CN112772560A - 一种秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法 - Google Patents
一种秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法，具体包括以下步骤：将秀丽隐杆线虫进行同步化处理，培养至青年状态，将部分线虫加入到涂满PA14细菌平板上训练4h；训练完成后将其分别移入M9培养基中，设置0.5h、1h、2h、4h遗忘时间点，检测对照组线虫、PA14训练线虫、不同时间点遗忘线虫偏好指数，绘制遗忘曲线；通过检测病原处理前、处理时、移除后，线虫对病原细菌的偏好指数的变化以明确遗忘时间点。本发明所述方法建立的模型可用于研究秀丽隐杆线虫对病原菌的记忆遗忘机制，还用于研究病原菌与宿主之间的相互作用关系。
Description
技术领域
本发明涉及一种秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法，属于生物模型构建技术领域。
背景技术
遗忘型轻度功能认知障碍、短暂性全面遗忘症、阿尔茨海默病(Alzheimer,sdisease，AD)等疾病都和遗忘行为异常相关。其中，轻度认知障碍(mild cognitiveimpairment，MCI)是介于正常衰老与痴呆之间的状态，分为遗忘型MCI(amnestic MCI，aMCI)和非遗忘MCI(non-amnestic MCI)。遗忘型MCI最易发展成为AD源性痴呆(dementiadue to AD)。在中国一项针对阿尔茨海默病以及其他痴呆病症的系统性研究显示，随着人口老龄化问题的凸显，AD的发病率在日趋升高。阿尔茨海默病必然会长期对中国的家庭、社会、经济以及公共卫生系统造成巨大的压力，对其发病的生物学机制深入研究已刻不容缓。遗忘行为异常是AD发病的重要特点之一，因此弄清遗忘行为异常的机制显得尤为重要。过往的研究主要以果蝇、小鼠为模型探索遗忘机制，但由于其遗传学操作复杂、耗时，因此得不到推广和普及。
自然环境中，秀丽隐杆线虫是生活在土壤中的一种微小生物，它们以土壤有机细菌为食物。线虫体型较小，长度约为3-5mm，按照性别可分为雄虫和雌雄同体两种，其中雌雄同体线虫为主要组成部分尤为常见，而雄虫较少一般比例约为千分之一。在整个发育阶段，大致可将其生活史划分为2个时期，分别为幼虫阶段和性成熟阶段。而幼虫阶段又可分为L1，L2，L3和L4，L4期线虫的生殖腺基本发育完全，接下来进入成虫期，这个时期线虫大量产卵。在实验室环境中培养线虫，其生活周期短、产卵量多、易于进行遗传学操作，大量线虫突变株已经构建完成。此外，线虫对气味、温度、光线等物理因素反应敏感，身体呈透明状，在发育过程当中，容易在显微镜下对其进行跟踪观察。作为第一个完成测序的多细胞生物体，其基因组约有40％和哺乳动物同源，并且线虫神经元之间的连接相对清楚，哺乳动物的一些重要的神经肽在线虫中也被发现，因此是研究神经元调控行为学变化的绝佳模型。因此，建立一种秀丽隐杆线虫病原遗忘模型非常有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法，具体包括以下步骤：
(1)将秀丽隐杆线虫进行同步化处理，培养至青年状态，将部分线虫加入到涂满PA14细菌平板上训练4h。
(2)训练完成后，设置不同的遗忘时间点(0.5h、1h、2h、4h)，检测秀丽隐杆线虫、PA14训练线虫、不同时间点产生遗忘线虫偏好指数，绘制遗忘曲线。
(3)通过检测病原处理前、处理时、移除后，线虫对病原细菌的偏好指数的变化和恢复明确遗忘时间点。
优选的，本发明所述秀丽隐杆线虫进行同步化的具体过程为：
①将保存于固体平板上的线虫切小块置于新鲜的OP50平板上，20℃培养箱培养48小时，并注意观察，平板上出现大量虫卵即可；如果培养过程中出现食物不够的情况，则在平板中加入离心浓缩后的OP50食物。
②待平板上出现大量虫卵后，用M9溶液将线虫和虫卵冲洗于14ml的收集管中3000rpm，离心2分钟；冲洗过程一定要充分以免造成虫卵的大量损失。
③离心完后，弃上清液，加入2mL的线虫裂解液；高速震荡，边震荡边在显微镜下观察，大量虫体破碎释放出卵即可，随后加入M9定容至14mL；3000rpm，离心2分钟。
④离心完后，弃上清，加入M9定容至14mL，3000rpm，离心2分钟；重复该步骤4次直至无次氯酸钠气味即可；次氯酸钠一定要去除干净否则会严重抑制线虫虫卵孵化。
⑤去除上清后，预留1mL的M9，用1mL的移液器吹起后移至6mm的培养平板中；最后加入适量M9将虫卵吹散，放置于20℃培养箱中待孵化。
优选的，本发明所述秀丽隐杆线虫培养至青年状态的培养条件为：
①提前将OP50细菌活化于LB平板上，挑取单克隆细菌接种于50ml的LB液体培养基中过夜培养，180rpm，37℃培养18小时。
②将300ml的NGM培养基加热溶解冷却后，加入8ml的磷酸盐缓冲液、300ul硫酸镁、300ul的氯化钙和300ul的胆固醇溶液；混匀并倒入直径为6mm的小平板中吹干。
③在吹干后的平板中加入300-600ul的OP50菌液，并在超净工作台中吹干，37℃培养48小时。
④将适量同步化后的L1线虫加入到培养好的OP50平板上，放入20℃培养箱中培养48小时，即可发育为young adult的线虫。
本发明的有益效果：
(1)随着分子生物学技术的发展，越来越多的转录组和蛋白组数据表明小鼠和果蝇的一些基因可能参与线虫遗忘行为的调控，但由于其遗传学操作复杂、耗时；秀丽隐杆线虫易于培养、遗传操作简便，本发明所述方法建立秀丽隐杆线虫的动物模型在研究其对病原细菌的遗忘行为具有独特优势。
(2)过往的研究主要以挥发性气味(苯甲醛等)为记忆刺激信号探讨遗忘的机制，和这种方法相比，本发明所述方法建立的模型可用于研究秀丽隐杆线虫对病原菌的记忆遗忘机制，不仅局限于线虫对气味的记忆和遗忘；还用于研究病原菌与宿主之间的相互作用关系。
附图说明
图1线虫遗忘模型偏好指数检测试验模式图；
图2线虫对病原细菌偏好指数变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
实施例1
一种秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法，具体包括以下步骤：
(1)将秀丽隐杆线虫进行同步化处理：
①将保存于固体平板上的线虫切小块置于新鲜的OP50平板上，20℃培养箱培养48小时，并注意观察，平板上出现大量虫卵即可；如果培养过程中出现食物不够的情况，则在平板中加入离心浓缩后的OP50食物。
②待平板上出现大量虫卵后，用M9溶液将线虫和虫卵冲洗于14ml的收集管中3000rpm，离心2分钟；冲洗过程一定要充分以免造成虫卵的大量损失。
③离心完后，弃上清液，加入2mL的线虫裂解液；高速震荡，边震荡边在显微镜下观察，大量虫体破碎释放出卵即可，随后加入M9定容至14mL；3000rpm，离心2分钟。
④离心完后，弃上清，加入M9定容至14mL，3000rpm，离心2分钟；重复该步骤4次直至无次氯酸钠气味即可；次氯酸钠一定要去除干净否则会严重抑制线虫虫卵孵化。
⑤去除上清后，预留1mL的M9，用1mL的移液器吹起后移至6mm的培养平板中；最后加入适量M9将虫卵吹散，放置于20℃培养箱中待孵化。
(2)将秀丽隐杆线虫培养至青年状态：
①提前将OP50细菌活化于LB平板上，挑取单克隆细菌接种于50ml的LB液体培养基中过夜培养，180rpm，37℃培养18小时。
②将300ml的NGM培养基加热溶解冷却后，加入8ml的磷酸盐缓冲液、300ul硫酸镁、300ul的氯化钙和300ul的胆固醇溶液；混匀并倒入直径为6mm的小平板中吹干。
③在吹干后的平板中加入300-600ul的OP50菌液，并在超净工作台中吹干，37℃培养48小时。
④将适量同步化后的L1线虫加入到培养好的OP50平板上，放入20℃培养箱中培养48小时，即可发育为young adult的线虫。
(3)将部分young adult的线虫加入到涂满PA14细菌平板上训练4h。
(4)训练完成后，将其移入M9培养基中，设置0.5h、1h、2h、4h遗忘时间点，检测对照组线虫(野生型线虫)、PA14训练线虫、不同时间点产生遗忘线虫偏好指数，如图1所示，绘制遗忘曲线；本实施例中偏好指数通过以下公式计算：
(5)通过检测病原处理前、处理时、移除后，线虫对病原细菌的偏好指数的变化和恢复情况明确遗忘时间。
通过检测病原处理前、处理时、移除后，线虫对病原细菌的偏好指数的变化和恢复明确遗忘时间点，如图2所示，病原细菌处理前，线虫趋化于病原细菌偏好指数为0.46；病原细菌处理后，趋避于病原细菌偏好指数为-0.24，移除病原细菌0.5、1、2、4h后，偏好指数分别为-0.21、-0.08、0.41和0.38；移除病原细菌2h后，线虫偏好指数恢复为病原细菌处理前，说明线虫病原记忆已经完全消退，遗忘完成。
Claims (3)
1.一种秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将秀丽隐杆线虫进行同步化处理，培养至青年状态，将部分线虫加入到涂满PA14细菌平板上训练4h；
(2)训练完成后，将其移入M9培养基中，设置不同的遗忘时间点，检测对照组线虫、PA14训练线虫、不同时间点产生遗忘线虫偏好指数，绘制遗忘曲线；
(3)通过检测病原处理前、处理时、移除后，线虫对病原细菌的偏好指数的变化和恢复情况明确遗忘时间。
2.根据权利要求1所述秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法，其特征在于：秀丽隐杆线虫进行同步化的具体过程为：
①将保存于固体平板上的线虫切小块置于新鲜的OP50平板上，20℃培养箱培养48小时，平板上出现大量虫卵即可；
②待平板上出现大量虫卵后，用M9溶液将线虫和虫卵冲洗于14ml的收集管中3000rpm，离心2分钟；
③离心完后，弃上清液，加入2mL的线虫裂解液；高速震荡，边震荡边在显微镜下观察，虫体破碎释放出卵即可，随后加入M9定容至14mL；3000rpm，离心2分钟；
④离心完后，弃上清，加入M9定容至14mL，3000rpm，离心2分钟；重复该步骤4次直至无次氯酸钠气味即可；
⑤去除上清后，预留1mL的M9，用1mL的移液器吹起后移至6mm的培养平板中；最后加入适量M9将虫卵吹散，放置于20℃培养箱中待孵化。
3.根据权利要求1所述秀丽隐杆线虫对病原细菌遗忘的动物模型的建立方法，其特征在于：秀丽隐杆线虫培养至青年状态的培养条件为：
①提前将OP50细菌活化于LB平板上，挑取单克隆细菌接种于50ml的LB液体培养基中过夜培养，180rpm，37℃培养18小时；
②将300ml的NGM培养基加热溶解冷却后，加入8ml的磷酸盐缓冲液、300ul硫酸镁、300ul的氯化钙和300ul的胆固醇溶液；混匀并倒入直径为6mm的小平板中吹干；
③在吹干后的平板中加入300-600ul的OP50菌液，并在超净工作台中吹干，37℃培养48小时；
④将适量同步化后的L1线虫加入到培养好的OP50平板上，放入20℃培养箱中培养48小时，即可发育为young adult的线虫。
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