CN112763468A - 一种微流控芯片吸附固定线虫装置及其使用方法 - Google Patents

一种微流控芯片吸附固定线虫装置及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微流控芯片吸附固定线虫装置及其使用方法。本发明用此微流控芯片侧面吸附装置能够很好的对线虫实现吸附固定。固定效果与常规胶水黏附固定相当，效果佳，而且固定时间更长，能较好保持线虫活性，即使固定长达两小时之久，适于长时程实验操作。线虫是被吸附固定，不是压力固定，对其体内的压力影响不大，是一种物理固定方法。按照本专利的线虫固定操作步骤，可以其个正常生理体态进行固定，尽量将固定操作对其生理行为的影响降到最低，固定完释放后，线虫活性恢复快，而胶水黏附法线虫无法回收。本装置线虫进样速度可控，操作方便。还可以同步实施化学药物的头部刺激及神经元成像分析，能够有效提高实验效率。

Description

一种微流控芯片吸附固定线虫装置及其使用方法
技术领域
本发明属于微流控芯片及线虫研究方法技术领域，具体涉及一种微流控芯片吸附固定线虫装置及其使用方法。
背景技术
作为模式生物，秀丽隐杆线虫已经被广泛应用于生命科学研究并取得了重大突破。线虫有结构简单、生命周期短、易于培养和保存、明确的遗传背景和与人基因同源等优势。线虫由959个细胞组成个体较小，成虫长度仅有1毫米，幼虫个体更小需用显微镜观察。微流控芯片其微流通道尺寸为微米级，与线虫尺寸匹配完好，所以可以使用微流控芯片对线虫进行操作。
对线虫进行显微成像分析时需要先行对其进行固定，任何形式的身体扭动都会对成像结果造成严重影响。传统的线虫固定方法主要包括胶水固定和麻醉剂麻醉两种。胶水固定的方法虽然能很好的固定线虫，但是此法费时费力而且胶水对线虫有毒。麻醉剂固定的方法也很方便，但是麻醉剂细胞生理活动有影响。近年来发展起来的芯片线虫固定技术，基本不影响线虫的表型，且具有简单易行，可用于高分辨率亚细胞成像，更具有高通量以及长时间观察的特点。并排多通道侧吸、楔形通道、块阀挤压等芯片固定方法能很好的解决固定线虫的问题。
并排多通道侧吸技术原理简单，是一种较为理想的微流控芯片线虫固定方法。但是前人设计的这种侧吸通道有将线虫吸入侧吸通道的风险。本专利将对芯片结构进行改造，减少侧吸通道数目，并降低其高度，以解决此问题，另外还设计了可以捕获线虫的操纵模块，以提高微流控芯片对线虫的操控性能。
发明内容
发明目的：为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种微流控芯片吸附固定线虫装置及其使用方法，基于微流控芯片多排侧吸通道的线虫吸附固定技术，通过降低侧吸通道高度及减少侧吸通道数目解决了线虫会被吸入侧吸通道的问题。使对线虫的高分辨率成像分析、神经元激光烧蚀等操作可以实施。同时，在此吸附通道两侧额外添加了特殊结构单通道用以捕获线虫及药物给药刺激等。
技术方案：一种微流控芯片吸附固定线虫装置，包括线虫所在的主通道，线虫所在的主通道的高度为80微米，略大于成虫线虫的体宽；
线虫所在的主通道的一侧设置了侧吸通道，所述的侧吸通道包括多个吸附通道多排并排细通道及与之连接的吸附通道高通道；用以吸附线虫的单个单通道宽度为20微米，两个通道间隔为60微米；多个吸附通道多排并排细通道其总宽度小于线虫成虫成体长度；
所述的侧吸通道的左右两侧各设有一个用以捕获线虫单通道，用以实现对线虫的捕获等对线虫的微纳操纵，可用来吸引捕获线虫，通道内有“栅栏”结构能够有效防止线虫被吸入；通道宽度与高度和侧吸低通道相同，通过80微米高通道与负压源相连；在进行化学药物刺激时，可以从靠近头部的单通道通入化学药物进行刺激，此单通道还有通化学药物刺激线虫的作用；
对线虫的刺激主要是刺激其唇部，即头部的尖端，那里分布有线虫化感神经元的末梢，培养中的线虫在爬行及在水溶液中游动时，线虫体态多是呈正玄函数曲线型(类似“S”型)前进，这是由线虫体壁中肌肉组织组成结构决定的，爬行中的体位为其背部与腹部在两侧，侧线在上下两面。线虫正常的生理体位为此正玄函数曲线型(类似“S”型)；
主通道的多个吸附通道多排并排细通道开口侧壁并非平面，而是凹凸有序，呈正玄函数曲线型，类似“S”型；经过对线虫爬行中的体态测量分析设置了此种吸附通道，开口结构可以使线虫以生理常态被吸附固定，以减小固定操作对线虫生理行为的影响；
线虫可以被较为牢固的吸附固定，时间可以长达2小时；吸附固定2小时以内，线虫活力受影响较小；若需要更为牢固的固定效果，可以启动两侧单通道负压，将线虫的头与尾部吸住即可；
针对主侧吸通道、两侧两个单独侧吸通道，使用三个不同的负压源提供负压，主通道负压源吸附能力偏强；
线虫所在的主通道的另一侧设置了开口处有“栅栏”的进样液流缓冲通道，进样液流缓冲通道与大气相通，可以有效降低液流的变化速度，使对线虫的驱动可控。
作为优化：所述的吸附通道高通道高度为80微米。
作为优化：所述的多个吸附通道多排并排细通道高度较低，35-40微米，约为主通道高度的一半。
一种根据所述的微流控芯片吸附固定线虫装置的使用方法，具体操作如下：
芯片的制作过程中，在套刻时，第一层低通道制作时，曝光后按照光刻工艺流程进行曝光后进行后烘，然后进行显影，凸显出低通道的结构，再进行坚模，然后再铺胶做高通道，套刻结束，精细显影时一定要显影完全，可以在显微镜下观察通道显影效果，直至显影完全；
使用芯片吸附固定时，先行线虫进样，启动侧吸通道两侧距离线虫较远的单通道负压，线虫将随流体来到侧吸通道口，线虫的端部可以被此单通道捕获；先抓住尾部，线虫有逆流游动行为，当抓住尾部后线虫整个身体可以呈“S”型自由摆动，这与其自然状态下栽培养基中爬行体态相同，都是腹背线在两侧，如此方便以“S”型进行吸附固定；
抓住尾部后线虫有逃离行为，在侧吸通道口位置以“S”型摆动不停，启动侧吸通道负压进行吸附，如果吸附体位不正确，释放后重新吸附固定，固定结束释放尾部，完成线虫的吸附固定；
线虫可以掉头，具体方法：就像翻跟头一样，线虫身体柔软可以在微通道内翻跟头，主要是使用两个单独通道对线虫进行抓取及翻转操作，抓住线虫一端，主通道内从线虫体部向此端部缓慢驱动流体即可实现对线虫的掉头即翻跟头，流体速度要慢，在主通道的两端设有缓冲通道，可以降低主通道流体流速使对线虫的操作易于控制；
头部化学药物刺激：选择距头部较近的线虫捕获单通道通化学药物对唇部化感神经元进行刺激，同时虫体向头部方向驱动主通道内的流体，将药液推出主通道；精准控制两通道的流速，实现流体形式稳定，刺激流体不宜较快，因为流动流体本身对线虫也有刺激。
作为优化：采用铜离子刺激ASH神经元：以ASH带有G-camp钙离子探针标记的线虫作为研究材料，进样固定好线虫后，对其头部实施铜离子刺激。当铜离子浓度达到10mM时，线虫G-camp钙离子探针标记的ASH神经元光密度增强，表明钙离子浓度升高，线虫对此铜离子刺激有响应。
作为优化：采用线虫肠细胞钙离子成像：以CFP/YFP FRET钙离子荧光探针标记肠细胞，可以观察到由后往前的钙离子信号跨细胞传递过程。
有益效果：本发明用此微流控芯片侧面吸附装置能够很好的对线虫实现吸附固定。固定效果与常规胶水黏附固定相当，效果佳，而且固定时间更长，能较好保持线虫活性，即使固定长达两小时之久，适于长时程实验操作。线虫是被吸附固定，不是压力固定，对其体内的压力影响不大，是一种物理固定方法。按照本专利的线虫固定操作步骤，可以其个正常生理体态进行固定，尽量将固定操作对其生理行为的影响降到最低，固定完释放后，线虫活性恢复快，而胶水黏附法线虫无法回收。本装置线虫进样速度可控，操作方便。还可以同步实施化学药物的头部刺激及神经元成像分析，能够有效提高实验效率。
附图说明
图1是本发明的吸附固定线虫微流控芯片装置结构示意图；
图2是本发明的线虫被微流控芯片装置吸附固定结构示意图；
图3是本发明的线虫尾部肠细胞钙离子震荡结构示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
如图1所示，一种微流控芯片吸附固定线虫装置，包括线虫所在的主通道1，线虫所在的主通道1的高度为80微米，略大于成虫线虫的体宽。
线虫所在的主通道1的一侧设置了侧吸通道，所述的侧吸通道包括多个吸附通道多排并排细通道3及与之连接的吸附通道高通道2；所述的吸附通道高通道2高度为80微米。所述的多个吸附通道多排并排细通道3高度较低，35-40微米，约为主通道1高度的一半。通道高度降低能有效避免线虫被吸入侧吸通道。这里用以吸附线虫的单个单通道宽度为20微米，两个通道间隔为60微米。多个吸附通道多排并排细通道3其总宽度小于线虫成虫成体长度。
所述的侧吸通道的左右两侧各设有一个用以捕获线虫单通道4、5，用以实现对线虫的捕获等对线虫的微纳操纵。并排多个侧吸通道两侧用以捕获线虫单通道4、5结构相似，功能相同，可用来吸引捕获线虫，通道内有“栅栏”结构能够有效防止线虫被吸入。通道宽度与高度和侧吸低通道相同，通过80微米高通道与负压源相连。在进行化学药物刺激时，可以从靠近头部的单通道通入化学药物进行刺激。此单通道还有通化学药物刺激线虫的作用。
对线虫的刺激主要是刺激其唇部，即头部的尖端，那里分布有线虫化感神经元的末梢。培养中的线虫在爬行及在水溶液中游动时，线虫体态多是呈正玄函数曲线型(类似“S”型)前进，这是由线虫体壁中肌肉组织组成结构决定的，爬行中的体位为其背部与腹部在两侧，侧线在上下两面。线虫正常的生理体位为此正玄函数曲线型(类似“S”型)。
主通道1的多个吸附通道多排并排细通道3开口侧壁并非平面，而是凹凸有序，呈正玄函数曲线型，类似“S”型。经过对线虫爬行中的体态测量分析设置了此种吸附通道，开口结构可以使线虫以生理常态被吸附固定，以减小固定操作对线虫生理行为的影响。
线虫可以被较为牢固的吸附固定，时间可以长达2小时。吸附固定2小时以内，线虫活力受影响较小。若需要更为牢固的固定效果，可以启动两侧单通道负压，将线虫的头与尾部吸住即可。此吸附固定密封性好，不会有溶液进入负压源，线虫固定效果佳。
针对主侧吸通道、两侧两个单独侧吸通道，使用三个不同的负压源提供负压，主通道负压源吸附能力偏强。
线虫所在的主通道1的另一侧设置了开口处有“栅栏”的进样液流缓冲通道6，进样液流缓冲通道6与大气相通。因为微流控芯片通道尺寸微小，主通道1对液流速度变化敏感，对线虫的控制能力差，在两侧各加上此进样液流缓冲通道6，可以有效降低液流的变化速度，使对线虫的驱动可控。
所述的微流控芯片吸附固定线虫装置的使用方法，具体操作如下：
芯片的制作过程中，在套刻时，第一层低通道制作时，曝光后按照光刻工艺流程进行曝光后进行后烘，然后进行显影，凸显出低通道的结构，再进行坚模，然后再铺胶做高通道，这里，显影操作一定要做，套刻结束，精细显影时一定要显影完全，可以在显微镜下观察通道显影效果，直至显影完全；
使用芯片吸附固定时，先行线虫进样，启动侧吸通道两侧距离线虫较远的单通道负压，线虫将随流体来到侧吸通道口，线虫的端部可以被此单通道捕获；先抓住尾部，因为头部神经元集中特别是唇部，不抓头部以避免造成损伤，还因为线虫有逆流游动行为，当抓住尾部后线虫整个身体可以呈“S”型自由摆动，这与其自然状态下栽培养基中爬行体态相同，都是腹背线在两侧，如此方便以“S”型进行吸附固定；
抓住尾部后线虫有逃离行为，在侧吸通道口位置以“S”型摆动不停，启动侧吸通道负压进行吸附，如果吸附体位不正确，释放后重新吸附固定，固定结束释放尾部，完成线虫的吸附固定；
线虫可以掉头，具体方法：就像翻跟头一样，线虫身体柔软可以在微通道内翻跟头，主要是使用两个单独通道对线虫进行抓取及翻转操作，抓住线虫一端，主通道内从线虫体部向此端部缓慢驱动流体即可实现对线虫的掉头即翻跟头，注意：流体速度要慢，在主通道的两端设有缓冲通道，可以降低主通道流体流速使对线虫的操作易于控制；
头部化学药物刺激：选择距头部较近的线虫捕获单通道通化学药物对唇部化感神经元进行刺激，同时虫体向头部方向驱动主通道内的流体，将药液推出主通道；精准控制两通道的流速，实现流体形式稳定，刺激流体不宜较快，因为流动流体本身对线虫也有刺激。
本发明的实验分析如下：
1.铜离子刺激ASH神经元：以ASH带有G-camp钙离子探针标记的线虫作为研究材料，进样固定好线虫后，对其头部实施铜离子刺激。当铜离子浓度达到10mM时，线虫G-camp钙离子探针标记的ASH神经元光密度增强，表明钙离子浓度升高，线虫对此铜离子刺激有响应。
2.线虫肠细胞钙离子成像：以CFP/YFP FRET钙离子荧光探针标记肠细胞，可以观察到由后往前的钙离子信号跨细胞传递过程(如图3)。
本发明用此微流控芯片侧面吸附装置能够很好的对线虫实现吸附固定。固定效果与常规胶水黏附固定相当，效果佳，而且固定时间更长，能较好保持线虫活性，即使固定长达两小时之久，适于长时程实验操作。线虫是被吸附固定，不是压力固定，对其体内的压力影响不大，是一种物理固定方法。按照本专利的线虫固定操作步骤，可以其个正常生理体态进行固定，尽量将固定操作对其生理行为的影响降到最低，固定完释放后，线虫活性恢复快，而胶水黏附法线虫无法回收。本装置线虫进样速度可控，操作方便。还可以同步实施化学药物的头部刺激及神经元成像分析，能够有效提高实验效率。

Claims (6)

1.一种微流控芯片吸附固定线虫装置，其特征在于：包括线虫所在的主通道(1)，线虫所在的主通道(1)的高度为80微米，略大于成虫线虫的体宽；
线虫所在的主通道(1)的一侧设置了侧吸通道，所述的侧吸通道包括多个吸附通道多排并排细通道(3)及与之连接的吸附通道高通道(2)；用以吸附线虫的单个单通道宽度为20微米，两个通道间隔为60微米；多个吸附通道多排并排细通道(3)其总宽度小于线虫成虫成体长度；
所述的侧吸通道的左右两侧各设有一个用以捕获线虫单通道(4、5)，用以实现对线虫的捕获等对线虫的微纳操纵，可用来吸引捕获线虫，通道内有“栅栏”结构能够有效防止线虫被吸入；通道宽度与高度和侧吸低通道相同，通过80微米高通道与负压源相连；在进行化学药物刺激时，可以从靠近头部的单通道通入化学药物进行刺激，此单通道还有通化学药物刺激线虫的作用；
对线虫的刺激主要是刺激其唇部，即头部的尖端，那里分布有线虫化感神经元的末梢，培养中的线虫在爬行及在水溶液中游动时，线虫体态多是呈正玄函数曲线型(类似“S”型)前进，这是由线虫体壁中肌肉组织组成结构决定的，爬行中的体位为其背部与腹部在两侧，侧线在上下两面。线虫正常的生理体位为此正玄函数曲线型(类似“S”型)；
主通道(1)的多个吸附通道多排并排细通道(3)开口侧壁并非平面，而是凹凸有序，呈正玄函数曲线型，类似“S”型；经过对线虫爬行中的体态测量分析设置了此种吸附通道，开口结构可以使线虫以生理常态被吸附固定，以减小固定操作对线虫生理行为的影响；
线虫可以被较为牢固的吸附固定，时间可以长达2小时；吸附固定2小时以内，线虫活力受影响较小；若需要更为牢固的固定效果，可以启动两侧单通道负压，将线虫的头与尾部吸住即可；
针对主侧吸通道、两侧两个单独侧吸通道，使用三个不同的负压源提供负压，主通道负压源吸附能力偏强；
线虫所在的主通道(1)的另一侧设置了开口处有“栅栏”的进样液流缓冲通道(6)，进样液流缓冲通道(6)与大气相通，可以有效降低液流的变化速度，使对线虫的驱动可控。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片吸附固定线虫装置，其特征在于：所述的吸附通道高通道(2)高度为80微米。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片吸附固定线虫装置，其特征在于：所述的多个吸附通道多排并排细通道(3)高度较低，35-40微米，约为主通道(1)高度的一半。
4.一种根据权利要求1所述的微流控芯片吸附固定线虫装置的使用方法，其特征在于：具体操作如下：
芯片的制作过程中，在套刻时，第一层低通道制作时，曝光后按照光刻工艺流程进行曝光后进行后烘，然后进行显影，凸显出低通道的结构，再进行坚模，然后再铺胶做高通道，套刻结束，精细显影时一定要显影完全，可以在显微镜下观察通道显影效果，直至显影完全；
使用芯片吸附固定时，先行线虫进样，启动侧吸通道两侧距离线虫较远的单通道负压，线虫将随流体来到侧吸通道口，线虫的端部可以被此单通道捕获；先抓住尾部，线虫有逆流游动行为，当抓住尾部后线虫整个身体可以呈“S”型自由摆动，这与其自然状态下栽培养基中爬行体态相同，都是腹背线在两侧，如此方便以“S”型进行吸附固定；
抓住尾部后线虫有逃离行为，在侧吸通道口位置以“S”型摆动不停，启动侧吸通道负压进行吸附，如果吸附体位不正确，释放后重新吸附固定，固定结束释放尾部，完成线虫的吸附固定；
线虫可以掉头，具体方法：就像翻跟头一样，线虫身体柔软可以在微通道内翻跟头，主要是使用两个单独通道对线虫进行抓取及翻转操作，抓住线虫一端，主通道内从线虫体部向此端部缓慢驱动流体即可实现对线虫的掉头即翻跟头，流体速度要慢，在主通道的两端设有缓冲通道，可以降低主通道流体流速使对线虫的操作易于控制；
头部化学药物刺激：选择距头部较近的线虫捕获单通道通化学药物对唇部化感神经元进行刺激，同时虫体向头部方向驱动主通道内的流体，将药液推出主通道；精准控制两通道的流速，实现流体形式稳定，刺激流体不宜较快，因为流动流体本身对线虫也有刺激。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片吸附固定线虫装置的使用方法，其特征在于：采用铜离子刺激ASH神经元：以ASH带有G-camp钙离子探针标记的线虫作为研究材料，进样固定好线虫后，对其头部实施铜离子刺激。当铜离子浓度达到10mM时，线虫G-camp钙离子探针标记的ASH神经元光密度增强，表明钙离子浓度升高，线虫对此铜离子刺激有响应。
6.根据权利要求4所述的微流控芯片吸附固定线虫装置的使用方法，其特征在于：采用线虫肠细胞钙离子成像：以CFP/YFP FRET钙离子荧光探针标记肠细胞，可以观察到由后往前的钙离子信号跨细胞传递过程。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114289083A (zh) * 2021-12-29 2022-04-08 南通大学 一种可用于线虫显微解剖的微流控芯片
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