CN112773788A - 双氢青蒿素在制备非小细胞肺癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双氢青蒿素在制备经过放疗的非小细胞肺癌药物中的应用。本申请首次对PD‑L1表达与NSCLC放疗抗性的关系进行了研究，DHA能有效地缓解NSCLC治疗中放疗抗性，并可作为NSCLC放疗增敏剂。

Description

双氢青蒿素在制备非小细胞肺癌药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体为双氢青蒿素在制备非小细胞肺癌药 物中的应用。
背景技术
在中国，肺癌是是死亡率较高的癌症之一，并且非小细胞肺癌 (NSCLC)患者占所有肺癌患者数量高达80％(W.Chen et al.,2016)。 放射治疗在多学科管理NSCLC患者中是最重要的非手术治疗方法， 大约有70％的非小细胞肺癌患者在接受治疗期间需要进行放疗 (Harrington et al.,2011)。然而，放射抗性仍然是导致癌症患者预后差 的一个主要临床问题(Restifo et al.,1993；Shen et al.,2017；Shimura et al.,2010)。
非小细胞肺癌是一个高免疫抑制性恶性肿瘤，它有多个免疫机制 逃避抗肿瘤免疫反应，包括免疫调节细胞因子的释放，T细胞激活抑 制以及其他缺陷(Shimura et al.,2010；Shimura et al.,2014)。放射疗法 使用X，γ电离辐射或者高能电子激光，通过破坏肿瘤细胞的DNA来 杀伤肿瘤细胞，因此它能够发挥靶向治疗作用(Shimura et al.,2013)。然而，放射治疗并不是对所有的NSCLC患者都有效，而且有些病人 在放射治疗后会产生放射抗性。之前放疗相关研究主要关注的是肿瘤 细胞自身，而忽略了免疫系统在肿瘤微环境中的作用。由于放疗的效 果和放射敏感性因人而异，最近越来越多的证据表明放射抗性和免疫 逃逸之间有密切的关系(Atkins&Larkin,2016；Deng et al.,2014； Dovedi et al.,2014；Filippi,Di Muzio,Badellino,Mantovani,&Ricardi, 2018；Macherla et al.,2018；Masago et al.,2017；Shen et al.,2017)。有报 道表明，一些特定的信号通路如DNA损伤修复、细胞黏附、免疫检查 点阻滞和炎症反应也会促成抗肿瘤的放射抗性(Chinnaiyan,Allen,& Harari,2006；J.Li et al.,2014；Pitroda et al.,2018；Schuurbiers et al., 2009；Shen et al.,2017；Shimura et al.,2013；Ye et al.,2009)。
程序性细胞死亡配体1(PD-L1)是限制抗肿瘤免疫反应的重要 免疫检查分子，并且能够诱导免疫逃逸(Deng et al.,2014；Macherla et al.,2018；Masago et al.,2017)。现有技术的研究表明，PD-L1高表达的 NSCLC患者会产生放疗抗性，并且他们的放疗效果比那些PD-L1阴性 的患者差(X.Gong et al.,2017；X.M.Gong,Zhang,Torossian,Cao,& Fu,2012)。同时，已有研究证实，在NSCLC细胞水平和动物水平， PD-L1抗体联合放疗能够增强放疗效果(X.Gong et al.,2017；Simone, Burri,&Heinzerling,2015)。虽然放疗能够杀死一部分NSCLC细胞， 但可能会通过增加未被杀死的NSCLC细胞中PD-L1的表达诱导放疗 抗性。放疗可以上调PD-L1的表达，目前多项研究已证实，PD-L1上 调后NSCLC细胞系的放疗抗性也增加。
PD-L1抗体已经被广泛用于非小细胞肺癌的治疗，但是它经常会 诱导出许多意料之外的副作用，并且很多病人承担着高额医疗费却没 能获得生存收益(Filippi et al.,2018；Shen et al.,2017；Somasundaram& Burns,2017)。因此，我们有望找到一个能够抑制PD-L1表达的小分子 化合物，用于和放疗一起联合治疗非小细胞肺癌。
青蒿素是青蒿中著名的倍半萜内酯过氧化物(Dondorp et al.,2011； Meshnick,2002；O'Neill&Posner,2004)，因为其衍生物经FDA批准为 有效，并被WHO推荐用于治疗疟疾。双氢青蒿素(DHA)是青蒿中 许多青蒿素化合物的活性代谢产物，并且其抗疟疾的效力是青蒿素的 5倍(Fairhurst et al.,2012；Y.Li,2012)。值得注意的是，双氢青蒿素已 经显示对许多肿瘤，包括肝癌、胰腺癌、肺癌等，有很好的抑制作用 (Cao et al.,2014；Hou,Wang,Zhang,&Wang,2008；Jiao et al.,2007；Lu et al.,2009；Mu et al.,2008；Nam etal.,2007)。
发明内容
如背景技术所述，非小细胞肺癌的患者大多在临床上会选择化疗， 而这种类型的肿瘤化疗特别容易产生放疗抗性，而产生抗性的研究多 数认为是因为PD-L1表达上调，作为抑制PD-L1上调的临床药物一般 都是抗PD-L1抗体，抗PD-L1抗体经常会诱导出许多意料之外的副作 用，并且很多病人承担着高额医疗费却没能获得生存收益(Filippi et al.,2018；Shen et al.,2017；Somasundaram&Burns,2017)。
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种双氢青蒿素在制备经 过放疗的非小细胞肺癌药物中的应用，所述双氢青蒿素的分子式如下：
Figure BDA0002708930120000031
本发明所述应用中，所述经过放疗的非小细胞肺癌为未对放疗产 生放疗抗性的非小细胞肺癌，或对放疗产生了放疗抗性的非小细胞肺 癌。
本发明所述应用中，所述双氢青蒿素通过抑制PD-L1的表达对经 过放疗的非小细胞肺癌产生作用；和/或，双氢青蒿素抑制PD-L1非依 赖性信号通路，TRIM21和EMT的蛋白激酶激活，从而增强非小细胞 肺癌的放射敏感性。
根据NSCLC细胞和异种移植小鼠模型的免疫印迹结果显示，在 经过DHA给药后，TGF-β、pAKT、pSTAT3和PD-L1的表达受到抑制， 从而消除免疫逃逸。因此，DHA能够通过抑制TGF-β、pAKT和pSTAT3，下调PD-L1的表达。
上皮间质转化(EMT)能够促进细胞凋亡以增强放疗敏感性。 EMT相关蛋白包括E-钙粘蛋白、波形蛋白、snail蛋白和N-钙粘蛋白， 并且它们的表达可以反映细胞凋亡率。本研究显示，经过DHA治疗后， TRIM21的蛋白表达显著减少；经过DHA给药后，A549/X和PC9/X细 胞中E-钙黏蛋白的表达显著增加，而波形蛋白、snail蛋白和N-钙粘蛋 白的表达均减少。这表明，DHA可能通过调节EMT的过程增强放射 敏感性。此外，免疫印迹结果显示，经过放疗和DHA治疗后，凋亡前 蛋白的表达显著下调，半胱氨酸蛋白酶-8和半胱氨酸蛋白酶-3的裂解 增加以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调。因此，DHA可能通过激活 PD-L1非依赖性下游信号通路，TRIM21和EMT相关蛋白，增强放射 敏感性，从而促进细胞凋亡。本发明进一步明确了PI3K/AKT和 STAT3是PD-L1的上游信号通路。
本发明所述应用中，所述双氢青蒿素还可以用于逆转非小细胞肺 癌对PD-L1靶向药物产生的耐药。
本发明所述应用中，所述双氢青蒿素与抗癌药物联合使用；优选 地，所述抗癌药选自顺铂、吉西他滨、紫杉醇中的至少一种。
本发明第二方面提供一种PD-L1抑制剂，该抑制剂为双氢青蒿素， 所述双氢青蒿素的分子式如下：
Figure BDA0002708930120000041
本发明第三方面提供一种非小细胞肺癌的放疗增敏剂，该增敏剂 为双氢青蒿素，所述双氢青蒿素的分子式如下：
Figure BDA0002708930120000051
研究发现，异种移植小鼠模型的免疫印迹和IHC结果显示，DHA 能够消除iTregs和MDSCs的局部聚集，促进肿瘤微环境中CD8+T细胞 的渗透，这表明DHA联合放射治疗可以协同增强抗肿瘤效果。据我们 所知，这是目前第一例阐述小分子作为改善肺癌免疫微环境增强放疗 增敏剂的报告，它通过阻止免疫逃逸消除放射抗性，通过抑制PD-L1 表达促进放射敏感性。
本发明第四方面提供一种用于治疗经过放疗的非小细胞肺癌药 的药物，该药物为双氢青蒿素，所述双氢青蒿素的分子式如下：
Figure BDA0002708930120000052
本发明中所述药物，该药物还包括药学可接受的辅料。所述药物 优选为可以高效递送DHA的载体，如脂质体，水凝胶，纳米颗粒等， 以提高DHA的水溶性、生物利用度和抗癌治疗效果，并促进DHA的 工业化生产。因此，未来DHA制剂可能会有价格低廉和供应稳定的优 势。
本发明中所述药物，还包括与抗癌药；优选地，所述抗癌药选自 顺铂、吉西他滨、紫杉醇中的至少一种。
研究发现，顺铂与DHA联合治疗可以协同抑制肺癌肿瘤血管的生 成，DHA通过抑制顺铂诱导的mTOR激活，可以协同增强顺铂在耐药 的癌细胞中的抗肿瘤作用。吉西他滨与DHA联用可以协同诱导A549 NSCLC细胞，并且在小鼠模型中的血液毒性较低。DHA通过诱导活 性氧增加表现出协同抗肿瘤的效果，并且其血液毒性比单用吉西他滨 更低。紫杉醇和DHA通过缀合形成纳米粒子复合物可以显著降低大剂 量紫杉醇导致的严重副作用。
我们的研究具创造性地发现DHA通过调控免疫检查点PD-L1的 含量，抑制PD-L1的表达，改善免疫微环境，增强NSCLC肿瘤组织中 CD8+T细胞的浸润，提高机体的免疫监控机能，增强放疗疗效，延 长PFS、OS。
与现有技术比，本发明取得了如下积极效果：本申请首次对 PD-L1表达与NSCLC放射抗性的关系进行了研究，DHA能有效地缓解 NSCLC治疗中放疗抗性，并可作为NSCLC放疗增敏剂。进一步机理 研究发现，DHA通过抑制PD-L1表达从而增强NSCLC抗癌症放疗效果 的协同机制。由于DHA在市场上可以购买且有经济价值，因此DHA 和放疗联合治疗可能会为NSCLC患者提供一个极具前景的治疗策略。
附图说明
图1NSCLC中PD-L1的表达与抗放射性呈正相关，并且放射治疗 能够增强NSCLC细胞PD-L1的表达。
A.两名PD-L1表达阴性和阳性的代表性患者对放射治疗的反应 不同。B.经MTT测定，在给予每次2Gy的放射后A549、A459/X、PC9 和PC9/X细胞系的生长抑制。C.经免疫印迹实验，给予常规分次放疗 后(0，2，4，6Gy，每次2Gy)A549、A459/X、PC9和PC9/X细胞系 中PD-L1的表达。D.经流式细胞术，在体外分三次共给予6Gy的放射 后A549、A459/X、PC9和PC9/X细胞系中PD-L1的表达。
图2放疗和DHA治疗对A549和A549/X细胞中PD-L1、TGF-β、 PI3K/Akt和STAT3信号通路作用效果。
A.用媒介D，R，D+R处理的A549和A549/X细胞系的MTT测定 结果；B.用媒介D，R，D+R处理的A549/X-NC和A549/ X-Si-PD-L1-RNA细胞系的MTT测定结果；C.通过免疫印迹法，用媒 介D，R，D+R处理的A549和A549/X细胞系中TGF-β、Akt、p-Akt、 STAT3、p-STAT3、NF-κB和PD-L1的表达情况。该值表示为平均值 ±SEM。ap<0.05vs A549组，bp<0.05vs A549/X组，cp<0.05vs A549 /X-R组；D.通过免疫印迹法，用媒介D，R，D+R处理的用NC或PD-L1 siNRA转染的A549/X细胞系中TGF-β、Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3、 NF-κB和PD-L1的表达情况；该值表示为平均值±SEM。ap<0.05vs A549/X-NC组，bp<0.05vs A549/X-Si-PD-L1-RNA组，cp<0.05vs A549/X-Si-PD-L1-RNA+R组。
图3放疗和DHA对PC9和PC9/X细胞中PD-L1、TGF-β、PI3K/Akt 和STAT3信号通路的影响。
A.用媒介D，R，D+R处理的PC9和PC9/X细胞系的MTT检测结 果；B.用媒介D，R，D+R处理的PC9/X-NC和PC9/X-Si-PD-L1-RNA 细胞系的MTT检测结果；C.通过免疫印迹法，用媒介D，R，D+R处 理的PC9和PC9/X细胞系中TGF-β、Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3、 NF-κB和PD-L1的表达情况。该值表示为平均值±SEM。ap<0.05vs PC9组，bp<0.05vs PC9/X组，cp<0.05vsPC9/X-R组；D.通过免疫 印迹法，用媒介D，R，D+R处理的用NC或PD-L1 siNRA转染的PC9/X细胞系中TGF-β、Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3、NF-κB和PD-L1的 表达情况。该值表示为平均值±SEM。ap<0.05vs PC9/X-NC组，bp<0.05 vs PC9/X-Si-PD-L1-RNA组，cp<0.05vs PC9/X-Si-PD-L1-RNA+R组。
图4放疗和DHA对A549 and A549/X细胞系中凋亡相关性信号通 路的影响。
A.通过免疫印迹法，用媒介D，R，D+R处理的A549和A549/X 细胞中TRIM21、凋亡相关蛋白、Bcl-2、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3、 裂解的半胱氨酸蛋白酶-8、Bim以及EMT相关蛋白、波形蛋白、E-钙 黏蛋白、Snail蛋白和N-钙黏蛋白的表达情况。该值表示为平均值 ±SEM，ap<0.05vs A549组，bp<0.05vs A549/X组，cp<0.05vs A549/X-R 组。
B.用媒介D，R，D+R处理的A549/X、A549/X-NC和 A549/X-Si-PD-L1细胞中TRIM21、凋亡相关蛋白、Bcl-2、裂解的半胱 氨酸蛋白酶-3、裂解的半胱氨酸蛋白酶-8、Bim以及EMT相关蛋白、 波形蛋白、E-钙黏蛋白、Snail蛋白和N-钙黏蛋白的表达情况；该值表 示为平均值±SEM。ap<0.05vs A549/X-NC组,bp<0.05vs A549/X-Si-PD-L1组,cp<0.05vs A549/X-Si-PD-L1+R组。
图5放疗和DHA对PC9 and PC9/X细胞系中凋亡相关性信号通路 的影响。
A.通过免疫印迹法，用媒介D，R，D+R处理的PC9和PC9/X细 胞系中TRIM21、凋亡相关蛋白、Bcl-2、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3、 裂解的半胱氨酸蛋白酶-8、Bim以及EMT相关蛋白、波形蛋白、E-钙 黏蛋白、Snail蛋白和N-钙黏蛋白的表达情况。该值表示为平均值 ±SEM。ap<0.05vs A549组,bp<0.05vs A549/X组,cp<0.05vs A549/X-R 组。
B.通过免疫印迹法，用媒介D，R，D+R处理的PC9/X,PC9/X-NC 和PC9/X-Si-PD-L1细胞系中TRIM21、凋亡相关蛋白、Bcl-2、裂解的 半胱氨酸蛋白酶-3、裂解的半胱氨酸蛋白酶-8、Bim以及EMT相关蛋 白、波形蛋白、E-钙黏蛋白、Snail蛋白和N-钙黏蛋白的表达情况。该值表示为平均值±SEM。ap<0.05vs PC9/X-NC组,bp<0.05vs PC9/X-Si-PD-L1组,cp<0.05vsPC9/X-Si-PD-L1+R组。
图6放疗和DHA在NSCLC异种移植小鼠模型中的协同作用。
A.在体内用媒介D，R，D+R处理12天后异种移植小鼠模型的肿 瘤体积。B.通过免疫印迹法，在NC,D,R和D+R组中凋亡相关蛋白 Bcl-2,裂解的半胱氨酸蛋白酶-3,裂解的半胱氨酸蛋白酶-8,Bim和 EMT相关蛋白PD-L1,TRIM21,波形蛋白,E-钙黏蛋白,Snail蛋白和N-钙黏蛋白的表达情况。该值表示为平均值±SEM。ap<0.05vs NC组， bp<0.05vs D组，cp<0.05vs R组。C.免疫印迹法，在NC,D,R和D+R 组中EMT相关蛋白PD-L1,TRIM21，波形蛋白,E-钙黏蛋白,Snail蛋白 和N-钙黏蛋白的表达情况。放疗联合DHA组，E-钙黏蛋白的表达显 著增加，而波形蛋白,Snail蛋白和N-钙黏蛋白的表达减少。这表明， DHA可能通过抑制EMT过程从而增强放射敏感性。该值表示为平均 值±SEM。ap<0.05vs NC组，bp<0.05vs D组，cp<0.05vs R组。
图7免疫组化法检测NC，D，R和D+R组PD-L1，CD8+，CD4+， FOXp3+，LyGr+，CD11b+细胞的表达情况，比例尺＝50μm。
图8DHA通过抑制PD-L1表达增强NSCLC抗癌放疗效果的协同 机制。
具体实施方式
以下结合具体实施方式详述本发明，但需说明的是，本发明的保 护范围不受这些具体实施方式和原理性解释的限制，而是由权利要求 书来确定。
本发明中，除了明确说明的内容之外，未提到的任何事宜或事项 均直接适用本领域已知的那些而无需进行任何改变。而且，本文描述 的任何实施方式均可以与本文描述的一种或多种其他实施方式自由 结合，由此形成的技术方案或技术思想均视为本发明原始公开或原始 记载的一部分，而不应被视为是本文未曾披露或预期过的新内容，除 非本领域技术人员认为该结合明显不合理。
本发明所公开的所有特征可以任意组合，这些组合应被理解为本 发明所公开或记载的内容，除非本领域技术人员认为该组合明显不合 理。
本说明书所公开的数值点，不仅包括实施例中具体公开的数值点， 还包括说明书中各数值范围的端点，这些数值点所任意组合的范围都 应被视为本发明已公开或记载的范围。
本发明中的技术和科学术语，给出定义的以其定义为准，未给出 定义的则按本领域的通常含义理解。
说明，本实施例中的数据处理：定量的数值表示为3次独立实验 测定值的均值±标准差(SD)或均值的标准误差(SEM)。本研究采 用独立样本t检验比较均值，用χ2检验和费希尔精确检验来比较分类 值。P<0.05被认为具有统计学意义。我们使用SPSS软件包(version 17.0, Chicago,SPSS Inc.)进行统计分析。
实施例1高PD-L1表达与经放射治疗的NSCLC患者的放射抗性 和不良预后有关
本发明对57例上海市肺科医院手术切除术后复发的NSCLC患者 作为样本，并且他们从2014年1月至2019年12月接受同步放化疗。所 有的入组患者在接受常规分次放疗后均可用于反应评估。我们将 NSCLC组织固定在10％中性缓冲的福尔马林中，并保存为石蜡包埋 档案(FFPE)样品。所有组织均由经验丰富的病理科医生进行检查， 以确认组织学类型和肿瘤含量高于30％。我们对FFPE样本进行PD-L1 免疫组化检测。根据实体肿瘤反应评估标准标准(RESCIST，版本1.1)， 在常规分次放疗一个月和三个月后对肿瘤反应进行评估。
我们通过估计57名接受放射治疗的NSCLC患者预处理活检肿瘤 标本的PD-L1表达水平来评估PD-L1表达与肿瘤消退之间的关系。研 究发现，18名PD-L1表达阴性的患者对放射治疗有良好的反应，而39 名PD-L1表达阳性的患者对放射治疗没有或仅有弱反应。PD-L1表达 阴性的患者(IHC 0)，其客观缓解率ORR值(100％比56.41％[p< 0.001])显著高于PD-L1表达阳性的患者(IHC 1,2和3)(表1)。这表 明，PD-L1的表达与NSCLC的放射抗性呈正相关。PD-L1表达阴性的 NSCLC患者对放射治疗有积极的反应，而高PD-L1表达的患者对放射治疗没有或仅有微小的反应(图1A)。这些结果表明，高PD-L1的表达 会促进NSCLC患者的放射抗性和不良的预后。尽管结果显示PD-L1 表达阴性的患者第一次放射治疗效果较好，但在后续放射治疗中效果 逐渐变差。因此，可以推论放射治疗不仅杀死了一部分NSCLC细胞，也增加了未杀死的NSCLC细胞中PD-L1的表达。所以在多次放射治疗 后，原来PD-L1表达阴性的NSCLC患者，其PD-L1的表达增加。
Table 1.The Characteristics of Efficacy,Radiotherapy Response,and PD-L1 Expression in Patients with NSCLC
Figure BDA0002708930120000111
Figure BDA0002708930120000121
注：PD-L1表达阴性(IHC 0)；PD-L1表达阳性(IHC1，2和3)；PD-L1，程序性死亡配体1； IHC，免疫组化；PR，部分反应；PD，进展性疾病；ORR，客观反应率。
实施例2在放射治疗后NSCLC患者PD-L1的表达增加且与 NSCLC细胞系的放射抗性呈正相关
A549，PC9和路易斯肺癌细胞(LLC)是从ATCC中获得的 (Manassas,VA,USA)。如前所述，本实验室诱导和获得了A549/X和 PC9/X细胞系(X.Gong et al.,2017；J.Li et al.,2014)。所有的细胞系均 是在37℃，5％CO2的条件下含10％胎牛血清(FBS)(LifeTechnologies， Grand Island，NY)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM中培养的。 所有用于研究的细胞系均培养了不到20代，并且对其进行了常规筛选 以确认不存在支原体污染。通过Lipofectamine2000，在6孔板培养的 融合细胞中进行PD-L1模拟物和siRNA的细胞转染实验(RiboBio, Guangzhou,China)，及其相应的对照(X.Gong et al.,2017；J.Li etal., 2014)。si-PD-L1-RNA的目标序列如下：正义链，5’- CAUAGUAGCUACAGACAGAdTdT-3’；反义链，3’-dTdT GUAUCAUCGAUGUCUGUCU-5’。在转染后48小时后，收集细胞用 于流式细胞术或蛋白质印记分析。
如前所述，为了进一步研究PD-L1在放射抗性中的作用，我们诱 导了具有放射抗性的A549和PC9细胞系，并且命名为A549/X和PC/X。 在给予2Gy的放射后，A549/X(76％)和PC9/X(88％)的细胞活力比 A549(52％)和PC9(38％)的细胞活力更高，这表明A549/X和PC/X细 胞已经具有放射抗性(图1B)。免疫印迹分析显示，与普通NSCLC细 胞系(A549和PC9细胞，图1C)相比，抗放射NSCLC细胞系(A549/X 和PC/X细胞，图1C)的PD-L1表达显著上调。以0,2,4和6Gy的剂量 (2Gy每次每天，连续3天)进行常规分次放射后，流式细胞仪分选 的存活A549和PC9细胞的PD-L1表达显著增加，但是具有放射抗性的 A549/X和PC/X细胞仍然处于PD-L1高表达状态，没有明显的改变。 (图1D)这些结果表明，常规分级放射会上调A549和PC9细胞PD-L1 的表达，并且PD-L1表达的上调与NSCLC细胞的放射抗性相关。
实施例3细胞增殖和凋亡检测-DHA通过抑制PD-L1的表达消除 NSCLC细胞系的放射抗性
在有含10％FBS的DMEM96孔板中以1×105的密度将细胞播 种过夜，并且用MMT检测确定暴露于DHA(Sigma,USA)中不同细 胞的增殖情况。在生长48小时后，将细胞在37℃的200μl MTT溶 液中孵化4h，并且使用酶标仪在490nm下进行测量。
对细胞凋亡的检测包括收集细胞，用预冷的PBS溶液冲洗两次， 以1000rpm离心10分钟，在含有10％FBS的DMEM中生长48小 时后重悬在冷却的PBS中。然后，根据制造商对凋亡染色的说明， 在暗处室温下将细胞用荧光素结合的膜联蛋白V和碘化丙啶(BDBiosciences)进行染色，并且用BD FACSCalibur流式细胞仪对凋亡细 胞的百分比进行分析(BD Biosciences,San Jose,CA)。试验组代表至 少3次独立实验。
MTT实验结果显示：双氢青蒿素A549细胞系IC50是56.33nM； A549/X细胞系的IC50是178.96nM；PC9细胞系IC50是30.26nM MMT细胞活力测定显示，与A549和PC9细胞相比，在用DHA 处理后，经过放射的A549/X和PC9/X细胞的活力显著下降(图 2A-3A)。研究发现，敲除PD-L1后，经过放射的 A549/X-Si-PD-L1-RNA和PC9/X-Si-PD-L1-RNA细胞的活力也显著下降，其效果与DHA相似(图2B-3B)。在给予6Gy剂量的放射(1.0％ 比1.3％)后，A549/X和PC9/X细胞的凋亡率并没有明显改变，这表 明A549/X和PC9/X细胞具有放射抗性。值得注意的是，在用 DHA(71.5％和68.2％)处理后，经放射的A549/X和PC9/X细胞的凋 亡率显著上升，这表明DHA可以减轻放射抗性和促进细胞凋亡(图 4A-5A)。当PD-L1被敲除后，我们发现经过放射的 A549/X-Si-PD-L1-RNA和PC9/X-Si-PD-L1-RNA细胞的凋亡率也显 著增加，其效果与给予DHA处理相似。敲除PD-L1和给予DHA处 理可以对A549/X和PC9/X细胞的细胞活力和凋亡率产生相似的效 果。免疫印迹分析显示，在给予DHA处理后A549/X和PC9/X细胞PD-L1表达显著下降(图2D-3D)。综上所述，这些研究显示DHA 能够通过抑制PD-L1的表达消除NSCLC细胞系的放射抗性。
实施例4蛋白免疫印迹分析-DHA通过抑制TGF-β, PI3K/AKT和STAT3信号通路下调PD-L1的表达以避免免疫逃逸
用辅以苯基甲磺酰氟(PMSF)(Riche,CA,USA)的RIPA蛋白质 提取剂(Beyotime,Beijing,China)溶解细胞。用10％十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离大约50μg的蛋白质提取物， 转移到硝酸纤维素膜上，并且用特定的抗体进行孵育。用增强的化 学发光(ECL)生色底物显示条带。用化学发光系统对印记进行显 影，GRAPH作为对照。所有的兔单克隆抗体均购自Cell Signaling Technology，包括PD-L1(1:5000),Bim,Bcl-2,裂解的半胱氨酸蛋白 酶-3,裂解的半胱氨酸蛋白酶-8(1:5000),TGF-β,TRIM21,
Figure BDA0002708930120000141
AKT Phospho-AKT(Ser473)(1:2500),AKT(1:2500), Phospho-STAT3(Tyr705)(1:3000),STAT3(1:3000),E-钙黏蛋白,N-钙 黏蛋白,Snail蛋白,波形蛋白(1:1000)。实验组代表至少3次独立实 验。
免疫印迹结果显示，在给予放射治疗后，A549/X和PC9/X细胞 TGF-β,PD-L1,p-AKT和p-STAT3的表达上调，而在给予DHA处 理后，其表达下调(图2C和3C)。更值得注意的是，与仅给予放射 治疗相比，联合DHA和放射治疗后，TGF-β、p-AKT、p-STAT3 和PD-L1的表达均被显著逆转。这表明通过抑制TGF-β、p-AKT、 p-STAT3和PD-L1的表达可以产生抗肿瘤的协同作用(图2C和3C)。 同时，我们注意到，在si-PD-L1-RNA转染A549/X和PC9/X细胞 后，p-AKT，p-STAT3和
Figure BDA0002708930120000151
的表达未改变，但是在进行DHA 处理后，其表达减少(图2D-3D)。这表明，PI3K/AKT和STAT3是 PD-L1的上游信号通路，而DHA可以通过抑制上游的 PI3K/AKT,STAT3和
Figure BDA0002708930120000152
信号通路下调PD-L1的表达，达到消除 放射抗性的作用。
实施例5异种移植动物研究-DHA可以通过激活PD-L1依赖性 的下游信号通路TRIM21和EMT相关蛋白，来增加放射敏感性，促 进细胞凋亡
将5周大的雌性无特定病原体(SPF)C57/BL6小鼠用于动物 实验。该动物实验已经同济大学医学院动物保护和使用委员会批准, 并且研究人员依据机构的指南进行实验操作。如宫和周等人之前所 述(X.Gong et al.,2017；Zhou,Zhang,Li,Wang,&Lou,2010)，将LLC 细胞注射到小鼠的右大腿外侧。在第一天以2Gy每次对小鼠进行分 次放疗，1天1次，连续5天，并且以50mg/kg的计量胃内注射DHA， 1天1次，连续12天。
用游标卡尺每2天对小鼠的肿瘤大小进行测量。通过测量肿瘤 的长和宽确定肿瘤的体积，并且计算体积公式如下：V＝lw2/2。在12 天的DHA治疗后，杀死小鼠，并且将石蜡包埋的组织用免疫组化进 行染色。实验组每组至少包含6只小鼠，代表至少三次独立实验。
我们通过免疫印迹法分析了包括BIM,半胱氨酸蛋白酶-8,半 胱氨酸蛋白酶-3和Bcl-2在内的细胞凋亡指标。免疫印迹结果显示， 在经过联合DHA和放射治疗后，凋亡前蛋白BIM的表达显著上调， 半胱氨酸蛋白酶-8和半胱氨酸蛋白酶-3的裂解增加以及抗凋亡蛋白 Bcl-2的表达下调(图4A和5A)。此外，E-钙黏蛋白,波形蛋白,Snail 蛋白和N-钙黏蛋白也参与EMT的过程，其表达可以反映细胞的凋 亡率。经过DHA和放射处理后的A549/X和PC9/X细胞E-钙黏蛋 白的表达显著增加，而波形蛋白,Snail蛋白和N-钙黏蛋白的表达减 少(图4A和5A)。这表明，DHA可能通过抑制EMT过程从而增强 放射敏感性。如图4A和5A所示，在接受放疗和DHA处理后， TRIM21蛋白的表达增加。
在敲除PD-L1后，经放射处理的A549/X-Si-PD-L1-RNA和 PC9/X-Si-PD-L1-RNA细胞的凋亡率也显著增加。免疫印迹结果显示， 凋亡前蛋白BIM显著上调，抗凋亡蛋白Bcl-2下调，TRIM21蛋白 增加以及半胱氨酸蛋白酶-8和半胱氨酸蛋白酶-3的裂解增加，并且 在放射治疗和DHA处理后，这些信号通路并没有明显改变(图 4B-5B)。以上结果表明，TRIM21和EMT相关蛋白是PD-L1依赖性 的下游信号通路。综上所述，DHA可以通过激活PD-L1依赖性的下 游信号通路TRIM21和EMT相关蛋白来增加放射敏感性，促进细胞 凋亡。
实施例6免疫组化(IHC)-联合放疗和DHA在异种移植小鼠 NSCLC抗肿瘤治疗中的协同作用
将4μm厚的福尔马林固定石蜡包埋(FFP)的异种移植NSCLC 组织在二甲苯中脱蜡，在分级醇中水合并且在PBS溶液中进行洗涤。 用3％H2O2水溶液封闭内源性过氧化物酶活性10分钟后，一抗孵 育过夜。PBS溶液洗涤后，再用通用型IgG-HRP聚合物(K5007,Dako,USA)先孵育10分钟，随后再用3，3'-二氨基联苯胺(DAB)孵育 2-5分钟。最后，这些部分用苏木精染色1分钟后，进行分级酒精脱 水，二甲苯清除，并盖上盖玻片。如之前叶等人所述，我们采用了 染色强度分布(SID)分数(Ye et al.,2009)。与内对照相比，根据染 色强度，我们将阳性肿瘤细胞的强度氛围三个等级：-,阴性染色；+ (弱)，比骨骼肌浅；++(中等)，与骨骼肌相当；+++(强)比骨 骼肌深。阳性肿瘤细胞的分布等级为：-，非染色细胞；+,染色细胞<25％；++,染色细胞占25-50％；++,染色细胞占25-50％；以及+++， 染色细胞>50％。我们使用了抗PD-L1(1:100)，CD8(1:100),CD4 (1:500),Foxp3(1:500),LyGr(1:1000)和CD11b(1:1000)的兔多克隆抗 体作为一抗(Novus Biologicals,USA)。实验组代表至少三次独立实验。
为了证实DHA与放疗联合是否具有协同的抗肿瘤作用，我们建 立了路易斯肺癌小鼠模型，并且以50mg/kg的剂量(D组)给予DHA 治疗，在第1天给予2Gy分次放疗，以后每天以2Gy的剂量进行放 疗，连续5天(R组)，D组和R组给予的DHA与放射的剂量相同， 以及非处理(NC组)。如图6A所示，单独给予DHA处理对肿瘤的 生长并没有显著影响，而放疗可以稍微减慢肿瘤的进展。最值得注 意的是，与单独给予DHA(p<0.01)或放射处理(p<0.01)相比， DHA联合放射治疗可以明显抑制肿瘤生长。
免疫印迹结果显示，在接受放疗和DHA处理后，凋亡前蛋白 BIM显著上调，抗凋亡蛋白Bcl-2下调，TRIM21蛋白增加以及半胱 氨酸蛋白酶-8和半胱氨酸蛋白酶-3的裂解增加(图6B)。髓源性抑 制细胞(MDSCs)已经证明可以抑制免疫反应以及促进肿瘤进展。肿 瘤浸润调节性T细胞(iTregs)能够抑制效应T细胞，并且也是外周 耐受的关键调节因子。在此研究中，我们通过免疫组化的方法，检 查了DHA和放射治疗后，PD-L1,CD8+,MDSCs以及iTregs的表达 情况。从免疫组化的结果可以判断，放射治疗后PD-L1的表达显著 增加，但是在联合DHA治疗后，其表达被抑制。相反，在联合DHA 和放射治疗后，CD8+细胞的表达增加。我们也发现，小鼠在DHA 和放射治疗后，外周耐受的双关键调节因子，iTregs(CD4+,Fox3p+) 和MDSCs(LyGr+,CD11b+)显著减少(图7)。综上所述，联合DHA 和放射治疗可以通过下调PD-L1表达减少MDSCs和iTregs的聚积 以及促进CD8+T细胞的渗透，从而协同增强抗肿瘤效果。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发 明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.双氢青蒿素在制备经过放疗的非小细胞肺癌药物中的应用，所述双氢青蒿素的分子式如下：
Figure FDA0002708930110000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述经过放疗的非小细胞肺癌为未对放疗产生放疗抗性的非小细胞肺癌，或对放疗产生了放疗抗性的非小细胞肺癌。
3.根据权利要求1或所述的应用，其特征在于，所述双氢青蒿素通过抑制PD-L1的表达对经过放疗的非小细胞肺癌产生作用；和/或，双氢青蒿素抑制PD-L1非依赖性信号通路，TRIM21和EMT的蛋白激酶激活，从而增强非小细胞肺癌的放疗敏感性。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述双氢青蒿素还可以用于逆转非小细胞肺癌对PD-L1靶向药物产生的耐药。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述双氢青蒿素与抗癌药物联合使用；优选地，所述抗癌药选自顺铂、吉西他滨、紫杉醇中的至少一种。
6.一种PD-L1抑制剂，该抑制剂为双氢青蒿素，所述双氢青蒿素的分子式如下：
Figure FDA0002708930110000021
7.一种用于非小细胞肺癌的放疗增敏剂，该增敏剂为双氢青蒿素，所述双氢青蒿素的分子式如下：
Figure FDA0002708930110000022
8.一种用于治疗经过放疗的非小细胞肺癌增敏药的药物，该药物为双氢青蒿素，所述双氢青蒿素的分子式如下：
Figure FDA0002708930110000031
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，该药物还包括药学可接受的辅料。
10.根据权利要求8或9所述的药物，其特征在于，还包括与抗癌药；优选地，所述抗癌药选自顺铂、吉西他滨、紫杉醇中的至少一种。
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