CN112812157A - 一种羊毛硫肽AmylocinA3及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种羊毛硫肽AmylocinA3及其制备方法和应用，涉及肽类抗生素领域。该新型羊毛硫肽的生物合成基因簇来源于解淀粉芽胞杆菌公开数据库的挖掘，即将挖掘所得羊毛硫肽前体肽AmyA3、合成酶AmyMB和肽酶结构域AmyT150基因共转化至感受态细胞E.coliBL21(DE3)，构建共表达菌株，通过异源表达共表达菌株获得新型羊毛硫肽AmylocinA3；本发明所述新型的羊毛硫肽AmylocinA3具有广谱杀菌作用，对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有较强的抑制效果。

Description

一种羊毛硫肽AmylocinA3及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及肽类抗生素领域，特别是涉及一种羊毛硫肽Amylocin A3及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素是全球最常见的处方药物，但在临床使用中由于耐受药性细菌的出现，使抗生素的使用面对越来越严重的挑战。目前全球为抵御致病菌而导致的抗生素乱用问题日益严重，为此寻找一些新型和环境友好型兼备的抗菌物质代替抗生素已成为研究热点。抗菌肽可以快速有效地杀死具有抗生素抗性的细菌，被认为是传统抗生素的最佳替代物。
羊毛硫肽是革兰氏阳性菌产生的一种环状小分子多肽，对多种食源性致病菌及多药物抗性细菌都有一定的抑制作用。羊毛硫肽类抗菌肽作用靶点通常位于细胞壁或细胞膜上，造成细胞壁或膜的结构不完整，形成孔洞从而杀死细菌，这一杀菌机制也导致羊毛硫肽类抗菌肽的耐药性极少出现。因其特殊的靶标识别作用，羊毛硫肽类抗菌肽几乎不会产生抗性，可作为传统抗生素代替药物。目前已经发现及报道的羊毛硫肽类抗菌肽在50种左右，其中NVB302、Mutacin1140、Duramycin、Gallidermin、Nisin及Microbisporicin已经进入临床研究。这样高的临床研究转化率使得羊毛硫肽类抗菌肽在药物研发中极具前景。
但是羊毛硫肽类抗菌肽通常存在抗菌谱较窄和抗逆性不足的缺点，因此开发研究新型高效的抗逆性较强的羊毛硫肽类抗菌肽具有重要的价值。随着高通量测序技术的快速发展，基于大量的微生物基因组数据显示，解淀粉芽孢杆菌在合成多种新颖的羊毛硫肽类抗菌肽方面，其潜力远超以往的认知。解淀粉芽孢杆菌中存在很多编码羊毛硫肽类抗菌肽的生物合成基因簇，这些基因簇在野生型菌株通常是沉默的，通过异源表达的方法实现这些羊毛硫肽类抗菌肽的生产对于研发新型高效的羊毛硫肽类抗菌肽具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种羊毛硫肽AmylocinA3及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种羊毛硫肽AmylocinA3，所述的羊毛硫肽AmylocinA3的氨基酸序列的骨架氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述骨架氨基酸序列中的第3位和第5位丝氨酸脱水形成脱氢丙氨酸，第7、8、12和18位的苏氨酸脱水形成脱氢丁氨酸，第18苏氨酸脱水并与第25位半胱氨酸形成硫醚环后，获得所述的羊毛硫肽AmylocinA3的氨基酸序列。
进一步的，所述羊毛硫肽AmylocinA3的分子结构式为：
Figure BDA0002930760310000031
本发明还提供一种所述的羊毛硫肽AmylocinA3的制备方法，具体步骤为：将羊毛硫肽前体肽AmyA3基因、合成酶AmyMB基因和肽酶结构域AmyT150基因共转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，构建共表达菌株，共表达菌株异源表达后进行纯化获得所述羊毛硫肽AmylocinA3。
进一步的，所述纯化的具体方法为半制备高效液相色谱法，羊毛硫肽AmylocinA3在23min洗脱出峰。
进一步的，所述羊毛硫肽前体肽AmyA3基因的基因序列如SEQ ID NO:2所示；所述羊毛硫肽合成酶AmyMB基因的基因序列如SEQ ID NO:3所示；所述羊毛硫肽肽酶结构域的基因序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步的，根据任一所述的羊毛硫肽AmylocinA3的制备方法，其特征在于：所述羊毛硫肽前体肽AmyA3基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明还提供一种根据任一所述的羊毛硫肽AmylocinA3在制备抗革兰氏阳性菌产品中的应用。
本发明还提供一种药物组合物，所述组合物以任一所述羊毛硫肽类抗菌肽AmylocinA3或其药学上可接受的盐作为活性成分。
本发明还提供一种所述羊毛硫肽AmylocinA3的骨架氨基酸序列，所述骨架氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明公开了以下技术效果：本发明从解淀粉芽孢杆菌中鉴定和合成出新型的羊毛硫肽AmylocinA3，为多重耐药细菌的治疗提供新的替代药物，为异源生物合成羊毛硫肽提供技术支持。新型的羊毛硫肽AmylocinA3，具有广谱杀菌作用，对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有较强的抑制效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为共表达菌株的PCR扩增产物的验证结果，其中，a为Marker，b为AmyA3，c为AmyMB，d为AmyT150；
图2为共表达菌株3BT的异源表达产物羊毛硫肽AmylocinA3的高效液相纯化图谱；
图3为羊毛硫肽AmylocinA3的串联质谱分析的质谱图；
图4为羊毛硫肽AmylocinA3结构示意图；
图5为羊毛硫肽AmylocinA3化学结构式。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
除非特殊说明，本发明中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术。
除非特殊说明，本发明中所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
LB培养基：用于大肠杆菌的培养；
胰蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母提取物5g，加去离子水定容至1000mL，调节pH值为7.0-7.2。
下述实施例中所用到的菌株和载体：
大肠杆菌BL21(DE3)购自北京全式金生物技术公司(TransGen Biotech)。指示菌：金黄色葡萄球菌由河北省科学院生物所保藏。pET-28a、pCDFDuet-1和PACYCDuet-1载体购自天恩泽生物技术公司(TIANDZ)。
下述实施例中所用到的生物信息学工具：
数据库：NCBI(National Center for Biotechnology Information Searchdatabase)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；
分析软件：BAGEL3(http://bagel.molgenrug.nl/)；antiSMASH4.0(https://antismash.secondarymetabolites.org/)；Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)。
本地软件：EditSeq软件，Primer 5.0软件，MegAlign软件。
实施例1羊毛硫肽AmylocinA3的来源及筛选过程
1、在NCBI数据库中的“Genome”条目下输入“Bacillus amyloliquefaciens”查找解淀粉芽胞杆菌菌种所有菌株基本信息并获取所有菌株的NCBI登录号。
2、通过生物信息学软件antiSMASH 4.0和BAGEL 3挖掘27株解淀粉芽孢杆菌进行了基因组数据挖掘，共预测到314个基因簇，这些基因簇主要分为16种类型。并发现其中DSM7、TA208等12株菌中含有18个第二类羊毛硫肽合成基因簇，共挖掘出21个潜在的第二类羊毛硫肽，其中即存在合成新型羊毛硫肽AmylocinA3的前体肽基因。新型羊毛硫肽AmylocinA3的前体肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。合成酶AmyMB和肽酶结构域AmyT150基因从解淀粉芽孢杆菌WS-8基因组序列获得，合成酶AmyMB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，肽酶结构域AmyT150基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。解淀粉芽孢杆菌WS-8在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,编号为CGMCCNo.11787。
实施例2构建基因表达载体
将实施例1中挖掘出的羊毛硫肽前体肽AmyA3、合成酶AmyMB和肽酶结构域AmyT150基因的碱基序列送至NovoPro公司进行合成。并将前体肽基因构建到pET28a载体上，合成酶基因构建到pCDFDuet-1载体上，肽酶结构域基因构建到pACYCDuet-1载体上。
实施例3构建共表达菌株和异源表达
1、将实施例2得到的含有羊毛硫肽前体肽AmyA3、合成酶AmyMB和肽酶结构域AmyT150基因的三个重组载体利用热激转化法共转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，构建共表达菌株。
2、利用含三种抗生素(卡纳霉素、壮观霉素、氯霉素)的LB平板筛选出阳性共表达菌株。
3、采用菌落PCR的方法对共表达菌株的阳性菌落进行鉴定。
所用引物为：
AmyA3 F1(SEQ ID NO:6)：TAATACGACTCACTATAGGG；
AmyA3 R1(SEQ ID NO:7)：TTATACTTGCCTTTGCGGAC；
AmyMB F1(SEQ ID NO:8)：CCTGGGTGATATCTATGAAAACTAA；
AmyMB R1(SEQ ID NO:9)：TTAATCCAGTGCCAGCGGTGTCG；
AmyT150 F1(SEQ ID NO:10)：CACCATCATCACCACCTG；
AmyT150 R1(SEQ ID NO:11)：TTAGGCGGTTTTATCTTTGCGTTCC。
PCR反应体系为：上游引物1.5uL，下游引物1.5uL，模板DNA 1uL，10×Buffer 5uL，2Mm dNTPs 5uL，25mM MgSO4 2uL。
含前体肽AmyA3共表达菌株PCR验证条件：95℃2min；95℃30s，Tm55℃40s，72℃30s，共32个循环；72℃10min；4℃保存。
含合成酶AmyMB共表达菌株PCR验证条件：95℃2min；95℃30s，Tm53℃40s，72℃2min，共32个循环；72℃10min；4℃保存。
含肽酶结构域AmyT150共表达菌株PCR验证条件为：95℃2min；95℃30s，Tm50℃40s，72℃1min，共32个循环；72℃10min；4℃保存。
共表达菌株验证结果如图1所示，其中a为Marker，b为AmyA3，c为AmyMB，d为AmyT150。PCR扩增产物条带与目的条带相一致，表明共表达菌株构建成功。
4、挑取共表达菌株菌落接种于100mL含三种抗生素(卡纳霉素、壮观霉素、氯霉素)的LB液体培养基中，37℃培养12h，180rpm连续摇动。
5、将步骤4中的菌液以5％接种量接种至含有800mL LB液体培养基的转瓶中，在37℃下连续摇动培养。培养90min后，测定OD600值为0.6-0.8时，将摇床温度降低至25℃，半小时后，在超净台上加入IPTG使其终浓度为0.2mM/mL。
6、保持25℃，180rpm连续摇动培养24h后，8000rpm 4℃离心20min，收集菌体。菌体沉淀-20℃保存备用。
实施例4羊毛硫肽AmylocinA3的纯化和鉴定
1、将实施例3得到的菌体取甲醇萃取4h后，收集甲醇萃取相，经0.22um的有机滤膜过滤后，采用半制备高效液相色谱分离纯化(HPLC:SHIMADZU LC-20A,Japan)。
C18柱型号为Shim-pack VP-ODS，内径20mm，柱长250mm，填充介质为C18，检测波长范围(190-800nm)。
流动相由A液和B液组成。其中，A液由H2O和三氟乙酸组成，三氟乙酸在A液中的体积百分含量为0.1％；B液由乙腈和三氟乙酸组成，三氟乙酸在B液中的体积百分含量为0.1％。
洗脱条件为：10％-35％乙腈线性梯度洗脱(0-13min)；35％-100％乙腈线性梯度洗脱(13-43min)；100％乙腈等度洗脱(43-53min)；100％-10％乙腈线性梯度洗脱(53-63min)；10％乙腈等度洗脱(63-78min)；上样量为5000uL，流速为5mL/min，检测波长为214nm，柱温为30℃。
共表达菌株3BT的异源表达产物羊毛硫肽AmylocinA3的高效液相纯化图谱如图2所示，图中以星号标注的色谱峰即为AmylocinA3，出峰时间为23min。
2、采用QTOF MS/MS质谱鉴定纯化后的AmylocinA3结构：在一级质谱的基础上，选择对应分子量为3053.51Da的母离子进行二级串联质谱分析，串联质谱分析结果如图3所示。
羊毛硫肽AmylocinA3的结构示意图如图4所示。羊毛硫肽AmylocinA3的骨架序列SEQ ID NO:1所示，其中第3和第5位丝氨酸脱水形成脱氢丙氨酸，第7、8、12和18位的苏氨酸脱水形成脱氢丁氨酸，第18苏丝氨酸脱水并与第25位半胱氨酸形成硫醚环后，得到羊毛硫肽AmylocinA3的氨基酸序列。羊毛硫肽AmylocinA3化学结构式如图5所示。
实施例5：羊毛硫肽AmylocinA3生物活性活性测定
以金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、大肠杆菌和荧光假单胞菌为指示菌做平板对峙实验。制备菌悬液倒入预热融化的固体LB培养基中混匀后到平板，每个平板定量倒入30mL。待平板凝固后，使用直径为8mm的打孔器打孔。每个孔内加入100uL分离组分，最后置于37℃恒温培养箱中培养1天后观察结果，以相同体积相同浓度的Nisin(乳链菌肽)作为对照，实验结果如表2所示，结果表明，AmylocinA3对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌具有较强抑菌活性。
表2羊毛硫肽AmylocinA3生物活性活性测定
Figure BDA0002930760310000111
实施例6羊毛硫肽AmylocinA3与羊毛硫肽前体肽amyA6(申请号为201910997810.1)生物活性比较
发明人在前期研究中发现了可以提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性的羊毛硫肽前体肽amyA6，羊毛硫肽前体肽amyA6与本发明公开的羊毛硫肽AmylocinA3的氨基酸序列较为相似，但二者作用完全不同。
以金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌为指示菌做平板对峙实验。制备菌悬液倒入预热融化的固体LB培养基中混匀后到平板，每个平板定量倒入30mL。待平板凝固后，使用直径为8mm的打孔器打孔。每个孔内加入100uL分离组分，最后置于37℃恒温培养箱中培养1天后观察结果，以相同体积相同浓度羊毛硫肽前体肽amyA6进行活性比较，实验结果如表3所示，结果表明，羊毛硫肽AmylocinA3对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌具有较强抑菌活性，而羊毛硫肽前体肽amyA6对革兰氏阳性菌没有抑制活性。
表3羊毛硫肽AmylocinA3与amyA6生物活性比较
Figure BDA0002930760310000121
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 河北省科学院生物研究所
<120> 一种羊毛硫肽Amylocin A3及其制备方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Asn Ser Val Ser Ile Thr Thr Ile Pro Ile Thr Asn His Val Cys
1 5 10 15
Pro Thr Ile Thr Val Gly Cys Ala Cys Pro Gln Arg Gln Val
20 25 30
<210> 2
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaagaga acttcagcgc gttgtatgaa acatcagagc aagaattaag agagcttatt 60
ggagggcaaa actcagtatc aataacaaca attccaataa caaatcatgt ttgtccaact 120
atcacagtag gctgcgcatg tccgcaaagg caagtataa 159
<210> 3
<211> 2907
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcatcacc atcatcacca catgaacaaa acccagaaca gcgataacta tgtgtatgag 60
aatagcatgc tgaacctgtt caaagaagag gattattttg aaggcttcgc ccagtattat 120
atcagcatct ttaaagccca gatcgtgaaa gaaattgatc gtattccgag cgaaagcctg 180
ctggataaag gttgtctggt tgaaagcatt ctgatcaact acaaaaaaaa gatctatcat 240
ctggcaggca aaaccctgat ccatgaattt catcagacct tcgatgagtt cgatcagaaa 300
aacgagagca aaaactatga catctttagc gaacgcctga aaaatagcgc atttgtggaa 360
gaaatcctga acaattatcc ggttctgcag gatctgatta gccgtagcac cagcgatttt 420
attcgtttta ccatcagcat catcaagcac tgggtgaacg attataagaa aatccagcag 480
aaatttaacc tgagctttgg caaaatgcgc aaaatcaata tgaatgccgg tgatgttcat 540
aatggtggta aaagcgttgt gatcatcgag ttcgaaaata acaagctggt gtataaaccg 600
cgtagcctgg aaattgatgt gttctatgaa aaagtgatcg attatgtgaa ccagtattac 660
cagaccaatc tgaaaacacc gctgagcctg aatcagggtg aatatggttg gcaagaatat 720
gttcagagcg aaccgtgtga taatatcgaa caggtgcgca attattacta tcagtttggt 780
atgcacctgg gcttcattta tgcatttcag ggtagcgatt ttcacttcga aaacattatt 840
gcctgtcgtg ataaaccggt tctggttgat ctggaaaccc tgtttcagag cagcctgttt 900
tttagcgaag agaacaaaga aaacgtgaat ctgatggcaa gcgcacaggt gaataaaacc 960
attctgaaaa gcgcactgtt caactatatg agctttccgg aagataatgg cctgacaaat 1020
attggtggtc tgattaatac cgaaaaccag aaaggcgaaa aagaagaagt gctgcatatc 1080
aaaaccgaca aaattagcat gcgcaagaaa cagtacctgt ttaaacgtgg tcgtaatctg 1140
ccggtgtata agaataaagt tgccgaatgc tttgaattcg aacgcgaatt tatcgaaggc 1200
ttcaaacgca tctattttat cctgaaagag gatctgtata tccgcaacct gattagcgat 1260
ctgaattatg caccgattcg tattattgtt cgtccgacct atgtttatgc aagctttctg 1320
gaaacactgc tgcatccgat gtatctgaaa gattatggtg aacgtattcg tgtgctgagc 1380
tttatcaaag atgcctacac caaatacaaa gtgttcgata gcattagccc gttcgagatc 1440
aaagatatga tgattggtga tatcccgtat ttcaacgcac cgattagcga aaaacgtgtg 1500
tattccaata gcatccatgt tgttgatacc ggcattatga aacagagcgc aaaacaagaa 1560
gttctgaccc gtctggcaaa tatgagcgaa gaagatatgc atcagcaggt tagcctgatt 1620
aacatggcac tgagcagcac cgcagcaaat ctggatatta tctataaaaa ccagatcgat 1680
gacttcgttc cgggttatct gaaaaacgac atccagatta aagaactgat ccagattgaa 1740
accgactgca ttctgaagca ggcaattgaa agcgaaaaat atctgcagtg ggttagcatt 1800
gtttcagcac cgaatggcac cctgagcgtt ggtccgctga gttttggtct gtatgatggc 1860
ctggcaggcg tgggtctgta ttttagcgca tatgatttca tctacaacga tgagaaagtg 1920
aaaagcgtgc tgcgtaaaat tgtgaacagc attaaccaga tctacgagca cagcatttac 1980
aaaaccaact ttagcgcctt ttatggcagc agcagctata tctatttcgt gaacaaaatg 2040
cgtggcaccg gtctgtatag cgaaaatgaa gttaatagca tgtgcaaggc ctacctggaa 2100
aaactgcgtc aagaaaccgc acagattacc catacagatt ttattggcgg tctggcaggt 2160
attctgaaag ttgttattca gctgggtcgt tattatcgta ccgaactgat ggaagatacc 2220
gcacgtgcag tttgtaaaga aatttgtaaa cgtgccattc agaatcgcaa tgaggcatat 2280
tggaaaagtg atgccgatga aaatattgtg ctggcaggtt ttagccatgg tattaccggt 2340
atttgttatg ccctgagcga atattatgca catattgaag caagtggcga agttctgcgt 2400
ctgattgaaa gtgcactgaa atatgaggac aagttcttcg acatcaagat caacaaatgg 2460
cgtgataacc gcaaaaacga aagcgattat tcaagcgcaa tgtggtgtca tggtagctgt 2520
ggtatcctgc tgggtcgcag ccgtatttat gaaaatgttg atggtcgtat tcacgtgggc 2580
tatatcaatg aaagcctgga tgataccctg ctgaatggta atagccatcg tcagggttat 2640
agcctgtgtc atggcaccat gggtaatatt gatgttctgc atgcaattaa agagctgtcc 2700
ctgtttaaga accgcaaaca agaaatcgag aacacgatta acatttgggt gaaccacttt 2760
gaagagaatc tgctgaaaaa tggctggcag aatggtattc gtaatgatca tagcggtctg 2820
ggtatgatgc tgggcaaaac cggtcagctg tatgcactgc tgcgcctggt taataaagaa 2880
atcccgacac cgctggcact ggattaa 2907
<210> 4
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcatcacc atcatcacca catgaaaatc cgcaaacgta aactgccggt tattctgcag 60
cgtaatcagt ttgattgtgg tattacctgt ctggcaatgg ttctgagccg tgcagaaggc 120
attaaaatca atccgaataa actgaaactg aacaaagaaa tcattggccg tgatggcacc 180
gatctgattg aaatgaaaaa aatcagcgaa accttcgact acgactttaa agcatttcgc 240
accgataaca tcatgcagct gaaagagctg aataaaaacc atccgctgat tgtgcattgg 300
aaccataatc attttgttgt cgttgatgcc tttggcacgg ataacgttaa aatcattgat 360
ccgagcagcg gtcgtctgac cattacactg gaagaattca aaaccttcta taacggcatt 420
agcattatgc tgatccgcaa aaatgaactg gaacgcaaag ataaaaccgc ctaa 474
<210> 5
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Lys Glu Asn Phe Ser Ala Leu Tyr Glu Thr Ser Glu Gln Glu Leu
1 5 10 15
Arg Glu Leu Ile Gly Gly Gln Asn Ser Val Ser Ile Thr Thr Ile Pro
20 25 30
Ile Thr Asn His Val Cys Pro Thr Ile Thr Val Gly Cys Ala Cys Pro
35 40 45
Gln Arg Gln Val
50
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactataggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttatacttgc ctttgcggac 20
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctgggtgat atctatgaaa actaa 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttaatccagt gccagcggtg tcg 23
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caccatcatc accacctg 18
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttaggcggtt ttatctttgc gttcc 25

Claims (9)

1.一种羊毛硫肽AmylocinA3，其特征在于：所述的羊毛硫肽AmylocinA3的氨基酸序列的骨架氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述骨架氨基酸序列中的第3位和第5位丝氨酸脱水形成脱氢丙氨酸，第7、8、12和18位的苏氨酸脱水形成脱氢丁氨酸，第18苏氨酸脱水并与第25位半胱氨酸形成硫醚环后，获得所述的羊毛硫肽AmylocinA3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的羊毛硫肽AmylocinA3，其特征在于，所述羊毛硫肽AmylocinA3的分子结构式为：
Figure FDA0002930760300000021
3.一种根据权利要求1或2所述的羊毛硫肽AmylocinA3的制备方法，其特征在于，具体步骤为：将羊毛硫肽前体肽AmyA3基因、合成酶AmyMB基因和肽酶结构域AmyT150基因共转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，构建共表达菌株，共表达菌株异源表达后进行纯化获得所述羊毛硫肽AmylocinA3。
4.根据权利要求3所述的羊毛硫肽AmylocinA3的制备方法，其特征在于：所述纯化的具体方法为半制备高效液相色谱法，羊毛硫肽AmylocinA3在23min洗脱出峰。
5.根据权利要求3所述的羊毛硫肽AmylocinA3的制备方法，其特征在于：所述羊毛硫肽前体肽AmyA3基因的基因序列如SEQ ID NO:2所示；所述羊毛硫肽合成酶AmyMB基因的基因序列如SEQ ID NO:3所示；所述羊毛硫肽肽酶结构域的基因序列如SEQ ID NO:4所示。
6.根据权利要求3或5所述的羊毛硫肽AmylocinA3的制备方法，其特征在于：所述羊毛硫肽前体肽AmyA3基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
7.一种根据权利要求1或2所述的羊毛硫肽AmylocinA3在制备抗革兰氏阳性菌产品中的应用。
8.一种药物组合物，其特征在于：所述组合物以权利要求1或2所述的羊毛硫肽类抗菌肽AmylocinA3或其药学上可接受的盐作为活性成分。
9.一种权利要求1所述羊毛硫肽AmylocinA3的骨架氨基酸序列，其特征在于，所述骨架氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
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