细胞试剂用作区室内条件的指示剂或检测器而不会改变或修饰细胞的代谢或表型。细胞试剂包括活力染料、荧光酶底物和发光酶底物。术语“细胞反应物”包括用于诱导表型变化的物质的任意物质或混合物——在分析过程中不直接测量的基本上任意的与细胞相互作用的物质。细胞反应物可以影响或修饰细胞的代谢或表型。细胞反应物包括细胞营养物、抗菌药物和细胞毒性药物。细胞营养物包括但不限于培养基、缓冲剂、盐、气体(例如O2和CO2)、激素等。细胞营养物还包括任意碳水化合物、糖和醇，例如核糖醇/侧金盏花醇、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、帕拉金糖、蔗糖、半乳糖、核糖、棉子糖、海藻糖、龙胆二糖、乳糖、蜜二糖、鼠李糖、山梨糖、松二糖、木糖和/或松三糖。细胞反应物还可以包括酶抑制剂等。药物包括但不限于小分子、抗菌药物、化疗药物、细胞毒性药物、噬菌体、肽、纳米颗粒、基于CRISPR-CAS9的治疗剂、免疫治疗剂等。
在各个方面对样品进行分区或分区(图3)。可以将样品或细胞悬浮液加工到多个区室中。然后对每个区室进行表征(图4)。在图4的左侧随时间采样和记录了可观察的区室信号。空区室将随时间产生可重复的背景信号。具有细胞的区室将产生实时变化，所述变化与由空微滴或由具有不同细胞表型的区室产生的变化不同。将记录的信号波形馈送到分类函数，在这种情况下是神经网络，其基于采样的波形对每个经分区的细胞进行分类。
图5表示本文所述方法的基本实施方案。图5表示采样和记录来自分区(子样品或部分样品)内的单个区室的表型波形并将所记录的波形馈送到深度神经网络中以进行分类的一个实例。
图6表示可以使用一种或多于一种试剂和/或一种或多于一种反应物来实施的各种方案。图6A表示利用多个分区的方法，每个分区具有其包含的反应物混合物以增加给定样品的表型变化或说明不同细胞类型的营养需要。在特定实施方案中，该方案是不含试剂的。图6B是与细胞试剂结合使用的类似于图6A的实施方案的示意图。图6C是具有共享相同的细胞反应物但包括不同细胞试剂的分区的方案的示意图。能够进行无试剂检测的方法包括：
区室的光密度。随着细胞生长，它们将影响区室的光密度(OD)，所述光密度根据细胞的生长特征而有所不同，并且由OD确定的那些生长特征可用于对细胞进行分类，例如参见图21)。OD方法特别适用于使用简单明场显微镜的二维微滴阵列。
区室的光谱吸收度。有许多方法可以完成光谱学。在基本方法中，将样品暴露于白色束源并使用探测器建立基线，然后发射器/检测器装配扫描微滴的二维阵列，并且通过比较透射光谱与基线获得吸收光谱。
氧化还原电势或pH。涉及将区室蚀刻到硅中的分区方法可以结合回路以测量区室不断变化的氧化还原电势和pH。
某些方案可以使用多试剂和多反应物分区。图7A至图7C是表明包括覆盖一个或多于一个分区的细胞反应物和细胞试剂的组合的方案示意图。一个特定方案如图8所示。图8A表示图6B所示的方案的一个实施方案，其中细胞反应物是不同的营养混合物并使用了单一细胞试剂。图8B表示图7B所示的方案的一个实施方案，其中细胞反应物是营养混合物并且细胞试剂是活力染料、荧光底物和发光底物的不同组合。
在某些方面，本文描述的方法可用于细胞反应物的快速表型测试，例如评估测试底物对细胞的作用。图9是用于评估细胞反应物在细胞种类上的影响的诊断测试的示意图。测试反应物(TR)仅存在于测试样品(TS)中，在其他方面测试样品与对照样品(CS)分区相同。N1是编码器，其将完整波形压缩成稀疏表示，然后通过CL分类。例如，表征器(CH)包含两个群体的总体统计数据例如每个区室的平均强度。针对TS和CS，N2使用CL中的分类波形和CH中的群体统计数据，以计算临床终点。
图10是方案的示意图，其中图9中的测试反应物是药物。这里N2利用CL中的分类波形和CH中的群体统计数据以计算与处方药物相关的临床终点，所述处方药物与被测试细胞相互作用。使用机器学习，可以将神经网络训练至任意临床终点。实例包括患者诊断、患者预后等。
患者诊断。本文描述的方法的一个优点是允许将诊断测试直接优化到与被测试细胞相关的任意临床终点。
最小抑菌浓度(MIC)。在微生物学中，最小抑菌浓度(MIC)是防止微生物可见生长的化学药品的最低浓度。MIC信息可用于根据感染位点计算给定抗菌剂的最佳剂量。
易感、中度或耐药(SIR)。在微生物学中，通过使用对病原体-抗菌剂组合特异的截止点，将MIC结果解释为对病原体-抗菌剂组合易感(或敏感)、中度或耐药。通过CLSI指南为每个病原体类别建立MIC截止值。习惯上，抗菌剂易感性测试(AST)产生给定抗菌药物的MIC并且使用单独的测试来识别(ID)被测病原体。病原体ID用于建立被测试的抗菌药物的SIR截止值。只有在已知ID后，才能建立截止值以理解MIC是否指示耐药性或易感性。
本文描述的方法的优点是CS样品中的信息可用于同时建立MIC和SIR截止值而不需要将CS中的波形转化为系统分类的中间物ID步骤。这能使整个系统优化至临床终点(SIR)而不是两个中间步骤。
药效学。抗菌MIC通常是预测药物的药效学的方法。MIC是抗菌药物的效能的度量。特定物种的分离株将具有不同的MIC。敏感菌株将具有相对低的MIC，并且耐药菌株将具有相对高的MIC。断点MIC是分离敏感和耐药菌株的MIC，并且常规上根据其区分两个不同群体的能力来选择：MIC小于断点的一个群体(即易感的)和MIC大于断点的一个群体(即耐药的)。
断点MIC的另一个属性是对应于使用标准剂量可达到的血清药物水平。为了指导剂量策略，MIC可以与内在抗生素信息结合，所述抗生素信息是例如抗菌药物是时间依赖性的还是浓度依赖性的。
患者抗菌谱。抗菌谱是考虑用于治疗的一组抗菌剂中每种抗生素的SIR结果，从而提供特定微生物对一组药物的抗生素易感性测试结果的总体概况。可以使用多种药物并记录每种药物的每个概况。
化学敏感性测试和哺乳动物细胞诊断。上述用于抗菌剂易感性测试的方法可直接应用于癌症以及基于组织的疾病的化学敏感性或药物敏感性，其中可以将组织/细胞分离并暴露于或与药物接触改变了细胞特征。
患者预后。除了患者预后，可以优化图9中通常描述的方法以提供患者预后信息，例如患者发病率、死亡率和住院时间。图11提供了波形信息链的示意图。将对照和测试分区波形馈送至相同的N1、CH和CL，但将得到的统计数据馈送至预测器神经网络(N2)的单独的输入节点，从而允许对CS和TS中存在的变化进行详细比较。图12表示使用这个基本方案以通过测试或评估多种药物来提供预后的一个实例。在其他方面，该方法可以包括各种其他信息来源，例如成像数据、生物标记、患者信息、社区信息等(例如参见图13)。
本文描述的方法的一个优点是，可以使用机器学习来优化诊断，所述机器学习使用样品分区统计结合其他实验室结果、患者信息和社会信息，以达到除了图10所描述的那些之外最准确且全面的诊断和预后，其包括但不限于：
推荐的抗菌药物。抗菌谱可以给临床医生提供一组抗生素，所述抗生素可能对引起感染的微生物有效。然而，选择优选抗生素仍取决于临床医生。本文描述的方法的优点是，可以基于感染的表型细胞概况结合相关患者信息、社会信息、成像数据和疾病标记来优化诊断测试以改善患者结果。在某些实施方案中，可以将诊断测试优化至需要采取的最终临床决定：施用哪种药物和以多少剂量。
患者信息可以包括患者健康记录和当前状况中的任何信息，其包括但不限于主要或次要诊断、年龄、既往治疗史和/或潜在状况。患者信息还可以包括从可穿戴计算机得到的或记录在个人应用软件中的生物统计数据。
社区信息是与患者社区有关的聚合医疗信息，其包括但不限于遗传信息、年龄；国籍；种族；住所；工作地点；社会经济群体；行为习惯；生活习惯；环境条件；化学物质接触；污染物等。如果病人有微生物感染，社会监测和医院抗菌谱信息可能在区分候选抗菌药物组方面发挥重要作用。在某些方面，患者群体可以限于处于患有疾病、病症或其组合的风险中的患者群，或目前或以前患有疾病、病症或其组合的患者群；地理区域，如社区、城市、县、州、国家、大陆等；具有一个或多于一个共同人口统计的人口统计社区等。
疾病标记包括来自其他实验室测试的与待测状况有关的任何信息，其他实验室测试包括细胞因子、微小RNA、抗体、无细胞DNA、人类基因组信息、血液化学等，其可与表型细胞数据结合使用以改善诊断。
成像数据包括患者信息、X射线、CAT扫描、PET扫描、MRI等。这类数据通常由临床医生解释。在某些方面，可以使用神经网络对成像数据进行编码，以生成稀疏表示并馈送至预测器神经网络例如N1以帮助诊断。
与抗生素治疗的病历结合的由本文所述方法获得的细胞概况可用于预测患者未来产生抗菌剂耐药感染的风险，即识别耐药风险。它还可以用于与社会信息结合以预测爆发风险。
I.机器学习和深度学习。
数据科学家利用机器学习技术来构建从真实数据中进行预测的模型。通常，在将机器学习模型应用到原始数据之前，对数据进行几个预处理步骤。预处理步骤的一些实例包括数据质量处理(例如插补和异常值去除)和特征提取处理。习惯上，建立这些处理和模型以处理大数据样品(“大数据”)(例如大流量数据样品，例如万亿字节或大于万亿字节的数据，所述数据因太大而无法适应单个机器因此必须储存于多个机器)或小数据样品(“小数据”)(例如少量的数据样品，例如千字节或兆字节的数据，所述数据可以容易地在单个机器上储存和处理)。将训练集提供给机器学习单元，例如神经网络或支持向量机。使用训练集，机器学习单元可以生成模型以基于波形对样品根据组分进行分类。
人工神经网络(NNet)基于大脑的神经结构模拟“神经元”网络。它们一次处理一条记录，或者以批处理模式处理一条记录，并通过比较他们对记录的分类(一开始很大程度上是任意的)和已知的对记录的实际分类来“学习”。在多层感知器神经网络(MLP-NNet)中，将来自第一次记录的初始分类的错误馈送到网络并用于第二次修改网络算法，如此反复多次。
在某些实施方案中，在一段时间中测量荧光反应或其他信号，并将所有测量结果收集成波形的集合。在某些方面，可使用先前经训练以识别样品中的组分的神经网络基于属性特征将波形聚类到已知类别中。某些方面采用个体响应群体，并使用机器学习来提取对诊断、治疗以及社会健康评估和监测有用的临床相关信息。
例如，提供者在等待培养结果的同时用抗生素治疗有症状的患者。这会导致抗生素的无效治疗、误治或过度治疗，这可能在个体患者和广大群体上具有不利后果。因为本发明的方面可用于评估抗菌剂的易感性，其可以在2小时至6小时内完成，有效治疗可以更早开始。
因为本发明描述了从患者样品中提取临床相关信息的机器学习技术，所以可以确定并优化最好的模型且不会有设计者的偏见。机器学习可以发现数据中的隐藏结构，这对于人类的观察来说可能并非显而易见。
例如，方法可用于获取所有目标病原体的不同抗生素耐药性水平的病原微生物样品，并用于设计测定以测试的目标抗生素。将这些样品分为不同已知耐药水平下的对照样品和抗生素易感性样品。设λ为泊松分布的随机变量。对于每个对照样品，将样品分区为含有与荧光剂或其他试剂混合的λ微生物病原体的离散单元。对于每个抗生素易感性样品和每个抗生素，将样品分区为含有与抗生素和荧光剂或其他试剂混合的λ微生物病原体的离散单元。随时间测量每个经分区的微生物的荧光反应或其他信号并将信号收集为波形的集合。基于光学度规将信号分为两类正波形和负波形，所述光学度规可有效确定哪个区室包括非零个病原体(阳性)以及哪个区室是空的(阴性)。
特定实施方案将悬浮在水乳液中的油滴内的细菌细胞和刃天青染料分隔开来。在该实施方案中，基于分析的动态范围要求而确定λ<1。将微滴装入成像室，并在2小时至6小时内拍摄一系列图像。在每个图像中识别微滴并通过软件在图像序列中相互关联，以产生线粒体刃天青/试卤灵还原的波形。然后在对每个波形施用光学度规后，该软件使用OTSU分割、核密度估计或固定阈值分割将波形分段为“正”和“负”。另外，优选实施方案过滤了任意合并的微滴、堆叠的微滴和不相关的微滴。
收集波形数据之后，将数据分成两个集合进行交叉验证：训练集和测试集。将每个正波形归一化，使其在时间维度上具有N个点并且它的荧光维度为0.0至0.1。
用监督学习步骤开始训练以将每个波形的维度从N个点减少至更小的数字M＝4至10。通过荧光(或信号)维度的归一化，曲线的相对大小被忽略，并且曲线形状变得重要。训练自动编码器以将维度从N减少到更小的数字M＝4至10。还将训练数据分为用于训练自动编码器的子集和用于测试自动编码器的子集。在优选的实施方案中，自动编码器是神经网络，其具有1-D卷积层，然后是大小为M的全连接层。应用激活函数例如tanh将输出范围设为0.0至1.0。输出这些M次激活将变为“编码”M维的每个波形。存在其他减少数据的维数的方法，例如主要组分分析和特征向量分解，并且这些方法也可能有用。
接下来确定波形“类别”的最佳数量K。在优选的实施方案中，通过用不同的K值迭代应用“K平均聚类”来确定最佳值K。对于每个K，计算拟合的失真并基于统计方法如“肘部法则”，或率失真方法如“跳跃法”或“折线型法”来选择最佳值。确定最佳值K之后，根据K个聚类中心之间的最近邻分类对曲线进行分类。这就完成了非监督训练步骤。
以监督步骤继续训练，所述步骤建立了将目标抗生素和波形摘要映射到抗生素易感性度量的回归函数F(t,d)＝μ。在优选地实施方案中，抗生素易感性度量是抗生素最小抑制浓度，并且波形摘要是如下的4(K+1)个要素的向量：以下向量的串联：
(1)K+1个要素的向量，其中0<＝j<k的每个要素是在对照样品中阳性微滴中出现的波形类别“j”的比，其中j＝k处的要素是出现在对照样品中阴性微滴的比。
(2)K+1个要素的向量，其中要素类似地如(1)定义，不同之处在于要素是每类微滴波形的平均强度与对照样品中所有微滴波形的平均强度的比。
(3)K+1个要素的向量，其中要素类似地如(1)定义，不同之处在于使用抗生素易感性测试样品。
(4)K+1个要素的向量，其中要素类似地如(2)定义，不同之处在于使用抗生素易感性测试样品。
在优选的实施方案中，模型是具有4(K+1)个输入节点、多个隐藏层和一个对应于抗生素易感性度量的输出节点的深度神经网络。在替代实施方案中，抗生素易感性度量是0至1的无单位的值，其中0表示无抗生素耐药性，1表示完全抗生素耐药性，定义为与对照无差别。在训练回归函数之后，通过使用为测试数据集保留的数据评估该函数的准确性。
在优选的实施方案中，训练数据通过以下方式扩增:
(1)根据每个数据中波形的随机采样构建波形摘要。
(2)在构建波形摘要之前，对每个正波形进行分类时使用M-最近邻分类。对于每个正波形w，在所有K中找到与w最接近的波形聚类中心的集合M。j＝0至K+1的K+1个要素的向量v是加权平均数，使得M中的位置j处的值是w与每个中心j的接近程度，且在M中的位置j处不为0。“接近程度”的实例可以是距离加权的倒数或从概率分布来评估。
(3)通过具有小离差的随机变量然后通过再归一化引起波形摘要的扰动。
当在患者样品上进行抗生素易感性测试时，将样品加载到A+1个回路中，其中回路数A不含抗生素，是对照数据，并且j＝0至A-1的每个回路数都包含特定的抗生素j，是抗生素j的易感性数据。将微生物进行分区，在一段时间内测量荧光反应(或其他信号)，提取波形并如先前所述的分为“正”和“负”。对每个回路j，将波形归一化并分类。对j＝0至A-1的每个回路，构建如先前所述含有来自回路j和A的波形的摘要d(j)。评估回归函数F(j,d(j))以确定抗生素易感性度量。基于由训练数据所定义的标准曲线或表格，将该抗生素易感性度量映射到临床结果如SIR值或MIC值。
在某些方面，根据所进行的分析的目标，表征器可以接受多种输入信息并发送多种输出信息。在某些表征器的输入信息和输出信息的实例中：输出信息：(i)分区中所有波形的平均最大信号，(ii)分区中所有波形的曲线下方面积；(iii)分区中所有波形的平均最大导数；(iv)当每个波形跨越分区中所有波形的特定阈值时的平均时间点；(v)一如以上，不同之处在于使用“中位数”而不是“平均数”；(vi)一如以上，不同之处在于使用归一化的波形，其中每个波形除以相同分区内负区室(没有细胞的区室)中波形在相同时间点的平均信号。输入分类器的信息的实例包括(i)原始波形和/或(ii)维度减少的波形，除了以上输入的患者信息外，还有社区信息和/或成像数据。
此外，通过使用自动编码器以在正波形(实际上显示生长的波形)上进行一些非监督学习，发明人可以导出编码的向量空间中的数据聚类。如果一些物种的分布在编码的向量空间中是多模式的，聚类的数量可能大于细菌种类的数量。把聚类的数量称为K并将它们标记为1到K(含1和K)。对于对照分区中的每个负波形(不显示生长的波形)，将其视为属于聚类0。对于对照分区中的每个正波形，确定所最可能属于的聚类：
表征器的其他输入信息包括(i)j＝0至K的K+1个要素的向量，其中要素j对应于属于聚类j的所有波形的最大荧光值的平均值；(ii)j＝0至K的K+1个要素的向量，其中要素j对应于属于聚类j的所有波形在波形荧光曲线下的平均面积；(iii)j＝0至K的K+1个要素的向量，其中要素j对应于属于聚类j的所有波形的最大导数荧光值的平均数；(iv)j＝0至K的K+1个要素的向量，其中要素j对应于属于聚类j的所有波形中每个波形荧光曲线首次达到特定阈值时的平均时间点；(v)一如以上，不同之处在于定义为“中位值”而不是“平均值”；(vi)一如以上，不同之处在于使用归一化的波形，其中每个波形除以聚类0(没有细胞的区室)和其他聚类的波形在相同时间点的平均信号。
II.一般方法
在某些方面，样品的处理不需要裂解或洗涤。由于使用完整细胞，因此仅需要操纵整个细胞而不是核酸分子，由于核酸分子的小尺寸和与不同材料的基于电荷的相互作用的倾向，所以核酸分子操作困难得多。此外，细胞可以在单一温度下孵育，通常是25℃至45℃的相对低温，不需要大多数NAT所需的热循环设备，这降低了当前所述发明的成本和工作流复杂性。有利地，通过避免高温步骤，本发明避免了可能由于会破坏响应完整性和/或荧光读数的流体蒸发和/或气泡而产生的重大问题。
对包含至少一种靶细胞的测试样品或样品的一部分进行分区，与试剂组合或不与试剂组合，例如，与活力染料或报告分子组合成区室或微滴，使得统计学上显著数量的区室或微滴包含不超过一个靶细胞或细胞聚集体(一些细胞倾向于聚集成细胞簇或链)。在细胞的存在下，试剂可以用来产生或不产生信号。随时间监测每个微滴并使用数据来识别和表征每个区室。以下提供关于本发明方法的其他细节。
样品。样品中的细胞可以包括细菌、真菌、植物细胞、动物细胞或来自任何其他细胞生物的细胞。细胞可以是培养的细胞或直接从天然存在的来源获得的细胞。细胞可以直接从生物体获得或从生物体获得的生物样品中获得，例如从痰、唾液、尿液、血液、脑脊液、精液、粪便和组织中获得。在一个实施方案中，样品包括从包含多种其他组分的生物样品中分离的细胞，例如其他细胞(背景细胞)、病毒、蛋白质和无细胞核酸。细胞可以被病毒或另一种细胞内病原体感染。然后可以将分离的细胞重新悬浮在与获得它们的培养基不同的培养基中。在一个实施方案中，样品包括悬浮在营养培养基中的细胞，所述营养培养基使细胞能够复制和/或保持存活。营养培养基可以是具有已知量或所有成分的限定培养基，或者营养物质是例如酵母提取物或酪蛋白水解物的复杂成分的未限定培养基，其中含有许多未知比例的化学物质的混合物，包括碳源如葡萄糖、水、各种盐、氨基酸和氮。在一个实施方案中，测试样品中的靶细胞包含病原体，并且营养培养基包含通常使用的用于培养病原体的营养肉汤(液体培养基)，例如溶原性肉汤、Mueller-Hinton肉汤、营养肉汤或胰蛋白酶大豆肉汤。在任意实施方案中，培养基可以补充有血清或合成血清以促进挑剔的生物体的生长。
分区。本发明的某些方法涉及将包含细胞的样品或样品部分、或样品的一部分与一种或多于一种试剂和/或一种或多于一种反应物组合，然后对样品或样品部分进行分区。对样品进行分区使得统计学上显著的区室的部分含有不超过一个靶细胞或细胞聚集体。根据应用，区室的数量可以从数百到数百万不等。根据应用，区室体积还可以为1pL至100nL，但优选为25pL至500pL。本文描述的方法与任何分区方法兼容。
分区的一个非限制方法是使用微滴。虽然用于微滴形成的方法不同，但所有方法都将在这种情况下为测试样品的水相分散到还被称为连续相的不混溶相中，使得每个微滴被不混溶的载体流体包围。在一个实施方案中，不混溶相是油。在某些方面，油可以包含表面活性剂。在相关实施方案中，不混溶相是包含氟表面活性剂的氟碳油。使用氟碳油的一个重要优点是它能够相对良好地溶解气体并且具有生物惰性。因此，本文所述方法中使用的氟碳油包含细胞存活所必需的溶解气体。
微滴形成的一个非限制性实例是通过使用拉普拉斯压力梯度(参见例如Dangla等人,2013,PNAS 110(3):853-58)。拉普拉斯压力是曲面内外之间的压力差，例如微滴内外的压力差。含有细胞或微生物的水相可以加入到具有连续相(即不混溶流体)的贮液池的装置中，在适当的装置中形成含水“舌(tongue)”。该装置可以将高度变化结合到微通道中，所述微通道使不混溶的界面受到没有经历高度变化的水相部分与高度变化下游的水相部分之间的曲率差的影响。当水相流过高度变化时，在高度变化下游的水相部分达到临界曲率，超过该曲率，则两部分不能保持静态平衡，将水相破碎成微滴，因为下游部分与通过将水相加入到连续相而形成的舌分开，微滴的尺寸由装置的几何形状决定。高度变化可以通过微通道高度中的单步变化(分步乳化)、多步(多步乳化)和斜坡或类似渐变梯度的限制来实现。
报告分子。各种报告分子可以作为试剂与本文公开的系统和方法一起使用。例如，报告分子可以是荧光团、蛋白标记的荧光团、包含光可氧化的辅因子的蛋白质、包含另一种插入的荧光团的蛋白质、线粒体活体着色剂或染料、氧化还原活性染料、膜定位染料、具有能量转移性质的染料、pH指示染料和/或由染料和可被酶作用的部分组成的任何分子。在另一方面，报告分子可以是或包括刃天青染料、吖啶、四唑
染料、香豆素染料、蒽醌染料、花青染料、偶氮染料、呫吨染料、芳基次甲基染料、芘衍生物染料、钌联吡啶络合物染料或其衍生物。将也包含在本文使用的术语报告分子中的细胞活力染料用作分析试剂，以识别和表征包封在微滴内的单个细胞或病原体。自1950年代以来，活力染料一直用于细胞活力检测目的。然而，这些试剂通常用于体积显著大于1微升的样品和/或用作终点测试以指示活细胞的存在。本发明的方面在1pL至100nL，更具体地25pL至500pL的微滴中使用活力染料。在此处描述的方法中，由活力染料产生的光学信号通过小微滴体积集中并在孵育时间内测量和记录。在含有活细胞的微滴中，这导致光学特性快速产生，并且具有关于包封在微滴内的细胞特征的信息。结合环境应激源例如抗菌或细胞毒性药物，通过随时间监测含有细胞的微滴的光学信号，可以产生额外的特征。来自具有和不具有环境应激源的细胞的光学特征可用于确定细胞的身份和/或特征。此外，从暴露于药物的一种细胞获得的光学特征与未暴露于药物的同种靶细胞的光学特征之间的差异可用于确定从测试样品中获得的靶细胞的表型耐药性谱。因为这些特征是由包封在微滴中的单个细胞产生的，所以它们表示关于每个细胞的个体特征的信息，而不是从包含许多细胞的大块样品的细胞群产生的平均特征。
本发明的方法与能和活细胞一起使用的任意活力染料或报告分子或荧光或发光酶底物兼容(不需要细胞裂解)。在优选的实施方案中，活力染料是基于刃天青的染料或其衍生物。实例是刃天青，当它不可逆地还原成粉色和高度荧光的试卤灵时(图6)，它产生荧光信号和比色偏移(从蓝色到粉色)。在优选的实施方案中，使用荧光，因为它提供了与比色信号变化相比更好的灵敏度。亚纳升体积内的有限扩散限制的分泌荧光分子快速集中到可检测的信号水平，然后通过下述方法检测。此外，如果氧化还原环境降至低于特定的氧化还原阈值，通常为约-100mV，试卤灵可逆地还原为非荧光氢化试卤灵(图6)。根据微滴的氧化还原电势，从刃天青到试卤灵的不可逆还原和试卤灵到氢化试卤灵的可逆还原以及氢化试卤灵回到试卤灵的氧化的组合随时间在微滴中产生独特的荧光特征，所述微滴体积足够小以致于在单细胞或细胞聚集体的存在下很快发生氧化还原变化。可商购获得的基于刃天青的染料的实例是：AlamarBlueTM(各种)、PrestoBlueTM(Thermo Fisher Scientific)、Cell-titer BlueTM(Promega)或刃天青钠盐粉末(Sigma-Aldrich)。与刃天青结构上相关的染料并且也可以在该方法中使用的是：10-乙酰基-3,7-二羟基吩噻嗪(也称为Amplex RedTM)、C12乙氧基刃天青和1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基吖啶-2(9H)-酮(DDAO染料)。在替代的实施方案中，用作为荧光底物的可分裂部分来修饰试卤灵。可商购获得的基于试卤灵的荧光底物的实例是7-乙氧基试卤灵、试卤灵-β-D-葡萄糖醛酸、试卤灵-β-葡萄糖醛酸甲酯。在替代的实施方案中，依赖于四唑
还原的染料，例如甲
染料，可用作细胞活力指示剂。实例包括INT、MTT、XTT、MTS、TTC或氯化四唑
、NBT和WST系列。在替代的实施方案中，报告分子可以包括荧光底物，例如4-甲基伞形酮(4-MU)、乙醇7-羟基香豆素-3-羧酸酯(EHC)、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、荧光素和试卤灵。在替代的实施方案中，报告分子可以是
指示剂(Biosynth)。在替代的实施方案中，报告分子可以包括发光底物，例如鲁米诺、Shaapdeoxetanes、荧光素衍生物和原底物以及二氧杂环丁烷衍生物。化学发光的报告分子可以与荧光报告分子组合以增加细胞特异的波形变化，其有助于区分相似的DCC。在某些方面，报告分子是带有特定的酶不稳定基团的二氧杂环丁烷衍生物。当与由分离的细胞表达的酶接触时，使酶不稳定基团分裂，释放相应的不稳定酚盐阴离子，所述酚盐阴离子分解，产生高能中间体，所述高能中间体通过返回其未激发的基态而发光。二氧杂环丁烷衍生物的实例是AquaSpark(Biosynth)。荧光素酶原底物也可以与荧光和/或化学发光报告分子结合，以增加细胞特异性变异。在分离的细胞内将原底物还原为荧光素酶底物，然后通过荧光素酶氧化以产生生物荧光信号。实例包括实时Glo(Promega)。
本发明提供了非发光的多重测定，例如荧光、比色和/或发光测定。本文使用的“发光测定”包括其中分子一旦被细胞组分作用就发光的反应。发光测定包括化学发光和生物发光测定，其包括但不限于使用或检测荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-内酰胺酶、蛋白酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶和合适的相应底物的那些，所述相应底物例如修饰形式的荧光素、腔肠素、鲁米诺、肽或多肽、二氧杂环丁烷、二氧杂环丁酮和相关的吖啶酯。如本文所使用的，“发光测定试剂”包括底物以及分裂或修饰用于发光反应的底物的活化剂或酶。
在某些方面，一种或多于一种分离的细胞可以含有或表达可用于产生发光反应的酶。具体地，可用于本发明的酶包括表现出酶活性的任意蛋白质，例如脂肪酶、磷脂酶、硫酸盐、脲酶、芳基酰胺酶、肽酶、蛋白酶、氧化酶、催化酶、硝酸还原酶、和酯酶，包括酸性磷酸酶、葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半乳糖苷酶、羧酸酯酶和荧光素酶。在一个实施方案中，其中一种酶是水解酶。在另一个实施方案中，至少其中两种酶是水解酶。水解酶的实例包括碱性和酸性磷酸酶、酯酶、脱羧酶、磷脂酶D、P-木糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶、硫葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、α-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡萄糖醛酸酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-呋喃果糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸酶(glucosiduronase)。
对于碱性磷酸酶，优选底物包括含磷酸盐的二氧杂环丁烷，例如3-(2′-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷、二钠盐、或3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2′(5′-氯)-三环-[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基]苯基磷酸二钠，或2-氯-5-(4-甲氧基螺环{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5′-氯)-三环{3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)-1-苯基磷酸二钠或2-氯-5-(4-甲氧基螺环{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-三环[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)-1-苯基-1-磷酸二钠(分别为AMPPD、CSPD、
和ADP-StarTM)。
对于β-半乳糖苷酶，底物优选包括含有半乳糖苷酶可裂解基团或半乳糖苷基团的二氧杂环丁烷。测定中的荧光是由二氧杂环丁烷底物的糖部分的酶切造成的。这种底物的实例包括3-(2′-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-β-D-吡喃半乳糖基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷(AMPGD)、3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5′-氯)三环[3.3.1.13,7]-癸基]-4-基-苯基-β-D-半乳糖苷
5-氯-3-(甲氧基螺环[1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5′-氯)三环[3.3.13,7]癸-4-基-苯基-β-D-半乳糖苷
和2-氯-5-(4-甲氧基螺环[1,2-二氧杂环丁烷-3,2′(5′-氯)-三环-[3.3.1.13，7]癸基]-4-基)苯基β-D-半乳糖苷
在β-葡萄糖醛酸酶和β-葡萄糖苷酶的测定中，底物包括含β-葡糖苷酸酶可裂解基团的二氧杂环丁烷如葡糖苷酸，例如3-(4-甲氧基螺环{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5′-氯)-三环[3.3.1.13，7]癸烷}-4-基)苯基-β-D-葡糖醛酸钠(GlucuronTM)。在羧基酯酶的测定中，底物包括与二氧杂环丁烷结合的合适的酯基。在蛋白酶和磷脂酶的测定中，底物包括与二氧杂环丁烷结合的合适的可裂解基团。
优选地，测定中每种酶的底物不同。对于包含一种含二氧杂环丁烷底物的测定，底物任选含有经取代的或未经取代的金刚烷基、Y基团和酶可裂解基团，所述Y基团可以是经取代或未经取代的。优选的二氧杂环丁烷的实例包括上述那些，例如，称为
GlucuronTM、AMPPD、
和ADP-StarTM，以及3-(4-甲氧基螺环{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5′-氯)-三环[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(GluconTM)、CSPD、3-氯-5-(4-甲氧基螺环{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′(5′-氯)-三环-[3.3.1.13,7]癸烷)-4-基)-1-苯基磷酸二钠(CDP)。
细胞(DCC)聚集体。本发明的优选应用是通过识别引起感染的微生物以及它们是否对抗菌药物具有耐药性来诊断微生物感染。因此，在该申请中，DCC可以是单细胞微生物。然而，一些细菌自然聚集成簇或链。在这些情况下，一些微滴可以包含相同微生物种类的细胞聚集体(均质聚集体)而不是单个微生物。在这些情况下，曲线的形状可能受到聚集体中细胞数量的影响。然而，用于对分区的细胞进行分类的储存的特征波形和调用逻辑可以以与其解释单个细胞的方式相同的方式解释这样的聚集体。此外，如果实施方案包括抗菌易感性测试，则包含抗菌药物的混合物将表现出与不包括抗菌药物的混合物相同的细胞聚集体特征，并且比较仍然是准确的。因此，尽管本发明的方法通常包括在每个微滴中分离单个细胞，但它必然适应于在微滴中分离的均质聚集体中单细胞种类的情况而非单个细胞的情况。在癌症疾病诊断的情况下，如果它们是循环肿瘤细胞，则目标DCC通常不会聚集。如果从组织获得癌细胞，则在分析之前通常将组织分解成单个细胞。因此，每个微滴最多只包含一个细胞；然而，在一些情况下，还可以使用所述方法分析癌症聚集体。
信号检测。一旦产生微滴，它们就必须由光学系统、传感器或传感器阵列呈现以进行分析。在优选的实施方案中，微滴以二维阵列呈现，使得可以保持良好的热控制，并且对于许多微滴可以同时(在单个时刻及时)测量微滴信号。在含有目标细胞的微滴中，报告分子将产生集中的荧光信号，该信号将升高到超过不含细胞的背景微滴。微滴的浓缩信号使得能够在可比较的时间标准PCR技术中进行单细胞识别，这是快速识别的黄金标准。在某些方面，通过用特定波长的光激发还原的报告分子并用相机收集带通滤波的斯托克斯位移光来检测信号。使用成像技术的优点是它们可以对保持静止的微滴阵列成像，因此可以容易地随时间监测。基于细胞计量法的方法通常采用终点检测而不是实时检测，因为难以在一段时间内跟踪移动的微滴。阵列成像的另一个优点是在分析时所有微滴都经历相同的反应条件。因此，可以在等效时间点比较微滴信号，这很重要，因为信号是随时间变化的。使用细胞计量法，微滴在不同时间通过检测器。因此，在分析时，一些微滴比其他微滴孵育更长时间。最后，测试样品中可能存在不同的靶细胞种类。对于每个物种，可能存在最佳微滴体积和染料或报告分子的浓度，以在特定时间点使信号最大化。如果使用终点法，则不需要将微滴体积和报告分子浓度控制在相同的程度，因为时间可以补偿次优性，并且可以在单一染料和微滴浓度内普遍地表征不同物种。
多重测定。本文描述的方法包括来自单个测试样品的多个细胞的特异性识别。通过将单个细胞分区至它们自身的分离微滴，消除细胞之间资源的竞争。因此，与大多数细胞群体相比，在大量群体中全体作为少数存在的个别细胞现在能够平等获得营养物质，这使得对具有多种细胞类型的样品中的低丰度细胞具有更高的敏感性。本发明的多重测定限制取决于区分不同细胞类型之间的活力特征的能力。大多数多重测定方法需要多种染料(荧光团)，而这些染料又需要多组LED、激发和发射滤波器。因为本文描述的方法使用形状信息而不是光谱信息，所以该方法可以用于使用仅需一个LED、发射滤波器和激发滤波器的单个染料来多重测试许多目标，从而简化进行分析所需的硬件。在其他实施方案中，多种报告分子可以组合、一起或分别使用，其中报告分子选自一组不同的光谱波长或发光类别(例如荧光、化学发光或比色)，使得可以对每个感兴趣的微滴测量多个正交的代谢途径。例如，氧化还原敏感荧光染料例如刃天青，可以与用于酶活性的第二荧光报告分子如荧光素β-半乳糖苷和生物发光报告分子如荧光素/荧光素酶组合使用。任意数量的另外的报告分子可以组合使用，其中每种报告分子将提供独特的细菌特异信息。
实施例
包括以下实施例以及附图以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解的是，实施例或附图中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中能够很好地起作用的技术，因此可以认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。
核心技术
将单个微生物细胞与细胞活力染料包封成微微量级的微滴，该染料在活细胞存在的情况下会产生荧光。在某些实施方案中，使用了基于刃天青的染料。在活细胞的存在下，试卤灵分子将在微微量级的微滴环境下快速集中并产生易检测的荧光信号。
每种微生物还原刃天青的速率取决于细胞特异的特征，如渗透性、代谢特征、尺寸和生长速率。此外，在微滴内微微量级的环境中，包封的微生物将主导决定试卤灵是否会还原成氢化试卤灵的条件(例如氧化还原电势)。结果是不同微生物种类产生独特的随时间变化的荧光“特征”，从而允许识别每个微滴中的微生物。
根据需要，也可以在这些测定中加入额外的荧光试剂，以增加信号变化，从而根据需要给特征增加特异性。而且，可以通过将抗菌药物引入到微滴中，并比较来自包含抗菌药物的那些微滴和不包含抗菌药物的那些微滴的活力信号来测量抗菌易感性(AST)。
通过将成千上万个微滴排列成二维阵列，并使用带LED激发和CMOS传感器检测的宽视场成像系统记录每个微滴的荧光来实时观察反应。
深度学习驱动的神经网络。机器学习可用于通过荧光特征来识别微生物和用于确定药物的易感性。特别地，专有的深层神经网络结构可用于解释身份识别(ID)和抗生素易感性(AST)结果。通过利用机器学习，可以基于在单细胞分辨率下明显的表型差异对细菌进行分类，允许使用相同的检测形式进行病原体识别和抗生素易感性的无缝集成。该发现独特地允许降低测试成本和复杂性。神经网络输入数据基于来自二维微滴阵列的时间序列图像。专有软件可在一段时间中识别和跟踪微滴，并生成每个微滴的荧光强度随时间变化的波形。
为了细菌ID的目的，仅使用无抗生素的“对照”回路。对每个微滴进行分类并计数每个物种的总微滴。对于每种抗生素，将不存在抗生素的对照回路与存在特定浓度抗生素的测试回路进行比较。神经网络将通过比较对照回路和抗生素测试回路之间的波形变化来确定抗生素的有效性。
病原体身份识别。总之，ID和AST为临床医生提供精确治疗细菌感染所需的明确信息。病原体身份识别的价值取决于AST结果何时可用。在当前范例下，在AST结果可用前的数小时、有时数天，ID结果是可用的。如果没有及时的AST结果，则会增加ID提供物种形成来帮助临床医生调整抗生素方案的负担。
例如，在没有AST结果的情况下，临床医生会想要区分鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和其他不动杆菌物种，因为鲍曼不动杆菌通常对某些抗生素耐药，而其他不动杆菌则不会。
然而，如果AST结果与ID结果同时可用，则无需区分鲍曼不动杆菌和其他不动杆菌，因为揭示了完整的耐药性概况，并且根据CLSI指南，由AST结果指导的措施对于所有不动杆菌物种都是相同的。
当ID和AST结果同时可用时，根据CLSI指南用ID结果解释AST结果，生成感染的抗菌谱(抗菌谱是经测试的抗生素列表，以及感染是否对所列每种抗生素易感(S)、中度(I)或耐药(R)的列表)。这被广泛认为是微生物实验室中最具临床意义的测试结果。
A.结果
敏感性和特异性统计数据见表1(TP代表真阳性，TN代表真阴性，FP代表假阳性，FN代表假阴性)。表2详述了不一致的结果。
表1.敏感性和特异性
表2.不一致的结果
表2中呈现的结果基于每个微滴(即每个阳性微滴被视为独立的培养分离株)。这种方法更有效地强调了神经网络，因为在调用中不会利用群体统计，使性能估计偏向更严格。
根据患病率和死亡率，该研究纳入了许多最重要的病原体。重要的是，该研究包括系统发育相似的物种：研究者能够在相同条件下区分的肠杆菌科的两种病原体。所有这些结果都是在Difco LB肉汤(Becton Dickinson 244620)中收集的。
抗生素易感性测试。大多数AST平台需要多种浓度的相同抗生素以观察与抗生素疗效相关的不同细菌响应。例如，肉汤微稀释法需要将每种抗生素稀释七次。Vitek2要求每种抗生素的浓度有至少三种。计划每次测试包括至多25种抗菌剂，除非可以以单一浓度检测大多数抗菌药物，否则这是不可能的。
正如ID，研究者有大量支持AST能够进行的定性数据。但与ID不同的是，到目前为止，缺乏推进发展的定量证据。相比于ID神经网络，AST神经网络结构更复杂且需要更多的数据进行监督学习。因此，为了生成AST数据，该系统必须更进一步，使得每天产生比收集的ID可行性数据更多数量级的微滴数据。
在该研究中，参照根据CLSI程序进行的肉汤微量稀释来测量绝对一致(Categorical Agreement，CA)。例如，100％的绝对一致表示每次参照将病原体称为“易感”或“耐药”时，测试结果都是一样的。这是ID/AST测试中与临床最相关的结果，并且将在FDA审批期间进行严格审查。
如提到的一样，这是针对肉汤微量稀释法(黄金标准)对我们的AST方法进行的首次定量评估。因为这是一个持续的评估，现在做出任何明确的结论还为时过早。然而，迄今为止，结果是令人鼓舞的。
表3.抗生素的AST结果
VME-严重错误；R称为S
ME-错误，S称为R
表4.病原体的AST结果
B.材料和方法
病原体身份识别。将绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 15442)、克雷伯肺炎杆菌(ATCC 33495)和金黄色葡萄球菌(ATCC BAA-977)的多个传代培养物在37℃下在胰酪胨大豆液体培养基(Becton Dickinson 211825)中孵育过夜；将鲍曼不动杆菌(ATCC19606)、大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC 25922)和表皮葡萄球菌(ATCC 14990)菌株在37℃下在Difco营养液体培养基(Becton Dickinson 234000)中孵育过夜；将屎肠球菌(Enterococcus faecium)菌株ATCC 19434在37℃下在脑心浸液(Sigma 53286-100G)中孵育过夜。
通过向来自过夜传代培养物的Difco LB液体培养基(Becton Dickinson 244620)加入10％基于刃天青的染料来制备人工样品。制备并测试重悬浮的多个稀释液，以实现微滴分区内单个细胞或单个细胞簇(单克隆)的泊松分布。使用分步乳化将样品分成约30000个微微升体积的微滴(195微微升)。将微滴排列成单层，并使用Leica DMI 6000B荧光显微镜成像。每隔5分钟捕捉图像。使用我们专有的图像处理软件在一段时间内跟踪每个微滴，所述软件为每个微滴生成“波形”(荧光强度随时间变化)。在本实验中，然后从每个波形中提取基于形状的特征，以便研究者可以使神经网络优化时间最小化并使小数据组的训练性能最大化。
抗生素易感性测试。从ATCC、BEI和CDC的分离株保藏中心获得菌株。使用已发表的生化方法确认菌株身份。按照CLSI程序制备和验证抗生素。根据已公布的CLSI程序，通过使用经阳离子调整的Mueller-Hinton肉汤的肉汤微量稀释法来测定分离菌的抗菌剂易感性参考结果。
通过向肉汤加入含有10％基于刃天青的染料的来自传代培养板的菌落来制备人工样品。然后将每个样品分离，其中每个微流控芯片含有一个无抗生素的对照和最多7种不同的抗生素。将最多4个芯片加载到我们的原型仪器中，其中给定芯片的每个回路同时生成微滴阵列，在4小时的过程中对其进行培养和成像。将得到的图像处理为波形，并通过对照和独特抗生素的成对分析生成AST调用。
包括了前述描述和实施例以及附图来说明本发明的特定方面。本领域技术人员应该理解，说明书、实施例或附图中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此可以认为是构成其实践的特定模式的技术。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，在所公开的具体实施方案中可以做许多改变，并仍获得类似或相似的结果。
Claims (24)
1.一种用于评估样品的方法，其包括：
(a)将样品分成两个或多于两个子样品或样品部分，包含对照子样品和至少一个测试样品；
(b)将每个子样品或样品部分与一种或多于一种试剂、一种或多于一种反应物、或一种或多于一种试剂和一种或多于一种反应物混合，形成不同的子样品或样品部分混合物；
(c)将每个子样品或样品部分混合物分区至多个小体积区室，其中一些小体积区室含有一个细胞或一个细胞聚集体；
(d)检测小体积区室的物理或化学特征随时间的变化并生成与每个区室相关的数据；和
(e)将数据作为输入信息传输到使用机器学习优化的至少一个函数并生成分析输出信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括：
(f)将数据作为输入信息传输到(i)至少一个神经网络和(ii)表征器，形成神经网络输出信息和表征器输出信息；
(g)将神经网络输出信息传输到分类器并形成分类器输出信息；和
(h)将表征器输出信息和分类器输出信息传输到第二神经网络，所述第二神经网络形成分析输出信息。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是环境样品或生物样品。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物样品是患者样品。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述患者是人类患者。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物样品是支气管肺泡灌洗液(BAL)、痰、唾液、尿液、血液、脑脊液、精液、粪便、拭子、刮除物、脓或组织。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照子样品不包含反应物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照子样品不包含试剂。
9.根据权利要求1所述的方法，其中将一个或多于一个子样品与试剂和反应物混合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应物是营养混合物或药物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为荧光试剂或发光试剂。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析输出信息是临床终点的决定。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述临床终点是患者治疗成效、药物的最小抑制浓度、易感或耐药细胞、或预后。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述预后是住院持续时间或对象的不良事件风险。
15.一种用于评估样品的方法，其包括：
(a)将样品分成两个或多于两个子样品或样品部分，包含对照子样品和至少一个测试样品；
(b)将每个子样品或样品部分与一种或多于一种试剂、一种或多于一种反应物、或一种或多于一种试剂和一种或多于一种反应物混合，形成不同的子样品或样品部分混合物；
(c)将每个子样品或样品部分混合物分区至多个小体积区室，其中一些小体积区室含有一个细胞或一个细胞聚集体；
(d)检测小体积区室的物理或化学特征随时间的变化以及与每个区室相关的数据；
(e)将收集的数据作为输入信息传输到(i)至少一个神经网络和(ii)表征器，形成神经网络输出信息和表征器输出信息；
(f)将神经网络输出信息传输到分类器并形成分类器输出信息；和
(g)将表征器输出信息、分类器输出信息、社区信息和患者信息传输到第二神经网络，所述第二神经网络形成分析输出信息。
16.根据权利要求15所述的方法，其还包括对照子样品。
17.根据权利要求15所述的方法，其中将一个或多于一个子样品与试剂和反应物混合。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述反应物是营养混合物或药物。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述试剂为荧光试剂或发光试剂。
20.一种用于评估样品的方法，其包括：
(a)将样品分为两个或多于两个子样品或样品部分；
(b)将每个子样品或样品部分与一种或多于一种试剂和/或一种或多于一种反应物混合，形成不同的子样品或样品部分混合物；
(c)将子样品或样品部分混合物分区至多个小体积区室，其中一些小体积区室含有一个细胞或一个细胞聚集体；
(d)监测小体积区室的特征随时间的变化并收集区室数据；和
(e)将收集的数据传输到至少一个神经网络。
21.根据权利要求20所述的方法，其还包括对照子样品。
22.根据权利要求20所述的方法，其中将一个或多于一个子样品与试剂和反应物混合。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述反应物是营养混合物或药物。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述试剂为荧光试剂或发光试剂。
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