CN112772405A - 一种甘蓝型油菜强优势杂交种创制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜强优势杂交种创制方法，该方法首先选用新育成丰产、稳产、抗逆性强的杂交种及其不育系作为育种材料；再以上述杂交种为供体进行小孢子培养，快速纯合小孢子单株，构建重组恢复系DH群体，以上述杂交种不育系为母本，以小孢子培养获得的重组恢复系为父本，进行杂交，配制新组合；最后通过产量鉴定、品种比较及多点试验多重鉴定，创制强优势杂交种。本发明通过选用优良杂交种及其不育系为育种材料及育种技术创新，应用小孢子培养快速纯合杂种优势基因聚合的重组恢复系，创制油菜强优势杂交种，有效简化了育种程序、加快了育种速度、降低了育种成本，为油菜强优势杂交种创制提供了新方法和新思路。

Description

一种甘蓝型油菜强优势杂交种创制方法

技术领域

本发明涉及油菜育种领域，具体涉及一种甘蓝型油菜强优势杂交种创制方法。

背景技术

油菜是我国最重要的食用油料作物，其主要产品是菜籽油和优质蛋白饲料，因此，提高菜籽产量和产油量一直是油菜育种最重要的目标。近二十多年来，随着我国油菜杂种优势利用技术的蓬勃发展，杂交油菜新品种及配套高产、高效栽培技术大面积应用于生产，大幅度提高了我国油菜单产和总产，有力推动了我国油菜产业的发展。2008年，傅廷栋院士等科学家提出了开展油菜杂种优势利用技术和强优势杂交种创制的研究，提出二十年提高30％的目标，并得到了国家重点科技研发计划项目支持。该项目的实施为我国油菜杂种优势利用研究制定了中、长期目标，即通过油菜杂种优势利用技术的创新和改良，创制强优势杂交种，大幅提高现有杂交油菜品种的产量。

目前，我国油菜杂种优势利用技术及强优势杂交种创制方法主要有：细胞质雄性不育三系法、细胞核雄性不育两系法、化学杀雄法及自交不亲和等方法。上述方法杂种优势利用技术的基本原理相同，不同的是亲本选育方法、杂交种生产技术等不同。

近十多年来，众多的育种家积极开展了杂种优势利用技术创新与改良，并创制了一批强优势杂交应用于生产。但随着高产、高效杂交油菜品种大面积推广应用，杂交种单产达到了一个较高的水平，通过大幅提高杂交种的单产来提高油菜籽总产量，存在难度大、周期长及成本高等问题，创制一个有突破性强优势杂交种需要大量的人力、物力及时间。

因此，迫切需要一种筛选强优势杂交种的方法。

发明内容

本发明针对现有强优势杂交种创制周期长、难度大、突破性不足等问题，提供了一种甘蓝型油菜强优势杂交种创制方法，简称为“二次选育法”。该方法以新育成的丰产、稳产的优良杂交种及其配合力高的不育系为育种材料，结合油菜高效小孢子培养技术体系，快速获取纯合的重组恢复系DH群体，与其不育系再次杂交配制新组合，通过多重鉴定创制较供体杂交种增产显著的强优势杂交种的方法。该方法有效简化了育种程序、加快了育种速度，为油菜强优势杂交种创制提供了新方法、新思路。

为实现上述目的，本发明所设计了一种甘蓝型油菜强优势杂交种的创制方法，包括以下步骤：

1)选用育种材料：

选用新育成丰产、稳产、抗逆性强的杂交种及其不育系作为育种材料；

上述育种材料选用主要考虑两个因素：

首先，新育成优良杂交种，丰产性、稳产性好，抗逆性强及品质优良等优良特性。以优良杂交种为育种材料创制强优势杂交种时，以大幅提高产量为目标，减轻主要农艺性状的筛选，提高了育种速度和育成品种的产量优势。

其次，选用的优良杂交种，其不育系配合力高，有利于与杂种优势基因聚合的重组恢复系杂交测配、获得优势更强、产量更高的强优势杂交种。

2)应用油菜小孢子培养技术构建重组恢复系DH群体：

以上述杂交种为供体进行小孢子培养，快速获得纯合小孢子单株，构建重组恢复系DH群体，其中，所述重组恢复系DH群体中包含杂种优势相关基因聚合的重组恢复系；

3)新组合配制：

以上述杂交种不育系为母本，以小孢子培养获得的重组恢复系为父本，进行杂交，配制新组合；

4)多重鉴定创制强优势杂交种：

通过产量鉴定、品种比较及多点试验的多重鉴定，创制获得强优势杂交种。以供体杂交种为对照，对上述新组合进行产量鉴定和品比试验，产量均较对照增产5％以上的组合进入多点试验。两年多点试验，平均产量较对照品种增产8％以上的品种，即为“二次选育法”创制的强优势杂交种。

进一步地，所述步骤1)中，选用杂交种为云油杂15号及其不育系为育种材料。该品种为本单位培育的优质、高产、抗逆性强的甘蓝型油菜胞质不育三系杂交种，目前已在生产上大面积推广应用。

再进一步地，所述步骤2)中，油菜小孢子培养技术构建重组恢复系DH群体的具体步骤如下：

(1)供体材料种植：

将上述杂交种作为供体材料分批分期进行种植；

(2)小孢子培养：

供体材料开花时，利用油菜小孢子培养技术，开展小孢子培养，油菜小孢子培养操作流程如下：

①于初花期取适宜大小的油菜花蕾，用15％次氯酸钠消毒15min，无菌水洗三次；

②加入NLN13培养液进行研磨，尼龙网过滤后转入10mL离心管中，200rpm离心2min；

③弃上清，用NLN13培养液悬浮小孢子，200rpm离心2min，重复一次；

④弃上清，加入NLN13培养液，并转移到培养皿中(含活性炭和秋水仙碱)，30℃恒温箱中暗培养24hr；

⑤收集小孢子悬浮液，200rpm离心2min，弃上清，NLN13培养液洗后，分装到培养皿中；

⑥经4-5天30℃恒温箱中暗培养后移至25℃恒温箱中暗培养，至出现肉眼可见的胚状体后，吸去NLN13培养液，并加入B5培养液于摇床上培养，生长到子叶期的胚，用于胚直播；

(3)胚直播：

当小孢子胚成熟时，在温度为20-24℃、湿度为70％的温室内，将洗干净的小孢子胚(精细清洗，不损伤胚)直接播种在腐质土上生长成苗；40天左右，将已经生长5-6叶期的小孢子植株移栽到大田种植管理；

(4)重组恢复系DH群体构建：

小孢子植株在大田条件下生长普遍较弱，田间种植需要精细管理；当小孢子植株陆续开花时，通过育性识别，选择所有可育株系自交套袋，成熟时，分别收获自交种子，获得的多个双单倍体材料的组合，即为重组恢复系DH群体，其中，包含有杂种优势相关基因聚合的重组恢复系。

再进一步地，所述步骤3)中，配制新组合具体步骤如下(采用“2+2”组配法)：

(1)每个组合播种4行，1、3行种母本；2、4行种父本；开花时将父母本单株的花序套入同一个杂交袋内，杂交授粉；每组合套袋10对；

(2)套袋后每天中午，进行摇袋辅助授粉，终花后取下纸袋，分开父母本；成熟时，混合收获杂交的母本，即为新组合。

本发明的有益效果：

本发明的方法以新育成丰产、稳产杂交种及其配合力高的不育系为育种材料，避免了大规模亲本及育种材料转育，简化了育种程序、节约了成本。其次，利用小孢子培养技术，快速构建重组恢复系DH群体，包括杂种优势相关基因聚合的重组恢复系。加快了优良恢复系的选育，并容易与配合力高的不育系测配获得优势更强、产量更高的强优势杂交种，提高了育种效率。

综上所述，本发明弥补了强优势杂交种创制存在周期长、难度大、突破性不足等问题，有效简化了育种程序，降低了育种成本，提高了育种效率，为油菜杂种优势利用技术创新和强优势杂交种创制提供新方法和新思路。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

本发明的一种甘蓝型油菜强优势杂交种创制方法，包括以下步骤：

1)选用育种材料：

选用新育成丰产、稳产、抗逆性强的杂交种及其不育系作为育种材料；

2)应用油菜小孢子培养技术构建重组恢复系DH群体：

以上述杂交种为供体进行小孢子培养，快速获得纯合小孢子单株，构建重组恢复系DH群体，其中，所述重组恢复系DH群体中包含杂种优势相关基因聚合的重组恢复系；上述油菜小孢子培养技术构建重组恢复系DH群体的具体步骤如下：

(1)供体材料种植：

将上述杂交种作为供体材料分期进行种植；

(2)小孢子培养：

供体材料开花时，利用油菜小孢子培养技术，开展小孢子培养，油菜小孢子培养操作流程如下：

①于初花期取适宜大小的油菜花蕾，用15％次氯酸钠消毒15min，无菌水洗三次；

②加入NLN13培养液进行研磨，尼龙网过滤后转入10mL离心管中，200rpm离心2min；

③弃上清，用NLN13培养液悬浮小孢子，200rpm离心2min，重复一次；

④弃上清，加入NLN13培养液，并转移到培养皿中，30℃恒温箱中暗培养24hr；

⑤收集小孢子悬浮液，200rpm离心2min，弃上清，NLN13培养液洗后，分装到培养皿中；

⑥经4-5天30℃恒温箱中暗培养后移至25℃恒温箱中暗培养，至出现肉眼可见的胚状体后，吸去NLN13培养液，并加入B5培养液于摇床上培养，生长到子叶期的胚，用于胚直播；

(3)胚直播：

当小孢子胚成熟时，在温度为20-24℃、湿度为70％的温室内，将洗干净的小孢子胚直接播种在腐质土上生长成苗；40天左右，将已经生长5-6叶期的小孢子植株移栽到大田种植管理；

(4)重组恢复系DH群体构建：

小孢子植株在大田条件下生长普遍较弱，田间种植需要精细管理；当小孢子植株陆续开花时，通过育性识别，选择所有可育株系自交套袋，成熟时，分别收获自交种子，获得的多个双单倍体材料的组合，即为重组恢复系DH群体，其中，重组恢复系DH群体包含有杂种优势相关基因聚合的重组恢复系。

3)新组合配制

以上述杂交种不育系为母本，以小孢子培养获得的重组恢复系为父本，进行杂交，配制新组合；配制新组合具体步骤如下：

(1)每个组合播种4行，1、3行种母本；2、4行种父本；开花时将父母本单株的花序套入同一个杂交袋内，杂交授粉；每组合套袋10对；

(2)套袋后每天中午，进行摇袋辅助授粉，终花后取下纸袋，分开父母本；成熟时，混合收获杂交的母本，即为新组合。

4)多重鉴定创制强优势杂交种：

通过产量鉴定、品种比较及多点试验的多重鉴定，创制获得到强优势杂交种。

基于上述方法用于具体实施案例：

“云油杂32号”和“云油杂34号”系甘蓝型油菜细胞质雄性不育三系杂交种，是选用丰产、稳产杂交油菜新品种云油杂15号及其不育系11XS081A为育种材料，应用“二次选育法”培育的强优势杂交种。其培育流程如下：

1.育种材料选用：

云油杂15号是2016年云南省农业科学院经济作物研究所选育的甘蓝型油菜细胞质雄性不育三系杂交种。2012年-2014年省区试平均产量3606.60kg/hm²，较对照品种云油杂2号增产12.96％，丰产性、稳产性好、抗逆性强。其不育系11XS081A配合力高，主要农艺性状优良，利用该不育系已育成多个杂交种；

因此，本实施例选用了云油杂15号及其不育系为育种材料；

2.油菜小孢子培养快速纯合重组恢复株系DH群体：

1)供体材料种植与管理：

2014年9月20日和30日分两批在云南省农业科学院经济作物研究所试验田种植云油杂15号。田间采取精细管理，出苗整齐，生长健壮，在生长过程中给予了充足的水、肥条件。2015年1月3日和1月20日，两批种植的云油杂15号分别开花，可开展小孢子培养；

2)小孢子培养及胚直播：2015年1月5日-26日，利用油菜小孢子培养技术体系(操作方法见上述小孢子培养的方法2.2)，分三批次开展了小孢子培养。结果显示，第一、二批小孢子出胚率低、畸形胚多，1月22日进行的第三批小孢子出胚率高，胚长势正常，累计获得1500个左右，作为构建的重组恢复株系的DH群体。

3)重组恢复株系DH群体种植：2015年5月2日利用本实验室构建的胚直播技术，对获得的1500余个小孢子成熟胚进行直播。经过在温室内精细管理617株成苗。6月5日将生长成苗的小孢子植株从温室内移栽到时试验田。7月27日，试验田中小孢子植株陆续开花，选择可育株全部套袋自交。成熟时收获双单倍体植株158份，全部为重组恢复株系。

3.新组合配制：

2015年秋播，以不育系11XS081A为母本，以筛选出的157个重组恢复株系为父本，再次杂交配制新组合。新组合配制采用“2+2”方法组配(见发明内容3)进行。2016年1月15日-2月27日，经套袋授粉杂交，4月18日陆续收获了146个新组合。

4.强优势杂交种鉴定、筛选：

2016年秋播，以云油杂15号为对照品种，对146个新组合进行产量鉴定(鉴定方法见发明内容4)。鉴定结果显示：

146个组合有9个较对照增产，增幅0.33％-11.22％，增产5％以上组合有3个，分别为15XS210(+5.33％)、15XS227(+8.49％)、15XS168(+11.22％)。

2017年秋播，以云油杂15号为对照品种，对鉴定试验中9个增产组合进行品种比较试验，品比试验结果显示，9个组合8个较对照增产，增幅0.43％-5.86％，其中，15XS210增产4.69％、15XS227增产5.19％、15XS168增产5.86％，2个组合两年鉴定均较对照增产5％以上，达到了本发明的预期，验证了本发明的可行性。

2018年秋播，15XS210(云油杂32号)进入国家冬油菜新品种试验(云贵高原组)、15XS168(云油杂34号)进入云南省优质油菜多点试验，对其丰产性、稳产性及适应性作进一步鉴定。

2018-2020年国家冬油菜新品种试验结果，云油杂32号两年平均亩产为260.7kg，较对照青杂10号增产9.1％，增产极显著；2018-2020年云南省优质油菜新品种多点试验结果：云油杂34号两年平均亩产为263.62kg，较对照云油杂10号(231.58kg)增产13.91％，增产极显著。云油杂32号和云油杂34号新品种试验中产量均较对照品种增产8％以上，达到强优势杂交种创制目标。

2019-2020年秋播，15XS227(云油杂36号)进入云南省优质油菜多点试验，8个试点平均亩产237.58kg，较对照云油杂10号(212.30kg)增产11.91％，增产极显著。

由上可知：本实施例开展了甘蓝型油菜强优势杂交种创制；以优质、高产甘蓝型油菜细胞质雄性不育三系杂交种云油杂15号及不育系11XS081A为育种材料，利用“二次选育法”，创制了“云油杂32号”、“云油杂34号”等产量较云油杂15号增产5％以上、较多点试验对照品种增产8％以上的强优势杂交种，大幅提高了新育成杂交种的单产，取得了预期的效果。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (4)

1.一种甘蓝型油菜强优势杂交种创制方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)选用育种材料：

选用新育成丰产、稳产、抗逆性强的杂交种及其不育系作为育种材料；

2)应用油菜小孢子培养技术构建重组恢复系DH群体：

以上述杂交种为供体进行小孢子培养，快速获得纯合小孢子单株，构建重组恢复系DH群体，其中，所述重组恢复系DH群体中包含杂种优势相关基因聚合的重组恢复系；

3)新组合配制：

以上述杂交种不育系为母本，以小孢子培养获得的重组恢复系为父本，进行杂交，配制新组合；

4)多重鉴定创制强优势杂交种：

通过产量鉴定、品种比较及多点试验多重鉴定，创制获得强优势杂交种。

2.根据权利要求1所述一种甘蓝型油菜强优势杂交种创制方法，其特征在于：所述步骤1)中，选用杂交种为云油杂15号及其不育系为育种材料。

3.根据权利要求1所述一种甘蓝型油菜强优势杂交种创制方法，其特征在于：所述步骤2)中，油菜小孢子培养技术构建重组恢复系DH群体的具体步骤如下：

(1)供体材料种植：

将上述杂交种作为供体材料分期进行种植；

(2)小孢子培养：

供体材料开花时，利用油菜小孢子培养技术，开展小孢子培养，油菜小孢子培养操作流程如下：

①于初花期取适宜大小的油菜花蕾，用15％次氯酸钠消毒15min，无菌水洗三次；

②加入NLN13培养液进行研磨，尼龙网过滤后转入10mL离心管中，200rpm离心2min；

③弃上清，用NLN13培养液悬浮小孢子，200rpm离心2min，重复一次；

④弃上清，加入NLN13培养液，并转移到培养皿中，30℃恒温箱中暗培养24hr；

⑤收集小孢子悬浮液，200rpm离心2min，弃上清，NLN13培养液洗后，分装到培养皿中；

⑥经4-5天30℃恒温箱中暗培养后移至25℃恒温箱中暗培养，至出现肉眼可见的胚状体后，吸去NLN13培养液，并加入B5培养液于摇床上培养，生长到子叶期的胚，用于胚直播；

(3)胚直播：

当小孢子胚成熟时，在温度为20-24℃、湿度为70％的温室内，将洗干净的小孢子胚直接播种在腐质土上生长成苗；40天左右，将已经生长5-6叶期的小孢子植株移栽到大田种植管理；

(4)重组恢复系DH群体构建：

小孢子植株在大田条件下生长普遍较弱，田间种植需要精细管理；当小孢子植株陆续开花时，通过育性识别，选择所有可育株系自交套袋，成熟时，分别收获自交种子，获得的多个双单倍体材料的组合，即为重组恢复系DH群体，其中，重组恢复系DH群体包含有杂种优势相关基因聚合的重组恢复系。

4.根据权利要求1所述一种甘蓝型油菜强优势杂交种创制方法，其特征在于：所述步骤3)中，配制新组合具体步骤如下：

(1)每个组合播种4行，1、3行种母本；2、4行种父本；开花时将父母本单株的花序套入同一个杂交袋内，杂交授粉；每组合套袋10对；

(2)套袋后每天中午，进行摇袋辅助授粉，终花后取下纸袋，分开父母本；成熟时，混合收获杂交的母本，即为新组合。